KR100762357B1 - 염증특이적 엠알 조영제 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

기존의 MR 영상 조영제인 Gd-DTPA는 T1 조영제로서 널리 사용되고 있으나, 선택 특이적이지 않으며 생체내 잔류시간이 짧다.
본 발명은 기존의 MR 영상 조영제인 Gd-DTPA의 문제점을 해소할 수 있는 신규한 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체는 혈관내 잔류시간을 길게 하고 염증조직을 특이적으로 조영하는데 사용할 수 있으며, 또한 기존의 조영제인 Gd-DTPA의 Gd에 대한 사용양보다 적은 양을 이용하여 MR 영상을 얻을 수 있으며, 염증을 수반하는 질병을 쉽게 진단할 수 있다.
Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체, 염증특이적 T1 조영제, MRI 조영제, ICAM-1

Description

염증특이적 엠알 조영제 및 이의 제조방법{Inflammation-specific contrast media for magnetic resonance imaging and process for preparing the same}
도 1은 본 발명의 조영제 제조에 있어 합성반응에 사용된 항-ICAM-1 항체와 생성된 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체의 MALDI-TOF 분석자료이다.
도 2는 종래의 조영제인 Gd-DTPA를 이용한 염증유발 쥐에서의 T1 MR 영상이다.
도 3은 본 발명의 조영제인 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체를 이용한 염증유발 쥐에서의 염증특이적 T1 MR 영상이다.
도 4는 도 2 및 도 3의 결과를 그래프화한 자료이다.
본 발명은 조영제 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 염증특이적 MR 조영제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
상자기성 금속-킬레이트 화합물 및 거대분자와 결합한 화합물들은 MRI(magnetic resonance imaging)를 위한 T1 조영제로서 널리 사용되고 있으며, 그 중 Gd(gadolinium)는 가장 대표적인 조영소재이다.
Gd-DTPA(gadolinium-diethylenetriaminepentaacetic acid) 화합물은 생체내에서 안정적이며 독성을 가지지 않으나, 작은 분자량으로 인해 쉽게 혈관조직으로부터 소실되어 그 활용범위에 한계가 있다.
현재 상용화되어 있는 조영제는 모두 조영제가 혈관이나 위장관의 공간에 머물러 있음으로 인하여 조직과 공간간의 조영효과를 제공함으로써, 진단에 도움을 주는 수동적 조영 단계라 할 수 있다.
본 발명에서는 이와 달리 조영제를 직접 병변조직에 결합시킴으로써, 질병특이적 조영을 구현하여 질병의 진단을 가능하게 하는 능동적 조영제를 개발하고자 하였다.
구체적으로, 대부분 질병의 초기 발병단계라 할 수 있는 염증조직에는 ICAM-1(Intercellular adhesion molecule-1)이 많이 생성되어 있으므로, 이와 특이적으로 결합할 수 있는 항-ICAM-1 항체를 Gd-DTPA와 결합시킴으로써 염증조직을 특이적으로 조영할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 염증을 수반하는 질병의 효과적 진단을 위한 염증특이적 분자조영제 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 하기 화학식 1로 표시되는 DTPABA(diethylenetriaminepentaacetic acid bisanhydride), 하기 화학식 2로 표시되는 항-ICAM-1 항체 및 Gd를 반응시켜 제조한 하기 화학식 3으로 표시되는 Gd- DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체를 포함하는 조영제를 제공한다.
Figure 112005034660075-pat00001
Figure 112005034660075-pat00002
Figure 112005034660075-pat00003
본 발명의 조영제는 종래의 조영제와 달리 조영제를 직접 병변조직에 결합시킴으로써, 질병특이적 조영을 구현하여 질병의 진단을 가능하게 하는 능동적 조영제라 할 수 있다.
구체적으로, 대부분 질병의 초기 발병단계라 할 수 있는 염증조직에는 ICAM-1이 많이 생성되어 있으므로, 본 발명은 이와 특이적으로 결합할 수 있는 항-ICAM-1 항체를 Gd-DTPA와 결합시킴으로써, 염증조직에 특이적으로 조영할 수 있도록 한 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체는 MR 영상에서 염증을 수반 하는 병변조직을 특이적으로 조영하여 진단에 효과적으로 사용될 수 있다. 또한 거대분자인 항체를 결합시킴으로써 분자량이 증가됨에 따라, 혈관내에 잔류시간을 연장시켜 염증 특이적 MR 영상을 효과적으로 실현할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조영제는 염증조직에 특이적으로 결합함으로써, 염증을 수반하는 조직의 MR 영상, 국소병변의 감별진단, 염증성 병변의 범위(extent) 결정 및 심각성(severity) 판단, 염증성 병변의 초기진단에 사용될 수 있다.
본 발명에서 항-ICAM-1 항체는 생쥐의 ICAM-1에 대한 쥐의 하이브리도마를 ATCC(No.CRL-1878)사로부터 분양받아 DMEM(Dulbecco's modification of Eagle's medium) 배지에서 배양한 후, 그 배양액으로부터 단백질-G 친화성 크로마토그래피 방법에 의해 정제한 것을 사용하였다.
또한, 본 발명은 (a) 화학식 1로 표시되는 DTPABA를 용매에 혼탁시킨 후 정제된 하기 화학식 2로 표시되는 항-ICAM-1 항체 용액에 첨가하는 단계; (b) 혼합액을 교반하여 반응시킴으로써 DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체를 제조하는 단계; (c) 제조된 DTPA-항-ICAM-1 항체 용액에 Gd 용액을 첨가하는 단계; 및 (d) 혼합액을 교반하여 반응시킴으로써 화학식 3으로 표시되는 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체를 제조하는 단계를 포함하는, Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체를 포함하는 조영제의 제조방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 DTPABA에 대한 용매로는 DMF(dimethylformamide), 무수 DMSO(dimethylsulfoxide) 등을 사용할 수 있다.
상기 두 용매는 모두 사용 가능하며, DMF는 DTPABA에 대한 용해도가 DMSO보다 상당히 낮으며 소량씩 첨가하기 위해 현탁시키는 의미가 크다. DMSO는 DTPABA에 대한 용해도는 크나 독성이 있어 사용에 한계가 있다. 두 용매는 DTPABA의 무수물 형태가 항체와의 반응 전에 가수분해에 의해 카르복시산(-CO2H)으로 전환되면 반응성이 감소되므로 무수 조건이어야 한다.
상기 (b) 및 (d) 단계에서는 혼합액을 실온에서 대략 1시간 동안 교반하여 반응시키거나, 혼합액을 대략 4℃에서 대략 24시간 동안 교반하여 반응시킬 수 있다.
상기 두 반응 조건은 모두 가능하며, 반응속도에 영향을 줄 뿐 수율이나 생성물의 물성에 크게 영향을 주지 않는다. 실온에서 반응은 낮은 온도 조건에서 반응보다 반응속도가 빠르기 때문에 1시간으로 충분하다. 단 그 이상의 시간이 소요되면 항체가 단백질이므로 물성변화가 예상된다.
본 발명에 따른 조영제는 구체적으로 다음과 같은 방법으로 제조된다.
① DTPABA 40eq(당량)를 DMF 또는 무수 DMSO에 혼탁시켜서 정제된 1eq의 항-ICAM-1 항체 용액에 첨가한다.
② 실온에서 1시간 동안 교반하여 반응시키거나, 또는 혼합액을 4℃에서 24시간 동안 교반하여 반응시킨다. 이때, 반응용액의 pH는 8.0 내지 9.0으로 유지시킨다. 이 반응에 따라 DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체가 형성된다.
③ 반응액을 PD-10 컬럼(column)을 이용하여 0.1M의 아세트산 나트륨(sodium acetate) 용액으로 미반응물 및 부반응물로부터 분리한다.
④ GdCl3 40eq를 탈이온화된 증류수에 녹인다.
⑤ GdCl3(gadolinium chloride) 용액을 분리된 1eq의 DTPA-항-ICAM-1 항체 용액에 첨가한다.
⑥ 실온에서 1시간 동안 교반하여 반응시키거나, 또는 혼합액을 4℃에서 24시간 동안 교반하여 반응시킨다. 이때, 반응용액의 pH는 5.0 내지 5.5로 유지시킨다. 이 반응에 따라 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체가 형성된다.
⑦ 반응액을 PD-10 컬럼을 이용하여 0.15M 염화 나트륨(sodium chloride) 용액으로 미반응물 및 부반응물로부터 분리한다.
⑧ 분리된 용액을 농축한다.
⑨ 생성물을 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight)와 ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry)를 이용하여 확인한다.
요컨대, 본 발명에 따른 조영제는 하기 반응식 1에 따라 합성된다. 여기서 Ab는 항체(antibody)이다. DTPA 및 항-ICAM-1 항체는 아미드결합(-CONH-)으로 결합되어 있다. Gd-DTPA는 Gd가 DTPA에 배위결합된 금속-킬레이트 화합물이다.
Figure 112005034660075-pat00004
이하 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명한다.
[실시예 1]
① DTPABA(40eq)를 DMF에 혼탁시켜서 정제된 항-ICAM-1 항체 용액(1eq)에 첨가하였다. ② 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이때, 반응용액의 pH는 8.5로 유지시켰다. ③ 반응액을 PD-10 컬럼을 이용하여 0.1 M의 아세트산 나트륨 용액으로 미반응물 및 부반응물로부터 분리하였다. ④ GdCl3(40eq)를 탈이온화된 증류수에 녹였다. ⑤ GdCl3 용액을 분리된 DTPA-항-ICAM-1 항체 용액(1eq)에 첨가하였다. ⑥ 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이때, 반응용액의 pH는 5.0 내지 5.5로 유지시켰다. ⑦ 반응액을 PD-10 컬럼을 이용하여 0.15 M 염화 나트륨 용액으로 미반응물 및 부반응물로부터 분리하였다. ⑧ 분리된 용액을 농축하였다. ⑨ 생성물을 MALDI-TOF와 ICP-MS를 이용하여 확인하였다.
[실시예 2]
① DTPABA(40eq)를 DMF에 혼탁시켜서 정제된 항-ICAM-1 항체 용액(1eq)에 첨가하였다. ② 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 이때, 반응용액의 pH는 8.5로 유지시켰다. ③ 반응액을 PD-10 컬럼을 이용하여 0.1 M의 아세트산 나트륨 용액으로 미 반응물 및 부반응물로부터 분리하였다. ④ GdCl3(40eq)를 탈이온화된 증류수에 녹였다. ⑤ GdCl3 용액을 분리된 DTPA-항-ICAM-1 항체 용액(1eq)에 첨가하였다. ⑥ 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 이때, 반응용액의 pH는 5.0 내지 5.5로 유지시켰다. ⑦ 반응액을 PD-10 컬럼을 이용하여 0.15 M 염화 나트륨 용액으로 미반응물 및 부반응물로부터 분리하였다. ⑧ 분리된 용액을 농축하였다. ⑨ 생성물을 MALDI-TOF와 ICP-MS를 이용하여 확인하였다.
[실시예 3]
① DTPABA(40eq)를 무수 DMSO에 녹여서 정제된 항-ICAM-1 항체 용액(1eq)에 첨가하였다. ② 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이때, 반응용액의 pH는 8.5로 유지시켰다. ③ 반응액을 PD-10 컬럼을 이용하여 0.1 M의 아세트산 나트륨 용액으로 미반응물 및 부반응물로부터 분리하였다. ④ GdCl3(40eq)를 탈이온화된 증류수에 녹였다. ⑤ GdCl3 용액을 분리된 DTPA-항-ICAM-1 항체 용액(1eq)에 첨가하였다. ⑥ 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이때, 반응용액의 pH는 5.0 내지 5.5로 유지시켰다. ⑦ 반응액을 PD-10 컬럼을 이용하여 0.15 M 염화 나트륨 용액으로 미반응물 및 부반응물로부터 분리하였다. ⑧ 분리된 용액을 농축하였다. ⑨ 생성물을 MALDI-TOF와 ICP-MS를 이용하여 확인하였다.
[실시예 4]
① DTPABA(40eq)를 무수 DMSO에 녹여서 정제된 항-ICAM-1 항체 용액(1eq)에 첨가하였다. ② 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 이때, 반응용액의 pH는 8.5로 유 지시켰다. ③ 반응액을 PD-10 컬럼을 이용하여 0.1 M의 아세트산 나트륨 용액으로 미반응물 및 부반응물로부터 분리하였다. ④ GdCl3(40eq)를 탈이온화된 증류수에 녹였다. ⑤ GdCl3 용액을 분리된 DTPA-항-ICAM-1 항체 용액(1eq)에 첨가하였다. ⑥ 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 이때, 반응용액의 pH는 5.0 내지 5.5로 유지시켰다. ⑦ 반응액을 PD-10 컬럼을 이용하여 0.15 M 염화 나트륨 용액으로 미반응물 및 부반응물로부터 분리하였다. ⑧ 분리된 용액을 농축하였다. ⑨ 생성물을 MALDI-TOF와 ICP-MS를 이용하여 확인하였다.
도 1은 본 발명의 조영제 제조에 있어 합성반응에 사용된 항-ICAM-1 항체와 생성된 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체의 MALDI-TOF 분석자료이다.
도 1에서 147488, 154670은 각각 출발물질인 항-ICAM-1 항체의 분자량과 반응 후 생성된 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체의 분자량이며, 이때 단위는 Dalton으로 물질의 분자량을 의미한다. 분자량의 차이는 출발물질로부터 새로운 물질이 생성되었음을 의미하며, Gd-DTPA가 항-ICAM-1 항체에 얼마만큼 결합되었는지를 계산할 수 있다. 이 수치는 상대적으로 가장 많이 존재하는 물질의 분자량을 의미하며, 항-ICAM-1 항체에 Gd-DTPA가 13개 결합된 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체가 가장 많이 존재함을 의미한다.
표 1은 ICP-MS를 이용한 DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체와 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체의 정량분석 결과이다.
결합 산물(conjugated product) (단백질 정량결과) 수율(%)
DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체 95 내지 98
Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체 75 내지 85
ICP-MS를 이용한 Gd의 분석결과 몰비
항 ICAM-1 항체(mAb): Gd 1:20
DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체 및 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체의 수율은 BCA(Bicinchoninic acid) 분석 방법을 이용한 항체 단백질의 정량결과이다.
그리고 mAb : Gd의 몰비는 시료를 2% 질산으로 전처리한 후, ICP-MS 기기분석을 이용하여 얻은 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체의 Gd의 농도와, Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체에 포함된 항-ICAM-1 항체만의 농도를 얻은 후, 전체 몰수를 비교한 결과치다. 즉, Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체에는 하나의 항 ICAM-1 항체에 대하여 20개의 Gd가 결합되어 있음을 의미한다.
도 2는 종래의 조영제인 Gd-DTPA를 이용한 염증유발 쥐에서 촬영한 T1 MR 영상으로, 대장균 백만 마리를 근육에 주사하여 만든 염증유발 쥐에 기존의 MR 조영제인 Gd-DTPA(2.5μmole Gd)를 주사한 후, 1.5T 자기공명영상장비(Gyroscan Integra, Philips Med. System)에서 47 ㎜ surface coil을 사용하여 T1-강조 스핀에코(TR/TE=500/15 ms) 영상법으로 촬영한 결과, 짧은 시간 동안에만 전반적인 조영증가를 보여주고 있다.
도 3은 본 발명의 조영제인 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체를 이용한 염증유발 쥐에서의 염증특이적 T1 MR 영상으로, 도 2와 같은 방법으로 촬영한 결과, Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체(250 nmole Gd)를 주사하면, 도 2의 Gd-DTPA를 주사한 경우와 달리, 24시간 동안 염증조직 특이적인 조영증가를 보여주고 있다. 또한 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체는 기존의 조영제보다 1/10의 적은 양으로도 충분히 염증조직과 정상조직의 차이를 효과적으로 관찰할 수 있다.
도 4는 도 2 및 도 3의 MR 영상을 시간의 변화에 따른 영상신호강도(CNR: contrast-to-noise ratio)로서 그래프로 표현한 것으로, Gd-DTPA 조영제의 경우 주사한 후 병변조직에서 1분 시간대에서 가장 높은 증가를 보이고 1시간 내에 빠르게 체내로부터 제거되어 감소하는 것을 알 수 있다. 반면 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체의 경우 염증부위에 생성된 ICAM-1과 특이적으로 항-ICAM-1 항체가 결합하여 영상신호가 서서히 증가되어 24시간까지 지속되며 6시간에서 가장 증가된 신호가 관찰된다.
이러한 결과에 의해, 본 발명에 따른 Gd-DTPA-항-ICAM-1 항체 결합체는 기존의 Gd-DTPA보다 체내에 긴 잔류시간을 가지면서 염증조직을 특이적으로 조영할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 조영제는 종래의 조영제와 달리 조영제를 직접 병변조직에 결합시킴으로써, 질병특이적 조영을 구현하여 질병의 진단을 가능하게 하는 능동적 조영제로서, 거대분자인 항체를 결합시킴으로써 분자량이 증가됨에 따라 혈관내에 잔류시간을 연장시켜 염증 특이적 MR 영상을 효과적으로 실현할 수 있으며, 또한 기존의 조영제인 Gd-DTPA의 Gd에 대한 사용양보다 적은 양을 이용하여 MR 영상을 얻을 수 있으며, 염증을 수반하는 질병을 쉽게 진단할 수 있다.
본 발명에 따른 조영제는 염증조직에 특이적으로 결합함으로써, 염증을 수반 하는 조직의 MR 영상, 국소병변의 감별진단, 염증성 병변의 범위(extent) 결정 및 심각성(severity) 판단, 염증성 병변의 초기진단 등 염증을 수반하는 병변조직을 특이적으로 조영하여 진단에 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 디티피에이비에이(DTPABA; diethylenetriaminepentaacetic acid bisanhydride), 하기 화학식 2로 표시되는 항-아이캠-1(ICAM-1; Intercellular adhesion molecule-1) 항체 및 가돌리늄(Gd; gadolinium)을 반응시켜 제조한 하기 화학식 3으로 표시되는 가돌리늄-디티피에이-항-아이캠-1(Gd-DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid)-항-ICAM-1) 항체 결합체를 포함하는 엠알 영상 조영제.
    [화학식 1]
    Figure 112007026970982-pat00005
    [화학식 2]
    Figure 112007026970982-pat00006
    [화학식 3]
    Figure 112007026970982-pat00007
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-아이캠-1 항체는 인간 또는 동물 유래 항체인 것을 특징으로 하는 엠알 영상 조영제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조영제는 염증조직에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 엠알 영상 조영제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조영제는 염증을 수반하는 조직의 엠알(MR; magnetic resonance) 영상, 국소병변의 감별진단, 염증성 병변의 범위(extent) 결정 및 심각성(severity) 판단, 염증성 병변의 초기진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 엠알 영상 조영제.
  5. (a) 하기 화학식 1로 표시되는 디티피에이비에이(DTPABA; diethylenetriaminepentaacetic acid bisanhydride)를 용매에 혼탁시킨 후 정제된 하기 화학식 2로 표시되는 항-아이캠-1(ICAM-1; Intercellular adhesion molecule-1) 항체 용액에 첨가하는 단계;
    (b) 혼합액을 교반하여 반응시킴으로써 디티피에이-항-아이캠-1(DTPA( diethylenetriaminepentaacetic acid)-항-ICAM-1) 항체 결합체를 제조하는 단계;
    (c) 제조된 디티피에이-항-아이캠-1 항체 용액에 가돌리늄(Gd; gadolinium) 용액을 첨가하는 단계; 및
    (d) 혼합액을 교반하여 반응시킴으로써 하기 화학식 3으로 표시되는 가돌리늄-디티피에이-항-아이캠-1(Gd-DTPA-항-ICAM-1) 항체 결합체를 제조하는 단계를 포함하는,
    가돌리늄-디티피에이-항-아이캠-1 항체 결합체를 포함하는 엠알 영상 조영제의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure 112007026970982-pat00008
    [화학식 2]
    Figure 112007026970982-pat00009
    [화학식 3]
    Figure 112007026970982-pat00010
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