KR100654904B1

KR100654904B1 - Composition with anti-inflammatory activity or regenerative effect of cartilaginous tissue containing herb medicine extract

Info

Publication number: KR100654904B1
Application number: KR1020060072572A
Authority: KR
Inventors: 김시나; 남경숙; 황성완; 황성연
Original assignee: 주식회사 케이엠에스아이; 황성연
Priority date: 2005-12-12
Filing date: 2006-08-01
Publication date: 2006-12-06

Abstract

Provided is a composition comprising an herb extract showing anti-inflammatory and analgesic activity, articulation decomposing enzyme inhibition activity, inflammation inducing related enzyme inhibition activity and joint synovial fluid increasing inhibition activity so as to offer excellent therapeutic effect on cartilaginous tissue regeneration and arthritis. The composition for regenerating cartilaginous tissue and treating osteoarthritis comprises an extract prepared by extracting at least one plant selected from the group consisting of Artemisia capillaris Thunberg, Pueraria lobata Ohwil and Perilla frutescens var. acuta with ethylacetate. The composition decreases the amount of proteoglycan, prostaglandin, matrix metalloprotease or cyclooxygenase in blood.

Description

COMPOSITION WITH ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY OR REGENERATIVE EFFECT OF CARTILAGINOUS TISSUE CONTAINING HERB MEDICINE EXTRACT}

도 1-a 내지 1-c는 골관절염을 유도한 토끼의 연골 조직 세포에 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 조성물을 처리한 후 생성된 일산화질소의 총량을 나타낸 것이다. CM은 골관절염을 유도한 후 생성된 대조군의 일산화질소의 총량을 나타낸 것이다. 1-a to 1-c show the total amount of nitrogen monoxide produced after treating the compositions of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 3 to rabbit cartilage tissue cells induced osteoarthritis. CM shows the total amount of nitric oxide in the control group produced after inducing osteoarthritis.

도 2는 실험예 1에서 CM에 의하여 골관절염을 유도한 토끼의 연골 조직 세포에 실시예 4의 조성물을 100, 200, 300 ug/ml로 처리한 후 생성된 프로스타글란딘 E₂의 총량을 나타낸 것이다. CM은 골관절염을 유도한 후 생성된 대조군의 프로스타글란딘 E₂의 총량을 나타낸 것이다.Figure 2 shows the total amount of prostaglandin E ₂ produced after the composition of Example 4 to 100, 200, 300 ug / ml of rabbit cartilage tissue cells induced osteoarthritis by CM in Experimental Example 1. CM shows the total amount of prostaglandin E ₂ in the control group produced after inducing osteoarthritis.

도 3은 실험예 1에서 CM에 의하여 골관절염을 유도한 토끼의 연골 조직 세포에 실시예 4의 조성물을 100, 200, 300 ug/ml로 처리한 후 분해된 프로테오글리칸의 총량을 나타낸 것이다. CM은 골관절염을 유도한 후 분해된 대조군의 프로테오글리칸 의 총량을 나타낸 것이다.Figure 3 shows the total amount of proteoglycans digested after treating the composition of Example 4 to 100, 200, 300 ug / ml of rabbit cartilage tissue cells induced osteoarthritis by CM in Experimental Example 1. CM shows the total amount of proteoglycans of the control group that was degraded after inducing osteoarthritis.

도 4는 실험예 1에서 CM에 의하여 골관절염을 유도한 토끼의 연골 조직 세포 에 실시예 4의 조성물을 100, 200, 300 ug/ml로 처리한 후 활성화된 MMP-9의 총량을 나타낸 것이다. CM은 골관절염을 유도한 후 활성화된 대조군의 MMP-9의 총량을 나타낸 것이다.Figure 4 shows the total amount of MMP-9 activated after the composition of Example 4 to 100, 200, 300 ug / ml of rabbit cartilage tissue cells induced osteoarthritis by CM in Experimental Example 1. CM shows the total amount of MMP-9 in the control group activated after inducing osteoarthritis.

도 5는 실험예 1에서 CM에 의하여 골관절염을 유도한 토끼의 연골 조직 세포에 실시예 4의 조성물을 100, 200, 300 ug/ml로 처리한 후 발현되는 COX-2의 총량을 나타낸 것이다. CM은 골관절염을 유도한 후 발현된 대조군의 COX-2의 총량을 의미한다.Figure 5 shows the total amount of COX-2 expressed after the composition of Example 4 to 100, 200, 300 ug / ml of rabbit cartilage tissue cells induced by osteoarthritis by CM in Experimental Example 1. CM refers to the total amount of COX-2 in the control group expressed after inducing osteoarthritis.

도 6은 실시예 4의 조성물이 골관절염 증상을 갖는 동물 모델에서 연골 재생에 미치는 효과를 나타낸 것이다. Figure 6 shows the effect of the composition of Example 4 on cartilage regeneration in animal models with osteoarthritis symptoms.

도 7은 실시예 4의 조성물이 골관절염 증상을 갖는 동물 모델에서 관절 활액의 양적 변화에 미치는 영향을 나타낸 것이다. Figure 7 shows the effect of the composition of Example 4 on the quantitative changes of joint synovial fluid in animal models with osteoarthritis symptoms.

도 8은 실시예 4의 조성물이 골관절염 증상을 갖는 동물 모델에서 관절 활액 내의 프로테오글리칸에 미치는 영향을 나타낸 것이다. FIG. 8 shows the effect of the composition of Example 4 on proteoglycans in joint synovial fluid in animal models with osteoarthritis symptoms.

도 9는 실시예 4의 조성물이 골관절염 증상을 갖는 동물 모델에서 관절 활액 내의 총단백질에 미치는 영향을 나타낸 것이다. FIG. 9 shows the effect of the composition of Example 4 on total protein in synovial synovial fluid in an animal model with osteoarthritis symptoms.

도 10은 실시예 4의 조성물이 골관절염 증상을 갖는 동물 모델에서 관절 활액 내의 프로스타글란딘 E₂에 미치는 영향을 나타낸 것이다. FIG. 10 shows the effect of the composition of Example 4 on prostaglandin E ₂ in joint synovial fluid in animal models with osteoarthritis symptoms.

도 11은 실시예 4의 조성물이 골관절염 증상을 갖는 동물 모델에서 관절 조직의 사프라닌 염색 결과와 활액막 세포 분포 결과를 나타낸 것이다. FIG. 11 shows the results of safranin staining and synovial cell distribution of joint tissue in an animal model in which the composition of Example 4 has osteoarthritis symptoms.

도 12는 실시예 4의 조성물이 마우스에서 통증 억제 정도에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 12 shows the effect of the composition of Example 4 on the degree of pain inhibition in the mouse.

도 13은 실시예 4의 조성물이 랫트에서 발 부종의 억제 정도에 미치는 영향을 나타낸 것이다.Figure 13 shows the effect of the composition of Example 4 on the degree of inhibition of foot edema in rats.

도 14는 실험예 1에서 CM에 의하여 골관절염을 유도한 토끼의 연골 조직 세포에서 실시예 6 내지 9의 조성물을 처리한 후 생성된 일산화질소의 총량을 나타낸 것이다. CM은 골관절염을 유도한 후 생성된 대조군의 일산화질소의 총량을 나타낸 것이다. Figure 14 shows the total amount of nitrogen monoxide produced after treating the composition of Examples 6 to 9 in rabbit cartilage tissue cells induced osteoarthritis by CM in Experimental Example 1. CM shows the total amount of nitric oxide in the control group produced after inducing osteoarthritis.

도 15는 실험예 1에서 CM에 의하여 골관절염을 유도한 토끼의 연골 조직 세포에 실시예 6의 조성물을 50, 100, 200, 300, 600 ug/ml로 처리한 후 생성된 일산화질소의 총량을 나타낸 것이다. CM은 골관절염을 유도한 후 생성된 대조군의 일산화질소의 총량을 나타낸 것이다.Figure 15 shows the total amount of nitrogen monoxide produced after treating the composition of Example 6 to 50, 100, 200, 300, 600 ug / ml of rabbit cartilage tissue cells induced osteoarthritis by CM in Experimental Example 1 will be. CM shows the total amount of nitric oxide in the control group produced after inducing osteoarthritis.

도 16은 실험예 1에서 CM에 의하여 관절염을 유도한 유도한 토끼의 연골 조직 세포에 실시예 6 내지 9의 조성물을 처리한 후 분해된 프로테오글리칸의 총량을 나타낸 것이다. CM은 골관절염을 유도한 후 분해된 대조군의 프로테오글리칸의 총량을 나타낸 것이다.FIG. 16 shows the total amount of proteoglycans degraded after treating the composition of Examples 6 to 9 to rabbit cartilage tissue cells induced by arthritis by CM in Experimental Example 1. FIG. CM shows the total amount of proteoglycans of the control group that was degraded after inducing osteoarthritis.

도 17은 실험예 1에서 CM에 의하여 골관절염을 유도한 토끼의 연골 조직 세포에 실시예 6의 조성물을 50, 100, 200, 300, 600 ug/ml로 처리한 후 분해된 프로테오글리칸의 총량을 나타낸 것이다. CM은 골관절염을 유도한 후 분해된 대조군의 프로테오글리칸의 총량을 나타낸 것이다.Figure 17 shows the total amount of proteoglycans degraded after treatment of the composition of Example 6 to 50, 100, 200, 300, 600 ug / ml of rabbit cartilage tissue cells induced osteoarthritis by CM in Experimental Example 1 . CM shows the total amount of proteoglycans of the control group that was degraded after inducing osteoarthritis.

도 18은 실시예 6의 조성물이 랫트에서 발 부종의 억제 정도에 미치는 영향을 나타낸 것이다.18 shows the effect of the composition of Example 6 on the degree of inhibition of foot edema in rats.

[산업상 이용분야][Industrial use]

본 발명은 연골 재생, 소염 및 진통 작용 등 관절 건강에 도움을 주는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인진, 갈근 및 차조기를 포함하며 연골 재생, 소염 및 진통 작용 등 관절 건강에 도움을 주는 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for helping joint health, such as cartilage regeneration, anti-inflammatory and analgesic action, and more particularly, to a composition including carcinogen, reeds and acupuncture, and to joint health, such as cartilage regeneration, anti-inflammatory and analgesic action. It is about.

[종래기술] [Private Technology]

인간을 비롯한 모든 호기성 생물체는 산소를 이용한 에너지 대사 과정에서 발생하는 활성 산소의 상해에 대하여 자기 방어기구를 구비하고 있지만, 조직의 방어능을 초월한 활성산소의 생성은 관절염 등 여러 질환의 원인이 되고 있다.All aerobic organisms, including humans, have self-defense mechanisms against free radical damage caused by oxygen metabolism. However, the production of free radicals beyond the defense of tissues causes many diseases such as arthritis. .

상기 활성산소는 가장 안정한 형태의 산소인 삼중항 산소(³O₂)가 산화, 환원 과정에서 환원되어 생성되는 일중항 산소인 수퍼옥사이드 음이온(Superoxide anion, ¹O₂-)과 과산화수소(H₂O₂), 아히드록시라디칼(·OH)과 같은 자유라디칼로서, 이들은 단백질, DNA, 효소 및 T 세포와 같은 면역계통의 인자를 손상시켜 각종 질병을 유발시킨다. 이러한 이유로 항산화제의 개발연구가 활발히 진행되어 예방적 항산화제인 수퍼옥사이드 디스무테이즈(Superoxide dismutase), 카탈레이즈(Catalase), 글루타티온 페록시데이즈(Glutathioneperoxidase)등과 같은 항산화 효소와 천연 항산화제인 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드(Carotenoid), 글루타티온(Glutathione) 및 합성 항산화제인 부틸히드록시 아니졸(t-Butyl-4-hydroxyanisole; BHA) 디부틸 히드록시 톨루엔(3,5-(t-Butyl)-4-hydroxytoluene; BHT) 등 많은 항산화제가 알려져 있다. 그러나 천연 항산화 효소는 노화에 따라 활성산소에 대한 방어능력이 저하되고, 합성 항산화제는 돌연변이를 유발하거나 독성 등의 문제가 있어 안전하고 효과적인 천연 항산화제의 개발이 절실히 요청되고 있다.The active oxygen is a singlet oxygen (Superoxide anion, ¹ O _2- ) and hydrogen peroxide (H ₂ O), which is a singlet oxygen produced by reduction of triplet oxygen ( ³ O ₂ ), which is the most stable form of oxygen, during oxidation and reduction. ₂ ), free radicals such as hydroxy radicals (.OH), which cause various diseases by damaging factors of the immune system such as proteins, DNA, enzymes and T cells. For this reason, researches on the development of antioxidants have been actively conducted, and antioxidant enzymes such as superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, vitamin E, and vitamin E, which are natural antioxidants, are preventive antioxidants. C, carotenoids, glutathione and the synthetic antioxidant t-Butyl-4-hydroxyanisole (BHA) dibutyl hydroxy toluene (3,5- (t-Butyl) -4-hydroxytoluene BHT) and many antioxidants are known. However, natural antioxidant enzymes have decreased defense against free radicals with aging, and synthetic antioxidants have a problem such as causing mutations or toxicity, and thus, there is an urgent need for the development of safe and effective natural antioxidants.

염증성 질환이란 세균의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 의미한다. 염증을 유발하는 효소인 시클로옥시게나제(COX)는 2종류가 알려져 있다. 이 중 COX-1는 염증부위뿐 아니라, 정상적인 인체 여러 장기와 조직, 즉, 위장관 또는 신장 등에서 프로스타글란딘(Postaglandin; 이하 PG)의 물질을 생성하는데에도 관여한다. 이에 비하여 COX-2는 염증이 있는 부위에서만 작용하는 효소로 알려져 있다. 시판되는 디클로페낙(diclofenac), 아스피린(aspirin) 및 이부프로펜(ibuprofen) 등의 비스테로이드성 항염증제(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs; 이하 NSAIDs)는 COX-1과 COX-2를 동시에 억제하거나 주로 COX-1을 억제하므로 염증이 있는 조직 뿐만 아니라, 장기 복용시, 간 위장관, 또는 신장 등의 기능 유지에 필수적인 PG를 동시에 억제하여 많은 부작용을 야기하는 것으로 알려져 있다(Isselbcher et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, (13th ed)2, pp1543-1711).Inflammatory disease refers to the pathological condition of an abscess formed by the invasion of bacteria. Two types of cyclooxygenase (COX), an enzyme that causes inflammation, are known. Among them, COX-1 is involved in the production of prostaglandins (PG) in various organs and tissues of the human body, ie, the gastrointestinal tract or kidneys. In comparison, COX-2 is known as an enzyme that acts only at the site of inflammation. Commercially available nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as diclofenac, aspirin and ibuprofen simultaneously inhibit COX-1 and COX-2, or primarily COX-1. Therefore, it is known to cause many side effects by simultaneously inhibiting PG, which is essential for maintaining the function of the liver, gastrointestinal tract, or kidney, as well as in inflamed tissues. (Isselbcher et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, (13th ed) 2, pp 1543-1711).

골관절염(Osteoarthritis, OA)은 전체 골근격계 질환의 40 내지 60%를 차지하고 있는 가장 흔한 운동기계의 질환이며, 평균 연령이 증가되면서 유병율이 꾸준히 증가되고 있다. 전세계 인구의 15%가 OA를 앓고 있는 것으로 진단되며, 그 중 60% 정도는 60 대 이상에 분포되어 있다(Haq Ⅰet al., J.Osteroarthritis, 79(993), pp377~383).Osteoarthritis (OA) is the most common disease of the motor system, which accounts for 40 to 60% of all skeletal musculoskeletal diseases, and its prevalence is steadily increasing as the average age increases. 15% of the world's population is diagnosed with OA, and 60% of them are in their 60s or older (Haq I et al., J. Osteroarthritis, 79 (993), pp 377-383).

관절염은 관절의 연골이 닳아 없어져 관절뼈가 맞부딪히면서 심한 관절통을 유발하며 그로 인한 활동의 제한이 장애의 주된 원인이 된다. 만성적 경과를 밟는 질환의 특성에 의하여 장기적인 치료를 필요로 하는데, 장기적인 약물 복용으로 인한 합병증 및 부작용이 발생하게 된다. 따라서, 관절염의 치료시 통증의 완화, 관절 연골의 기능 유지 및 회복은 물론 합병증도 함께 치료할 수 있는 치료제의 개발이 필요하다.Arthritis causes severe joint pain due to abrasion of joint cartilage in the joints, leading to severe joint pain. Long-term treatment is required due to the nature of the chronic course of the disease, and complications and side effects from long-term medications occur. Therefore, there is a need for the development of a therapeutic agent that can alleviate pain, maintain and restore the function of articular cartilage as well as complications in the treatment of arthritis.

일반적으로 시행되는 관절염의 치료 방법으로는, 초기에 있어 통증만 있는 경우에는 단순 진통제를 복용하여 통증을 없애는데 초점이 맞춰 있으나, 좀 더 진행된 후 통증이 계속된 경우에는 항염 효과가 강한 소염 진통제를 사용하게 된다. 이러한 소염 진통제는 코르티코스테로이드(Corticosteroid) 유형의 소염물질을 사용하게 된다. 예를 들어, 소염 진통제의 일종인 하이드로코르티존(Hydrocortisone) 및 베타메타손(betamethasone) 등을 장기간 사용하는 경우 위, 간, 신장의 기능을 저하시키고 연골 세포의 재생 능력을 저해시키는 등의 부작용이 있어 지속적인 관찰과 함께 경구투여가 아닌 관절 내 주사를 원칙으로 한다.In general, arthritis treatment is focused on eliminating pain by taking simple painkillers in the early stages of pain. However, if pain continues after further progress, anti-inflammatory analgesics with strong anti-inflammatory effects are used. Done. These anti-inflammatory drugs use anti-inflammatory substances of the corticosteroid type. For example, long-term use of anti-inflammatory analgesics such as hydrocortisone and betamethasone may cause side effects such as deterioration of gastric, liver and kidney function and regeneration of cartilage cells. As a rule, intraarticular injections should not be given orally.

따라서, 관절염 치료에 가장 일반적인 약물복용 방법에 있어 진통 억제 및 소염 효과를 가지며 상기 부작용을 낮추는 많은 약들이 개발되어 왔으며, 이들의 대표적인 예로는 디클로페낙(diclofenac), 아스피린(aspirin) 및 이부프로펜(ibuprofen) 등의 비스테로이드성 소염제(NSAID)가 이에 해당된다. 그러나 비스테로이드성 소염제 역시 소화기, 특히 위장에 부작용을 일으키는 문제점을 가지고 있다. 또한 이들은 관절염의 근본적인 치료 없이 통증 및 염증만을 제거하는 효과를 가진다.Accordingly, many drugs have been developed that have analgesic inhibitory and anti-inflammatory effects and lower the side effects in the most common drug administration methods for the treatment of arthritis. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAID) of this is the case. However, NSAIDs also have side effects on the digestive organs, especially the stomach. They also have the effect of removing only pain and inflammation without the underlying treatment of arthritis.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 항염증 작용, 소염 진통 작용, 관절 조직 분해 효소 억제 작용, 염증 유발 관련 효소 억제 작용, 관절 활액의 증가 억제 작용, 관절 활액의 총단백질 증가 억제 등의 치료 효능이 있어 연골 재생 및 골관절염 치료에 우수한 효과를 갖는 조성물을 제공하는 것이다.The present invention is to solve the above problems, anti-inflammatory action, anti-inflammatory analgesic action, inhibiting the articular tissue degrading enzymes, inhibiting inflammation-associated enzymes, inhibiting the increase of joint synovial fluid, inhibiting the increase of total protein of joint synovial fluid, etc. There is a therapeutic effect of to provide a composition having an excellent effect on cartilage regeneration and osteoarthritis treatment.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 인진, 갈근 및 차조기를 포함하는 연골 재생 및 골관절염 치료용 조성물을 제공한다. The present invention provides a composition for treating cartilage regeneration and osteoarthritis, including jinjin, reeds and perilla to achieve the above object.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 연골 재생 및 골관절염 치료용 조성물은 인진, 갈근 및 차조기를 포함한다. The composition for treating cartilage regeneration and osteoarthritis of the present invention comprises phosphorus, root, and perilla.

본 발명에 사용되는 인진(茵蔯, Artermisiae Scoparia Waldstein et Kitamura)은 국화과의 다년생 초본으로 특유의 향기와 약효로 인해 많은 관심을 받 아 왔으며, 민간에서는 식용, 약용, 단방약으로 오래전부터 애용되어 왔다. 허준의 동의보감에 따르면, 인진은 산모의 대변하혈이 있거나 산후 복통, 월경불순, 감기로 인한 오한 및 열, 오래된 이질, 피부병, 음부의 각종 질병, 풍습, 옴, 종양 등을 치료하며, 모든 실혈을 치료한다고 전해진다. 또한 인진은 졸심통을 치료하는데 좋고 배가 아픈 것을 치료하며, 황달을 주로 치료하므로 온몸이 황색으로 발하고 소변이 붉은 색이 있을 때 진하게 달여 마시면 그 정도가 진정되는 효과가 있다고 전해진다. 이러한 인진은 주성분으로 피넨, 테르피넨, 리모넨, 테르피네올, 쿠마린을 비롯한 정유 성분과 클로르겐산, 카페인산, 페놀라산 등의 방향족 옥시카르본산 등을 함유하고, 손상된 간회복, 진방간, 간암, 간염, 황달 등의 간질환 치료 및 예방하는 효과가 있다. 이러한 효과는 옥시카르본산, 쿠마린 등 여러 가지 성분의 종합적인 작용으로 보는 견해가 많다. Injin ( ae , Artermisiae) used in the present invention Spcoparia Waldstein et Kitamura) is a perennial herb of the Asteraceae family, and has received a lot of attention because of its unique fragrance and medicinal effect. According to Huh Jun's consent, Injin treats maternal stool bleeding, postpartum abdominal pain, dysmenorrhea, colds, chills and fever, old dysentery, skin disease, various diseases of the genitals, customs, scabies and tumors. It is said to cure. Injin is also good for treating painful pain in the stomach and stomach pain, and mainly treats jaundice, so that when the whole body is yellow and the urine is red, it is said that the effect of calming down is enough. Such phosphorus contains essential oils such as pinene, terpinene, limonene, terpineol, coumarin and aromatic oxycarboxylic acids such as chloric acid, caffeic acid, and phenolic acid as its main components. It is effective in treating and preventing liver diseases such as hepatitis and jaundice. This effect is often viewed as a comprehensive action of various components such as oxycarboxylic acid and coumarin.

본 발명에 사용되는 갈근(葛根, Pueraria thunbergiana Benth)은 칡뿌리의 껍질을 벗겨 잘게 썰어서 소금물 또는 백반수에 담가 말린 것으로 오래전부터 식용으로 칡차, 칡죽, 미숫가루 등에 사용되었고, 약용으로 감기, 머리 아픈데, 땀이 잘 나지 않고 가슴이 답답하고 갈증나는데, 당뇨병, 설사, 이질 등의 치료에 이용되었다. 한방에서는 발한, 해열, 완화제로서 고열, 두통, 고혈압, 심부전, 설사, 어깨가 결릴 때 처방한다. 특히 동의보감에 따르면 갈근은 평하고 맛은 달며 독이 없고 풍한으로 머리 아픈 것을 낫게 하며 땀이 나게 하여 감기, 몸살, 두통에 근육을 풀어주고 땀구멍을 열어 주며 숙독을 푼다고 전한다. 또한 번갈을 멈추며 음식 맛을 나게 하고 소화를 잘 되게 하며 가슴에 열을 없애고 소장을 잘 통하게 하며 쇠붙이에 다친 것을 낫게 한다고 한다. 이러한 갈근을 푸라린, 아피제닌, 이소플라보노이드, 제니스테인, 카코네인 등의 성분을 함유하고 있으며, 이들 성분 중에서 주로 이소플라보노이드와 관련된 성분 연구가 항산화 및 간 보호 작용 면에서 많이 보고 되었다. Brown root, Pueraria used in the present invention thunbergiana Benth ) is peeled and finely chopped root roots and soaked in brine or white rice water. It has been used for edible tea, rice porridge and rice flour for a long time. It is medicinal for cold, head soreness, sweating and chest feeling and thirst I have been used to treat diabetes, diarrhea and dysentery. Herbal medicine, sweating, fever, relief as a high fever, headache, high blood pressure, heart failure, diarrhea, when the shoulder is prescribed. According to Yeongbobom, it is said that brown root is flat, tastes sweet, nonpoisonous, and windy, soothes the head and makes sweating, which releases muscles for colds, body aches and headaches, opens the pores, and unwinds. It also stops alternating, tastes food, digests well, removes heat from the chest, makes the small intestine well, and heals the injured iron. These roots contain components such as furin, apigenin, isoflavonoids, genistein, and cacaine. Among these components, studies on components related to isoflavonoids have been reported in terms of antioxidant and liver protection.

본 발명에 사용되는 차조기(Perilla frutescense Linne)는 쌍떡잎 식물 통화식물목 꿀풀과의 한해살이풀로, 토종 약초백과에 따르면, 입맛을 돋우고 혈액 순환을 좋게 하며, 땀을 잘 나게 하며, 염증을 없애고, 기침을 멈추며, 소화를 잘 되게 하며 몸을 따뜻하게 하는 등의 효과가 있다고 전한다. Perilla used in the present invention ( Perilla frutescense Linne ) is a perennial plant of the dicotyledon, calliphytic plant Lamiaceae, according to the native herb encyclopedia, it promotes appetite, improves blood circulation, sweats, eliminates inflammation, stops coughing, improves digestion It is said to have an effect such as warming up.

또한 비타민 A, 비타민 C, 칼슘, 인, 철 등의 미네랄이 많이 들어 있어 식욕 증진, 이뇨, 해독, 정신 안정, 무좀, 두통 등 여러 질병에 다양하게 쓸 수 있으며, 이 외에도 기침, 가래, 인후염, 소화 불량, 부스럼, 불면증, 마비 증세, 당뇨병, 요통 등의 여러 질병에 다양하게 쓸 수 있다고 전한다. In addition, it contains a lot of minerals such as vitamin A, vitamin C, calcium, phosphorus and iron, so it can be used for various diseases such as appetite improvement, diuresis, detoxification, mental stability, athlete's foot, headache, etc. In addition, cough, sputum, sore throat, It can be used for various diseases such as indigestion, swelling, insomnia, paralysis, diabetes, and back pain.

이러한 차조기의 전체 정유 성분에는 약 55%의 페릴알데하이드와 20 ~ 30%의 I-리모넨, 소량의 피넨 등이 포함되어 있다. The total essential oil component of such a perforator contains about 55% perylaldehyde, 20-30% I-limonene, a small amount of pinene and the like.

본 발명의 조성물은 인진, 갈근 및 차조기로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택된 것을 함유한다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 건조물 중량 기준으로, 인진 3 내지 30 중량부, 갈근 3 내지 30 중량부, 차조기 4 내지 40 중량부를 함유할 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 조성물은 건조물 중량 기준으로, 인진 10 내지 20 중량부, 갈근 15 내지 25 중량부, 차조기 10 내지 30 중량부를 함유할 수 있다. 가장 바람직하게는 본 발명의 조성물은 건조물 중량 기준으로, 인진, 갈근 및 차조기를 3: 3: 4 내지 6의 중량비로 함유할 수 있다. 상기 함량 범위를 사용하여야 우수한 생약 조성물의 효능을 얻을 수 있다. 상기 함량 범위를 벗어나는 경우 조성물은 소염, 진통 및 연골 재생 효과 면에서 충분한 효과를 얻을 수 없다. 여러 배합 비율을 이용한 반복 실험을 통해 본 발명에 의한 조성물의 배합 비율에서 최대한의 효과를 발휘함을 확인하였다. The composition of the present invention contains at least one selected from the group consisting of phosphorus, reeds and perilla. Preferably, the composition of the present invention may contain 3 to 30 parts by weight of phosphorus, 3 to 30 parts by weight of roots, and 4 to 40 parts by weight of the agitator, based on the weight of the dry matter. More preferably, the composition of the present invention may contain 10 to 20 parts by weight of phosphorus, 15 to 25 parts by weight of roots, and 10 to 30 parts by weight of the agitator, based on the weight of the dry matter. Most preferably, the composition of the present invention may contain the phosphorus, the roots and the ridges in a weight ratio of 3: 3: 4 to 6, based on the weight of the dry matter. Only the above content range can be used to obtain the efficacy of the excellent herbal composition. If it is outside the content range, the composition may not obtain sufficient effects in terms of anti-inflammatory, analgesic and cartilage regeneration effects. Repeated experiments using various blending ratios confirmed that the compound exhibited the maximum effect in the blending ratio of the composition according to the present invention.

그러므로 본 발명의 조성물은 항염증 작용, 소염, 진통 작용, 관절 조직 분해 효소 억제 작용, 염증 유발 관련 효소 억제 작용, 발 부종 억제 작용, 관절 활액의 증가 억제 작용 등을 발휘할 수 있기 때문에 골관절염 치료 및 연골 재생 용도로 유용하게 사용할 수 있다. 또한 상기 인진, 갈근, 차조기는 식품 의약청으로부터 식품 원료로 인정 받은 원료이므로 식품으로 사용하였을 때, 안전하게 이용할 수 있다. Therefore, since the composition of the present invention can exert anti-inflammatory action, anti-inflammatory effect, analgesic action, inhibiting articular tissue degrading enzymes, inhibiting inflammation-related enzymes, inhibiting foot edema, and increasing joint synovial fluid, osteoarthritis treatment and cartilage It can be useful for regeneration purposes. In addition, the jinjin, brown root, persimmon since the raw material is recognized as a food raw material from the Food and Drug Administration, when used as a food, can be used safely.

상기 식물 또는 식물의 건조물 및 상기 중량부 또는 중량비로 혼합된 식물 또는 식물의 건조물은 분쇄하고, 용매에 대하여 분쇄물을 30 내지 50 중량%로 혼합하여 초음파 또는 환류장치를 이용하여 추출한 후, 이를 여과 또는 원심분리하여 상등액을 수득하여 본 발명의 조성물을 제조할 수 있다. 상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 에틸아세테이트, 헥산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 초음파 추출 및 환류 추출 장치를 이용한 추출은 3 내지 5 시간인 것이 바람직하다.The plant or the dried product of the plant and the dried plant or plant mixed with the weight part or weight ratio is ground, and mixed with 30 to 50% by weight of the ground powder with respect to the solvent and extracted using an ultrasonic or reflux apparatus, and then filtered Alternatively, the supernatant may be obtained by centrifugation to prepare a composition of the present invention. The solvent may be at least one selected from the group consisting of water, alcohols having 1 to 5 carbon atoms, ethyl acetate, and hexane. Extraction using the ultrasonic extraction and reflux extraction apparatus is preferably 3 to 5 hours.

상기 생약 조성물은 액상으로 사용하거나, 감압농축 또는 동결건조하여 용매가 제거된 분말의 형태로 사용할 수도 있다.The herbal composition may be used in a liquid form, or may be used in the form of a powder from which the solvent is removed by concentration under reduced pressure or lyophilization.

또한, 상기 생약 조성물은 약학적 효과를 갖는 제형화된 형태로 제공될 수 있다. 상기 생약 조성물의 적합한 제형으로는 산제, 액제, 환제, 정제, 당의정 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 좌약제 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출물을 약제학적으로 허용되는 염을 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토오즈, 옥수수 전분 또는 그 유도체, 활석, 스테아린산 또는 그 염을 사용할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제의 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올이 사용가능하다. 용액 또는 시럽의 형태인 경우에는 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등이 사용될 수 있다. 좌약용 담체로는 천연 오일 또는 경화된 오일, 왁스, 지방, 액체 폴리올 등이 사용가능하다.In addition, the herbal composition may be provided in a formulated form having a pharmaceutical effect. Suitable formulations of the herbal composition include, but are not limited to, powders, solutions, pills, tablets, dragees, hard or soft capsules, solutions, suspensions or emulsions, injections, suppositories, and the like. The extract may be prepared in a suitable dosage form using a pharmaceutically inert, organic or inorganic carrier, as a pharmaceutically acceptable salt. That is, lactose, corn starch or derivatives thereof, talc, stearic acid or its salts can be used when the formulation is a tablet, coated tablet, dragee and hard capsule. Also, where the formulation is a soft capsule, polyols of vegetable oils, waxes, fats, semisolids and liquids can be used. In the form of solutions or syrups, water, polyols, glycerol, vegetable oils and the like can be used. As suppository carriers, natural or hardened oils, waxes, fats, liquid polyols and the like can be used.

본 발명의 약학적 효과를 갖는 제형화된 조성물은 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더욱 포함할 수 있다. 투여 방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구로써 정맥, 피하, 복강내, 비강내 등에 투여될 수 있다.Formulated compositions having a pharmaceutical effect of the present invention may further include preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, solubilizers, sweeteners, colorants, osmotic agents, antioxidants and the like. The method of administration can be easily selected depending on the dosage form and can be administered orally or parenterally, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, intranasally and the like.

또한, 상기 생약 조성물은 식품에 첨가되어 연골 재생 또는 골관절염 치료 또는 예방 효과를 발생시키는 식품 첨가제로서 사용될 수 있고, 식품에 적용되어 연골재생 또는 골관절염의 치료 또는 예방용 건강보조식품의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 생약 조성물이 적용될 수 있는 건강보조식품은 시중에 유통되고 있는 모든 식품이 될 수 있으며, 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 인진, 갈근 및 차조기로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택된 것을 포함하는 식품 또는 식품첨가제를 제공할 수 있고, 보다 바람직하게는 건조물 중량 기준으로, 인진 3 내지 30 중량부, 갈근 3 내지 30 중량부 및 차조기 4 내지 40 중량부를 포함하는 식품 또는 식품첨가제를 제공할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 건조물 중량 기준으로, 인진 10 내지 20 중량부, 갈근 15 내지 25 중량부, 차조기 10 내지 30 중량부를 함유할 수 있고, 가장 바람직하게는 건조물 중량 기준으로, 인진, 갈근 및 차조기의 건조물 중량비가 3: 3: 4 내지 6으로 포함된 연골재생 또는 골관절염 치료 또는 예방효능을 갖는 건강보조식품을 제공한다.In addition, the herbal composition may be used as a food additive that is added to food to generate cartilage regeneration or osteoarthritis treatment or prophylactic effect, and may be applied to food and provided in the form of health supplement food for treating or preventing cartilage regeneration or osteoarthritis. have. The health supplement food to which the herbal composition of the present invention can be applied may be any food in the market, and is not particularly limited, but preferably includes one or more selected from the group consisting of jinjin, brown root and perilla Food additives may be provided, and more preferably, food or food additives including 3 to 30 parts by weight of phosphorus, 3 to 30 parts by weight of roots and 4 to 40 parts by weight of fermentation may be provided on a dry weight basis. Preferably it may contain 10 to 20 parts by weight of phosphorus, based on the weight of the dry matter, 15 to 25 parts by weight of the roots, 10 to 30 parts by weight of the conditioner, and most preferably, the weight ratio of the dry matter of the phosphorus, the roots and the conditioner based on the weight of the dry matter 3: 3: Provide a dietary supplement having the effect of treating or preventing cartilage regeneration or osteoarthritis contained in 4 to 6 do.

본 발명의 유효성분을 식품에 사용하는 경우, 상기 조성물을 그대로 포함하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 함량은 전체 건강보조식품에 대하여 1 내지 99.9 중량부로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 70 중량부로 포함될 수 있다. 그러나 유효성분의 혼합양은 그의 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있고, 상기 약제 조성물에 준하여 사용할 수 있으며, 본 발명의 실시예에 한정되지 아니한다. 또한, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.When the active ingredient of the present invention is used in food, the composition may be included as it is or used in combination with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. The content of the composition of the present invention may be included in 1 to 99.9 parts by weight, preferably 10 to 70 parts by weight based on the total dietary supplement. However, the mixed amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment), can be used according to the pharmaceutical composition, and is not limited to the embodiment of the present invention. In addition, in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or for health control, it may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety.

본 발명의 건강 기능 식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다. 본 발명의 건강음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한점이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에르트리톨 등의 당 알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연향미제(타우마틴, 스테비아 추출물) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 일예로 캡슐제는 본 발명의 조성물을 60 내지 70 중량부 덱스트린을 30 내지 40 중량부로 포함하여 제조할 수 있다. The dietary supplement of the present invention includes the form of tablets, capsules, pills, liquids and the like. The health beverage composition of the present invention has no particular limitation except for containing the extract as an essential ingredient in the indicated ratio, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks. Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as disaccharides such as glucose and fructose, for example polysaccharides such as maltose and sucrose, for example conventional sugars such as dextrin and cyclodextrin and xylitol. Sugar alcohols such as sorbitol and erythritol. As flavoring agents other than those mentioned above, natural flavoring agents (tautin, stevia extract) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. In one embodiment of the present invention capsules may be prepared by including the composition of the present invention 60 to 70 parts by weight of 30 to 40 parts by weight of dextrin.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. In addition to the above, the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants, pectic acids and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, and stabilizers. It may contain a topical agent, a preservative, glycerin, alcohol, carbonation agent used in the carbonated beverage and the like. In addition, the composition of the present invention may contain a natural fruit juice and a pulp for the production of fruit juice drinks and vegetable drinks. These components can be used independently or in combination.

또한, 상기 건강보조식품을 제조하기 위하여는 상기 첨가제 등의 여러 성분을 첨가하여 열풍건조, 동결건조, 충진 등 일반적으로 사용가능한 건강보조식품의 제조방법을 이용할 수 있다.In addition, in order to manufacture the health supplement food, it is possible to use a manufacturing method of a health supplement food which can be generally used, such as hot air drying, freeze drying, filling by adding various components such as the additive.

상기 건강보조식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 건강보조식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. There is no particular limitation on the kind of the health supplement. Examples of health supplements to which the substance may be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea , Drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes.

골관절염을 유발하는 연골 파손 과정에서, 일부 염증이 유발될 수 있으며, 이로써 염증 관련 효소의 방출을 야기하여 연골 손상을 가속시킨다. 일반적으로 염증 부위에서는 과다한 양의 NO가 발생하여 세포 조직의 괴사를 촉진시킨다고 알려져 있다[Moncada, S et al., Pharmacol. Rev. 43: 109-142 (1991)]. 이러한 NO를 발생시키는 iNOS(inducible nitric oxide synthetase)의 활성을 억제하거나 단백질 발현을 억제하는 것은 많은 염증성 질병에서 치료의 중요한 관건이 되고 있다. iNOS는 외부자극에 반응하여 생체를 방어하려는 목적으로 단시간에 과량의 NO를 생성하지만, 관절염과 같은 질환에서는 과잉 분비된 NO가 괴사, 통증 등의 2차적인 부작용을 일으키게 된다. 따라서, iNOS의 과잉발현 억제는 골관절염 치료에 중요한 것으로 알려져 있다.In the process of cartilage breakdown that leads to osteoarthritis, some inflammation can be induced, which leads to the release of inflammation-related enzymes, accelerating cartilage damage. In general, an excessive amount of NO is generated at the site of inflammation to promote necrosis of cellular tissues [Moncada, S et al., Pharmacol. Rev. 43: 109-142 (1991). Inhibiting the activity of inducible nitric oxide synthetase (iNOS) that produces these NOs or inhibiting protein expression has become an important key to treatment in many inflammatory diseases. iNOS produces excess NO in a short time in order to defend the living body in response to external stimulation, but in diseases such as arthritis, excessive secreted NO causes secondary side effects such as necrosis and pain. Thus, inhibition of overexpression of iNOS is known to be important for the treatment of osteoarthritis.

또한, 골관절염이 유도되면, 관절내 염증 반응과 함께 통증이 증가하게 되는데 이러한 통증은 활액내에서 이와 관련된 중요한 인자인 프로스타글란딘 E₂의 농도가 증가하기 때문이며, 따라서 활액내의 프로스타글란딘 E₂의 농도를 감소시키는 것이 또한 골관절염의 개선에 중요하다.In addition, when osteoarthritis is induced, pain increases with an intra-articular inflammatory response, which is due to an increase in the concentration of prostaglandin E ₂ , an important factor associated with it in the synovial fluid, thus reducing the concentration of prostaglandin E _{2 in} the synovial fluid. It is also important for the improvement of osteoarthritis.

프로테오글리칸(proteoglycan)은 단백질, 당분으로 구성되어 있으며, 콜라겐 섬유와 엉겨붙어 연골 내에 빽빽하게 밀집된 구조 또는 틀을 형성하여 몸을 굽혔다 폈다 하는 운동을 가능하도록 연골에 탄력성을 부여하는 복합 분자이다. 또한 프 로테오글리칸을 연골 조직 내로 수분을 감금시켜 스폰지 역할을 해 연골이 계속적인 관절운동을 가능하게 한다.Proteoglycan (proteoglycan) is composed of protein, sugar, and is a complex molecule that gives elasticity to the cartilage to allow the movement to bend and squeeze by forming a densely packed structure or a frame in the cartilage by intertwining with collagen fibers. In addition, the proteoglycan confines moisture into the cartilage tissue and acts as a sponge to allow the cartilage to continue to move joints.

골관절염이 진행되면, 염증 반응과 함께 연골이 파괴되어 활액내로 상기 프로테오글리칸(proteoglycan)이 방출되어 활액량 및 활액내의 프로테오글리칸의 농도가 증가한다. 따라서 활액내의 프로테오글리칸 농도의 감소는 골관절염의 개선을 측정하는 중요한 마커가 된다. 또한, 프로테오글리칸의 활액내로의 방출을 억제되는 경우, 연골내의 프로테오글리칸이 생성되고, 이는 연골세포의 증식에도 영향을 미치므로 활액내의 프로테오글리칸의 방출억제로 인하여 연골재생의 효과도 측정할 수 있다(Ailson M.Badger et al., Inhibition of Interleukin-1-induced Proteoglycan Degradation and Nitric Oxide Production in Bovine Articular Cartilage/Chondrocyte Cultures by the Natural Product, Hymenialdisine. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics . Vol.290 587-593).As osteoarthritis progresses, cartilage breaks down along with an inflammatory response, releasing the proteoglycan into the synovial fluid, thereby increasing the amount of synovial fluid and the concentration of proteoglycan in the synovial fluid. Thus, a decrease in proteoglycan concentration in the synovial fluid is an important marker to measure the improvement of osteoarthritis. In addition, when the release of proteoglycans into the synovial fluid is inhibited, proteoglycans are produced in cartilage, which affects the proliferation of chondrocytes, and thus the effect of cartilage regeneration can be measured due to the inhibition of proteoglycan release in the synovial fluid (Ailson M .Badger et al., Inhibition of Interleukin -1-induced proteoglycan Degradation and Nitric Oxide Production in Bovine articular Cartilage / chondrocyte Cultures by the Natural Product, Hymenialdisine. The Journal of Pharmacology and Experimentalal Therapeutics . Vol. 290 587-593).

또한 골관절염 발생된 연골조직은 MMP(매트릭스 메탈로프로테아제, matrix metalloproteinase) 합성 및 활성화에 의하여 파괴되고, MMP-1(collagenase-1), MMP-2, MMP-3(stromelysin-1), MMP-8(neutrophilcollagenase), MMP-9(gelatinase), MMP-13(collagenase-3) 등의 발현 및 활성이 증가한다. 따라서 활액내의 MMP-9의 농도의 감소 또한 골관절염의 개선정도를 측정하는 중요한 마커가 된다.In addition, osteoarthritis-induced cartilage tissue is destroyed by the synthesis and activation of MMP (matrix metalloproteinase), MMP-1 (collagenase-1), MMP-2, MMP-3 (stromelysin-1), MMP-8 (neutrophilcollagenase), MMP-9 (gelatinase), MMP-13 (collagenase-3) and the like increases the expression and activity. Therefore, decreasing the concentration of MMP-9 in synovial fluid is also an important marker to measure the improvement of osteoarthritis.

사이클로옥시게나제 2(cyclooxygenase 2; COX-2)는 통증 유발 물질인 프로스타글란딘E₂을 합성하는 효소이며, 이는 NO를 비롯한 기타 자극에 의해 합성이 촉진 되기 때문에 COX-2의 발현을 억제하거나 활성을 억제하는 것은 또한 골관절염 치료에 중요한 마커가 된다.Cyclooxygenase 2 (COX-2) is an enzyme that synthesizes prostaglandin E ₂ , a pain-causing substance, which inhibits COX-2 expression or inhibits its activity because it is promoted by NO and other stimuli. Inhibition is also an important marker for treating osteoarthritis.

또한 염증의 원인이 되는 활성산소는 항산화효소인 SOD(Super Oxide Dismutase,이하 'SOD'라함)에 의하여 제거되므로 세포내의 SOD 함유량은 골관절염 개선에 중요한 마커가 된다.In addition, the active oxygen causing inflammation is removed by the antioxidant enzyme SOD (Super Oxide Dismutase, hereinafter referred to as 'SOD'), so the SOD content in the cell is an important marker for improving osteoarthritis.

본 발명의 생약 조성물은 연골세포에서 프로테오글리칸과 프로스타글란딘E₂이 분리되는 것을 방지하여 활액내에서의 상기 물질의 농도를 감소시키고, 일산화질소의 생성, MMP-9 및 사이클로옥시게나제 2의 발현을 억제하며, 초산에 의한 롸이딩(Writhing) 증상을 감소시키는 것으로 나타났다. 또한, 발 부종율을 감소시키며, 활성산소를 제거하는 역할을 하는 SOD를 증가시킨다.The herbal composition of the present invention prevents the separation of proteoglycan and prostaglandin E ₂ from chondrocytes, thereby reducing the concentration of the substance in the synovial fluid, inhibiting the production of nitric oxide, the expression of MMP-9 and cyclooxygenase 2 It has been shown to reduce the symptoms of winding by acetic acid. It also reduces paw edema and increases SOD, which serves to remove free radicals.

본 발명의 생약 조성물은 골관절염의 정도에 따라 증가하는 활액의 양을 감소시키고, 연골 파열시 활액 내로 방출되는 총단백질의 양을 감소시키며, 프로테오글리칸의 활액 내의 함량을 감소시켜 발생된 골관절염의 진행을 방지하는 효과를 갖는다. The herbal composition of the present invention reduces the amount of synovial fluid that increases with the degree of osteoarthritis, reduces the amount of total protein released into the synovial fluid upon cartilage rupture, and reduces the content of proteoglycan in the synovial fluid to prevent the progression of osteoarthritis caused Has an effect.

또한, 골관절염은 손상된 연골 세포가 재증식됨에 따라서 근본적인 치료가 가능하다. 이러한 연골 세포의 재증식은 관절 연골의 외관상 관찰 및 사프라닌-O(Safranin-O) 염색으로 활액막 세포의 분포 및 표면을 관찰함으로서 판단할 수 있다. 일반적으로 골관절염이 발생하였던 연골조직에 있어서, 연골세포가 증식되었는지 여부는 손상되었던 연골조직의 표면이 매끄러워짐에 따라서 판단할 수 있다. 또한, 사프라닌-O(Safranin-O) 염색에 있어서, 골관절염이 유도된 세포에서는 연골 조직이 파괴되어 연골 조직을 관찰할 수 없는데 반해, 연골 조직이 재생된 세포는 대조군에 비하여 붉은색으로 염색된 정도와 염색 부위 상부의 생성 정도를 통하여 골관절염의 완화 및 연골세포의 증식여부를 판단할 수 있다.In addition, osteoarthritis is fundamentally curable as damaged cartilage cells repopulate. The repopulation of such cartilage cells can be judged by observing the surface and distribution of synovial membrane cells by visual observation of articular cartilage and safranin-O staining. In general, in cartilage tissue in which osteoarthritis has occurred, whether or not chondrocytes have proliferated can be determined as the surface of the damaged cartilage tissue becomes smooth. In addition, in safranin-O staining, cartilage tissue is destroyed and the cartilage tissue is not observed in the osteoarthritis-induced cells, whereas the cells in which the cartilage tissue is regenerated are stained in red as compared to the control group. It is possible to determine whether the osteoarthritis is relieved and the chondrocytes proliferate through the degree of formation and the degree of formation of the upper part of the staining site.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention are described. However, the following examples are only preferred embodiments of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시예Example 1: 인진, 1: injin, 갈근Rooting , 차조기 1 : 1 : 1의 에탄올 추출물의 제조Of Ethanol Extract of Perilla, Perilla 1: 1, 1: 1

수돗물로 잘 세척하여 불순물을 제거하고 하루 동안 건조시킨 인진 40 g, 그늘에서 잘 말려진 갈근 40 g, 차조기 40 g(중량비 1: 1: 1)을 준비하여 70%(v/v) 에탄올 수용액 2ℓ를 가한 후, 2시간 동안 환류 추출장치(Heating mantle [제조원:Glass-Col], Flask[제조원:Corning], Condenser[제조원:Corning])를 이용하여 추출하고 Whatman No.2에 여과한 후 감압 농축하여 복합 추출물 실시예 414.9 g을 얻었다. Wash well with tap water to remove impurities and dry 40g of phosphorus dried for one day, 40g of dried dry root in the shade, and 40g of perilla (weight ratio 1: 1) to prepare 70% (v / v) ethanol solution 2ℓ After the addition, extraction was carried out using a reflux extractor (Heating mantle [Glass-Col], Flask [Corning], Condenser], Condenser [Corning]) for 2 hours, filtered under Whatman No. 2, and concentrated under reduced pressure. 414.9 g of a composite extract Example was obtained.

실시예Example 2: 인진, 2: injin, 갈근Rooting , 차조기 5 : 3 : 2의 에탄올 추출물의 제조Preparation of Ethanol Extracts of Aperture 5: 3: 2

불순물을 제거하고 잘 건조시킨 인진 50 g, 그늘에서 잘 말려진 갈근 30 g, 차조기 20 g(중량비 5 : 3: 2)에 대하여 실시예 1과 같은 방법으로 복합 추출물 19.3 g을 얻었다. 19.3 g of the composite extract was obtained in the same manner as in Example 1 with respect to 50 g of dried phosphorus, 30 g of dried fine roots in a shade, and 20 g of aperitifolium (weight ratio 5: 3: 2).

실시예Example 3: 인진, 3: injin, 갈근Rooting , 차조기 3 : 5 : 2의 에탄올 추출물의 제조, Ethanol Extract of Perilla 3: 5: 2

불순물을 제거하고 잘 건조시킨 인진 30 g, 그늘에서 잘 말려진 갈근 50 g, 차조기 20 g(중량비 5 : 3: 2)에 대하여 실시예 1과 같은 방법으로 복합 추출물 16.2 g을 얻었다. 16.2 g of the composite extract was obtained in the same manner as in Example 1 for 30 g of dried phosphorus, 50 g of dried root, 50 g of dried root in shade, and 20 g of perilla (weight ratio 5: 3).

실시예Example 4: 인진, 4: injin, 갈근Rooting , 차조기 3 : 3 : 4의 에탄올 추출물의 제조 Preparation of Ethanol Extracts of Aperture 3: 3: 4

수돗물로 잘 세척하여 불순물을 제거하고, 하루동안 건조시킨 인진 30 g, 그늘에서 잘 말려진 갈근 30 g, 차조기 40 g(중량비 3 : 3: 4)을 준비하여 실시예 1과 같은 방법으로 복합 추출물 15.8 g을 얻었다. Wash well with tap water to remove impurities, prepare 30 g of dried phosphorus dried for one day, 30 g of well-dried dry root in the shade, 40 g (percent ratio 3: 3 of 4), extract the complex in the same manner as in Example 1 15.8 g were obtained.

실시예Example 5: 에탄올 추출물을 포함하는 캡슐제의 제조 5: Preparation of Capsules Containing Ethanol Extract

하기 표 1과 같은 조성비로 캡슐제를 제조하였다.To prepare a capsule in a composition ratio as shown in Table 1.

실시예Example 6: 인진, 6: Injin, 갈근Rooting , 차조기 3 : 3 : 4의 에틸아세테이트 추출물의 제조Preparation of Ethyl Acetate Extract of Perilla, 3: 3: 4

수돗물로 잘 세척하여 불순물을 제거하고 하루 동안 건조시킨 인진 60 g, 그늘에서 잘 말려진 갈근 60 g, 차조기 80 g(중량비 3: 3: 4)을 준비하여 에틸아세테이트 2ℓ를 가한 후, 3시간 동안 환류 추출장치(Heating mantle [제조원:Glass-Col], Flask[제조원:Corning], Condenser[제조원:Corning])를 이용하여 추출하고 Whatman No.2에 여과한 후 감압 농축하여 복합 추출물 실시예 1.21 g을 얻었다. After washing well with tap water to remove impurities, dried 60g phosphorus dried for one day, 60g dried root in the shade, 80g of aggi (weight ratio 3: 3: 4), and 2 liters of ethyl acetate were added, followed by 3 hours Extracted using a reflux extractor (Heating mantle [Glass-Col], Flask [Corning], Condenser], Condenser [Corning]), filtered in Whatman No. 2, concentrated under reduced pressure, and combined extract Example 1.21 g Got.

실시예Example 7: 7: 인진의Human 단일 에틸아세테이트 추출물의 제조 Preparation of Single Ethyl Acetate Extract

수돗물로 잘 세척하여 불순물을 제거하고, 하루 동안 건조시킨 인진 200g을 준비하여 에틸아세테이트 2 ℓ를 가한 후, 3 시간 동안 환류 추출 장치 (Heating mantle [제조원:Glass-Col], Flask [제조원:Corning], Condenser [제조원:Corning])를 이용하여 추출하고 Whatman No.2에 여과한 후 감압 농축하여 인진 건조물 1.15 g을 얻었다. Wash well with tap water to remove impurities, prepare 200g of dried phosphorus for one day, add 2 liters of ethyl acetate, and reflux for 3 hours (Heating mantle [Glass-Col], Flask [Corning]). , Condenser [manufactured by: Corning]), extracted with Whatman No. 2, and then concentrated under reduced pressure to give 1.15 g of a dried plant.

실시예Example 8: 8: 갈근의Coarse 단일 에틸아세테이트 추출물의 제조 Preparation of Single Ethyl Acetate Extract

수돗물로 잘 세척하여 불순물을 제거하고 하루 동안 건조시킨 갈근 200 g에 대하여 상기 실시예 7과 같은 방법으로 갈근 건조물 1.06 g을 얻었다. 1.06 g of the dried root was obtained in the same manner as in Example 7 with respect to 200 g of the dried root which was washed well with tap water to remove impurities and dried for one day.

실시예Example 9: 차조기의 단일 에틸아세테이트 추출물의 제조 9: Preparation of Single Ethyl Acetate Extract of Perilla

수돗물로 잘 세척하여 불순물을 제거하고 그늘에서 잘 말려진 차조기 200 g에 대하여 상기 실시예 7과 같은 방법으로 차조기 건조물 1.37 g을 얻었다.Washing well with tap water to remove impurities and 1.37 g of dried persimmon was obtained in the same manner as in Example 7 with respect to 200 g of the persimmon well dried in the shade.

비교예Comparative example 1: One: 인진의Human 단일 에탄올 추출물의 제조 Preparation of Single Ethanol Extracts

수돗물로 잘 세척하여 불순물을 제거하고, 하루 동안 건조시킨 인진 75 g을 세절하여 70%(v/v) 에탄올 수용액 2 ℓ를 가한 후 2 시간 동안 환류 추출 장치 (Heating mantle [제조원:Glass-Col], Flask [제조원:Corning], Condenser [제조원:Corning])를 이용하여 추출하고 Whatman No.2에 여과한 후 감압 농축하여 인진 건조물 13.7 g을 얻었다. After washing well with tap water to remove impurities, 75 g dried phosphorus was dried for 1 day, and 2 l of a 70% (v / v) ethanol aqueous solution was added thereto. , Flask [manufacturer: Corning], Condenser [manufacturer: Corning]) was extracted, filtered through Whatman No. 2, and concentrated under reduced pressure to obtain 13.7 g of phosphorus dried.

비교예Comparative example 2: 2: 갈근의Coarse 단일 에탄올 추출물의 제조 Preparation of Single Ethanol Extracts

불순물을 제거하고 잘 건조시킨 갈근 75 g을 비교예 1과 같은 방법으로 제조하여 갈근 건조물 15.2 g을 얻었다. 75 g of the dried root, which had been freed of impurities, was dried in the same manner as in Comparative Example 1 to obtain 15.2 g of dried root.

비교예Comparative example 3: 차조기의 단일 에탄올 추출물의 제조 3: Preparation of Single Ethanol Extract of Perilla

그늘에서 잘 말려진 차조기 100 g에 대하여 비교예 1과 같은 방법으로 차조기 건조물 21.2 g을 얻었다. With respect to 100 g of the perilla well dried in the shade, 21.2 g of the perilla dried product was obtained in the same manner as in Comparative Example 1.

실험예Experimental Example 1: 토끼 연골조직에서 일산화질소 생성 억제 효과 1: Inhibitory Effect of Nitric Oxide Production on Rabbit Cartilage

생약 조성물 실시예 1 내지 4 및 실시예 6 내지 9와 비교예 1 내지 3의 조성물의 소염작용을 확인하기 위해 연골조직에서 염증반응물질 일산화질소의 생성 억제 활성실험을 실시하였다.Herbal composition In order to confirm the anti-inflammatory action of the compositions of Examples 1 to 4 and Examples 6 to 9 and Comparative Examples 1 to 3 was conducted to inhibit the production of inflammatory reactant nitrogen monoxide in cartilage tissue.

2-3 주령의 토끼 관절로부터 연골조직을 분리하여 조직 세포분리하였다. 10 %의 소태아혈청 (fetal bovine serum, 26140-079. 제조원: Gibco), 100 U/ml 페니실린, 및 10㎍/ml 스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지를 포함한 24 well plate에 1 x 10⁶ 개의 토끼 연골조직세포를 접종하고 5-6일 동안 37 ℃, 5% CO₂, 습윤조건하에서 배양하였다. 연골조직세포가 80%정도 자랐을 때, 배지는 serum free DMEM으로 바꾸고, 대조군을 제외한 모든 well에 Lipopolysaccharide-Cytokine Mixture(이하 LCM)을 처리하여 20분간 반응시켰다. 그 후 대조군, 음성(Negative) 대조군에는 용매인 DMSO만 처리하고 실험군에는 실시예 1 내지 4 및 실시예 6 내지 9와 비교예 1 내지 3의 조성물을 300 ug/ml의 농도가 되도록 투여한 후, 16 시간 동안 배양하였다. 특히 실시예 4에 대해서는 100, 200, 300 ug/ml의 농도가 되도록 투여하여 소염 작용에 대한 농도 의존적 효과를 보고자 하였고, 실시예 6에 대해서는 50, 100, 200, 300, 600 ug/ml의 농도가 되도록 투여하여 소염 작용에 대한 농도 의존적 효과를 보고자 하였다. 그 다음 배지와 그리스 시약을 1:1의 비율로 혼합하고 상온에서 10분간 방치 후 흡광도 측정기로 파장 540nm에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과는 다음 도 1-a 내지 1-c 및 도 14와 15에 나타낸 바와 같다.Cartilage tissue was isolated from rabbit joints of 2-3 weeks of age and tissue cells were isolated. 1 x 10 ⁶ rabbit cartilage in a 24 well plate containing DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (26140-079. From Gibco), 100 U / ml penicillin, and 10 μg / ml streptomycin. Tissue cells were seeded and incubated under 37 ° C., 5% CO ₂ , wet conditions for 5-6 days. When the chondrocytes were grown to about 80%, the medium was changed to serum-free DMEM, and all the wells except the control were treated with Lipopolysaccharide-Cytokine Mixture (hereinafter LCM) for 20 minutes. Thereafter, the control group and the negative control group were treated only with DMSO as a solvent, and the experimental groups were administered with the compositions of Examples 1 to 4 and Examples 6 to 9 and Comparative Examples 1 to 3 at a concentration of 300 ug / ml, Incubated for 16 hours. In particular, in Example 4, the concentration of 100, 200, 300 ug / ml was administered to see the concentration-dependent effect on the anti-inflammatory action, in Example 6 50, 100, 200, 300, 600 ug / ml concentration To determine the concentration-dependent effect on anti-inflammatory activity by administering to. Then, the medium and the grease reagent were mixed at a ratio of 1: 1 and left at room temperature for 10 minutes, and the absorbance was measured at an absorbance meter at a wavelength of 540 nm. The results are shown in FIGS. 1-a to 1-c and FIGS. 14 and 15. As shown.

도 1-a 에서 보는 바와 같이 실시예 4의 조성물은 비교예 1 내지 3 조성물보다 효과적으로 일산화질소의 생성을 억제하고 있었다. 그리고, 다양한 약재의 비율을 적용한 실시예 1 내지 3보다 실시예 4가 소염 작용에 더 효과적임을 알 수 있다. 특히 도1-c는 실시예 4의 조성물이 토끼 연골 조직 세포에서 농도의존적으로 일산화질소 생성을 억제함을 보여 준다. 이를 보아 실시예 4의 조성물이 악화된 관절 부위의 소염 작용에 효과적임을 알 수 있다. As shown in Fig. 1-A, the composition of Example 4 more effectively inhibited the generation of nitrogen monoxide than the Comparative Examples 1 to 3 compositions. And, it can be seen that Example 4 is more effective in anti-inflammatory action than Examples 1 to 3 to which various ratios of medicines are applied. In particular, Figure 1-c shows that the composition of Example 4 inhibits nitric oxide production in a concentration-dependent manner in rabbit cartilage tissue cells. It can be seen that the composition of Example 4 is effective for anti-inflammatory action of the deteriorated joint site.

도 14에서 보는 바와 같이, 실시예 6 내지 9의 조성물은 효과적으로 일산화질소의 생성을 억제하였고, 효과적으로 일산화질소의 생성을 억제하였고, 특히 실시예 6의 조성물은 실시예 7 내지 9에 비하여 우수한 일산화질소의 생성 억제 효과를 나타내었다. 또한 도 15에서 보는 바와 같이, 실시예 6의 조성물은 농도의존적으로 일산화질소의 생성을 억제하였다. 이를 보아, 실시예 6 내지 9의 조성물이 관절 부위의 소염 작용에 효과적임을 알 수 있다.As shown in FIG. 14, the compositions of Examples 6 to 9 effectively inhibited the production of nitrogen monoxide, effectively inhibited the production of nitrogen monoxide, and in particular, the composition of Example 6 was superior to Examples 7-9. It showed an inhibitory effect on production. In addition, as shown in Figure 15, the composition of Example 6 inhibited the production of nitrogen monoxide in a concentration-dependent. From this, it can be seen that the compositions of Examples 6 to 9 are effective for anti-inflammatory action of the joint site.

실험예Experimental Example 2: 토끼 연골 조직에서 프로스타글란딘 2: prostaglandins in rabbit cartilage tissue EE ₂₂ ( ( prostaglandinprostaglandin EE ₂₂ , , PGEPGE ₂₂ ) 생성 억제 효과) Inhibitory effect on production

실시예 4 조성물의 소염작용을 확인하기 위해 토끼 연골 조직 세포에서 염증반응물질 프로스타글란딘 E₂의 생성 억제 활성실험을 실시하였다. 이를 위하여 Cayman사의 PGE₂ 면역분석키트를 사용하였다.Example 4 In order to confirm the anti-inflammatory effect of the composition, the activity of inhibiting the production of the inflammatory reactant prostaglandin E ₂ in rabbit cartilage tissue cells was performed. Cayman's PGE ₂ immunoassay kit was used for this purpose.

실험예 1과 같은 방법으로 1 x 10⁶개의 토끼 연골 조직 세포에, 대조군을 제외한 모든 well에 LCM 을 처리하고 20분 반응시킨 후, 실시예 4에 의해 제조된 조성물을 100, 200, 300 ㎍/ml의 농도로 처리하고 16시간 동안 배양하였다. 효소 결합 면역 분석 키트에 배양한 배지 50 ㎕, PGE₂-AchE2 Tracer 50ul, PGE₂ Monoclonal Antibody 50㎕ 를 넣고 4 ℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 발색시약인 Ellman s reagent 200ul 를 각 well에 넣고 암실에서 60 내지 90분 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 흡광도 측정기를 이용하여 405nm 의 파장에서 흡광도를 측정한 결과를 도 2에 나타냈다.In the same manner as in Experiment 1, 1 x 10 ⁶ rabbit cartilage tissue cells were treated with LCM in all wells except the control and reacted for 20 minutes, and then the composition prepared in Example 4 was 100, 200, 300 µg / Treated at a concentration of ml and incubated for 16 hours. 50 μl of culture medium, 50 μl of PGE ₂ -AchE2 Tracer, and 50 μl of PGE ₂ Monoclonal Antibody were added to the enzyme-linked immunoassay kit and reacted at 4 ° C. for 18 hours. After the reaction, 200ul of color reagent Ellman s reagent was added to each well and reacted in the dark for 60 to 90 minutes. After the reaction, the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm using an absorbance meter.

도 2에서 나타나듯이, 실시예 4에 따라 제조된 조성물은 토끼의 연골 조직 세포에서 농도 의존적으로 프로스타글란딘 E₂의 생성을 억제하였다.As shown in Figure 2, the composition prepared according to Example 4 inhibited the production of prostaglandin E ₂ concentration-dependently in rabbit cartilage tissue cells.

실험예Experimental Example 3: 토끼 연골 조직 세포에서의 3: in rabbit cartilage tissue cells 프로테오글리칸Proteoglycan 분해 억제효과 Degradation inhibitory effect

실시예 4 및 실시예 6 내지 실시예 9에 의해 제조된 조성물의 관절조직 보호효과를 실험하기 위하여, 프로테오글리칸 분해 억제 활성실험을 실시하였다. In order to test the protective effect of the joint tissue of the composition prepared in Example 4 and Examples 6 to 9, proteoglycan degradation inhibitory activity test was performed.

토끼 연골 조직 세포의 배양은 실험예 1과 같이, 2 내지 3 주령의 토끼 관절로부터 연골 조직을 분리하였다. 분리한 조직 세포는 24 well에 10% 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 100U/ml Penicillin, 10 ㎍/ml Streptomycin을 포함한 DMEM 배지를 이용하여 1 x 10⁶ 개로 접종한다. 접종 후 5 ~ 6일 동안 세포를 37℃에서 5% CO₂ 습윤 조건하에서 배양하였다. 토끼 연골 조직 세포가 80% 정도 자랐을 때, SFM(Serum Free Media)로 바꾸고, 대조군을 제외한 모든 well에 LCM(Lipopolysaccharide-Cytokine Mixture)을 처리하고 20분 동안 반응시킨 후, 실시예 4 에 따른 조성물의 경우, 100, 200, 300 ㎍/ml의 농도로 투여한 후 16시간 동안 배양하였고, 실시예 6에 따른 조성물의 경우, 50, 100, 200, 300, 600 ug/ml의 농도로 투여한 후 16시간 동안 배양하였으며, 실시예 7 내지 9에 따른 조성물의 경우, 300 ㎍/ml의 농도로 투여한 후 16시간 동안 배양하였다.Culture of rabbit cartilage tissue cells, cartilage tissue was isolated from rabbit joints of 2-3 weeks old, as in Experiment 1. Tissue cells isolated were inoculated in 1 x 10 ⁶ cells using DMEM medium containing 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 100 U / ml Penicillin, and 10 μg / ml Streptomycin in 24 wells. Cells were incubated at 37 ° C. under 5% CO ₂ wet conditions for 5-6 days after inoculation. When rabbit cartilage tissue cells were grown to about 80%, changed to SFM (Serum Free Media), treated with LCM (Lipopolysaccharide-Cytokine Mixture) to all wells except the control and reacted for 20 minutes, the composition of Example 4 In this case, the cells were administered at a concentration of 100, 200, 300 μg / ml, and then incubated for 16 hours. The cells were cultured for a period of time, and for the compositions according to Examples 7 to 9, the cultures were administered for 16 hours after administration at a concentration of 300 μg / ml.

위의 실험 방법을 통하여 토끼 연골 조직의 구성 성분인 프로테오글리칸의 분해를 유발시켜 배양액 내의 프로테오글리칸의 분해 산물인 글루코스아미노글리칸(Glucosaminoglycan, GAG)을 1-9,-디메틸메틸블루 발색제(1-9,-Dimethylmethylene blue dye, DMB)에 의해 발색된 정도를 525 nm에서 흡광도를 측정한 후, Chondroitin sulfate로 표준 정량하였다. 그 결과는 다음의 도 3 및 도 16과 도 17에 나타내었다. Through the above experimental method, the decomposition of proteoglycans, which is a component of rabbit cartilage tissue, was induced, and thus, glucose aminoglycan (GAG), which is a degradation product of proteoglycans, was added to 1-9, -dimethylmethylblue colorant (1-9, -Dimethylmethylene blue dye (DMB) was measured for absorbance at 525 nm, and then quantified by Chondroitin sulfate. The results are shown in the following FIGS. 3 and 16 and 17.

도 3에서 보는 바와 같이 실시예 4에 따라 제조된 조성물은 토끼의 연골 조직 세포에서 농도 의존적으로 프로테오글리칸 분해를 억제하였다. As shown in FIG. 3, the composition prepared according to Example 4 inhibited proteoglycan degradation in a concentration-dependent manner in rabbit cartilage tissue cells.

도 16에서 보는 바와 같이, 실시예 6 내지 9의 조성물은 대조군에 비해 효과적으로 프로테오글리칸의 분해를 억제하고 있으며, 특히 실시예 6의 조성물은 실시예 7 내지 9에 비하여 우수한 일산화질소의 생성 억제 효과를 나타내었다. 또한, 도 17에서 보는 바와 같이, 실시예 6의 조성물은 토끼의 연골 조직 세포에서 농도 의존적으로 프로테오글리칸 분해를 억제하였다.As shown in FIG. 16, the compositions of Examples 6 to 9 effectively inhibit the degradation of proteoglycans compared to the control group, and in particular, the composition of Example 6 exhibited an excellent effect of inhibiting the production of nitrogen monoxide compared to Examples 7 to 9. It was. In addition, as shown in Figure 17, the composition of Example 6 inhibited proteoglycan degradation in a concentration-dependent manner in the cartilage tissue cells of rabbits.

실험예Experimental Example 4 : 토끼 연골 관절 조직 세포에서의 분해효소 매트리스 4: Degrading Enzyme Mattress in Rabbit Cartilage Joint Tissue Cells 메탈로프로테나제Metalloproteinases -9 (-9 ( MMPMMP -9)의 활성억제 효과-9) activity inhibitory effect

실시예 4에 따른 조성물의 관절조직 분해효소 활성 억제효과를 확인하기 위하여 MMP-9의 활성실험을 하였다.In order to confirm the inhibitory effect of the articular degrading enzyme activity of the composition according to Example 4, the activity test of MMP-9 was performed.

실험예 1와 같이 2 ~ 3 주령의 토끼 관절로부터 연골 조직을 분리하여 24 well에 10% 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 100U/ml 페니실린, 10㎍/ml 스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지를 이용하여 1 x 10⁶개의 세포를 접종하였다. 접종 후 5 ~ 6일 동안 세포를 37℃에서 5% CO₂ 습윤 조건하에서 배양하였다. 토끼 연골 조직 세포가 80% 정도 자랐을 때, serum Free DMEM으로 바꾸고, 대조군을 제외한 모든 well에 LCM을 처리하고 20분 동안 반응시킨 후, 실시예 4의 조성물을 100, 200, 300 ㎍/ml 의 농도로 투여한 후 16시간 동안 배양하였다.Cartilage tissue was isolated from rabbit joints of 2 to 3 weeks of age, as in Experiment 1, and DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U / ml penicillin and 10 µg / ml streptomycin in 24 wells 1 x 10 ⁶ cells were inoculated. Cells were incubated at 37 ° C. under 5% CO ₂ wet conditions for 5-6 days after inoculation. When rabbit cartilage tissue cells grew about 80%, the cells were changed to serum free DMEM, treated with LCM in all wells except the control, and reacted for 20 minutes. The composition of Example 4 was prepared at concentrations of 100, 200, and 300 ㎍ / ml. Incubated for 16 hours after administration.

16시간 동안 배양된 세포로부터 원심분리(centrifuge)하여 상등액을 얻고 세포 파편(cell debris)을 제거하였다. 상등액 샘플과 염료(dye)를 섞은 후, 37 ℃ 에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 10% Zymogram gel (Novex EC61752)을 이용하여 100 V, 3 시간 동안 SDS-PAGE를 실시하였다. Gel Renaturing 과정을 실온에서 흔들어 주며 30분씩 3회 세척하고, gel을 Developing buffer에 담근 후, 48 시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 전개(developing)시켰다. 반응 후 쿠마시 G 블루 염료를 이용하여 gel을 염색하고, 밴드를 제외한 나머지 부분을 탈색 시킨 후 92 kDda의 MMP-9 밴드를 확인하여 도 4에 나타내었다.Supernatants were obtained by centrifuge from cells incubated for 16 hours to remove cell debris. The supernatant sample and dye were mixed and incubated at 37 ° C. for one hour. SDS-PAGE was performed at 100 V for 3 hours using a 10% Zymogram gel (Novex EC61752). The gel Renaturing process was shaken at room temperature three times for 30 minutes, the gel was soaked in Developing buffer, and then developed in a 37 ° C. incubator for 48 hours. After the reaction, the gel was stained using Coomassie G blue dye, and the remaining parts except the band were decolorized, and the MMP-9 band of 92 kDda was confirmed and shown in FIG. 4.

도 4에서 보는 바와 같이 실시예 4의 조성물은 관절조직 분해효소 MMP-9의 활성을 농도의존적으로 억제하였으며, 300 ug/ml에서 대조군 수준까지 감소되는 것을 확인하였다. As shown in FIG. 4, the composition of Example 4 inhibited the activity of the articular tissue degrading enzyme MMP-9 in a concentration-dependent manner, and was confirmed to be reduced to the control level at 300 ug / ml.

실험예Experimental Example 5 : 토끼 연골 조직 세포에서의 급성염증유발인자 억제 효과 5: Inhibitory Effects of Acute Inflammatory Factors on Rabbit Cartilage Tissue Cells

실시예 4에 의해 제조된 조성물이 통증 유발 물질인 프로스타글란딘을 합성하는 효소인 사이클로옥시게나제 2(Cyclooxygenase 2, 이하 'COX-2'라고 함)의 발현에 미치는 효과를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿(western blot)방법을 이용하였다.Western blot to determine the effect of the composition prepared in Example 4 on the expression of cyclooxygenase 2 (hereinafter referred to as 'COX-2'), an enzyme that synthesizes prostaglandins, a pain-causing substance blot) method was used.

토끼 연골 조직 세포의 실험 조건은 실험예 1과 동일하게 수행하여 준비하였다. 실시예 4의 조성물 및 LCM을 처리하여 배양한 세포의 배지를 제거하고 추출완충용액 (0.32M 슈크로오스 [S0389,제조원:Sigma], 0.2M HEPES [H3375, 제조원:Sigma], 1mM EDTA [808288, 제조원: BM], 1mM PMSF [P7627, 제조원: Sigma], 10ug/ml 아프로티닌 [A1153, 제조원: Sigma], 10ug/ml 류펩킨 [L0649, 제조원:Sigma])으로 세포를 분리하여 단백질을 정량한 후 20 ㎍의 단백질을 SDS (sodium dodecyl sulfate) 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 단백질을 PVDF (polyvinylidene difluoride, IPVH00010, 제조원: Millipore)막에 옮겨 5% NFDM (non fat dry milk)용액과 반응시키고 1차 항체, 2차 항체 순서대로 반응시킨 후 ECL 시약으로 발색시켜 X-ray 필름에 노출시켰다. 1차 항체로는 COX-2 (sc-1745, 제조원: Santacruze) 2 ㎍/ml을 사용하였고, 2차 항체로는 Anti-Rabbit-IgG-HRP (sc-2004, 제조원 : Santacruze) 80 ng/ml을 사용하여 결과를 도 5에 나타냈다.Experimental conditions for rabbit cartilage tissue cells were prepared in the same manner as in Experiment 1. Remove the medium of the cultured cells treated with the composition of Example 4 and LCM and extract buffer (0.32M sucrose [S0389, Sigma], 0.2M HEPES [H3375, Sigma], 1mM EDTA [808288] , BM], 1mM PMSF [P7627, Sigma], 10ug / ml aprotinin [A1153, Sigma], 10ug / ml leupekin [L0649, Sigma] Then, 20 μg of protein was subjected to SDS (sodium dodecyl sulfate) 10% polyacrylamide gel electrophoresis. The electrophoretic protein was transferred to PVDF (polyvinylidene difluoride, IPVH00010, Millipore) membrane and reacted with 5% NFDM (non fat dry milk) solution, followed by primary and secondary antibodies, followed by color development with ECL reagent. Exposed to X-ray film. 2 μg / ml of COX-2 (sc-1745, Santacruze) was used as the primary antibody, and Anti-Rabbit-IgG-HRP (sc-2004, Santacruze) 80 ng / ml was used as the secondary antibody. The results are shown in FIG. 5 using.

도 5에서 보는 바와 같이, 실시예 4에 따라 제조된 조성물은 토끼의 연골 조직 세포에서 100 ug/ml 농도에서 정상 상태의 수준까지 COX-2의 발현이 억제되어 매우 좋은 효과를 보이고 있었다. As shown in FIG. 5, the composition prepared according to Example 4 exhibited a very good effect of inhibiting the expression of COX-2 from the concentration of 100 ug / ml in rabbit cartilage tissue cells to a steady state level.

실험예Experimental Example 6 : 연골 세포 증식 효과의 관찰 6: Observation of chondrocyte proliferation effect

실시예 4에 의해 제조된 조성물의 연골 재생 효과를 확인하기 위하여 뉴질랜드 흰토끼의 양쪽 뒷다리 관절 부위에 전십자인대 횡절단술(ACLT;Anteior Crucuate Ligament Tansection)을 시술하여 3일 후부터 2주 동안 5 x 5 ㎥ 의 공간에서 지속적으로 운동시켜 관절염을 유도한 후, 실시예 4의 조성물을 한 달 동안 경구 투여하였다. 실험이 종료된 후에 토끼의 관절 연골을 채취하여 연골 세포 증식 효과를 비교하여 보았다. 대조군으로는 조성물을 투여하지 아니한 토끼의 관절 연골을 채취하여 관찰하였다.To confirm the cartilage regeneration effect of the composition prepared in Example 4, anterior cruciate ligament (ACLT) was performed on both hind limb joints of New Zealand white rabbits, and 5 x 5 for 2 weeks after 3 days. After inducing arthritis by continuously exercising in a space of m 3, the composition of Example 4 was orally administered for one month. After the experiment was completed, the joint cartilage of rabbits were collected and compared to the effect of cartilage cell proliferation. As a control, articular cartilage of rabbits not administered the composition was collected and observed.

도 6에 나타나듯이, 실시예 4를 경구 투여한 토끼에서는 외관상 관절 연골 부위의 표면이 매끄러운 반면, 대조군에서는 관절 연골 손상으로 인해 표면이 매우 불규칙하고 거칠어진 것을 확인할 수 있었다. 이를 보아, 실시예 4의 조성물을 투여하는 경우, 손상된 연골 세포의 재생효과가 우수함을 알 수 있다.As shown in FIG. 6, in the rabbit orally administered to Example 4, the surface of the articular cartilage was smooth in appearance, whereas in the control group, the surface was very irregular and rough due to articular cartilage damage. In view of this, it can be seen that when the composition of Example 4 is administered, the regeneration effect of damaged cartilage cells is excellent.

실험예Experimental Example 7 : 관절염 유도된 실험동물에서 7: arthritis induced in experimental animals 관절활액의Joint synovial fluid 총량 측정 Gross measurement

골관절염의 정도에 따라 활액 양의 변화가 보고되어 있어, 실험예 6과 같이 골관절염을 유도한 후, 실시예 4에 의한 활액 양의 변화를 알기 위해 경구 투여 2주, 4주에 각각 활액의 총량을 측정하였다. 대조군으로는 상기의 방법으로 골관절염을 유도한 후, 조성물을 투여하지 아니한 토끼의 관절활액의 양을 측정하였다.The amount of synovial fluid has been reported according to the degree of osteoarthritis. After inducing osteoarthritis as in Experimental Example 6, the total amount of synovial fluid was administered at 2 and 4 weeks of oral administration to know the change in the amount of synovial fluid according to Example 4. Measured. As a control, after inducing osteoarthritis by the above method, the amount of the joint synovial fluid of the rabbit which did not administer the composition was measured.

활액의 양은 활액의 Ca² ⁺의 농도를 비소아조 Ⅲ 착화 방법(Arsenazo Ⅲ complexion method)[Micaylova Ⅴ. Et al., Anal. Chim. Acta, 53(194), 1971]를 이용하여 측정하였고, 활약의 총량은 도난 평형 방정식(Donnan equilibrium equation)을 사용하여 계산하였다. 사용된 비소아조 Ⅲ 시약(Arsenazo Ⅲ reagent, [제조원 Sigma]) 1 ㎖과 관절활액 0.01 ㎖를 섞고, 실온에서 5분 동안 방치한 후 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험예의 결과는 도 7과 표 2에 나타냈다.The amount of synovial fluid azo arsenic to a concentration of Ca ^²⁺ in the synovial fluid Ⅲ ignition method (Arsenazo Ⅲ complexion method) [Micaylova Ⅴ. Et al., Anal. Chim. Acta, 53 (194), 1971], and the total amount of activity was calculated using the Donnan equilibrium equation. 1 ml of Arsenazo III reagent (manufactured by Sigma, Inc.) and 0.01 ml of the joint synovial fluid were mixed, left at room temperature for 5 minutes, and the absorbance was measured at 600 nm. The results of this experimental example are shown in Figure 7 and Table 2.

도 7과 표 2에서 나타나듯이, 대조군은 0.76 ㎖로 증가하였으나, 실시예 4를 경구 투여한 토끼에서는 대조군과 비교하여 보았을 때, 0.39 ㎖ 로 증가 폭이 감소하여 활액의 부피 증가를 억제하는 효과를 가지는 것을 알 수 있다.As shown in FIG. 7 and Table 2, the control group increased to 0.76 ml, but in the rabbit orally administered Example 4, the increase was decreased to 0.39 ml when compared to the control group to suppress the volume increase of the synovial fluid. It can be seen that it has.

실험예Experimental Example 8 : 관절염 유도된 실험동물에서 8: Arthritis Induced in Experimental Animals 관절활액의Joint synovial fluid 프로테오글리칸(Proteoglycan)양 측정 Determination of Proteoglycan

실험예 6에서 얻은 실시예 4의 조성물을 투여한 경우 및 대조군의 관절활액을 이용하여, 관절 조직 보호 효과를 알아보기 위해 활액 내의 프로테오글리칸 농도를 실험예 3과 동일한 방법으로 측정하였다. 본 실험예에서 측정한 결과는 도 8과 표 3에 나타내었다.In the case of administering the composition of Example 4 obtained in Experimental Example 6 and using the joint synovial fluid of the control group, the proteoglycan concentration in the synovial fluid was measured in the same manner as in Experimental Example 3 to determine the protective effect of the joint tissue. The results measured in this experimental example are shown in Figure 8 and Table 3.

도 8과 표 3에서 나타나듯이, 대조군에서는 16.38 ㎍/㎕로 60.12% 증가하였으나, 실시예 4를 4주 동안 경구 투여한 군에서는 9.06 ㎍/㎕ 로 활액 내 증가된 프로테오글리칸 함량이 36.66% 정도 감소하여 관절 조직의 보호에 좋은 효과를 보이고 있음을 알 수 있었다.As shown in FIG. 8 and Table 3, the control group increased by 60.12% to 16.38 μg / μl, but in the group given oral administration of Example 4 for 4 weeks, the increased proteoglycan content in the synovial fluid decreased by 36.66% to 9.06 μg / μl. It can be seen that it has a good effect on the protection of joint tissue.

실험예Experimental Example 9 : 관절염 유도된 실험동물에서 9: arthritis induced in experimental animals 관절활액의Joint synovial fluid 총단백질( Total protein ( TotalTotal Protein) 양 측정 Protein) Volume Measurement

골관절염이 진행되면 연골이 파열되어 활액 내로 총단백질이 방출되므로 골관절염의 억제를 알아보기 위하여 활액 내의 총단백질 농도를 측정하였다. 실험예 6에서 얻은 실시예 4의 조성물을 투여한 경우 및 대조군의 관절활액을 이용하였으며, 활액 내의 총 단백질의 농도는 브래드포드 방법(Bradford method)으로 595nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 본 실험예에서 측정한 결과는 도 9와 표 4에 나타냈다.As osteoarthritis progressed, cartilage ruptured and total protein was released into the synovial fluid. Therefore, total protein concentration in the synovial fluid was measured to investigate the inhibition of osteoarthritis. In the case of administration of the composition of Example 4 obtained in Experimental Example 6 and the control of the joint synovial fluid, the total protein concentration in the synovial fluid was measured at 595nm by the Bradford method (absorbance), measured in this Experimental Example One result is shown in FIG. 9 and Table 4. FIG.

도 9와 표 4에 나타나듯이, 대조군의 경우는 활액 내의 총단백질 농도가 25.67 ㎍/㎕의 정상 범위에서 52.71 ㎍/㎕로 24.99% 증가하였으나, 실시예 4를 4주 동안 경구 투여한 군에서는 31.90 ㎍/㎕로 36.98 % 억제되어 큰 효과를 나타냈다.As shown in FIG. 9 and Table 4, the total protein concentration in the synovial fluid increased by 24.99% to 52.71 μg / μl in the normal range of 25.67 μg / μl in the control group, but 31.90 in the oral administration of Example 4 for 4 weeks 36.98% of inhibition was shown at 占 // μl, indicating a great effect.

실험예Experimental Example 10 : 관절염 유도된 실험동물에서 10: In arthritis induced experimental animals 관절활액의Joint synovial fluid 프로스타글란딘 E Prostaglandin E ₂₂ (Prostaglandin (Prostaglandin EE ₂₂ ,, PGEPGE ₂₂ ) 양 측정Volume measurement

실험예 6에서 얻은 실시예 4의 조성물을 투여한 경우 및 대조군의 관절활액을 이용하여, 관절 조직 내의 소염 작용을 알아보기 위해 활액 내의 프로스타글란딘 E₂의 농도를 실험예 2와 같은 방법으로 측정하였다. 본 실험예에서 측정한 결과는 도 10와 표 5에 나타냈다.In the case of administering the composition of Example 4 obtained in Experimental Example 6 and using the joint synovial fluid of the control group, the concentration of prostaglandin E _{2 in} the synovial fluid was measured in the same manner as in Experimental Example 2 to determine the anti-inflammatory action in the joint tissue. The results measured in this experimental example are shown in Figure 10 and Table 5.

도 10과 표 5에서 나타나듯이, 대조군에서는 활액 내의 프로스타글란딘 E₂의 농도가 0.65 ㎍/㎕ 에서 2.1 ㎍/㎕ 까지 무려 221.78% 증가하였으나, 실시예 4를 4주 동안 경구 투여한 군에서는 50.61% 억제하여 대조군에 비하여 매우 큰 억제 효과를 나타냈다.As shown in Figure 10 and Table 5, in the control group, the concentration of prostaglandin E ₂ in the synovial fluid increased by 221.78% from 0.65 μg / μl to 2.1 μg / μl, but inhibited by 50.61% in the group given oral administration of Example 4 for 4 weeks. It showed a very large inhibitory effect compared to the control group.

실험예Experimental Example 11 : 관절 조직의 11: joint tissue 사프라닌Safranin -O(-O ( SafraninSafranin -O) 염색 결과 및 활액막 세포의 분포 측정 결과-O) staining results and measurement of synovial cell distribution

실험예 6과 같은 방법으로 골관절염을 유도한 후, 실시예 4의 조성물을 300 mg/kg의 농도로 한달 동안 경구투여하였다. 그 후, 토끼의 원위대퇴골을 채취하여 4% 포르말린(Sigma, F0507)에 24시간 이상 고정하고, 보고자 하는 면을 5mm 두께로 절편하여 5% 질산으로 24시간 이상 탈석회를 거쳐 파라핀 블록으로 제작하여, 4㎛의 박편을 연골 조직의 특이적 염색인 사프라닌-O(Sigma S2255) 염색하여 활액막 세포의 분포 및 표면을 조사하였다. 본 실험예에서 측정한 결과를 도 11에 나타내었다. 대조군으로는 생약 조성물을 투여하지 아니한 토끼의 원위대퇴골 활액막 세포를 측정하였다.After inducing osteoarthritis in the same manner as in Experimental Example 6, the composition of Example 4 was orally administered for one month at a concentration of 300 mg / kg. After that, the distal femur of the rabbit was collected and fixed in 4% formalin (Sigma, F0507) for more than 24 hours, and the surface to be sliced was cut into 5 mm thickness, and then demineralized with 5% nitric acid for 24 hours and then made into a paraffin block. , 4 μm flakes were stained with safranin-O (Sigma S2255), a specific stain of cartilage tissue, to examine the distribution and surface of the synovial membrane cells. The results measured in the present experimental example are shown in FIG. As a control, the distal femoral synovial membrane cells of rabbits that did not receive the herbal composition were measured.

도 11에서 보는 바와 같이, 실시예 4를 4주 동안 경구 투여한 군에서는 대조군에 비해 매끄러운 단면을 보여주고 있음을 확인할 수 있다.As shown in FIG. 11, in the group administered orally for 4 weeks, Example 4 shows a smoother cross section than the control group.

실험예Experimental Example 12 : 초산유발 마우스 12: acetic acid-induced mouse 롸이딩Weiding 신드롬 억제효과 Syndrome suppression effect

실시예 4 및 6에 따라 제조된 조성물의 진통 억제 효과를 확인하기 위하여 마우스에서 Whittle(1957)의 초산에 의한 롸이딩(Writhing) 증상을 관찰하였다. In order to confirm the analgesic inhibitory effect of the compositions prepared according to Examples 4 and 6, the symptoms of winding (Writhing) caused by acetic acid of Whittle (1957) were observed in mice.

생쥐(ICR계, Institute of Cancer Research)에 실시예 4 및 6에 의해 제조된 조성물을 각각 생쥐 kg 당 300, 600 mg/kg을 경구투여하고, 30분 후에 0.7% 초산-생리식염액을 0.1 ml/10 g 양으로 복강 주사하였다. 주사 후 10분 후부터 10분 동안의 롸이딩 증상 횟수를 관찰하였다. 그 결과는 표 6 및 표 7에 나타내었다. To the mice (ICR system, Institute of Cancer Research), the compositions prepared in Examples 4 and 6 were orally administered 300 and 600 mg / kg / kg of mice, respectively, and after 30 minutes, 0.1 ml of 0.7% acetic acid-physiological saline solution. Intraperitoneal injection in an amount of / 10 g. The number of guiding symptoms was observed from 10 minutes after injection to 10 minutes. The results are shown in Table 6 and Table 7.

표 6에서 나타나듯이, 실시예 4에 따라 제조된 조성물은 마우스에서 롸이딩 횟수가 35 내지 50% 감소한 것으로 보아 진통효과가 우수함을 알 수 있다.As shown in Table 6, the composition prepared according to Example 4 can be seen that the analgesic effect is excellent, as the number of guiding in the mouse is reduced by 35 to 50%.

표 7에서 나타나듯이, 실시예 6에 따라 제조된 조성물은 마우스에서 롸이딩 횟수가 26 내지 38 % 감소한 것으로 보아 진통 효과가 있음을 알 수 있다.As shown in Table 7, the composition prepared according to Example 6 was found to have an analgesic effect as the number of guiding decreases in the mouse by 26 to 38%.

실험예Experimental Example 13 : 포르말린 테스트를 통한 진통 효과 13: analgesic effect through formalin test

실시예 4에서 얻은 생약 추출물의 진통효과를 확인하기 위하여 포르말린 테스트를 시행하였다.The formalin test was conducted to confirm the analgesic effect of the herbal extract obtained in Example 4.

마우스의 뒷발 중 왼쪽 발바닥에 SC injection을 하고 acrylic observation chamber(20㎝, high, 20㎝, diameter)안에 넣고 40분 동안 행동을 관찰하여 주사된 발바닥을 타다닥 거리거나 핥는 등의 행동을 관찰하여 도 12에 기록하였다. 40분 중 처음 5분 동안을 1^st phase, 1^st phase 후 15분부터 나머지 20분을 2^nd phase라고 한다. SC injection is performed in the left foot of the mouse's hind paws and placed in an acrylic observation chamber (20 cm, high, 20 cm, diameter) for 40 minutes and observed for behavior such as patting or licking the injected sole. Recorded at 12. 40 minutes is referred to as the first 5 min the 1 ^{^st} phase, 1 ^st phase 2 ^nd phase the remaining 20 minutes from 15 minutes after of during.

도 12에 나타나듯이, 실시예 4의 조성물은 진통효과에 효과적임을 알 수 있다.As shown in Figure 12, it can be seen that the composition of Example 4 is effective for analgesic effect.

실험예Experimental Example 14 : 14: 랫드에서의In the rat 급성 염증에 대한 억제 효과 Inhibitory effect on acute inflammation

실시예 4 및 6에 의해 제조된 조성물의 항염증에 대한 효과를 확인하기 위하여 랫드에 카라기난(carrageenan) 을 이용하여 염증을 유도한 후 발 부종율에 미치는 영향을 확인하였다. In order to confirm the effects on the anti-inflammatory effects of the compositions prepared in Examples 4 and 6 using rat carrageenan (carrageenan) was confirmed the effect on the foot edema rate after inducing inflammation.

하루 밤 절식시킨 SD(Spraque-Dawley)계 랫드에 생약 조성물 300, 600mg/kg 를 경구투여하고 1시간 후 생리식염수에 녹여 제조한 1 % 카라기난을 각 발 당 0.1 ml를 우측 뒷발바닥에 피하 주사한다. 이 후 5시간 동안 1시간 간격으로 우측 뒷발의 부종 정도를 플레시스모미터(Plethymometer)를 이용하여 측정하였다. 각각의 부종의 억제율 정도를 도 13 및 도 16에 나타내었다. In the Spraque-Dawley rats fasted overnight, 300 ml or 600 mg / kg of the herbal composition was injected orally, and 1 ml of carrageenan prepared by dissolving in physiological saline after 1 hour was injected subcutaneously in the right hind paw. . Thereafter, the swelling degree of the right hind paw was measured at 1 hour intervals for 5 hours using a plethymometer. The degree of inhibition of each edema is shown in FIGS. 13 and 16.

도 13에서 보는 바와 같이 실시예 4에 따라 제조된 조성물은 발 부종의 증가율을 감소시켜 염증 억제에 효과적임을 알 수 있으며, 도 18에서 보는 바와 같이 실시예 6에 따라 제조된 조성물도 랫드의 발 부종의 증가율을 감소시켜 염증 억제에 효과적임을 알 수 있었다.As shown in Figure 13 it can be seen that the composition prepared according to Example 4 is effective in suppressing inflammation by reducing the increase rate of foot edema, the composition prepared according to Example 6 as shown in Figure 18 also paw edema of the rat It was found that the rate of increase was effective in suppressing inflammation.

실험예Experimental Example 15 : 유해활성산소의 분해 효과 테스트 15: Test of the decomposition effect of harmful active oxygen

실시예 4 및 실시예 6에 의해 제조된 조성물의 유해활성산소에 대한 분해 효과를 확인하기 위하여 잔틴-잔틴옥시다제(xanthine-xanthine oxidase)에 의해 발생된 활성산소를 제거하여 생체를 보호하는 SOD(Super Oxide Dismutase)를 Cayman 社의 Superoxide Dismutase Assay Kit(Cat No. 706002)를 이용하여 측정함으로써 유해활성산소의 분해 정도를 비교하여 보았다.In order to confirm the degradation effect on the harmful active oxygen of the composition prepared in Example 4 and Example 6 SOD that removes the active oxygen generated by xanthine-xanthine oxidase to protect the living body ( Super Oxide Dismutase was measured using Cayman's Superoxide Dismutase Assay Kit (Cat No. 706002) to compare the degree of decomposition of harmful active oxygen.

각각의 well에 유해활성산소의 검출자(radical detector)를 200 ul 넣고, 실시예 4 및 실시예 6에 의해 제조된 조성물을 각각 10ul, SOD standard를 10㎕씩 첨가한다. 그 후, 잔틴-잔틴 옥시다제(xanthine-xanthine oxidase)를 첨가하여 유해활성산소 라디칼을 발생시킨 후 20분 동안 실온에서 배양하여 540 nm에서 각각의 흡광도를 측정하여 그 기울기의 변화 정도로 유해활성산소의 분해 정도를 비교하여 표 8 및 표 9에 나타냈다. 아래 표 8에서 보는 바와 같이 실시예 4에 따라 제조된 조성물은 유해활성산소를 효과적으로 분해하고 있음을 볼 수 있었으며, 아래 표 9에서 보는 바와 같이 실시예 6에 따라 제조된 조성물도 유해활성산소를 효과적으로 분해하고 있음을 알 수 있었다. 200 ul of a reactive oxygen detector (radical detector) is added to each well, and 10 ul of the composition prepared according to Example 4 and Example 6 and 10 μl of SOD standard are added, respectively. Subsequently, xanthine-xanthine oxidase was added to generate noxious oxygen radicals, followed by incubation at room temperature for 20 minutes, and the respective absorbances were measured at 540 nm. The degree of decomposition was compared and shown in Table 8 and Table 9. As shown in Table 8 below, the composition prepared according to Example 4 was found to effectively decompose harmful active oxygen, and the composition prepared according to Example 6 as shown in Table 9 below effectively inhibited harmful active oxygen. It can be seen that the decomposition.

본 발명의 인진, 갈근 및 차조기를 함유하는 조성물은 항염증 작용, 소염 진 통작용, 관절 조직 분해 효소 억제 작용, 염증 유발 관련 효소 억제 작용, 발부종 억제 등에 치료 효능이 있어 관절 연골 재생 및 관절 건강에 도움을 줄 수 있다.Compositions containing phosphorus, root, and perilla of the present invention is effective in anti-inflammatory action, anti-inflammatory analgesic action, joint tissue degrading enzyme inhibitory action, inflammation-related enzyme inhibitory action, foot edema inhibition, etc. Can help.

Claims

A composition for cartilage regeneration comprising extracts obtained by extracting ethyl acetate with a solvent of one or more plants selected from the group consisting of phosphorus, root, and perilla.

A composition for cartilage regeneration comprising an extract obtained by extracting ethyl acetate with a solvent containing a mixture containing 3 to 30 parts by weight of phosphorus, 3 to 30 parts by weight of brown root and 4 to 40 parts by weight of aperture.

The method of claim 2,

The composition for cartilage regeneration of the dry weight ratio of the jinjin, the root and the tea seasoning is 3: 3: 4 to 6.

The method of claim 2,

The composition for cartilage regeneration is cartilage regeneration composition wherein the mixture of phosphorus, cartilage and chageum extract ethyl acetate with a solvent and concentrated under reduced pressure.

The method of claim 2,

The composition for cartilage regeneration is cartilage regeneration composition to reduce the amount of proteoglycans, prostaglandins, matrix metalloprotease or cyclooxygenase in the blood.

A composition for treating osteoarthritis, comprising extracts obtained by extracting ethyl acetate with a solvent of one or more plants selected from the group consisting of phosphorus, root, and perilla.

A composition for treating osteoarthritis, comprising an extract of ethyl acetate extracted from a mixture containing 3 to 30 parts by weight of phosphorus, 3 to 30 parts by weight of roots, and 4 to 40 parts by weight of perilla, with ethyl acetate.

The method of claim 7, wherein

The composition for treating osteoarthritis of the dry weight ratio of the jinjin, reeds and perilla is 3: 3: 4 to 6.

The method of claim 7, wherein

The osteoarthritis treatment composition is a composition for treating osteoarthritis is extracted by extracting a mixture of phosphorus, root, and perilla with ethyl acetate and reduced pressure.

The method of claim 7, wherein

The osteoarthritis treatment composition is a composition for treating osteoarthritis by reducing the amount of proteoglycans, prostaglandins, matrix metalloprotease or cyclooxygenase in the blood.

1 to 99 parts by weight of the composition of any one of claims 1 to 8, wherein the form is selected from the group consisting of capsules, beverages, tea, drinks and vitamin complexes cartilage regeneration, osteoarthritis improvement or preventive health supplement food.