CN101638429B - 一种特异性识别细胞表面整合素α3β1的小分子肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种特异性识别细胞表面整合素α3β1的小分子肽,该小分子肽的氨基酸序列为cdGLGHypNc;其中,c表示D型半胱氨酸,d表示D型天冬氨酸,G表示L型甘氨酸,L表示L型亮氨酸,Hyp表示L型4-羟脯氨酸,N表示L型天冬酰胺。本发明所述小分子肽可通过常规的固相合成法合成得到,能特异性识别细胞表面整合素α3β1,因此可作为影像造影剂如荧光素的靶向载体,将荧光素运输到高表达α3β1的癌细胞表面,通过荧光素扫描仪器,实现肿瘤的分子影像诊断。
Description
技术领域
本发明涉及有机化学领域,具体涉及一种肽,特别是含5-11个氨基酸的肽。
背景技术
整合素是细胞膜表面糖蛋白受体家族的成员之一,是介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质(ECM)的粘附分子。整合素分子是由α和β二个亚单位通过非共价键连接构成的异二聚体分子,参与细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的双向信号转导,对细胞的生存、增殖、分化、移动及癌细胞的侵袭、粘附和转移等产生重要调控作用。整合素分子的体内分布很广泛,不同类型的细胞表达整合素分子的种类是不同的,整合素分子的表达具有明显的细胞类型特性,如整合素α3β1在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胶质细胞瘤等中出现表达异常。因此,整合素可作为肿瘤分子诊断和靶向治疗的重要靶点。
本发明人曾利用“一个珠子一个化合物”的组合化学肽库筛选得到一个氨基酸序列为cNGQGEQc的小分子肽,该小分子肽可通过识别整合素α3特异性结合肺癌细胞A549,并发现该肽中对特异性粘附A549作出主要贡献的结构是-NGXG-以及六肽长度(郭琳琅等.一种特异性识别非小细胞肺癌A549细胞的小分子肽.生物化学与生物物理进展,2007,34(10):1080~1085)。但上述小分子肽粘附癌细胞A549的能力较弱,且不能作为荧光素的载体将荧光素运输到肿瘤中。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种可将荧光素运输到整合素α3β1阳性表达的肿瘤中的小分子肽。
本发明解决上述问题的技术方案是:
一种特异性识别细胞表面整合素α3β1的小分子肽,该小分子肽的氨基酸序列为cdGLGHypNc;其中,c表示D型半胱氨酸,d表示D型天冬氨酸,G表示L型甘氨酸,L表示L型亮氨酸,Hyp表示L型4-羟脯氨酸,N表示L型天冬酰胺。
本发明小分子肽可用常规的固相合成法(Lam KS,Salmon SE,Hersh EM,Hruby VJ,Kazmierski WM,Knapp RJ.Nature 1991,354,82)制备,具体方法如下:
(1)取表面具有NH2活性基团的树脂珠子,先用二甲基酰胺洗涤,然后浸泡在二甲基酰胺中使所述树脂珠子充分肿胀,接着按照所述小分子肽的氨基酸序列依次将相应的氨基酸偶联到所述树脂珠子上并形成肽链;
(2)用无水氟化氢将肽链从树脂珠子上切下,同时脱除所有侧链保护基;
(3)用30%乙酸稀释后,用碘作氧化剂使分子内2个半胱氨酸氧化形成二硫键;
(4)依次经Sephadex-G-15柱层析、透析和高效液相层析分离纯化。
本发明所述小分子肽可特异性识别细胞表面整合素α3β1,不仅通过识别α3β1粘附到肿瘤细胞表面,还可以在携带荧光素的情况下粘附到肿瘤细胞表面,因此可作为影像造影剂如荧光素的靶向载体,将荧光素运输到高表达α3β1的癌细胞表面,通过荧光素扫描仪器,实现肿瘤的分子影像诊断。本发明所述小分子肽还有一个重要的潜在用途是作为抗肿瘤药物载体,为实现靶向治疗提供物质基础。
附图说明
图1是4株肺癌细胞的PCR产物经内切酶Ava II消化后的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图,其中M表示分子量标准物,A表示A549,C表示Calu-1,H表示H1650,D表示DMS-53,1表示α5片段(104bp),2表示α3片段(69bp),3表示α4片段(45bp)。
图2是4株肺癌细胞的PCR产物经内切酶Bsp1286 I消化后的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图,其中M表示分子量标准物,A表示A549,C表示Calu-1,H表示H1650,D表示DMS-53,1表示β1片段(128bp)。
图3是不同浓度抗整合素α3抗体阻断A549细胞与小分子肽结合的阻断率柱形图。
图4是注入了连接了荧光素Alexa的小分子肽的荷瘤小鼠的荧光扫描图,其中1所指部位是注射点,2所指部位是肾脏,3所指部位是A549肿瘤。
图5是注入了连接了荧光素Alexa的小分子肽的荷瘤小鼠各器官的荧光扫描图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面将通过实施例以及效果实验进一步阐明本发明所具有的技术效果。
1、本发明小分子肽的制备
(1)称取1g表面具有NH2活性基团的树脂珠子,用二甲基酰胺洗涤3次,然后在二甲基酰胺浸泡至珠子充分肿胀;
(2)加入D型半胱氨酸和N,N′-二异丙基碳二亚胺,室温下反应2小时后,用DMF洗涤珠子5次,接着加入20%的哌啶,在室温下反应5min,再加入20%的DMF,反应15min,完全脱去Fmoc保护基;
(3)按步骤(2)方法依次偶联D型天冬氨酸、L型甘氨酸、L型亮氨酸,L型4-羟脯氨酸、L型天冬酰胺和D型半胱氨酸;
(4)将连接完最后一个氨基酸的珠子经25%的三氟乙酸洗涤一次,蒸馏水洗涤3次;
(5)用无水氟化氢将小分子肽从树脂珠子上切下,同时脱除所有侧链保护基。还原产物在30%乙酸高度稀释下用碘作氧化剂,使分子内2个半胱氨酸氧化形成二硫键。经Sephadex-G-15柱层析,透析和高效液相层析分离纯化,获得在反相高效液相层析(分析柱)为单一峰的高纯度产物。
2、分析癌细胞表面整合素α3β1的表达
(1)基因表达限制性分析
①RNA提取和RNA逆转录为cDNA:培养细胞,收获细胞3×107,移入1.5ml离心管,加入1ml Trizol,混匀,室温静置5min;加入0.2ml氯仿,振荡15sec,室温静置2min。4℃离心,12000g×15min,取上清;加入0.5ml异丙醇,将管中的液体轻轻混匀,室温静置10min;4℃离心,12000g×10min,弃上清;加入1ml 75%乙醇,轻轻洗涤后沉淀;4℃离心,7500g×5min,弃上清;晾干,加入适量DEPC H2O溶解;260nm波长分光度测定总RNA浓度,并根据OD260/OD280的比值计算纯度。将样品RNA逆转录为cDNA,50μl的混合反应液包含25μgfRNA、1mM dNTP和10个单位的AMV(禽成髓性白血病病毒)逆转录酶,反应条件为25℃,10min,然后42℃2hr,最后75℃5min。
②引物设计:根据整合素α和β亚单位基因序列,用MacVector公司ClustalW软件设计引物,引物长度为25-26个碱基,整合素α的扩增片段约250-330碱基对,整合素β的扩增片段约231-249碱基对。同时用MacVector公司的限制性酶切分析软件预测不同限制性酶消化扩增片段后的长度(见表1和2)。
表1限制性内切酶消化整合素α预测得到不同长度的基因片段
表2限制性内切酶消化整合素β预测得到不同长度的基因片段
③PCR:PCR反应体系总体积为50-μl,包括25μCi的γ33p标记的正向引物,400nM反向引物,200nM dNTP及25ng cDNA。cDNA变性,94℃,10min,PCR反应条件:前5个循环,94℃,40sec;50℃,90sec;72℃,15sec;后19个循环94℃,45sec;58℃,90sec;72℃,20sec。PCR产物经2.4%的琼脂糖纯化,QIACEX II试剂盒抽提。
④限制性酶切:分别用酶消化PCR产物,对整合素α各亚单位,采用的内切酶有Acc I、Ava II、Bsl I、BstN I、Hinf I、Taq I及Alu I,对整合素β各亚单位采用的酶有Alu I、Hinf I、Bsp1286 I及Bsl I(New England Biolabs,Inc)。酶切产物用7%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
结果:经Ava II酶切后,非小细胞肺癌细胞A549、Calu-1及H1650出现整合素α3(69bp),而DMS-53缺少α3(见图1)。经Bsp1286I酶切后,所有细胞均出现β1(128bp)(见图2)。
(2)流式细胞仪分析
①将1×106的培养细胞用2.5g/L胰蛋白酶消化,培养基终止消化,离心弃细胞培养基;
②PBS洗涤3次,50mg/mL多聚甲醛固定15min,制成单细胞悬液5×106/ml。
③每个样本分别取100μl细胞悬液加入2个EP管中,实验组加入第一抗体鼠抗人整合素α3、α4、α5及β1单克隆抗体,稀释度均为1∶100,对照组加入PBS,室温孵育1hr。
④洗涤液洗涤2次,离心弃上清。
⑤每个EP管加入FITC标记羊抗鼠IgG抗体,稀释度为1∶50,室温避光孵育30min。
⑥应用美国Becton Dickson公司的FAC-Sort型流式细胞仪分析蛋白表达阳性率,每种蛋白重复测定三次,分析结果。
结果显示非小细胞肺癌细胞A549、Calu-1及H1650出现整合素α3,四种细胞均有整合素β1表达。
3、确定本发明小分子肽与癌细胞表面整合素α3β1特异性结合
①筛选小分子肽与A549细胞的结合位点:利用特异性抗细胞表面粘附分子整合素的单克隆抗体,阻断小分子肽cdGLGHypNc与A549细胞表面相关受体结合,确定小分子肽与A549细胞的结合位点。阻断抗体有整合素α1-6,v和β1-5(Chemicon公司,USA),在96孔细胞培养板的A1-7孔中分别加入浓度为1.5mg/L的抗α1、α2、α3、α4、α5、α6、αv抗体,B1-5孔中分别加入抗β1、β2、β3、β4、β5抗体,因此,在A1B1孔中含有抗α1和β1两种抗体,A1B2孔中含有抗α1和β2两种抗体,依次类推,不同孔中即含有抗α和β两种抗体的不同组合。然后加入A549细胞悬液,摇动培养板,使两者充分混合,置细胞培养箱中孵育10min,加入小分子肽珠子。混合细胞和珠子,37℃,5%CO2的培养箱中培养,分别于24hr和48hr后计数表面粘附A549细胞的阳性珠子数。
②进一步确定小分子肽与A549细胞的结合位点:根据上述(1)的实验结果,在48孔细胞培养板中分别加入不同浓度的阻断抗体(0,0.125,0.25,0.5,1,2,5mg/L),其余步骤同上,分别于24hr和48hr后记数有细胞粘附的珠子的百分率,以此判定抗体对细胞与小分子肽结合的阻断百分率。
结果:用抗整合素(α1-6,v和β1-5)抗体(1.5μg/ml)阻断A549细胞与小分子肽的结合实验,结果显示抗整合素α3抗体与抗β亚单位抗体的任何组合如α3β1、α3β2、α3β3、α3β4、α3β5均可阻断A549细胞与cdGLGHypNc的结合,而α其它亚单位与β亚单位的组合如α1β1、α2β1、α4β1、α2β1、α2β2等对A549细胞与cdGLGHypNc的结合均无明显的阻断作用。抗整合素α3抗体对A549细胞与小分子肽结合的阻断作用随其浓度增加而增强,当α3抗体的浓度为0.5μg/ml时,其抑制作用可达95%以上(见表3和图3)
表3抗整合素α3抗体阻断A549细胞与小分子肽结合实验结果
4、本发明小分子肽作为特异性识别整合素α3β1的靶向载体
(1)用荧光素Alexa标记试剂盒(invitrogen公司)标记小分子肽cdGLGHypNc;
(2)于裸鼠背部皮下接种4~6×106细胞(肺腺癌细胞A549),3周后测量瘤体达1cm,成功建立高表达整合素α3β1的荷瘤小鼠模型;
(3)从裸鼠尾静脉将连接了荧光素Alexa的小分子肽(100μl)注入荷瘤小鼠模型体内,2小时后在荧光扫描仪下观察标记荧光素的小分子肽在荷瘤小鼠体内肿瘤及肝脏、脾脏、肺脏等脏器的分布情况。图中显示在荷瘤小鼠的肾脏和瘤体中出现荧光素聚集,而肝脏、脾脏、肺脏等脏器中未见明显荧光素聚集(见下图4);取出瘤体和肾脏、肝脏等脏器,再次用荧光扫描仪扫描,成像结果与体内显像一致(见下图5),瘤体良好成像表明小分子肽成功将荧光素Alexa运送到高表达整合素α3β1的癌组织,肾脏中出现荧光素聚集提示小分子肽能通过肾脏经尿液排泄。
5、本发明小分子肽与先期公开的小分子肽cNGQGEQc生物特性比较
(1)本发明小分子肽与cNGQGEQc的体外粘附特性比较
①吸取20μl(约1500个)的小分子肽珠子,PBS缓冲液和70%酒精各洗3次,然后细胞培养液洗2次。转移小分子肽珠子至48孔细胞培养板(约150个珠子/孔)。A549细胞株分别与小分子肽珠子cdGLGHypNc和cNGQGEQ混合培养(37℃,5%CO2),计算并比较培养24和48hr后两种小分子肽与细胞的结合百分率,以此评价小分子肽与细胞粘附结合力的强弱。
结果:培养24hr后,cdGLGHypNc与A549细胞的结合百分率为71.3%,明显高于cNGQGEQ与A549细胞的结合百分率55.8%;培养48hr后,两种小分子肽与细胞的结合百分率大致相同,分别为96.1%和95.6%。
②将100μl的avidin(抗生物素蛋白,20μg/ml in PBS)滴加在玻璃片上,37℃孵育1hr,甩去avidin,PBS洗1次,除去未与玻片结合的avidin,在玻片上分别滴加100μl(0.1μM)联接有生物素的游离小分子肽cdGLGHypNc和cNGQGEQc,仅包被avidin或小分子肽作为对照,无任何包被的玻片作为阴性对照。在玻片上加上100μl A549细胞悬液,孵育1hr,Gimsa染色,观察比较各玻片上的粘附细胞数量。
结果显示载有cdGLGHypNc的玻片上粘附的A549细胞数为53个,而载有cNGQGEQc的玻片上粘附的A549细胞为35个,仅载有avidin或无任何载物的玻片上见个别细胞或无任何细胞粘附。
上述实验①和②的结果表明小分子肽cdGLGHypNc与A549的结合力高于cNGQGEQc。
(2)本发明小分子肽与cNGQGEQc的体内靶向载体比较
从裸鼠尾静脉将连接了荧光素Alexa的小分子肽cdGLGHypNc和cNGQGEQc(100μl) 注入荷瘤小鼠模型体内,2小时后在荧光扫描仪下观察标记荧光素的小分子肽在荷瘤小鼠体内肿瘤及肝脏、脾脏、肺脏等脏器的分布情况。
结果显示荧光素Alexa-cdGLGHypNc在荷瘤小鼠的肾脏和瘤体中出现荧光素聚集(见图4),而肝脏、脾脏、肺脏等脏器中未见明显荧光素聚集,取出瘤体和肾脏、肝脏等脏器,再次用荧光扫描仪扫描,荧光素Alexa-cdGLGHypNc在荷瘤小鼠的肾脏和瘤体成像结果与体内显像一致(见图5);而荧光素Alexa-cNGQGEQc在荷瘤小鼠的瘤体中未见荧光素聚集。
结果表明小分子肽cdGLGHypNc能成功将荧光素Alexa运送到A549细胞。
序列表
<110>南方医科大学
<120>一种特异性识别细胞表面整合素α3β1的小分子肽
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Cys Asp Gly Leu Gly 4-Hyp Asn Cys
1 5
Claims (2)
1.一种特异性识别细胞表面整合素α3β1的小分子肽,该小分子肽的氨基酸序列为cdGLGHypNc;其中,c表示D型半胱氨酸,d表示D型天冬氨酸,G表示L型甘氨酸,L表示L型亮氨酸,Hyp表示L型4-羟脯氨酸,N表示L型天冬酰胺。
2.权利要求1所述小分子肽的制备方法,该方法由以下步骤组成:
(1)取表面具有NH2活性基团的树脂珠子,先用二甲基酰胺洗涤,然后浸泡在二甲基酰胺中使所述树脂珠子充分肿胀,接着按照所述小分子肽的氨基酸序列依次将相应的氨基酸偶联到所述树脂珠子上并形成肽链;
(2)用无水氟化氢将肽链从树脂珠子上切下,同时脱除所有侧链保护基;
(3)用30%乙酸稀释后,用碘作氧化剂使分子内2个半胱氨酸氧化形成二硫键;
(4)依次经Sephadex-G-15柱层析、透析和高效液相层析分离纯化。
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GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120125 Termination date: 20160828 |
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