KR100663785B1 - 캐피어 그레인으로부터 분리된 신균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 캐피어 그레인(kefir grain)으로부터 분리, 동정된 유산균 신균주에 관한 것으로서, 장기간 보존시 생존율이 높고, 다당 생성능이 뛰어나 고품질의 캐피어를 제조할 수 있다.
캐피어, 배양, 생균수, 유산균, 효모, 신균주
Description
도 1은 캐피어 그레인으로부터 분리 동정된 신균주 Leuconostoc sp.(1), Lactobacillus sp.(2)의 MRS agar(A), ROGOSA agar(B) plate 상에서의 배양성상을 나타낸 사진이다.
도 2는 16S rRNA 서열에 기초하여 류코노스톡 종의 전형적인 균주와 다른 관련 있는 분류군의 대표적인 균주, 본 발명의 신균주 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1(KCTC 10724BP)의 위치를 나타내는 계통도. 스케일 바는 뉴클레오타이드 위치당 0.01의 치환을 나타낸다.
도 3은 16S rRNA 서열에 기초하여 락토바실러스 종의 전형적인 균주와 다른 관련 있는 분류군의 대표적인 균주, 본 발명의 신균주 락토바실러스 케피리 (Lactobacillus kefiri) R-1(KCTC 10725BP)의 위치를 나타내는 계통도. 스케일 바는 뉴클레오타이드 위치당 0.01의 치환을 나타낸다.
본 발명은 캐피어 그레인(kefir grain)으로부터 분리, 동정된 유산균 신균주에 관한 것으로서, 장기간 보존시 생존율이 높고, 다당 생성능이 뛰어나 고품질의 캐피어를 제조할 수 있다.
캐피어는 변비 환자나 위장 장애가 있는 환자가 섭취하는 건강기능식품으로서 유산균의 생균수와 유산균이 생산하는 다당인 케퍼란(kefiran)의 함량이 매우 중요하다.
캐피어는 우유에 유산균과 효모 복합체가 자라면서 발효된 제품으로 티벳지방에서 유래되었다. 균체 복합체가 덩어리(grain)를 형성하기 때문에 일명 티벳버섯으로 잘 알려져 있다. 이러한 캐피어(kefir)는 인체에 유익한 유산균을 포함하고 있어 정장작용을 도와 변비를 억제하고 위장장애를 개선하는 데 크게 도움이 된다. 또한, 면역기능을 강화하고 항암 작용을 하는 것으로도 널리 알려져 있다 (Phytotherapy research, 8:78-82, 1994; Kor. J. Ann. Sci. 41 (1) 39-44, 1999; J. Nutr. 131:807-812, 2001).
일반적으로 캐피어는 가정에서 캐피어 그레인과 우유를 이용하여 개별적으로 배양, 섭취하는 사례가 많았다. 그러나, 이러한 경우 다른 균체의 오염으로 인한 위생상의 문제나 온도 및 시간 등 발효 조건의 변화에 따른 제품의 상태가 변하는 문제점이 있다. 일반적으로 유산균 제품의 경우 유산균의 생균수를 높게 유지하는 방법이 매우 중요하다. 발효된 액상 요구르트 제품의 경우 낮은 pH 영역(4∼4.5)으로서, 시간이 경과함에 따라 생균수가 급격히 줄어들기 때문에 제한된 시간 내에 섭취해야 하는 단점이 있다.
이러한 점을 개선하기 위하여 일정한 조건에서 캐피어를 제조한 후 동결건조하여 캐피어 분말을 제조하는 방법도 공개되었다(대한민국특허 공개번호 1987-0003704). 그러나 대부분의 경우 유산균은 상온에서 보관시 수개월 내에 생균수가 반 이하로 줄어드는 단점이 있다.
본 발명의 목적은 유산균과 효모 복합체인 캐피어 그레인을 사용하여 우유를 발효시킨 캐피어(kefir) 분말을 제조함에 있어 캐피어에 존재하는 유산균과 효모를 분리동정하여 균주의 특성을 밝히고, 유산균과 효모 생균수를 장기간 고농도로 유지할 수 있는 신규 유산균주를 제공하려는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 다수개의 캐피어 그레인으로부터 다당 생성능이 뛰어난 캐피어 그레인을 선발하고, 선발된 캐피어 그레인으로부터 통상의 다른 캐피어 그레인에서 분리된 균주와 다른 특성을 갖는 균주를 분리동정하여 그 특성을 밝혔다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
캐피어 그레인은 대전과 충청남도 지역 민가에서 소지한 캐피어 그레인을 분양받아 멸균수로 세척한 후 우유에 2%씩 접종하여 25℃에서 20∼24시간 정치 배양하였으며 발효 후 냉장고에서 2∼7일간 숙성시키는 방법으로 계속적으로 캐피어 발효를 통해 캐피어 그레인을 보존하였다.
캐피어에 존재하는 유산균을 분리하기 위하여 우유를 이용하여 25℃에서 18시간동안 배양한 다음, 배양액으로부터 Lactobacilli MRS medium(Difco. USA), ROGOSA SL medium(Difco. USA), BCP plate counting agar(Eiken Chemical Co., Ltd., Japan)를 이용하여 형태학적으로 구별되는 콜로니(colony)를 선별하였다. 선별된 균주는 생화학적 특성을 통한 1차 동정을 위하여 API 50CHL kit(Biomerieux, France)를 이용하여 동정하였다. 좀더 정확한 균주의 동정을 위하여 유전자 서열을 비교분석하여 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1, 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) R-1 균주 2종과 클루베라마이세스(Kluyveromyces)속 효모로 이루어진 캐피어 그레인을 1.5∼3.5% 되도록 첨가하여 20∼30℃에서 15∼24시간 정치 배양하여 캐피어 요구르트를 제조하였다. 캐피어 요구르트에서 캐피어 그레인을 채로 거른 후, 액상의 캐피어를 -40℃로 얼린 다음 서서히 진공 건조하여, 더이상 발효성분의 변화가 없는 캐피어 분말을 제조하였다.
건조시킨 캐피어 분말의 성분분석을 수행하였다. 캐피어 분말 내의 다당의 분석을 위하여 다음과 같이 하였다. 캐피어 분말을 증류수에 현탁하고 고속원심분리기에서 8,000 rpm으로 20분간 원심분리한 후 상등액을 취하였다. 에탄올 3부피를 첨가하여 침전물을 얻어 동결건조 후 정량하였다. 이 경우 침전물 중 다당의 양은 환원당 정량법(Anal. Chem. 31:426-428, 1959)을 이용하여 정량하고 이 값을 보정함으로써 구하였다. 유산균 생균수를 측정하기 위하여 적절한 농도로 희석하여 MRS, BCP 고체배지에 도말하여 2일간 30℃에서 배양한 후 생성되는 집락(colony)의 수를 확인하였다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나, 아래의 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예의 기재범위에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 캐피어 그레인에서 분리한 균주의 특징
본 발명에 사용한 캐피어 그레인에 존재하는 유산균을 분리하기 위하여 우유를 이용하여 25℃에서 18시간동안 배양한 다음, 배양액을 각각의 단계별로 희석하여 MRS 고체배지에서 콜로니를 선별하였다. 선별된 균주를 ROGOSA, BCP 고체배지에서 각각 순수배양하여 콜로니의 크기, 모양, 점질물 생성 유무 등에 따라 50개의 균주를 선별하였다. 형태학적으로 분리된 균주의 생화학적 특성을 통한 동정을 위하여 API 50CHL kit를 이용하였다. 형태학적인 특징은 MRS 배지에서 round와 mound의 형태로 구분되었으며 ROGOSA 배지에서는 다당생성 유무에 따가 균주가 선별되었다. 생화학적 특성을 통한 1차 동정결과 류코노스톡(Leuconostoc sp.)은 ROGOSA 배지에서 점질물의 다당을 생산하며, 락토바실러스(Lactobacillus sp.)는 MRS 배지에서 mound 형태를 나타내는 것을 알 수 있었다(도 1). 생화학적 특징은 다음 표 1과 같이 나타났다. 분리한 유산균은 더 정확한 동정을 위해 16S rDNA 서열결정(sequencing)을 수행하였다. 그 결과 류코노스톡(Leuconostoc sp.)은 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides NCDO 523T와 100%(도 2), 락토바실러스(Lactobacillus sp.)는 Lactobacillus kefiri NRIC 1693T와 99%(도 3)의 연관성(homology)을 갖는 균주로 동정이 되었으며, 분류학적 위치는 도 2와 도 3에 각각 나타내었다.
선별된 균주는 미생물 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행 (KCTC)에 2004년 11월 16일자로 Leuconostoc mesenteroides E-1(기탁번호 KCTC 10724BP), Lactobacillus kefiri R-1(기탁번호 KCTC 10725BP) 균주로 기탁하였다.
| Test | Leuconostoc mesenteroides (KCTC 10724BP) | Lactobacillus kefiri (KCTC 10725BP) |
| Glycerol | - | - |
| Erythrotol | - | - |
| D-Arabinose | - | - |
| L-Arabinose | + | + |
| D-Ribose | + | + |
| D-Xylose | + | - |
| L-Xylose | - | - |
| D-Adonitol | - | - |
| Methyl-β-D-Xylopyranoside | - | - |
| D-Galactose | + | + |
| D-Glucose | + | + |
| D-Fructose | + | + |
| D-Mannose | + | - |
| L-sorbose | - | - |
| L-Rhamnose | - | - |
| Dulcitiol | - | - |
| Inositol | - | - |
| D-Mannitol | - | - |
| D-Sorbitol | - | - |
| Methyl-α-D-Mannopyranose | - | - |
| Methyl-α-D-Glucopyranose | + | - |
| N-Acetylglucosamine | + | - |
| Amygdalin | - | - |
| Arbutin | - | - |
| Esculin ferric citrate | + | + |
| Salicin | - | - |
| D-Cellobiose | - | - |
| D-Maltose | + | + |
| D-Lactose | + | + |
| D-Melibiose | + | + |
| D-Saccharide(Sucrose) | + | - |
| D-Trehalose | + | - |
| Inulin | - | - |
| D-Melezitose | - | - |
| D-Raffinose | + | - |
| Starch | - | - |
| Glycogen | - | - |
| Xylitol | - | - |
| Gentiobiose | - | - |
| D-Turanose | + | - |
| D-Lyxose | - | - |
| D-Tagatose | - | - |
| D-Fucose | - | - |
| L-Fucose | - | - |
| D-Arabitol | - | - |
| L-Arabitol | - | - |
| Potassium gluconate | - | - |
| Potassium-2-ketogluconate | - | - |
| Potassium-5-ketogluconate | - | - |
실시예 2. 발효온도에 따른 생균수 및 다당체 생성
우유에 탈지분유를 10% 되도록 첨가한 발효배지에서, 류코노스톡 메센테로이드 E-1, 락토바실러스 케피리 R-1 균주 2종과 클루베라마이세스 속 효모로 이루어진 캐피어 그레인을 2% 되도록 첨가하여 15∼35℃로 18시간 정치 배양하여 캐피어 요구르트(발효액)를 제조하였다.
캐피어 요구르트(발효액)에서 캐피어 그레인을 채로 거른 후, 액상의 캐피어를 -40℃로 얼린 다음 서서히 진공 건조하여, 발효성분의 변화가 더 이상 없는 캐피어 분말을 제조하였다.
표 2에 최종 캐피어 1그램 당 생균수와 다당의 농도를 나타내었다. 배양온도 20∼30℃에서 유산균 생균수가 4.2x109∼3.0x1010, 효모 생균수가 2.0x104∼5.0x10
5, 다당 생성이 22∼32mg/g-분말로 높았으며, 장기간 보존시에도 생균이 안정하게 유지되었다.
| 배양온도 (℃) | 유산균 생균수(cfu/g) | 효모 생균수(cfu/g) | 다당 (mg/g) | ||||
| 제조시 | 3개월후 | 6개월후 | 제조시 | 3개월후 | 6개월후 | ||
| 15 | 5.0×104 | 4.8×104 | 3.5×104 | 2.0×102 | 2.0×102 | 1.8×102 | 12 |
| 20 | 4.2×109 | 4.5×109 | 4.0×109 | 2.0×104 | 2.0×104 | 1.7×104 | 22 |
| 25 | 3.0×1010 | 2.9×1010 | 2.7×1010 | 4.0×105 | 3.7×105 | 3.6×105 | 32 |
| 30 | 2.5×1010 | 2.0×1010 | 2.0×1010 | 5.0×105 | 4.5×105 | 4.4×105 | 27 |
| 35 | 1.5×107 | 1.5×107 | 1.4×107 | 4.0×104 | 3.7×104 | 3.6×104 | 25 |
실시예 3. 배양시간에 따른 생균수와 다당체 생성
실시예 1과 동일한 방법으로 배양온도를 25℃로 하여 제조하되 배양시간을 6시간에서 30시간으로 달리하여 캐피어 분말을 제조하였다.
표 3에 배양시간에 따른 최종 캐피어 분말 1그램 당 생균수와 다당체 생성을 살펴보았다. 배양시간 15∼24시간에서 유산균 생균수가 1.2x1010∼3.5x1010, 효모 생균수가 4.0x105∼5.0x105, 다당 생성이 32 mg/ g-분말로 높았으며, 장기간 보존시에도 생균이 안정하게 유지되었다.
| 배양시간 (h) | 유산균 생균수(cfu/g) | 효모 생균수(cfu/g) | 다당 (mg/g) | ||||
| 제조시 | 3개월후 | 6개월후 | 제조시 | 3개월후 | 6개월후 | ||
| 6 | 5.0×104 | 4.8×104 | 4.2×104 | 2.0×102 | 2.0×102 | 1.8×102 | 0 |
| 9 | 4.0×107 | 3.8×107 | 3.8×107 | 4.0×103 | 3.2×103 | 3.6×103 | 0 |
| 15 | 1.2×1010 | 1.0×1010 | 1.0×1010 | 4.0×104 | 3.7×104 | 3.7×104 | 11 |
| 20 | 3.5×1010 | 3.5×1010 | 3.0×1010 | 5.0×105 | 4.7×105 | 4.1×105 | 32 |
| 24 | 2.0×1010 | 1.9×1010 | 1.8×1010 | 4.8×105 | 4.7×105 | 3.9×105 | 25 |
| 30 | 3.8×109 | 3.5×109 | 3.6×109 | 4.9×105 | 4.4×105 | 4.2×105 | 24 |
실시예 4. 탈지분유 첨가량에 따른 유산균 생균수와 다당체 생성
실시예 2와 동일한 방법으로 배양온도를 25℃로 하고 배양시간을 18시간으로 하여 탈지분유 첨가량을 달리하여 캐피어 분말을 제조하였다.
표 4에 탈지분유 첨가량에 따른 최종 캐피어 분말 1 그램 당 생균수와 다당체 생성을 살펴보았다. 유산균의 생균수는 탈지분유 첨가량과 관계없이 2.5x1010∼4.4x1010으로 높게 나타났다. 한편, 생균수의 안정성은 탈지분유를 5∼10% 첨가하였을 때 6개월 후에도 초기 생균수의 90%이상을 보였다. 다당 생성은 탈지분유 10%를 첨가하였을 때 40 mg/g-분말로 가장 높았다.
| 첨가량 (wt/vol) | 유산균 생균수(cfu/g) | 효모 생균수(cfu/g) | 다당 (mg/g) | ||||
| 제조시 | 3개월후 | 6개월후 | 제조시 | 3개월후 | 6개월후 | ||
| 0 | 3.5×1010 | 3.5×1010 | 3.0×1010 | 4.0×105 | 4.0×104 | 4.0×105 | 32 |
| 5 | 4.4×1010 | 4.2×1010 | 4.3×1010 | 4.5×105 | 3.9×105 | 3.9×105 | 38 |
| 10 | 3.3×1010 | 2.9×1010 | 2.7×1010 | 2.3×105 | 2.2×105 | 2.1×105 | 40 |
| 15 | 2.5×1010 | 2.4×1010 | 2.0×1010 | 1.3×105 | 1.1×105 | 1.0×105 | 35 |
본 발명은 인체에 유익한 유산균의 생균수를 최대화하는 방법으로 고품질의 캐피어를 제조할 수 있었다.
본 발명에서는 유산균과 효모의 복합체인 캐피어 그레인을 이용하여 우유와 탈지분유를 포함한 배지에서 발효를 수행하여 다당이 다량 함유된 캐피어 분말을 제조할 수 있었다. 또한, 배양 온도와 시간을 조절함으로써 생균수를 높게 유지할 수 있었으며, 면역 증강능이 있는 다당의 생산을 최대화할 수 있었다. 또한, 탈지분유를 첨가함으로써 생균수를 6개월 이상 80% 이상 유지할 수 있게 함으로써, 정장작용이 뛰어난 유산균과 효모가 함유된 식품을 공급할 수 있다.
Claims (2)
- 캐피어 그레인으로부터 분리한, 다당 생성능이 우수한 신균주 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1(KCTC 10724BP)
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