KR100625379B1

KR100625379B1 - αＬβ２ 인테그린 매개된 세포 부착 저해제

Info

Publication number: KR100625379B1
Application number: KR1020047010969A
Authority: KR
Inventors: 일라 시르카; 마르쉘 모닝스타; 마사토시 가쿠시마; 히데후미 가지; 다카유키 가와구치; 도시유키 구메
Original assignee: 다나베 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date: 2002-02-07
Filing date: 2003-02-06
Publication date: 2006-09-20
Also published as: ATE411995T1; US7375128B2; NO20043563L; CA2474748A1; PE20030899A1; AU2003210862B2; PL372328A1; JP2005517016A; RU2004123219A; NZ534208A; ZA200405647B; EP1472257A1; EP1472257B1; DE60324250D1; CN1301255C; CO5601028A2; US20050171174A1; KR20040091625A; WO2003066636A1; AR040068A1

Abstract

본 발명은 일반식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다:

상기 식에서,

R은 수소원자, 하이드록실 그룹 또는 카바모일 그룹이고,

n은 1 또는 2이다.

Description

αＬβ２ 인테그린 매개된 세포 부착 저해제{Inhibitors of alpha Ｌ beta ２ integrin mediated cell adhesion}

발명의 배경

발명의 분야

본 발명은 α_Lβ₂ 인테그린 매개된 염증성 증상의 치료에 유용할 수 있는 α_Lβ₂ 인테그린 매개된 세포 부착의 강력한 저해제에 관한 것이다.

관련기술의 설명

백혈구 인테그린 및 세포간 부착 분자(ICAMs)는 표적 세포 및 세포외 매트릭스에 대한 백혈구 부착에 있어서 중추적인 역할을 한다. β₂ (CD18) 인테그린 하위군은 각각이 관련이 있지만 CD18과 비공유적으로 짝을 이루는 별개의 α-사슬로 이루어지는 4개의 구성원, 즉 α_Lβ₂ 인테그린(LFA-1, CD11a/CD18), α_Mβ ₂ 인테그린(Mac-1, CD11b/CD18), α_Xβ₂ 인테그린(p150/95, CD11c/CD18) 및 α_Dβ ₂ 인테그린(CD11d/CD18)을 가진다(Bochner ed., Adhesion Molecules in Allergic Disease, Marcel Dekker, Inc. pp 1-24 (1997)). 이들 가운데, LFA-1이 염증성 조직으로의 T 세포, 호산구 및 다른 백혈구의 경내피 이동 및 세포 부착에 대해 중추적인 것으로 나타났다(Garmberg, Curr. Opin. Cell Biology, 9, 643-650 (1997); Panes et al., Br. J. Pharmacology, 126, 537-550 (1999)). LFA-1은 혈관내피세포, 가지세포, 상피세포, 대식세포 및 T 림프모구와 같은 다양한 세포 형태 상에 발현되는 분자 ICAM 군(ICAM-1, -2, -3, -4, -5)에 결합한다(Dustin et al., J. Immunology, 137, 245-254 (1986)). 또한, LFA-1/ICAM-1과 LFA-1/ICAM-3의 상호작용은 T 세포 활성화에 필요한 공-자극 신호로서 작용할 수 있다(Wingren et al., Crit. Rev. in Immunology, 15, 235-253 (1995)).

세포 이동 및 T 세포 공-활성은 다수의 염증성 질환 증상에서 중요한 과정이다. 염증성 질환을 매개하는 LEA-1의 주된 역할이, LFA-1 또는 ICAM-1에 대한 항체가 치료 말기의 전개를 유의적으로 저해하는 염증성 질환의 일부 상이한 동물 모델에서 입증되었다(Rothlein et al., Kidney International, 41, 617 (1992); Iigo et al., J. Immunology, 147, 4167 (1991); Bennet et al., J. Pharmacol. and Exp. Therapeutics, 280, 988 (1997)). 또한, CD11a에 대한 모유화 모노클론 항체(LFA-1의 알파 사슬)가 건선을 앓는 환자에게서 효능을 나타내었다(Gottlieb et al., J. Am. Acad. Dermatoloty, 42, 428-35 (2000)).

더욱이, LEA-1에 대한 항체는 장기 이식후 거부반응을 억제하는 것으로 나타났다(Poston et al., Transplantation 69, 2005-2013 (2000)); Nakakura et al. Transplantation 62, 547-552 (1996)). WO94/04188은 모든 이식에 대한 α_Lβ₂ 인 테그린에 대한 모노클론 항체의 사용을 개시한다.

발명의 요약

본 발명은 신규한 일반식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다:

상기 식에서,

R은 수소원자, 하이드록실 그룹 또는 카바모일 그룹이고,

n은 1 또는 2이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 소기의 화합물은 비대칭 원자에 기초한 광학 이성체의 형태로 존재할 수 있고, 본 발명은 또한 이들 광학 이성체 및 그의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 구체예에서, 결합의 입체 배치는 고정되어 있을 필요가 없다. 본 발명의 화합물은 단일 배치를 갖는 화합물 또는 몇 가지 서로 다른 배치를 갖는 혼합물일 수 있다.

일반식 (I)의 화합물의 바람직한 구체예에서, R은 수소원자이다.

일반식 (I)의 화합물의 다른 바람직한 구체예에서, R은 하이드록실 그룹이다.

일반식 (I)의 화합물의 또 다른 바람직한 구체예에서, R은 카바모일 그룹이다.

일반식 (I)의 화합물의 더욱 바람직한 구체예에서, n은 1이다.

일반식 (I)의 화합물의 다른 더욱 바람직한 구체예에서, n은 2이다.

일반식 (I)의 화합물의 더욱 바람직한 구체예에서, R은 수소원자이고, n은 1이다.

일반식 (I)의 화합물의 다른 더욱 바람직한 구체예에서, R은 하이드록실 그룹이고, n은 1이다.

일반식 (I)의 화합물의 또 다른 더욱 바람직한 구체예에서, R은 카바모일 그룹이고, n은 2이다.

본 발명의 가장 바람직한 화합물은 하기 화합물로부터 선택된다:

(5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아세틸아미노-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온;

(5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-[(2-하이드록시아세틸)아미노]-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온;

(5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-[(3-카바모일프로피오닐)아미노]-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4- 디온.

본 화합물의 특징은 1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄 핵의 7-위치에 아실아 미노 그룹 및 5-위치에 시아노벤질 그룹의 조합이며, 이러한 특징은 선행 문헌에 구체적으로 기술되어 있지 않다.

본 발명의 화합물은 LFA-1 매개된 세포 부착 및 LFA-1 매개된 T 세포 공활성 둘 다에 대하여 강력한 저해 활성을 갖고, 경구투여후 (a) 혈장 단백질 결합, (b) 수용해도 및 (c) 친유도의 전체적인 향상을 반영하는 우수한 생체내이용률을 또한 나타낸다. 그러므로, 본 발명의 화합물은 LFA-1 매개된 세포 부착에 의해 야기된 바람직하지 못한 증상에 대한 우수한 인 비보(in vivo) 효능을 나타낸다

또한, 본 발명의 화합물은 물질 P 수용체, 즉 뉴로키닌 1 (NK1) 수용체에 대해서도 강력한 길항 활성을 가진다. 물질 P 수용체 길항제는 천식, 류마티스 관절염, 염증성창자병, 방광염 및 그 외의 위 질환과 같은 염증성 질환의 치료에 유용한 것으로 생각된다(Kraneveld et al., Int. Immunopharmacology, 1, 1629-1650 (2001); Swain et al., Ann. Rep. Med. Chem., 34, 51-60 (1999); Ohnmacht Jr. et al., Ann. Rep. Med. Chem., 33, 71-80 (1998)). 즉, 본 발명의 화합물은 물질 P에 의해 야기되거나 매개된 바람직하지 못한 증상에 대하여 우수한 치료 포텐셜을 가진다. 또한, 본 발명의 화합물은 LFA-1 매개된 세포 부착 저해와 물질 P 수용체 길항 작용이라는 이중 활성에 기인하여 염증성 질환의 치료 또는 예방에 대하여 탁월한 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 일반식 (I)의 화합물은 이전에 개시된 것들에 비해 세포독성이 감소되고 시토크롬 P450 저해 활성이 낮으며, 따라서 본 발명의 화합물은 부작용 포텐셜이 감소될 수 있다.

본 발명의 화합물은 유리 형태 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 형태로서 임상적으로 사용될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 무기산 또는 유기산과의 산부가 염 또는 무기 염기, 유기 염기 또는 아미노산과의 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 또한 그의 분자내 염, 또는 그의 용매화물 또는 수화물을 포함한다.

본 발명의 화합물은 치료적 유효량의 상기 정의된 바와 같은 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는 예를 들어 결합제(예, 시럽, 아라비아 검, 젤라틴, 솔비톨, 트라가칸트, 폴리비닐피롤리돈), 부형제(예, 락토스, 슈크로스, 옥수수 전분, 인산칼륨, 솔비톨, 글리신), 활택제(예, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜, 실리카), 붕해제(예, 감자 전분), 습윤제(예, 소듐 라우릴설페이트), 등일 수 있다.

본 발명의 소기의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 경구적으로 또는 비경구적으로 투여될 수 있고, 적합한 약제학적 제제로서 사용될 수 있다. 이들 약제학적 제제는 경구적으로 투여될 경우, 정제, 과립제, 캅셀제 및 산제와 같은 고형 제제의 형태이거나, 또는 용액, 현탁액 및 유제와 같은 액상 제제일 수 있다. 비경구적으로 투여될 경우, 약제학적 제제는 통상의 방법에 의한 좌제, 주사 제제 또는 주사용 증류수를 사용한 정맥내 점적 제제, 생리학적 염 용액, 수성 글루코스 용액, 등 및 흡입제의 형태일 수 있다.

본 발명의 소기의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 용량은 투 여방법, 나이, 성별, 체중 및 환자의 상태에 따라 다르지만, 일반적으로 일일 투여량이 바람직하게는 0.1 내지 100 ㎎/㎏/일, 특히 바람직하게는 1 내지 100 ㎎/㎏/일이다.

본 발명의 화합물은 환자, 예를 들어 사람 환자에게서 LFA-1 매개된 증상을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 LEA-1 매개된 증상으로부터 고통받고 있거나 감염되기 쉬운 환자의 치료에 사용될 수 있다. LEA-1 매개된 증상의 예로는 염증성 질환, 자가면역 질환 및 알레르기성 질환이 포함된다.

본 발명의 화합물은 또한 환자에게서 물질 P에 의해 야기되거나 매개된 증상의 치료 또는 예방에 사용될 수 있고, 이러한 증상으로부터 고통받고 있거나 감염되기 쉬운 환자의 치료에 사용될 수 있다. 이런 증상의 예는 염증성 질환일 수 있다.

본 발명의 화합물은 류마티스 관절염, 천식, 만성 폐쇄 폐질환, 알레르기 질환, 성인성 호흡곤란증후근, AIDS, 심혈관 질환, 혈전증, 유해 혈소판 응집, 혈전용해후의 재응집, 재관류 손상, 피부 염증 질환(예, 건선, 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염), 골다공증, 골관절염, 죽상경화증, 동맥경화증(이식-관련 동맥경화증 포함), 종양 질환(종양 또는 암성 증식의 전이 포함), 창상, 분리 망막, I형 당뇨병, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 안과적 염증 질환, 염증성창자병(크론병 및 궤양결장염), 방광염, 위 질환, 국소창자염, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome) 및 기타 자가면역 질환과 같은 질환의 치료 또는 예방에 사 용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 동종이식 거부반응(숙주 대 이식편 질환) 및 이식편 대 숙주 질환을 포함하는, 이식후 거부반응(즉, 만성 거부반응, 급성 거부반응)에도 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 건선, 류마티스 관절염, 염증성창자병(크론병, 궤양결장염), 전신성 홍반성 루푸스, 아토피성 피부염, 쇼그렌 증후군 및 장기이식후 거부반응(동종이식 거부반응 및 이식편 대 숙주 질환)의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 더욱 바람직하게는 류마티스 관절염, 천식, 만성 폐쇄 폐질환, 건선, 다발성 경화증 및 장기이식후 거부반응의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 더욱 바람직하게는 천식, 염증성창자병, 방광염 및 기타 위 질환과 같은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

본 발명에 따라, 소기의 화합물 (I)가 하기 방법중 하나에 의해 제조될 수 있다:

방법 A:

본 발명의 화합물 가운데, 일반식 (I-a)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 일반식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 일반식 (III-a)의 화합물 또는 그의 염 또는 그의 반응성 유도체와 축합시킨 다음, 생성된 화합물을 필요에 따 라 그의 약제학적으로 허용되는 염으로 전환시킴으로써 제조될 수 있다:

상기 식에서,

n은 상기 정의된 바와 같다.

화합물 (II) 및 (III-a)의 염은 예를 들어 무기 또는 유기 산과의 염(예, 트리플루오로아세테이트, 하이드로클로라이드, 설페이트), 또는 무기 염기와의 염(예, 소듐 염 또는 포타슘 염과 같은 알칼리 금속 염, 바륨 염 또는 칼슘 염과 같은 알칼리 토금속 염)일 수 있다.

화합물 (III-a) 또는 그의 염과 화합물 (II) 또는 그의 염의 축합 반응은 축합 시약의 존재하 및 염기의 존재하 또는 부재하에 적합한 용매중에서 수행될 수 있다.

축합 시약는 펩타이드 합성에 사용될 수 있는 통상적인 축합 시약, 예를 들어 BOP-Cl, BOP 시약, DCC, EDC 또는 CDI 중에서 선택될 수 있다. 축합 시약은 바 람직하게는 활성제(예, HOBT)와 함께 사용될 수 있다.

염기는 통상의 유기 염기, 예컨대 알킬아민(예, DIEA, Et₃N), 사이클릭 아민(예, DBU, DBN, 4-메틸모르폴린), 및 피리딘류(예, 피리딘, DMAP), 및 통상의 무기 염기, 예컨대 알칼리 금속 탄산염(예, Na₂CO₃, K₂CO₃), 및 알칼리 금속 중탄산염(예, NaHCO₃, KHCO₃), 및 알칼릴 금속 하이드록사이드(예, NaOH, KOH) 등에서 선택될 수 있다.

용매는 축합 반응을 방해하지 않는 임의의 것, 예를 들어, 에스테르(예, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트), 할로게노알칸(예, CHCl₃, CH₂Cl₂), 에테르(예, 디에틸 에테르, THF, DME, 디옥산), 아미드(예, DMF, N-메틸피롤리돈), 케톤(예, 아세톤, 메틸 에틸 케톤), CH₃CN, DMSO, H₂O, 및 이들 용매의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 반응은 -50℃ 내지 50℃, 바람직하게는 0℃ 내지 실온의 온도에서 수행될 수 있다.

화합물 (III-a)의 반응성 유도체와 화합물 (II) 또는 그의 혼합물의 축합 반응은 염기의 존재 또는 부재하에 적합한 용매중에서 또는 용매없이 수행된다.

화합물 (III-a)의 반응성 유도체의 예로는 산 할라이드(예, 산 클로라이드), 반응성 에스테르(예, p-니트로페놀과의 에스테르), 그의 무수물, 다른 카복시산과의 혼합 무수물(예, 이소부티르산과의 혼합 무수물) 등이 있다.

염기는 통상의 유기 염기, 예컨대 알킬아민(예, DIEA, Et₃N), 사이클릭 아민 (예, DBU, DBN, 4-메틸모르폴린), 및 피리딘류(예, 피리딘, DMAP), 및 통상의 무기 염기, 예컨대 알칼리 금속 탄산염(예, Na₂CO₃, K₂CO₃), 및 알칼리 금속 중탄산염(예, NaHCO₃, KHCO₃), 및 알칼릴 금속 하이드록사이드(예, NaOH, KOH) 등으로부터 선택될 수 있다.

용매는 축합 반응을 방해하지 않는 임의의 것, 예를 들어, 에스테르(예, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트), 할로게노알칸(예, CHCl₃, CH₂Cl₂), 에테르(예, 디에틸 에테르, THF, 디옥산), 아미드(예, DMF, N-메틸피롤리돈), 케톤(예, 아세톤, 메틸 에틸 케톤), CH₃CN, DMSO 및 H₂O, 및 이들 용매의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

축합 반응은 -30℃ 내지 실온의 온도에서 수행될 수 있다.

방법 B:

본 발명의 화합물 가운데, 일반식 (I-b)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 일반식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 일반식 (III-b)의 화합물 또는 그의 염 또는 그의 반응성 유도체와 축합시킨 다음, 보호 그룹을 제거하고, 생성된 화합물을 필요에 따라 그의 약제학적으로 허용되는 염으로 추가로 전환시킴으로써 제조될 수 있다:

상기 식에서,

n은 상기 정의된 바와 같고,

R¹O는 보호되거나 보호되지 않은 하이드록실 그룹이다.

화합물 (III-b)의 염은 예를 들어 무기 염기와의 염(예, 소듐 염 또는 포타슘 염과 같은 알칼리 금속 염, 바륨 염 또는 칼슘 염과 같은 알칼리 토금속 염)일 수 있다.

하이드록실 그룹에 대한 보호 그룹은 통상의 방법에 의해 쉽게 제거될 수 있는 하이드록실 그룹에 대한 통상적인 보호 그룹으로부터 선택될 수 있다. 이러한 보호 그룹의 예로는 트리알킬실릴 그룹(예, 트리메틸실릴 그룹, 트리에틸실릴 그룹 및 t-부틸디메틸실릴 그룹), 벤질 그룹, 메틸 그룹 및 테트라하이드로피라닐 그룹이 포함된다.

R¹O가 보호된 하이드록실 그룹인 화합물 (III-b), 그의 염 또는 그의 반응성 유도체와 화합물 (II) 또는 그의 염의 축합 반응은 방법 A에서 설명한 바와 같은 유사한 방법에 의해 수행될 수 있다.

보호 그룹의 제거는 제거될 보호 그룹에 따라 선택되는 통상의 방법, 예를 들어, 가수분해, 산 처리, BBr₃ 처리, 및 촉매적 환원에 의해 수행될 수 있다.

가수분해는 실온에서 또는 가열하면서 에테르(예, 디에틸 에테르, 디옥산 및 THF), 알콜(예, MeOH, EtOH), CH₃CN, DMSO, H₂O 등과 같은 적합한 용매중에서 알칼리 금속 하이드록사이드(예, LiOH, NaOH, 및 KOH)와 같은 무기 염기를 사용함으로써 수행될 수 있다.

산 처리는 실온에서 또는 가열하면서 에테르(예, 디에틸 에테르, 디옥산 및 THF), 할로게노알칸(예, CHCl₃, CH₂Cl₂), 알콜(예, MeOH, EtOH), CH₃CN, DMSO, H₂O 등과 같은 적합한 용매중에서 무기 산 또는 유기 산, 예컨데 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 아세트산, p-톨루엔설폰산, 및 트리플루오로아세트산을 사용함으로써 수행될 수 있다.

촉매적 환원은 수소 대기하에 실온에서 또는 가열하면서 에테르(예, 디에틸 에테르, 디옥산 및 THF), 에스테르(예, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트), 알콜(예, MeOH, EtOH), CH₃CN, AcOH, H₂O 등과 같은 적합한 용매중에서 라니-니켈(Raney-nickel) 및 활성탄상의 팔라듐과 같은 촉매를 사용함으로써 수행될 수 있다.

디메틸화를 위한 BBr₃처리는 적합한 용매(예, THF, CH₂Cl₂, AcOH)중에서 -78℃ 내지 50℃의 온도에서 수행될 수 있다.

R¹O가 하이드록실 그룹인 화합물 (III-b)이 축합 반응에 사용되는 경우, 화합물 (III-b)의 하이드록실 그룹은 축합 반응 이전에 원위치에서 보호되어야 한다.

하이드록실 그룹의 보호는 화합물 (III-b)를 염기의 존재하에 적합한 용매중에서 트리알킬실릴 할라이드와 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 트리알킬실릴 할라이드의 예로는 트리메틸실릴 클로라이드, 트리에틸실릴 클로라이드 및 t-부틸디메틸실릴 클로라이드가 포함된다. 염기는 하이드록실 그룹의 보호에 사용되는 통상의 염기, 예를 들어 트리에틸아민, 이미다졸 및 피리딘으로부터 선택될 수 있다. 용매는 반응을 방해하지 않는 임의의 것, 예를 들어, 에스테르(예, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트), 방향족 탄화수소(예, 벤젠, 톨루엔), 할로게노알칸(예, CHCl₃, CH₂Cl₂), 에테르(예, 디에틸 에테르, THF, DME, 디옥산), 아미드(예, DMF, N-메틸피롤리돈), 케톤(예, 아세톤, 메틸 에틸 케톤), CH₃CN, DMSO, 및 이들 용매의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 반응은 -50℃ 내지 50℃, 바람직하게는 0℃ 내지 실온의 온도에서 수행될 수 있다. 보호된 화합물은 필요에 따라 통상의 방법으로 분리될 수 있다.

방법 C:

본 발명의 화합물 가운데, 일반식 (I-c)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 화합물 (II)를 일반식 (III-c)의 화합물 또는 그의 염 또는 그의 반응성 유도체와 축합시킨 다음, 생성된 화합물을 필요에 따라 그의 약제학적으로 허용되는 염으로 전환시킴으로써 제조될 수 있다:

상기 식에서, n은 상기 정의된 바와 같다.

화합물 (III-c)의 염은 예를 들어 무기 염기와의 염(예, 소듐 염 또는 포타슘 염과 같은 알칼리 금속 염, 바륨 염 또는 칼슘 염과 같은 알칼리 토금속 염)일 수 있다.

화합물 (III-c) 또는 그의 염과 화합물 (II) 또는 그의 염의 반응은 방법 A에서 설명한 바와 같은 유사한 방법에 의해 수행될 수 있다.

일반식 (II)의 출발 화합물은 WO 01/30781에 개시된 설명 또는 하기 반응식에 따라 제조될 수 있다:

반응식 1.

(상기 반응식에서, X는 C_1-6 알킬 그룹 또는 벤질 그룹이고, tBDMSO는 tert-부틸디메틸실릴옥시 그룹이다)

단계 (a): 화합물 (IV)는 염기의 존재하에 적합한 용매중에서 4-하이드록시프롤린 C_1-6 알킬 또는 벤질 에스테르를 3,5-디클로로페닐이소시아네이트와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.

염기는 통상의 유기 염기, 예컨대 알킬아민(예, Et₃N, DIEA) 및 피리딘, 및 통상의 무기 염기, 예컨대 알칼리 금속 중탄산염(예, NaHCO₃, KHCO₃), 및 알칼리 금속 탄산염(예, Na₂CO₃, K₂CO₃)로부터 선택될 수 있다.

용매는 축합 반응을 방해하지 않는 임의의 것, 예를 들어, CH₂Cl₂, DME, THF, DMF, HMPA 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 반응은 -78℃ 내지 실온의 온도에서 수행될 수 있다.

단계 (b): 화합물 (V)는 화합물 (IV)의 하이드록실 그룹을 보호시킴으로써 제조될 수 있다. 통상의 방식에 의해, 예를 들어 화합물 (IV)를 이미다졸의 존재하에 적합한 용매, 예컨대 CH₃CN중에서 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드와 반응시킴으로써 보호될 수 있다. 반응은 0℃ 내지 용매 비점의 온도, 바람직하게는 실온에서 수행될 수 있다.

단계 (c): 화합물 (VI)는 화합물 (V)를 폐환시킴으로써 제조될 수 있다. 폐환은 염기의 존재 또는 부재하에 적합한 용매중에서 수행될 수 있다.

염기는 통상의 무기 염기, 예컨대 알칼리 금속 알콕사이드(예, NaOEt, NaOMe), 알칼리 금속 탄산염(예, K₂CO₃, Na₂CO₃), 알칼리 금속 중탄산염(예, NaHCO₃) 및 통상의 유기 염기, 예컨대 피리딘, DMAP, Et₃N 및 DIEA로부터 선택될 수 있다.

용매는 폐환 반응을 방해하지 않는 임의의 것, 예를 들어 톨루엔, DME, CH₂Cl₂, THF, CH₃CN, DMF, 알콜(예, MeOH, EtOH) 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 반응은 0℃ 내지 용매 비점의 온도, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃에서 수행될 수 있다.

단계 (d): 화합물 (VII)는 화합물 (VI)를 일반식 (XI)의 화합물과 축합시킴으로써 제조될 수 있다:

상기 식에서, Y는 이탈 그룹이다.

이탈 그룹은 할로겐 원자(예, 염소원자, 브롬원자 및 요오드원자), p-톨루엔설포닐옥시 그룹, 및 메탄설포닐옥시 그룹으로부터 선택될 수 있다.

축합 반응은 염기의 존재하에 적합한 용매중에서 수행될 수 있다.

염기는 통상의 염기, 예컨대 알칼리 금속 아미드(예, LiCl을 함유하거나 함유하지 않는 KHMDS 또는 LDA)로부터 선택될 수 있다.

용매는 축합 반응을 방해하지 않는 임의의 것, 예를 들어 디에틸 에테르, DME, THF, DMF, HMPA 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 반응은 -78℃ 내지 실온의 온도에서 수행될 수 있다.

단계 (e): 화합물 (VIII)는 화합물 (VII)를 탈보호함으로써 제조될 수 있다. 탈보호는 통상의 방법에 의해, 예를 들어 화합물을 적합한 용매중에서 또는 용매없이 HF/피리딘, n-Bu₄NF, 또는 산(예, HCl, AcOH, TFA, p-TsOH)으로 처리함으로써 수행될 수 있다.

용매는 축합 반응을 방해하지 않는 임의의 것, 예를 들어 CH₃CN, THF, DMF, 알콜(예, MeOH, EtOH) 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 반응은 -78℃ 내지 실온의 온도에서 수행될 수 있다.

단계 (f): 화합물 (IX)는 화합물 (VIII)를 염기의 존재하에 적합한 용매중에서 메탄설포닐 클로라이드와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.

염기는 통상의 염기, 예컨대 Et₃N, DIEA, 피리딘, NaHCO₃, KHCO₃, Na₂CO₃, K₂CO₃ 및 KHCO₃로부터 선택될 수 있다.

용매는 반응을 방해하지 않는 임의의 것, 예를 들어, CH₂Cl₂, THF, DMF, CH₃CN, 톨루엔으로부터 선택될 수 있다. 반응은 -20℃ 내지 50℃의 온도에서 수행될 수 있다.

단계 (g): 화합물 (X)는 화합물 (IX)를 알칼리 금속 아지드(예, NaN₃)와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.

치환 반응은 유기 용매중에서 0℃ 내지 100℃의 온도에서 수행될 수 있다.

용매는 반응을 방해하지 않는 임의의 것, 예를 들어 CH₂Cl₂, THF, DMF, CH₃CN 및 톨루엔으로부터 선택될 수 있다.

단계 (h): 화합물 (II)는 화합물 (X)를 환원시킴으로써 제조될 수 있다. 환원은 촉매적 수소화 조건하에, 예를 들어 Pd 또는 Pt 촉매(예, Pd-C, PtO₂)의 존재하에 적합한 용매중에서 H₂ 대기하에 실온에서 수행될 수 있다.

용매는 반응을 방해하지 않는 임의의 것, 예를 들어 EtOAc, MeOH 및 EtOH로부터 선택될 수 있다.

본 명세서 및 청구범위에서, C_1-6 알킬 그룹은 1 내지 6 개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 4 개의 탄소원자를 가진 직쇄 또는 측쇄 알킬 그룹, 예를 들어 메 틸 그룹, 에틸 그룹, 프로필 그룹, 이소프로필 그룹, 부틸 그룹, 이소부틸 그룹 등을 의미한다.

약어:

AcOEt: 에틸 아세테이트(=EtOAc)

AcOH: 아세트산

BOP-Cl: 비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스피닉 클로라이드,

BOP 시약: 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트

BSA: 소혈청 알부민

CDI: 카보닐디이미다졸

DBN: 1,5-디아자비사이클로[4.3.0]논-5-엔

DBU: 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운덱-7-엔

DCC: 1,3-디사이클로헥실카보디이미드

DIEA: 디이소프로필에틸아민

DMAP: 4-디메틸아미노피리딘

DME: 디메톡시에탄

DMF: 디메틸 포름아미드

DMSO: 디메틸 설폭사이드

EDC: 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드

Et: 에틸

EtOH: 에탄올

HBSS: 행크 평형염용액(Hank's balanced salt solution)

HMPA: 헥사메틸포스포르아미드

HOBT: 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트

HSA: 사람 혈청 알부민

KHMDS: 포타슘 헥사메틸디실라지드(=포타슘 비스(트리메틸실릴)아미드)

LDA: 리튬 디이소프로필아미드

Me: 메틸

MeOH: 메탄올

n-Bu: n-부틸

tBDMS: tert-부틸디메틸실릴

THF: 테트라하이드로푸란

TFA: 트리플루오로아세트산

p-TsOH: p-톨루엔설폰산

실시예

본 발명의 화합물을 하기 실시예에 의해 예시하지만, 이에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1. (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아세틸아미노-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온

THF(5 ㎖)중 (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아미노-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(78.5 ㎎)의 용액에 아세트산 무수물(1.0 ㎖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 45℃에서 2 시간동안 교반하고, 이 혼합물을 농축한 다음, 정제 박층 크로마토그래피(실리카 겔; CH₂Cl₂)에 의해 정제하여, 표제 화합물을 수득하였다(84 ㎎). MS (m/z) 478.8 (MNa⁺).

실시예 2. (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-[(3-카바모일프로피오닐)아미노]-l,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온

THF(5 ㎖)중 DIEA(104.79 ㎕), HOBT(61.24 ㎎), EDC(93.12 ㎎), 숙신아민산(45.86 ㎎) 및 (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아미노-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(82.7 ㎎)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축한 다음 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)[베크만(Beckman) 5μ C18 컬럼; H₂0/MeCN (10-100%)/0.1% TFA의 구배로 용리됨]에 의해 정제하여 표제 화합물 72 ㎎을 수득하였다. MS (m/z) 536 (MNa⁺).

실시예 3. (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-[(2-카바모일아세틸)아미노]-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온

THF(5 ㎖)중 DIEA(168 ㎕), HOBT(97.5 ㎎), EDC(112 ㎎), 말론아민산(59.5 ㎎) 및 (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아미노-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(200 ㎎)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc에 용해시키고, 생성된 용액을 물, NaHCO₃ 포화 수용액, 염수로 세척한 다음 건조시키고(Na₂SO₄) 농축하여 표제 화합물 212 ㎎을 수득하였다. MS (m/z) 500 (MH⁺).

실시예 4. (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-[(3-하이드록시프로피오닐)아미노]-l,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온

단계 1: THF(15 ㎖)중 DIEA(0.38 ㎕), HOBT(0.221 g), EDC(0.224 g), 3-메톡시프로피온산(0.209 ㎕) 및 (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아미노-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(0.300 g)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시켰다. 잔류물을 HPLC[베크만(Beckman) 5μ C18 컬럼; H₂0/MeCN (10-100%)/0.1% AcOH의 구배로 용리됨]에 의해 정제하여 포움(foam)을 수득하였다. 이것을 EtOAc에 용해시키고, 생성된 용액을 물, NaHCO₃ 포화 수용액, 염수로 세척한 다음 건조시키고(Na₂SO₄) 농축하여, (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-[(3-메톡시프로피오닐)아미노]-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온 0.259 g을 수득하였다. MS (m/z) 501 (MH⁺).

단계 2: BBr₃(3 ㎖, CH₂Cl₂중 1M)를 -78℃에서 CH₂Cl(15 ㎖)중 (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-[(3-메톡시프로피오닐)아미노]-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(0.16 g)의 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 -78℃에서 8 시간동안 교반하였다. 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 HPLC[베크만(Beckman) 5μ C18 컬럼; H₂0/MeCN (10-100%)/0.1% AcOH의 구배로 용리됨]에 의해 정제하여 포움을 수득하였다. 이것을 EtOAc에 용해시키고, 생성된 용액을 물, NaHCO₃ 포화 수용액, 염수로 세척한 다음 건조시키고(Na₂SO₄) 농축하여, 표제 화합물 0.119 g을 수득하였다. MS (m/z) 487 (MH⁺).

실시예 5. (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-[(2-하이드록시아세틸)아미노]-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온

단계 1: THF(4 ㎖)중 DIEA(189 ㎕) 및 (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아미노-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(150 ㎎)의 용액에 THF(2 ㎖)중 벤질옥시아세틸 클로라이드(57 ㎕)의 용액을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 EtOAc에 용해시켰다. 생성된 용액을 염수로 세척하고, 건조시킨 다음(Na₂SO₄), 여과하고 농축하였다. 잔류물을 HPLC[베크만(Beckman) 5μ C18 컬럼; H₂0/MeCN (10-100%)/0.1% AcOH의 구배로 용리됨]에 의해 정제하여 포움을 수득하였다. 이것을 EtOAc에 용해시키 고, 생성된 용액을 물, NaHCO₃ 포화 수용액, 염수로 세척한 다음 건조시키고(Na₂SO₄) 농축하여, (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-[(2-벤질옥시아세틸)아미노]-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온 0.135 g을 수득하였다. MS (m/z) 563.4 (MH⁺).

단계 2: Pd/C(5%, 15 ㎎)을 함유하는 EtOH(10 ㎖)중 단계 1로부터의 (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-[(2-벤질옥시아세틸)아미노]-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(0.125 g)의 용액에 수소를 버블링시키고, 이 반응 혼합물을 H₂ 대기하에서 밤새 교반하였다. 이 혼합물을 추가의 5% Pd/C(10 ㎎)로 재충진고, H₂ 대기하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트(Celite)의 베드(bed)를 통해 여과시키고, 여액을 농축하였다. 잔류물을 HPLC[베크만(Beckman) 5μ C18 컬럼; H₂0/MeCN (10-100%)/0.1% TFA의 구배로 용리됨]에 의해 정제하여 표제 화합물 0.023 g을 수득하였다. MS (m/z) 473 [MH⁺] 및 495 [MNa⁺].

참고실시예 1: (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아미노-1, 3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온

하기 반응식에 따라 표제 화합물을 제조하였다:

반응식 2.

(상기 반응식에서, tBDMSO는 tert-부틸디메틸실릴옥시 그룹이고, MsO는 메탄설포닐옥시 그룹이다)

단계-1: p-톨루엔 설폰산(50.6 g)을 벤질 알콜(100 ㎖)과 벤젠(250 ㎖)의 혼합물중 L-4-트랜스-하이드록시프롤린(25.25 g)의 현탁액에 첨가하고, 이 혼합물을 딘 스타크 트랩(Dean Stark trap)하에 24 시간동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 디에틸 에테르를 첨가하여 고체를 침전시켰다. 고체를 여과하고, 추가의 디에틸 에테르로 세척한 다음 건조시켜, L-4-트랜스-하이드록시프롤린 벤질 에스테르 75 g을 수득하였다.

단계-2: DIEA(51.3 ㎖) 및 THF(500 ㎖)중 단계-1로부터의 L-4-트랜스-하이드록시프롤린 벤질 에스테르 p-톨루엔 설폰산 염(40.43 g)의 현탁액에 3,5-디클로로페닐이소시아네이트(22.1 g)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 농축 하였다. 잔류물을 EtOAc에 용해시키고, 0.5N HCl, NaHCO₃ 포화 수용액, 염수로 세척한 다음 건조(Na₂SO₄)시키고, 여과한 다음 농축하였다. 잔류물을 EtOAc/헥산(1:1)에서 분쇄하고, 백색 고체를 여과한 다음 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 헥산/EtOAc 2:1)에 의해 정제하여, (2S,4R)-2-[(3,5-디클로로페닐)카바모일]-4-하이드록시프롤린 벤질 에스테르(33.07 g)를 수득하였다.

단계-3: CH₃CN(800 ㎖)중 (2S,4R)-2-[(3,5-디클로로페닐)카바모일]-4-하이드록시프롤린 벤질 에스테르(33.07 g)의 현탁액에 이미다졸(11 g) 및 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드(13.64 g)을 첨가하였다. 48 시간동안 교반한 후, 반응 혼합물을 농축하였다. 잔류물을 EtOAc에 용해시키고, 0.5N HCl, NaHCO₃ 포화 수용액, 염수로 세척한 다음 건조시키고(Na₂SO₄) 여과 및 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 헥산/EtOAc 2:1)을 통해 정제하여 (2S,4R)-2-[(3,5-디클로로페닐)카바모일]-4-(tert-부틸디메틸실릴옥시)프롤린 벤질 에스테르(44.45 g)를 수득하였다.

단계-4: CH₃CN(500 ㎖)중 (2S,4R)-2-[(3,5-디클로로페닐)카바모일]-4-(tert-부틸디메틸실릴옥시)프롤린 벤질 에스테르(23.49 g)의 용액에 DIEA(34.44 ㎖)을 첨가하고, 이 혼합물을 가열환류시켰다. 24 시간동안 환류시킨 후, 반응 혼합물을 농축하고, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 헥산 대 헥산/EtOAc 2:1)을 통해 정제하여, 3-(3,5-디클로로페닐)-7-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-1,3-디아자비사 이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온의 두 디아스테레오머를 분리하였다.

디아스테레오머 A: 7.46 g, MS: m/z 415 (M⁺); 및

디아스테레오머 B: 10.66 g, MS: m/z 415 (M⁺).

단계-5: 단계-4로부터의 화합물인 디아스테레오머 A 또는 B (12.73 g)을 다음과 같이 벤질화시켰다. n-부틸 리튬(30 ㎖, 헥산중 1.6 M)을 -78℃에서 N₂ 대기하에 THF(100 ㎖)중 디이소프로필아민(6.5 ㎖)의 용액에 교반하면서 첨가하였다. 이 혼합물을 이 온도에서 추가로 30 분간 유지시켰다. 혼합물을 -78℃에서 N₂ 대기하에 무수 THF(100 ㎖)중 3-(3,5-디클로로페닐)-7-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(12.73 g)의 용액에 캐뉼라를 통해 첨가하였다. -78℃에서 30 분간 교반한 후, THF(100 ㎖)중 4-시아노-α-브로모톨루엔(9.08 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 2.5 시간동안 교반한 다음, 실온까지 서서히 가온하고, 실온에서 0.5 시간동안 방지하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 EtOAc에 용해시켰다. EtOAc 용액을 0.5N HCl, NaHCO₃ 포화 수용액, 염수로 세척하고, 건조시킨 다음(Na₂SO₄), 여과 및 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 헥산/EtOAc 24:1 내지 3: 1)를 통해 정제하여, (5S,7R)- 및 (5R,7R)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-l,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온을 수득하였다.

(5S,7R) 이성체: 7.6 g, MS: m/z 530 (M⁺); 및

(5R,7R) 이성체: 1.8 g, MS: m/z 530 (M⁺)

단계-6: THF(1 ㎖)중 (5S,7R)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-l,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(1.0 g)의 용액에 70% HF/피리딘(25 ㎖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 24 시간동안 교반한 다음 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc에 용해시키고, 생성된 용액을 물, NaHCO₃ 포화 수용액, 염수로 세척하고, 건조시킨 다음(Na₂SO₄), 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; MeOH/CH₂Cl₂ 2-7%)에 의해 정제하여, (5S,7R)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-하이드록시-l,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(0.52 g)을 수득하였다. MS (m/z) 416 (MH⁺).

단계-7: 0℃에서 CH₂Cl₂(8 ㎖)중 단계-6으로부터의 (5S,7R)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-하이드록시-l,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(0.52 g)의 용액에 DIEA(0.45 ㎖), 이어 메탄설포닐 클로라이드(0.15 ㎖)를 첨가한 다음, 이 혼합물을 1.5 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂로 희석하고, 생성된 혼합물을 NaHCO₃ 포화 수용액, 이어 염수로 세척한 다음, 건조시키고(Na₂SO₄), 여과 및 농축하여 (5S,7R)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-메탄설포닐옥시-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온 0.76 g을 수득하였다. 이 화합물은 그대로 다음 단계에 사용되었다. MS (m/z) 501 [MH⁺].

단계-8: NaN₃을 DMF(5 ㎖)중 단계-7로부터의 (5S,7R)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-메탄설포닐옥시-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(0.76 g) 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 24 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 유기 용액을 염수로 세척하고, 건조시킨 다음(Na₂SO₄), 여과 및 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; CH₂Cl₂)에 의해 정제하여, (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아지도-l,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온 0.46 g을 수득하였다. MS (m/z) 441 (MH⁺).

단계-9: Pd/C(5%, 15 ㎎)을 함유하는 EtOH(15 ㎖)중 단계-8로부터의 (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아지도-l,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온(0.42 g)의 용액에 수소를 버블링시키고, 이 반응 혼합물을 H₂ 대기하에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트의 베드를 통해 여과시키고, 여액을 농축하였다. 잔류물을 HPLC[베크만(Beckman) 5μ C18 컬럼; H₂0/MeCN (10-100%)/0.1% TFA의 구배로 용리됨]에 의해 정제하여, (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아미노-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온 0.21 g을 수득하였다. MS (m/z) 415 [MH⁺].

참고실시예 2: (5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아미노-1, 3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온

단계-1: 참고실시예 1의 단계-1 내지 단계-4에 기술된 것과 유사한 방법에 따라, 3-(3,5-디클로로페닐)-7-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온을 제조하였다. 다만, L-4-트랜스-하이드록시프롤린 벤질 에스테르 p-톨루엔 설폰산 염을 L-4-트랜스-하이드록시프롤린 메틸 에스테르 하이드로클로라이드로 대체하였다.

단계-2: 단계-1로부터의 3-(3,5-디클로로페닐)-7-(tert-부틸디메틸실릴옥시)-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온을 참고실시예 1의 단계-5 내지 단계-9에 기술된 것과 유사한 방법으로 처리하여 표제 화합물을 수득하였다.

세포 부착 프로토콜

세포 부착 재조합 단백질 ICAM-1ㆍFc를 인간 ICAM-1의 5 개의 세포외 도메인으로부터 인간 IgG의 불변 영역과 융합시켜 축조하였다. ICAM-1ㆍFc는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고 -20℃에서 분취량씩 저장하였다. 고정 ICAM-1ㆍFc는 이 단백질을 pH 7.5 PBS 내에서 희석하고, 10㎕/웰을 Falcon Probind III 플레이트에 옮기고 4℃에서 밤새 인큐배이션시켜 제조하였다. BSA로 코팅된 웰은 비-특이적 배경 부착의 측정수단으로서의 역할을 한다. 세척된 플레이트는 PBS 내의 0.25% 오발부민의 용액으로 1시간 동안 37℃에서 블로킹시켰다. HBSS 세척된 Jurkat 세포는 TBSg 부착 버퍼(24 mM Tris pH 7.4, 0.14 M NaCl, 2.7 mM KCl, 2mM 글루코스, 0.1% HSA.) 내에서 2.5x10⁶/㎖의 최종농도까지 현탁시켰다. 100㎕ 부피의 세포를, 100㎕의 플레이트 버퍼(TBSg, 10 mM MgCl₂, 2% DMSO)를 함유한, 블로킹되고 세척된 ICAM-1ㆍFc 코팅된 플레이트에 부가시켰다. 부착은 37℃에서 1시간 동안 행해졌다. 비부착 세포는 EL404 플레이트 세척기(BioTek Instruments; Highland Park, VT)를 사용하여 제거되었다. 부착 세포의 수는 효소 기질 p-니트로페놀-N-아세틸-β-D-글루코스아미나이드인 pNAG를 사용하여 내인성 N-아세틸-헥소사미니다제의 효소적 활성을 측정함으로써 정량되었다. 유리된 p-니트로페놀의 양은 405 nm에서 수직 경로 스펙트로포토미터를 사용하여 광학 밀도를 판독하여 세포 부착을 정량함으로써 측정되었다(VMAX Kinetic Microplate Reader, Molecular Devices, Menlo Park, CA). 경쟁 연구를 위해 100% DMSO 스톡 용액으로부터의 화합물을 플레이트 버퍼에서, ICAM-1ㆍFc 코팅된 플레이트로 옮기기 전에 요구되는 시험 농도인 2 배로 희석시키고 연속적으로 희석시켰다.

Claims

일반식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:

상기 식에서,

R은 수소원자, 하이드록실 그룹 또는 카바모일 그룹이고,

n은 1 또는 2이다.
제 1 항에 있어서, R이 수소원자인 화합물 또는 염.
제 1 항에 있어서, R이 하이드록실 그룹인 화합물 또는 염.
제 1 항에 있어서, R이 카바모일 그룹인 화합물 또는 염.
제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, n이 1인 화합물 또는 염.
제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, n이 2인 화합물 또는 염.
제 1 항에 있어서, R이 수소원자이고, n이 1인 화합물 또는 염.
제 1 항에 있어서, R이 하이드록실 그룹이고, n이 1인 화합물 또는 염.
제 1 항에 있어서, R이 카바모일 그룹이고, n이 2인 화합물 또는 염.
제 1 항에 있어서, 화합물이 하기 화합물로부터 선택되는 화합물 또는 염:

(5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-아세틸아미노-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온;

(5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-[(2-하이드록시아세틸)아미노]-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온;

(5S,7S)-5-(4-시아노벤질)-3-(3,5-디클로로페닐)-7-[(3-카바모일프로피오닐)아미노]-1,3-디아자비사이클로[3.3.0]옥탄-2,4-디온.
일반식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 일반식 (III-a)의 화합물, 그의 염, 그의 산 할라이드 또는 그의 무수물과 축합시킨 다음, 생성된 화합물을 필요에 따라 그의 약제학적으로 허용되는 염으로 전환시키는 것을 포함하여, 일반식 (I-a)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법:

상기 식에서,

n은 1 또는 2이다.
일반식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 일반식 (III-b)의 화합물, 그의 염, 그의 산 할라이드 또는 그의 무수물과 축합시킨 다음, 보호 그룹을 제거하고, 생성된 화합물을 필요에 따라 그의 약제학적으로 허용되는 염으로 추가로 전환시키는 것을 포함하여, 일반식 (I-b)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법:

상기 식에서,

n은 1 또는 2이고,

R¹O는 보호되거나 보호되지 않은 하이드록실 그룹이다.
일반식 (II)의 화합물 또는 그의 염을 일반식 (III-c)의 화합물, 그의 염, 그의 산 할라이드 또는 그의 무수물과 축합시킨 다음, 생성된 화합물을 필요에 따라 그의 약제학적으로 허용되는 염으로 전환시키는 것을 포함하여, 일반식 (I-c)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법:

상기 식에서, n은 1 또는 2이다.
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