KR100751051B1 - 관절염 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 유효 성분으로서 다음 화학식 1의 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙스아디올 (20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol) 또는 그의 프로드럭의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 관절염 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다:

화학식 1

20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙스아디올, 화합물 K, 사포닌, 진세노사이드, 관절염, 골관절염

Description

관절염 치료용 약제학적 조성물{A Pharmaceutical Composition for Treating Arthritis}

도 1은 IL-1β로 처리된 연골세포에서 MMP-3 (matrix metalloproteinase-3)의 발현에 대한 화합물 K의 효과를 보여주는 그래프이다. 도면에서, CpK는 화합물 K를 나타낸다.

도 2는 IL-1β로 처리된 연골세포에서 MMP-13의 발현에 대한 화합물 K의 효과를 보여주는 그래프이다.

도 3는 IL-1β로 처리된 연골세포에서 NO (nitric oxide)의 생성에 대한 화합물 K의 효과를 보여주는 그래프이다.

도 4는 연골세포에 대한 화합물 K의 독성 여부를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 5는 여러 종류의 진세노사이드가 NO 생성에 효과를 미치는 지 여부를 확인한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.

도 6은 진세노사이드 Rb1이 NO 생성에 효과를 미치는 지 여부를 확인한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.

도 7은 화합물 K와 Rb1이 유도성 산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase: iNOS)의 발현 억제를 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과 사진이다.

도 8은 화합물 K가 MAP 키나아제 (mitogen activated protein kinase: MAP kinase)의 활성화 (즉, 인산화)에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과 사진이다.

본 발명은 관절염 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

관절염은 관절 및 결합조직에서 통증, 스웰링 및 한정된 움직임을 야기하는 다양한 상태 (conditions)를 총칭하는 용어이다. 관절염의 특정 병인은 확실하게 규명되어 있지 않다. 한편, 현재 관절염 치료의 대부분의 프로그램은 약물치료, 운동, 휴식, 관절 보호 및 수술의 조합을 통해 이루어지고 있다.

관절염의 가장 빈번한 형태는 골관절염, 섬유근통 (fibromyalgia) 및 류마티스 관절염이다.

골관절염은 관절 연골의 파괴에 의해 특징지워지는 퇴행성 관절 질환이다. 연골은 관절에 있는 뼈의 말단에 쿠션을 주는 기능을 한다. 연골의 파괴에 의해 뼈가 서로 마찰이 되며, 이는 통증을 야기하고 움직임을 제한한다. 골관절염은 주로 무릎, 고관절, 발 및 등과 같이 체중이 가해지는 관절에서 발생한다. 골관 절염의 위험 인자로는 노화, 비만, 관절 손상, 유전적 소인 등이 있다. 골관절염에 대한 분자적 기전으로는 연골세포 자체에서 분비되는 파괴적 효소 (destructive enzymes)가 유력하다.

골관절염에 대하여 현재 시술되고 있는 치료는 통증의 완화 및 관절 움직임의 개선에 초점이 맞추어지고 있다. 통증 완화 및 염증반응의 완화를 위해 처방되고 있는 약물로는 아스피린, 아세트아미노펜, 이부프로펜 및 비스테로이드성 항염증제 (NSAID) 등이 있다. 또한, 코티코스테로이드를 관절에 직접적으로 주입하는 방법도 이용되고 있다.

한편, 섬유근통 (fibromyalgia)은 근육과 골에 부착된 조직에 영향을 미치는 통증이다. 섬유근통을 치료할 목적으로, 통증 완화와 염증반응의 완화를 위해 아스피린, 아세트아미노펜, 이부프로펜 및 비스테로이드성 항염증제 (NSAID) 등이 처방되고 있다.

류마티스 관절염은 자가면역 질환의 일종으로서 염증성 질환이다. 류마티스 인자 (rheumatoid factor)가 혈액에 존재하는 지 여부를 조사하여 류마티스 관절염을 진단하고 있는 데, 이 비정상적인 물질은 류마티스 관절염을 가지고 있는 성인의 약 80%에서 발견된다.

류마티스 관절염의 치료를 위한 종래의 방법들은 부종의 완화, 통증과 경직성의 완화, 정상적 관절 기능의 유지에 초점이 맞추어지고 있다. 또한, 류마티스 관절염의 치료에 이용되고 있는 약물들은, 주로 염증, 관절통, 경직성 및 부종을 조절할 수 있는 비스테로이드성 항염증제 (NSAID)들이다. 또한, 프레드니손, 메 토트렉세이트, 히드록시클로로퀸, 아줄피딘, 금염 (gold salt) 및 사이클로스포린 등의 약물도 사용되고 있다.

관절염에 대한 종래의 치료 방식 (regimens)들은, 상술한 바와 같이 주로 염증 완화를 위한 약물로 이루어지고 있으나, 이는 제한된 치료 효과만을 나타내고 있다. 따라서, 염증 및 통증 완화와 다른 방식으로 관절염을 치료할 수 있는, 보다 근본적인 관절염 치료제에 대한 요구가 당업계에 대두되고 있다.

본 발명자들은 염증 및 통증 완화와 같은 일시적인 치료방식이 아닌, 보다 근본적으로 관절염을 치료할 수 있는 약물을 개발하고자 다양한 화합물을 스크리닝 하였고, 결국 특정 화합물이 관절염 발병과 관련된 효소 및 물질들의 발현 및 생성에 유효한 효능을 발휘함을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 관절염 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 유효 성분으로서 다음 화학식 1의 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙스아디올(20-O-β-D-glucopyranosyl -20(S)-protopanaxadiol) 또는 그의 프로드럭 (prodrug)의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 관절염 치료용 약제학적 조성물을 제공한다:

화학식 1

본 발명자들은 염증 및 통증 완화와 같은 일시적인 치료방식이 아닌, 보다 근본적으로 관절염을 치료할 수 있는 약물을 개발하고자 다양한 화합물을 스크리닝 하였고, 결국 상기 화학식 1의 화합물이 관절염 발병과 관련된 효소 및 물질들의 발현 및 생성에 유효한 효능을 발휘함을 발견하였다. 화학식 1의 화합물이 작용하여 관절염 치료 효능을 나타내는 분자적 타깃은 MMP (matrix metalloproteinase)-3, MMP-13, NO (nitric oxide) 합성효소 및 MAP 키나아제 (mitogen activated protein kinase: MAP kinase) 패밀리 [p38 MAP 키나아제 (p38 mitogen activated protein kinase), 세포외 신호-조절 단백질 키나아제 (extracellular signal-regulated protein kinase: ERK 1/2) 및 c-Jun N-말단 키나아제 (c-Jun N-terminal kinase: JNK)]이다. 즉, 화학식 1의 화합물은 (ⅰ) 연골 세포 기질 분해효소인 MMP-3 및 MMP-13의 발현을 억제하고, (ⅱ) NO 합성효소의 발현을 방해하여 NO의 생성을 억제하며, (ⅲ) 연골세포 기질 분해 효소인 MMPs의 증가와 연골세포의 아폽토시스를 매개하는 MAP 키나아제의 활성화 (즉, 인산화)를 효과적으로 차단함으로써 관절염 치료 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 MMPs에 대하여 길항작용을 한다고 알려진 TIMP (tissue inhibitor of metalloproteinase)의 발현에 영향을 미치지 않기 때문에, 매우 효과적인 관절염 치료제가 될 수 있다.

본 발명의 화합물은 상기 화학식 1로 나타낼 수 있으며, 상기 화학식 1의 화합물은 당업계에서 화합물 K로 약칭되고 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 화합물은 상기 화학식 1에 의해 표현되는 것뿐만 아니라, 상기 화학식 1에서 치환 가능한 작용기 (예컨대, -OH 기)를 당업계의 통상적인 방법에 따라 변형시켜 제조되는 유도체들도 그 유도체가 관절염 치료 효능을 나타내는 한 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 유효성분은 화합물 K의 프로드럭 (prodrug)도 포함한다. 화합물 K는 인삼 (Panax ginseng)의 다양한 사포닌 성분들의 체내 주요한 대사물로 알려져 있다. 따라서, 용어 “화합물 K의 프로드덕”은 체내에서 화합물 K로 전환될 수 있는 화합물을 의미한다.

예를 들어, Akao T. et al., J. Pharm . Pharmacol ., 50(10):1155(1998)은 진세노사이드 (ginsenoside) Rb1이 체내에서 화합물 K로 전환됨을 개시하고 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프로드럭은 인삼으로부터 분리된 사포닌이며, 보다 바람직하게는 진세노사이드 (ginsenoside) Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3 등이고, 보다 더 바람직하게는 진세노사이드 Rb1이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 관절내 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식 을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 약제학적 조성물은 골관절염 치료에 통상적으로 이용되는 히아루론산 (Hyaluronic acid; HA)을 추가적으로 포함할 수 있다. 히아루론산은 화합물 K 또는 그의 프로드럭을 포함하는 본 발명의 조성물의 관절염 치료 효과를 상승적으로 (synergic) 증가시킬 것으로 기대된다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 관절염은 골관절염, 섬유근통 (fibromyalgia) 및 류마티스 관절염이고, 바람직하게는 골관절염이며, 가장 바람직하게는 퇴행성 골관절염이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 종래의 관절염 치료제와는 달리, 관절염 발전의 원인으로 알려져 있는 (ⅰ) 연골세포 기질 분해효소인 MMP-3 및 MMP-13의 발현을 억제하고, (ⅱ) NO 합성효소의 발현을 방해하여 NO의 생성을 억제하며, (ⅲ) 연골세포 기질 분해 효소인 MMPs의 증가와 연골세포의 아폽토시스를 매개하는 MAP 키나아제의 활성화 (즉, 인산화)를 효과적으로 차단함으로써 근본적인 치료 기전을 가지기 때문에 관절염 치료에 매우 유효하다.

더욱이, 본 발명의 약제학적 조성물에서 이용되는 유효성분은 매우 낮은 농도 (μM 수준)에서도 (특히, 화학식 1의 화합물의 경우) 상술한 효능을 발휘하기 때문에, 최종적으로 의약으로 개발하는 데에 매우 유리하다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 생체에 대하여 독성을 나타내지 않아 매우 안전하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 화합물 K의 준비

10 g의 인삼(홍삼, 인삼 또는 인삼근 포함)을 2 L의 시트레이트 완충액 (pH 4.0)에 용해시킨 다음, 10 g의 나린기아제 (naringiase; Sigma, St Louis, MO) 또는 10 g의 펙티나아제와 함께 38℃에서 이틀간 방치하였다. 2 L의 에틸 아세테이트를 첨가하여 반응 화합물을 추출한 다음 증발시켜 2.8 g의 잔여물을 얻었다. 이 물질에 대하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 시행하여 층화시키고 클로로포름:메탄올 (9:1) 및 클로로포름:메탄올(6:1) 용액에 차례로 함침시켜 정제하여 화합물 K (0.28 g)을 얻었다. 정제된 화합물의 순도는 HPLC로 확인하였다.

실시예 2: 연골세포의 배양

연골세포는 퇴행성 관절염 환자의 관절로부터 다음과 같이 분리하였다: 연 골을 여러 조각으로 잘게 자른 다음 0.2% 프로테아제 타입 XIV (Sigma, St. Louis, MO)으로 1시간 동안 분해한 다음, 0.2% 콜라겐나아제 타입 IA (Sigma)로 3시간 동안 37℃에서 처리하였다. 처리 후, 70 ㎛ 나일론 체를 이용하여 분해되지 않은 연골 단편을 제거하였다. 연골세포를 PBS로 세척한 다음, 10% 우태아 혈청 (FBS; Life Technologies), 100 units/㎖ 페니실린-스트렙토마이신 (Life Technologies) 및 25 g/㎖ L-아스코브산 (Sigma)을 포함하는 DMEM 배지 (Life Technologies Inc., Rockville, MD) 내에서 7일 동안 단층 배양을 하여 유지하였다. 모든 실험은 초기 또는 제1패시지 세포를 이용하여 실시하였다.

실시예 3: IL-1β에 의해 유도되는 MMP -3의 발현 억제 효과 확인

본 발명의 화합물 K가 IL-1β에 의해 유도되는 MMP-3 (matrix metalloproteinase-3)의 발현을 억제하는 지 여부를 다음과 같이 조사하였다.

대조군을 제외한 실험군 연골세포에 2 ng/㎖의 농도로 IL-1β를 처리하였고 이와 동시에 화합물 K를 각각 0, 0.1, 0.5, 1, 2 및 5 μM로 첨가한 다음 48시간 동안 FBS가 없는 DMEM 용액에서 배양하였다. 배양 후 배양 용액을 걷어 MMP-3의 농도를 측정하였다. MMP-3의 측정은 상용화되어 있는 ELISA kit (Biosource international)를 사용하였으며 측정 방법은 제품에 포함되어 있는 대로 시행하였다.

도 1에서 확인할 수 있듯이, IL-1β에 의해 유도되는 MMP-3의 발현은 화합물 K에 의해 농도-의존적으로 (dose-dependent) 감소하였고, 화합물 K의 5 μM 농도에 서 MMP-3의 발현이 거의 완전하게 억제됨을 알 수 있었다.

실시예 4: IL-1β에 의해 유도되는 MMP -13의 발현 억제 효과 확인

본 발명의 화합물 K가 IL-1β에 의해 유도되는 MMP-13 (matrix metalloproteinase-13)의 발현을 억제하는 지 여부를 다음과 같이 조사하였다.

대조군을 제외한 실험군 연골세포에 2 ng/㎖의 농도로 IL-1β를 처리하였고 이와 동시에 화합물 K를 각각 0, 0.1, 0.5, 1, 2 및 5 μM로 첨가한 다음 48시간 동안 FBS가 없는 DMEM 용액에서 배양하였다. 배양 후 배양 용액을 걷어 MMP-3의 농도를 측정하였다. MMP-3의 측정은 상용화되어 있는 ELISA kit (R&D)를 사용하였으며 측정 방법은 제품에 포함되어 있는 대로 시행하였다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, IL-1β에 의해 유도되는 MMP-13의 발현은 화합물 K에 의해 농도-의존적으로 (dose-dependent) 감소하였고, 화합물 K의 5 μM 농도에서 MMP-3의 발현이 거의 완전하게 억제됨을 알 수 있었다.

실시예 5: IL-1β에 의해 유도되는 NO 생성의 억제 효과 확인

본 발명의 화합물 K가 IL-1β에 의해 유도되는 NO (nitric oxide) 생성을 억제하는 지 여부를 따라 다음과 같이 조사하였다.

대조군을 제외한 실험군 연골세포에 2 ng/㎖의 농도로 IL-1β를 처리하였고 이와 동시에 화합물 K를 각각 0, 0.1, 0.5, 1, 2 및 5 μM로 첨가한 다음 48시간 동안 FBS가 없는 DMEM 용액에서 배양하였다. 배양 후 배양 용액을 걷어 그리에스 반응 (Griess reaction)으로 총 NO의 농도를 측정하였다. 그리에스 반응에 사용되는 시약은, 그리에스 시약 A: 5% 인산에 용해된 2% 설파닐아미드, 그리고 그리에스 시약 B: 5% 인산에 용해된 0.2% N-(1-나프틸)-에텔렌 디아민 디하이드로클로라이드의 조성으로 만들어 사용하였다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, IL-1β에 의해 유도되는 NO 생성은 화합물 K에 의해 농도-의존적으로 (dose-dependent) 감소하였고, 화합물 K의 5 μM 농도에서 NO 생성이 거의 완전하게 억제됨을 알 수 있었다.

실시예 6: 화합물 K의 연골세포에 대한 독성 조사

본 발명의 화합물 K가 연골세포에 독성을 나타내는 지를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다:

모두 8군으로 나누어 실험하였는데 대조군에는 화합물 K를 용해하기 위해 사용한 DMSO 용액만을 첨가하였고, 두 번째 군에는 2 ng/㎖ 농도의 IL-1β를 처리하였다. 나머지 6개의 실험군에는 화합물 K를 각각 0.1, 0.5, 1, 2, 5 및 10 μM로 첨가한 다음 96-웰 플레이트에서 48시간 동안 FBS가 없는 DMEM 용액에서 배양하였다. 배양 후 세포의 증식의 정도를 MTT 분석방법으로 측정하였다.

도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 화합물 K는 상기 실시예에서 사용된 농도, 5 μM 까지 연골세포에 대하여 전형 독성을 나타내지 않았고, 더욱이 10 μM 에서도 독성을 나타내지 않았다. 따라서, 상기 실시예에서 확인된 화합물 K의 효과는 독성에 의한 효과가 아니라 실제적인 효과임을 알 수 있고, 또한 본 발명의 화합물 K의 인체 안전성이 우수하다는 것을 알 수 있다.

실시예 7: 진세노사이드의 NO 생성에 미치는 효과 확인

본 발명에서 화합물 K가 아닌 진세노사이드들이 IL-1β에 의해 유도되는 NO 생성을 억제하는 효능이 있는지 여부를 상기 실시예 5와 같은 방법으로 조사하였다. Rb2, Rg1 및 Rg3를 각각 25 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리하였다. 도 5에서 확인할 수 있듯이, IL-1β에 의해 유도되는 NO 생성은 Rb2, Rg1 및 Rg3와 같은 진세노사이드에 의해 조금 억제되는 양상을 나타내었다. 따라서, Rb2, Rg1 및 Rg3와 같은 진세노사이드가 관절염 치료 효과를 나타내기 위해서는 그들의 생체 대사물 (metabolite)인 화합물 K로 전환되어야 바람직하다는 것을 알 수 있다.

또한, 다른 진세노사이드인 Rb1에 대하여도 NO 생성 억제능 실험을 실시하였다. 도 6에서 확인할 수 있듯이, 화합물 K가 효과를 나타내는 낮은 농도에서는 NO 생성 억제능이 거의 관찰되지 않았지만, 25 μM부터 어느 정도 NO 생성을 억제하는 양상을 나타내었다. 따라서 진세노사이들 중에서는, Rb1이 가장 우수한 NO 생성 억제능을 갖는다는 것을 알 수 있다.

실시예 8: 유도성 산화질소 합성효소의 발현 억제 확인

상기 실시예에서 확인한, NO 생성 억제 효과가 유도성 산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase: iNOS)의 발현을 억제하여 이루어지는 것인지를 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 연골세포를 5 X 10⁵ 세포/웰로 6-웰에 플레이팅한 다음, IL-1β, 화합물 K와 Rb1을 각각의 농도로 24시간 처리하고 라이시스 완충액으로 라이시스시킨 다음 상층액만 수집하였다. 세포 분해물 (50 ㎍ 단백질)을 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분리한 후 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 이동시켰다. 5% 스킴 밀크로 블록킹하고 TBST (Tris-buffered saline containing 0.1 Tween 20)에서 1시간 동안 배양한 후 토끼항-iNOS 폴리클로날 항체를 첨가한 후 TBST에서 12시간 동안 배양 하였다. 2시간 동안 2차 항체 (호스래디쉬 퍼옥시다아제-접합 항-토끼 IgG)를 첨가하여 배양한 후 ECL (enhanced chemiluminescence assay)로 시각화하였다.

도 7에서 볼 수 있듯이, 화합물 K는 iNOS의 발현을 억제한다는 것을 알 수 있고, 이러한 억제 효과는 5 μM에서 확연하게 관찰할 수 있었다. 한편, 진세노사이드 Rb1은 200 μM의 고농도에서 iNOS의 발현을 조금 억제하였다.

따라서, 화합물 K의 우수한 NO 생성 억제 효과는 iNOS의 발현을 억제함으로써 이루어진다는 것을 알 수 있다.

실시예 9: TIMP 에 대한 영향 분석

연골 분해 기질 효소인 MMPs에 대하여 길항작용을 한다고 알려진 TIMP (tissue inhibitor of metalloproteinase)의 발현에 대하여 본 발명의 화합물이 미치는 영향을 다음과 같이 조사하였다. 대조군을 제외한 실험군 연골세포에 2 ng/ ㎖의 농도로 IL-1β를 처리하였고 이와 동시에 화합물 K를 각각 0, 0.1, 0.5, 1, 2 및 5 μM로 첨가한 다음 48시간 동안 FBS가 없는 DMEM 용액에서 배양하였다. 배양 후 배양 용액을 걷어 TIMP-1의 농도를 측정하였다. TIMP-1의 측정은 상용화되어 있는 ELISA kit (R&D)를 사용하였으며 측정 방법은 제품에 포함되어 있는 프로토콜에 따라 실시하였다.

실시예 10: MAP 키나아제에 대한 영향 분석

연골세포 기질 분해 효소인 MMPs의 증가, 연골세포의 아폽토시스를 매개하는 중간 신호전달체로 알려져 있는 MAP 키나아제 (mitogen activated protein kinase: MAP kinase)의 활성화에 대하여 본 발명의 화합물이 미치는 영향을 웨스턴 블롯팅으로 다음과 같이 분석하였다. 조사 대상의 MAP 키나아제는 p38 MAP 키나아제 (p38 mitogen activated protein kinase), 세포외 신호-조절 단백질 키나아제 (extracellular signal-regulated protein kinase: ERK 1/2) 및 c-Jun N-말단 키나아제 (c-Jun N-terminal kinase: JNK)이다.

연골세포를 5 X 10⁵ 세포/웰로 6-웰에 플레이팅한 다음 IL-1β 2 ng/ml, 화합물 K 2 μM, 5 μM 농도로 30분간 처리하고 라이시스 완충액으로 라이시스시킨 다음 상층액을 수집하였다. 세포 분해물 (50 ㎍ 단백질)을 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분리한 후 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 이동시켰다. 5% 스킴 밀크로 블록킹하고 TBST (Tris-buffered saline containing 0.1 Tween 20)에서 1시간 동안 배양한 후 토끼 항-p38, phospho-p38, ERK, phospho-ERK, JNK 및 phospho-JNK 항체를 첨가한 후 TBST에서 12시간 동안 배양 하였다. 2시간 동안 2차 항체 (호스래디쉬 퍼옥시다아제-접합 항-토끼 IgG)를 첨가하여 배양한 후 ECL (enhanced chemiluminescence assay)로 시각화하였다.

도 8에서 볼 수 있듯이, 화합물 K는 상기 MAP 키나아제 패밀리의 활성화를 효과적으로 억제한다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 관절염 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 종래의 관절염 치료제와는 달리, 관절염 발전의 원인으로 알려져 있는 (ⅰ) 연골세포 기질 분해효소인 MMP-3 및 MMP-13의 발현을 억제하고, (ⅱ) NO 합성효소의 발현을 방해하여 NO의 생성을 억제하며, (ⅲ) 연골세포 기질 분해 효소인 MMPs의 증가와 연골세포의 아폽토시스를 매개하는 MAP 키나아제의 활성화 (즉, 인산화)를 효과적으로 차단함으로써 근본적인 치료 기전을 가지기 때문에 관절염 치료에 매우 유효하다. 더욱이, 본 발명의 약제학적 조성물에서 이용되는 유효성분은 매우 낮은 농도 (μM 수준)에서도 상술한 효능을 발휘하기 때문에, 최종적으로 의약으로 개발하는 데에 매우 유리하다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 생체에 대하여 독성을 나타내지 않아 매우 안전하다.

Claims (6)

1. (a) 유효 성분으로서 다음 화학식 1의 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙스아디올 (20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol) 2.0 μM - 5.0 μM; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고,

   화학식 1의 화합물이 연골세포에서 MMP-3 및 MMP-13의 발현을 억제하며, p38 MAP 키나아제, ERK 1/2 및 JNK의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 약제학적 조성물 :

   화학식 1

   
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6. 제 1 항에 있어서, 상기 관절염은 골관절염인 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 약제학적 조성물.

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