KR100739448B1 - Ｌ-카르노신 및 그 유도체의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

항산화제 및 노화방지제로서 유용한 L-카르노신 및 그 유도체를 별도의 정제과정 없이 간편하게 고순도 및 고수율로 합성할 수 있는 방법이 개시된다. 상기 L-카르노신 및 그 유도체의 제조방법은 베타-알라닌을 보호기로 보호하고, 산무수물화 시키는 과정; 유기용매에 L-히스티딘을 용해시키는 과정; 상기 보호기로 보호된 베타-알라닌 산무수물과 상기 유기용매에 용해된 L-히스티딘을 반응시키는 과정; 및 상기 반응의 반응액에 산성화제를 첨가하는 과정을 포함한다.
L-카르노신, 산무수물, 실릴화제, 베타-알라닌, L-히스티딘

Description

Ｌ-카르노신 및 그 유도체의 제조 방법{Method for producing L-carnosine and derivatives thereof}
본 발명은 L-카르노신으로 명명된 베타-알라닐-L-히스티딘 및 그 유도체의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항산화제 및 노화방지제로서 유용한 L-카르노신 및 그 유도체를 별도의 정제과정 없이 간편하게 고순도 및 고수율로 합성할 수 있는 L-카르노신 및 그 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.
L-카르노신(베타-알라닐-L-히스티딘)은 척추동물의 근육에 존재하는 펩타이드로서 항산화제 및 노화방지제로 사용되고 있으며, 그 제조방법으로 베타-요오드프로피오닐클로라이드와 L-히스티딘을 반응시킨 후, 암모니아로 처리하여 합성하는 방법(L. Baumann, et al., J. Biol. Chem., 35, 263 (1918)), 베타카르보벤즈옥시프로피오닐 아자이드와 L-히스티딘 메틸에스테르를 반응시킨 후, 디에스테르화 반응 및 탈보호기 반응으로 합성하는 방법(R. Siffered, et al., J. Biol. Chem., 108, 753 (1935)) 등이 오래전부터 공지되었다.
J. Am. Chem. Soc., 75, 2388(1953)는 수용액상에서 베타-프탈로일알라닐 클로라이드와 L-히스티딘을 반응시켜 L-카르노신을 합성하는 방법을 개시하고 있으나, 이와 같은 방법은 출발 원료로 사용되는 베타-프탈로일알라닐 클로라이드를 얻기 위하여 베타-프탈로일알라닐과 티오닐클로라이드 등의 염소화제를 염소화 반응시켜야 하는데, 이때 다량의 염산가스가 발생되고, 사용한 유기 용매를 제거시켜야 하는 단점이 있다. 또한, 상기 베타-프탈로일알라닐 클로라이드의 수분에 대한 불안정성은 수용액상에서 L-히스티딘과의 반응성을 저하시키기 때문에, 과량의 베타-프탈로일알라닐 클로라이드를 사용하고도 L-카르노신의 수율이 낮은 문제점이 있다.
또한 J. Org. Chem., 229, 1968(1964)은 수용액상에서 베타-프탈로일알라닐의 혼합 무수물과 L-히스티딘을 반응 시킨 후, 탈보호기 반응을 거쳐 L-카르노신을 합성하는 방법을 개시하고 있으나, 상기 베타-프탈로일알라닐의 혼합 무수물도 수분에 매우 불안정하기 때문에, 수용액에서의 반응성이 저하되어 수율이 낮은 문제점이 있다. 미국특허 제4,359,416호에는 pH 8.5 내지 9.5의 수용액상에서 테트라히드로-1,3-티아진-2,4-디온과 L-히스티딘을 반응시켜 L-카르노신을 합성하는 방법이 개시되어 있으나, 상기 방법은 복잡한 합성 경로를 통하여 핵심원료인 테트라히드로-1,3-티아진-2,4-디온을 얻어야 하며, 과량의 테트라히드로-1,3-티아진-2,4-디온을 사용하고도, L-카르노신의 수율이 낮은(79%) 문제점이 있다.
이와 같이, L-카르노신은 일반적으로 수용액상에서의 아실화 반응에 의하여 제조되고 있으나, 이 방법은 수율 증대를 위해 진공 농축으로 물을 제거하는 번거로운 과정이 필요하며, 고온에서 장시간 진공 농축시 탄화로 인한 착색과 불순물이 생성되는 문제점이 있다.
따라서 본 발명의 목적은 고순도의 목적화합물을 고수율 및 대량으로 얻을 수 있는 L-카르노신 및 그 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 별도의 정제과정을 거치지 않고, 목적화합물을 간단히 얻을 수 있는 L-카르노신 및 그 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 베타-알라닌을 보호기로 보호하고, 산무수물화 시키는 과정; 유기용매에 L-히스티딘을 용해시키는 과정; 상기 보호기로 보호된 베타-알라닌 산무수물과 상기 유기용매에 용해된 L-히스티딘을 반응시키는 과정; 및 상기 반응의 반응액에 산성화제를 첨가하는 과정을 포함하는 L-카르노신 및 그 유도체의 제조방법을 제공한다. 여기서, 상기 L-히스티딘의 용해는 유기용매 중에서 L-히스티딘에 실릴화제를 첨가하여 실릴화 반응시킴으로서 수행되거나, 물 및 염기를 포함하는 유기용매에 L-히스티딘을 첨가하고 교반하여 수행되는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 L-카르노신 및 그 유도체를 제조하는데 있어서, 하기 화학식 2로 표시되는 베타-알라닌을 보호기로 보호 및 산무수물화 시키고, 유기용매에 하기 화학식 3으로 표시되는 L-히스티딘을 용해시킨 후, 상기 보호기로 보호된 베타-알라닌 산무수물과 유기용매에 용해된 L-히스티딘을 반응시키고, 산성화제를 첨가하여 L-카르노신 또는 그 유도체를 석출시키는 과정을 이용한다.
Figure 112005064813214-pat00001
Figure 112005064813214-pat00002
Figure 112005064813214-pat00003
본 발명에 따라 L-카르노신 및 그 유도체를 제조하기 위해서는, 먼저 염기 존재 하에서, 베타-알라닌과 메틸아세토아세테이트, 에틸아세토아세테이트, 프탈릭안하이드라이드 등을 반응시켜, 베타-알라닌의 아민기를 보호시킨다. 이와 같이, 보호기로 보호된 베타-알라닌은 하기 화학식 4로 표시될 수 있다.
Figure 112005064813214-pat00004
상기 화학식 4에서, R1은 프탈로일(phthaloyl), =C(CH3)CH2COOEt 또는 =C(CH3)CH2COOMe이고, R2는 K, Na, Li 등의 알카리 금속 또는 수소화된(protonated) 트리에틸아민 등의 염기이다.
상기 메틸아세토아세테이트, 에틸아세토아세테이트 또는 프탈릭안하이드라이드는 베타-알라닌의 아민기와 결합하여, 엔아민(enamine) 또는 프탈이미드를 형성함으로서, 아민기를 보호하는 것으로서, 이들의 사용량은 베타-알라닌에 대하여 몰비로 0.9 내지 2 배인 것이 바람직하다. 만일 상기 화합물의 사용량이 베타-알라닌에 대하여 0.9배 미만이면 반응 생성물에 다량의 미반응 베타-알라닌이 잔류할 우려가 있고, 2배를 초과하면 반응 생성물에 프탈릭안하이드라이드와 같은 보호기 물질이 다량 잔류할 우려가 있다.
상기 아민기의 보호 반응에 사용되는 염기로는, 알칼리 금속(K, Na, Li 등) 의 탄산수소염, 탄산염, 또는 수산화물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬기(메틸, 에틸, 프로필, t-부틸 등)로 치환된 2급 또는 3급 아민, 이에 상응하는 4급 암모늄염, 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다. 상기 염기의 구체적인 예로는 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 디메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민 등을 예시할 수 있다. 상기 염기의 사용량은 베타-알라닌 1몰에 대하여, 몰비로 0.2 내지 2배이며, 만일 상기 염기의 사용량이 0.2배 미만이면 아실화 반응 시 부산물이 생성될 우려가 있고, 2배를 초과하면 반응 색상이 붉은 색으로 착색되는 문제가 있다. 상기 보호기 형성 반응은 메탄올, 이소프로판올, 톨루엔 등의 유기용매 중에서 수행될 수 있으며, 상기 유기용매의 사용량은 베타-알라닌 1중량부 당 약 1 내지 100중량부인 것이 바람직하다. 상기 유기용매의 사용량이 1중량부 미만이면 반응성이 저하되어 미반응 물질이 다량 잔류할 우려가 있고, 100 중량부를 초과하면 감압 농축 시 많은 시간이 소요되는 문제가 있다. 상기 보호기 형성 반응의 반응온도는 통상 사용되는 용매의 비점 온도 정도인 것이 바람직하고, 반응 시간은 통상 2 내지 5시간이다.
다음으로, 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 염기가 존재하는 유기용매 중에서, 상기 보호기로 보호된 베타-알라닌을 산 할라이드와 반응시켜, 보호기로 보호된 베타-알라닌 산무수물을 제조한다.
Figure 112005064813214-pat00005
상기 반응식 1에서, R1 및 R2는 상기 화학식 4에서 정의한 바와 같으며, X는 할로겐 원자이고, Y는 탄소수 1 내지 7, 바람직하게는 2 내지 5의 저급 알킬 또는 알콕시기이다.
상기 산 할라이드의 할로겐 원자(X)로는 염소, 브롬, 요오드 원자 등을 예시할 수 있고, 상기 산 할라이드의 구체적인 예로는 피발로일클로라이드, 에틸클로로포르메이트, 트리메틸아세틸클로라이드, 2-클로로프로피오닐클로라이드, 2-에틸헥사노일클로라이드 등을 예시할 수 있다. 상기 산 할라이드의 사용량은 보호된 베타-알라닌 1몰에 대하여 0.1 내지 50몰, 바람직하게는 0.5 내지 50몰, 더욱 바람직하게는 0.9 내지 10몰이며, 보호된 베타-알라닌과 산 할라이드가 등몰량으로 사용되면 가장 바람직하다. 상기 산 할라이드의 사용량이 1몰 미만이면 수율이 저하되고, 50몰을 초과하면 더 이상의 수율의 증가는 없고, 다량의 부산물이 생성될 우려가 있다.
상기 베타-알라닌의 산무수물화 반응에 사용되는 유기용매로는 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤, 메틸포르메이트, 에틸아세테이트 등의 에스테르, 디에틸에테 르, 테트라하이드로푸란 등의 에테르, 디클로로메탄(메틸렌클로라이드), 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소, 아세토니트릴 등의 니트릴, 메탄올, 에탄올 등의 저급 알코올, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드 등의 아미드, 이들의 혼합물 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는 할로겐화 탄화수소 및 에테르를 사용할 수 있다. 상기 유기용매의 사용량은 베타-알라닌 1중량부에 대하여 1 내지 1,000중량부, 바람직하게는 5 내지 100중량부이다. 상기 유기용매의 사용량이 1중량부 미만이면 반응점도가 높아져, 교반이 어렵고, 반응성이 저하될 우려가 있고, 1,000중량부를 초과하면 반응 부피가 커져 생산성이 저하되는 문제가 있다.
상기 베타-알라닌의 산무수물화 반응에 사용되는 염기로는 피리딘, 2,6-루티딘, 트리에틸아민, 이들의 혼합물 등을 예시할 수 있으며, 상기 염기의 사용량은 보호된 베타-알라닌에 대하여 몰비로 0.5 내지 2배이다. 상기 염기의 사용량이 0.5배미만이면 반응성이 저하될 우려가 있고, 2배를 초과하면 부반응 물질이 생성되어 수율이 저하될 우려가 있다. 또한, 상기 보호기 형성 반응에서 염기가 사용되어, 반응액에 염기가 잔류하는 경우에는, 별도로 염기를 추가할 필요가 없다. 상기 산무수물화 반응의 반응온도는 통상 -50℃ 내지 50℃, 바람직하게는 -30℃ 내지 25℃이고, 반응 시간은 0.1 내지 12시간, 바람직하게는 0.1 내지 8시간이다.
다음으로, 유기용매에 L-히스티딘을 용해시킨다. 상기 L-히스티딘의 용해는 유기용매 중에서 L-히스티딘에 실릴화제를 첨가하여 실릴화 반응시키거나, 물 및 염기를 포함하는 유기용매에 L-히스티딘을 첨가하고 교반함으로서 수행될 수 있다.
L-히스티딘의 용해를 위하여 실릴화 반응을 사용하는 경우, 실릴화 반응을 위한 실릴화제로는 디메틸디클로로실란, 트리메틸클로로실란, 헥사메틸디실라잔, N,O-비스트리메틸실릴아세트아미드(BSA), 이들의 혼합물 등을 예시할 수 있다. 상기 실릴화제의 사용량은 L-히스티딘 1몰에 대하여 0.5 내지 50몰인 것이 바람직하며, 1 내지 10몰이면 더욱 바람직하다. 이때, 상기 실릴화제의 사용량이 0.5몰 미만이면 실릴화 되지 않은 L-히스티딘이 잔류할 우려가 있고, 50몰을 초과하면 수율이 감소될 우려가 있다.
상기 실릴화 반응의 유기용매로는 상기 산무수물화 반응에 사용된 유기용매를 사용할 수 있으며, 구체적으로는 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤, 메틸포르메이트, 에틸아세테이트 등의 에스테르, 디에틸에테르, 테트라하이드로푸란 등의 에테르, 디클로로메탄(메틸렌클로라이드), 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소, 아세토니트릴 등의 니트릴, 메탄올, 에탄올 등의 저급 알코올, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드 등의 아미드, 디메틸설폭사이드, 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다. 상기 실릴화 반응에 사용되는 유기용매의 사용량은 상기 L-히스티딘 1 중량부에 대하여 1 내지 100중량부, 바람직하게는 5 내지 20중량부이다. 상기 유기용매의 사용량이 1중량부 미만이면 L-히스티딘의 용해성이 저하될 우려가 있고, 100중량부를 초과하면 과량의 용매 사용으로 인하여 생산성이 저하될 우려가 있다.
필요에 따라, 상기 실릴화 반응은 염기의 존재 하에서 수행될 수 있으며, 상기 실릴화 반응의 염기로는 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬기(메틸, 에틸, 프로필, t-부틸 등)로 치환된 2급 또는 3급 아민, 이에 상응하는 4급 암모늄염 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 염기가 사용될 경우, 그 사용량은 L-히스티딘 1몰에 대하여 1 내지 100몰, 바람직하게는 1 내지 10몰이며, 상기 염기의 사용량이 1몰 미만이면 L-히스티딘의 용해성이 저하될 우려가 있고, 100몰을 초과하면 반응액의 색상이 착색될 우려가 있다. 상기 실릴화 반응의 반응온도는 통상 -10 내지 110℃, 바람직하게는 10 내지 70℃이고, 반응시간은 반응온도, L-히스티딘의 농도 및 혼합된 용매의 양에 따라 달라지지만, 일반적으로 0.1 내지 4시간, 바람직하게는 1 내지 5시간이다.
L-히스티딘을 용해시키기 위하여, 물 및 염기를 포함하는 유기용매에 L-히스티딘을 첨가하고 교반하는 경우, 상기 물의 사용량은 L-히스티딘 1 중량부에 대하여 0.1 내지 10중량부인 것이 바람직하고, 0.5 내지 2중량부이면 더욱 바람직하다. 상기 물의 사용량이 0.1중량부 미만이면 L-히스티딘의 용해성이 저하될 우려가 있고, 10중량부를 초과하면 과량의 물로 인해 산무수물이 분해될 우려가 있다. 상기 L-히스티딘의 용해에 사용되는 유기용매로는 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤, 메틸포르메이트, 에틸아세테이트 등의 에스테르, 디에틸에테르, 테트라하이드로푸란 등의 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소, 아세토니트릴 등 의 니트릴, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드 등의 아미드, 디메틸설폭사이드, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 알코올을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 디클로로메탄, 테트라하이드로푸란, 이소프로판올, 아세토니트릴 등을 사용할 수 있다. 상기 유기용매의 사용량은 상기 L-히스티딘 1중량부에 대하여 1 내지 100중량부, 바람직하게는 2 내지 20중량부이다. 상기 유기용매의 사용량이 1중량부 미만이면 L-히스티딘의 용액 점도가 커져서 반응액 이송이 어려워질 우려가 있고, 100중량부를 초과하면 L-히스티딘이 재석출되어 반응성이 저하될 우려가 있다.
상기 L-히스티딘의 용해를 위한 유기용매에 첨가되는 염기로는 아민 화합물, 예를 들면, 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬기(메틸, 에틸, 프로필, t-부틸 등)로 치환된 2급 또는 3급 아민, 이에 상응하는 4급 암모늄염 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 특히 L-히스티딘의 용해성이 우수한 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운데센-7 등을 사용하면 바람직하다. 상기 염기의 사용량은 L-히스티딘 1몰에 대하여 0.1 내지 50몰인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 10몰이다. 상기 염기의 사용량이 0.1몰 미만이면 용해성이 저하되기 때문에 수율이 낮으며, 50몰을 초과하면 용해 색상이 갈색으로 착색될 우려가 있고, 부산물의 생성량이 증가하여 순도가 저하될 우려가 있다. 물 및 염기를 포함하는 유기용매에 L-히스티딘을 용해시키는 경우, 반응액의 온도는 통상 -50 내지 50℃, 바람직하게는 -20 내지 30℃이다.
상기 베타-알라닌 산무수물의 제조 및 L-히스티딘의 용해가 완료되면, 상기 보호기로 보호된 베타-알라닌 산무수물과 상기 유기용매에 용해된 L-히스티딘을 하기 반응식 2와 같이 반응시켜 목적화합물인 L-카르노신 및 그 유도체를 제조할 수 있다.
Figure 112005064813214-pat00006
상기 반응식 2에서, R1은 프탈로일(phthaloyl), =C(CH3)CH2COOEt 또는 =C(CH3)CH2COOMe이며, Y는 탄소수 1 내지 7, 바람직하게는 2 내지 5의 저급 알킬 또는 알콕시기이다.
상기 반응식 2에서, 상기 보호기로 보호된 베타-알라닌 산무수물의 사용량은 L-히스티딘 1몰에 대하여 1 내지 10몰, 바람직하게는 1 내지 5몰이다. 상기 베타-알라닌 산무수물의 사용량이 1몰 미만이면 수율이 낮아지고, 10몰을 초과하면 수득된 L-카르노신 및 그 유도체에 과량의 베타-알라닌이 잔류되어 순도가 저하될 우려가 있다. 상기 반응의 반응온도는 통상 -70 내지 50℃, 바람직하게는 -40 내지 25℃이며, 반응시간은 반응온도, 반응물의 농도 및 혼합된 산무수물의 양에 따라 달라지지만, 일반적으로 0.1 내지 24시간이고, 바람직하게는 1 내지 8시간이다.
이와 같이, 상기 보호된 베타-알라닌 산무수물과 L-히스티딘의 반응이 완료되면, 상기 반응의 반응액에 산성화제를 첨가하여, L-카르노신 또는 그 유도체를 결정화시킨다. 구체적으로, 산성화제를 첨가하여 반응액의 pH를 4 내지 9로 조절하면 아민기가 보호된 L-카르노신의 유도체 결정을 얻을 수 있다. 또한 산성화제를 첨가하여 상기 반응액의 pH를 0.5 내지 2로 조절함으로서, L-카르노신 유도체의 아민 보호기를 제거하고, 다시 반응액의 pH를 7 내지 9로 조절하면 보호기가 제거된 L-카르노신 결정을 얻을 수 있다. 여기서, 상기 산성화제로는 염산, 황산, 질산, 초산, 젖산, 2-에틸헥사노익산, 주석산, 구연산, 인산, 메탄술폰산, 파라톨루엔술폰산, 포름산, 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있으며, 상기 반응액의 pH를 증가시키기 위한 염기로는 암모니아수 또는 아민 화합물, 예를 들면, 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬기(메틸, 에틸, 프로필, t-부틸 등)로 치환된 2급 또는 3급 아민, 이에 상응하는 4급 암모늄염 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 L-카르노신 및 그 유도체의 결정성을 양호하게 하고, 수율을 향상시키기 위하여, 상기 산성화제가 첨가된 반응액에 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 등의 알코올, 아세톤, 메틸이소부틸케톤 등의 케톤, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, n-부틸아세테이트 등의 에스테르, N,N-디메틸포름아미드 등의 아미드, 아세토니트릴 등의 니트릴, 메틸셀로솔브, 에틸셀로솔브, 테트라하이드로푸란 등의 에테르 등의 결정화 유기용매를 더욱 첨가할 수 있다. 상기 결정화 유기용 매는 단독 또는 혼합물 형태로 사용할 수 있으며, 그 사용량은 2 내지 20 중량부인 것이 바람직하다. 상기 결정화 용매의 사용량이 너무 작으면 목적물의 결정화를 충분히 향상시킬 수 없고, 너무 많으면 특별한 이익이 없이 경제적으로 바람직하지 못하다. 이와 같이 결정화된 L-카르노신 또는 그 유도체를 포함하는 반응액을 0 내지 10℃로 냉각하고, 생성된 결정체를 여과, 세척하여, 양호한 결정성의 L-카르노신 및 그 유도체를 고순도, 고수율로 얻을 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 보호된 베타-알라닌 산무수물의 제조
500ml 3구 플라스크에 메탄올 200ml 및 수산화칼륨 12g을 넣은 후, 수산화칼륨을 완전히 용해시킨 다음, 베타-알라닌 18g을 넣고 용해시켰다. 베타-알라닌의 용해가 완료된 후, 에틸아세토아세테이트 27.5ml을 첨가하고 2시간 동안 환류시켰다. 반응이 진행됨에 따라 생성되는 물을 딘스탁 트랩으로 받고, 반응이 완료되면 감압 농축하여 반응 용매를 제거하였다. 생성된 반응물을 메틸렌클로라이드 170ml 및 N,N-디메틸아세트아미드 20ml에 넣어 용해시킨 후, -20℃로 냉각하고 피리딘 2ml 및 피발로일클로라이드 25ml를 30분 동안 서서히 적가하였다. 적가 후, 상기 온도에서 1시간 동안 교반한 다음 -25℃로 냉각시켜 =C(CH3)CH2COOEt로 보호된 베타 -알라닌 산무수물을 제조하였다.
[실시예 2] 보호된 베타-알라닌 산무수물의 제조
500ml 3구 플라스크에 프탈릭안하이드라이드와 베타-알라닌을 반응시켜 제조한 프탈로일-베타-알라닌 2.2g을 넣고, 메틸렌클로라이드 10ml와 N,N-디메틸아세트아미드 4ml를 넣어 용해시킨 후, -20℃로 냉각하고, 피리딘 0.1ml 및 피발로일클로라이드 1.2ml를 30분 동안 서서히 적가하였다. 적가 후, 상기 온도에서 1시간 동안 교반하여 프탈로일기로 보호된 베타-알라닌 산무수물을 제조하였다.
[실시예 3] 보호된 베타-알라닌 산무수물부터 L- 카르노신의 제조
500ml 3구 플라스크에 L-히스티딘 20g, 메틸렌클로라이드 80ml, N,N-디메틸포름아미드 80ml 및 N,O-비스트리메틸실릴아세트아미드(BSA) 40ml를 넣은 후, 서서히 승온하여 40 내지 50℃에서 L-히스티딘을 용해시켰다. 용해된 L-히스티딘을 상기 실시예 1에서 제조된 베타-알라닌 산무수물에 30분 동안 적가한 후, -20 내지 10℃에서 4시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응물에 진한 염산을 가하여 반응물의 pH를 1.8로 조절하고, 20분간 교반하였다. 다음으로, 트리에틸아민을 첨가하여 반응물의 pH를 8.0으로 유지시킨 후, 이소프로판올 200ml를 넣고, 5℃에서 3시간동안 서서히 교반하여 결정을 생성시켰다. 생성된 결정을 여과하여 이소프로판올과 아세톤으로 순차적으로 세척한 후, 건조시켜 L-카르노신 29g을 얻었다.
[실시예 4] 보호된 베타-알라닌 산무수물부터 L- 카르노신의 제조
500ml 3구 플라스크에 L-히스티딘 20g, 메틸렌클로라이드 40ml, 이소프로판올 40ml 및 물 10ml를 넣고 5℃로 냉각하였다. 상기 혼합물에 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운데센-7 40ml을 넣고 30분간 교반하여 L-히스티딘을 용해시켰다. 용해된 L-히스티딘을 상기 실시예 1에서 제조된 베타-알라닌 산무수물에 30분 동안 적가한 후, -40 내지 -20℃에서 4시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응물에 진한 염산을 가하여 반응물의 pH를 1.8로 조절하고, 20분간 교반하였다. 다음으로, 트리에틸아민을 첨가하여 반응물의 pH를 8.0으로 유지시킨 후, 이소프로판올 200ml를 넣고, 5℃에서 3시간 동안 서서히 교반하여 결정을 생성시켰다. 생성된 결정을 여과하여 이소프로판올과 아세톤으로 순차적으로 세척한 후, 건조시켜 L-카르노신 28g을 얻었다.
[실시예 5] 보호된 베타-알라닌 산무수물부터 프탈로일 -L- 카르노신의 제조
500ml 3구 플라스크에 L-히스티딘 1.1g, 이소프로판올 2.2ml, 메틸렌클로라이드 2.2ml, 및 물 0.6ml을 넣고 5℃로 냉각하였다. 상기 혼합물에 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운데센-7 2.2ml을 넣고 30분간 교반하여 L-히스티딘을 용해시켰다. 용해된 L-히스티딘을 상기 실시예 2에서 제조된 프탈로일기로 보호된 베타-알라닌 산무수물에 30분 동안 적가한 후, -40 내지 -20℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응물에 진한 염산을 가하여 반응물의 pH를 5.0로 조절하고 20분간 교반하였다. 다음으로 반응물에 이소프로판올 30ml를 넣고, 5℃에서 3시간 동안 서 서히 교반하여 결정을 생성시켰다. 생성된 결정을 여과하여 이소프로판올과 아세톤으로 순차적으로 세척한 후, 건조시켜 프탈로일-L-카르노신 2.2g을 얻었다.
[실시예 6] 보호된 베타-알라닌 산무수물로부터 프탈로일 -L- 카르노신의 제조
500ml 3구 플라스크에 L-히스티딘 1.1g, 메틸렌클로라이드 4.4ml, N,N-디메틸포름아미드 4.4ml 및 N,O-비스트리메틸실릴아세트아미드(BSA) 2.2ml를 넣고 서서히 승온하여 40 내지 50℃에서 L-히스티딘을 용해시켰다. 용해된 L-히스티딘을 상기 실시예 2에서 제조한 프탈로일기로 보호된 베타-알라닌 산무수물에 30분 동안 적가한 후, -40 내지 10℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료되면 반응물에 진한 염산을 가하여 반응물의 pH를 5.0으로 조절하고 20분간 교반하였다. 다음으로 반응물에 이소프로판올 30ml를 넣고, 5℃에서 3시간 동안 서서히 교반하여 결정을 생성시켰다. 생성된 결정을 여과하여 이소프로판올과 아세톤으로 순차적으로 세척한 후, 건조시켜 프탈로일-L-카르노신 2.0g을 얻었다.
이상 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 L-카르노신 및 그 유도체의 제조방법은 무수 반응 또는 물의 사용량이 최소화된 반응을 이용하기 때문에, 보호기로 보호된 베타-알라닌 산무수물의 물에 대한 불안정성 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 과량의 물을 제거하기 위한 감압 농축 등의 별도의 과정을 거치지 않아도 된다. 즉, 보호기로 보호된 베타-알라닌 산무수물의 사용량을 최소로 하면서도, 산 성화제 첨가 및 결정화 용매 첨가과정을 통하여 고순도, 고수율의 L-카르노신 및 그 유도체를 간단하고, 안정적으로 대량 생산할 수 있다.

Claims (7)

  1. 베타-알라닌을 =C(CH3)CH2COOEt 또는 =C(CH3)CH2COOMe 보호기로 보호하고, 산무수물화 시키는 과정;
    아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸포르메이트, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 테트라하이드로푸란, 디클로로메탄, 클로로포름, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 디메틸설폭사이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기용매에 L-히스티딘을 용해시키는 과정;
    상기 보호기로 보호된 베타-알라닌 산무수물과 상기 유기용매에 용해된 L-히스티딘을 반응시키는 과정; 및
    상기 반응의 반응액에 염산, 황산, 질산, 초산, 젖산, 2-에틸헥사노익산, 주석산, 구연산, 인산, 메탄술폰산, 파라톨루엔술폰산, 포름산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 산성화제를 첨가하는 과정을 포함하는 L-카르노신 및 상기 보호기가 결합된 그 유도체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 L-히스티딘의 용해는 상기 유기용매 중에서 L-히스티딘에 N,O-비스트리메틸실릴아세트아미드(BSA) 실릴화제를 첨가하여 실릴화 반응시킴으로서 수행되는 것인 L-카르노신 및 상기 보호기가 결합된 그 유도체의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 L-히스티딘의 용해는 물 및 1,8-디아자비시클로[5,4,0]운데센-7 염기를 포함하는 상기 유기용매에 L-히스티딘을 첨가하고 교반하여 수행되는 것인 L-카르노신 및 상기 보호기가 결합된 그 유도체의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서, 상기 물의 사용량은 L-히스티딘 1 중량부에 대하여 0.1 내지 10중량부이고, 상기 유기용매의 사용량은 상기 L-히스티딘 1중량부에 대하여 1 내지 100중량부인 것인 L-카르노신 및 상기 보호기가 결합된 그 유도체의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 산성화제가 첨가된 반응액에 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 메틸이소부틸케톤, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, n-부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 메틸셀로솔브, 에틸셀로솔브, 테트라하이드로푸란 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정화 유기용매를 첨가하는 과정을 더욱 포함하는 L-카르노신 및 상기 보호기가 결합된 그 유도체의 제조방법.
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