KR100615357B1

KR100615357B1 - 인지력 향상효과를 갖는 신규 알칼로이드 유도체 화합물및 이를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR100615357B1
Application number: KR1020040041251A
Authority: KR
Inventors: 황완균; 노정렬
Original assignee: 황완균; 오미현
Priority date: 2004-06-07
Filing date: 2004-06-07
Publication date: 2006-08-25
Also published as: KR20050116200A

Abstract

본 발명은 인지력 향상효과를 갖는 하기 일반식 Ⅰ로 표기되는 신규 알칼로이드 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 신규 화합물은 아세틸콜린에스테라제의 활성을 저해하여 아세틸콜린의 농도를 증가시키는 효과가 있으므로, 이를 포함하는 조성물은 인지력 향상 및 치매 특히, 아세틸콜린의 감소를 포함하는 콜린성 신경기능 퇴화로 인한 알츠하이머병의 예방 및 치료에 유용한 의약품으로 이용될 수 있다.

알칼로이드 유도체 화합물, 아세틸콜린에스테라제, 아세틸콜린, 치매, 알츠하이머병, 약학조성물

Description

인지력 향상효과를 갖는 신규 알칼로이드 유도체 화합물 및 이를 함유하는 조성물{Novel alkaloid derivative compound having memory improving activity and the composition comprising the same}

도 1 은 신규 알칼로이드 유도체 화합물에 대하여 농도의존적인 아세틸콜린에스테라제 50% 저해농도(IC₅₀값)를 측정하여 그래프로 나타낸 도이고,

도 2 는 본 발명의 화합물에 대한 EIMS 스펙트럼 데이타이고,

도 3 은 본 발명의 화합물에 대한 UV 흡광도를 측정한 UV 스펙트럼 데이타이며,

도 4 는 본 발명의 화합물에 대한 IR 스펙트럼 데이타이고,

도 5 는 본 발명의 화합물에 대하여 DEPT 스펙트럼을 이용한 분석도이며,

도 6 은 본 발명의 화합물에 대하여 H¹-NMR 스펙트럼을 이용한 분석도이고,

도 7 은 본 발명 화합물의 구조결정을 위하여 COSY 반응을 분석한 도이며,

도 8 은 본 발명 화합물의 구조결정을 위하여 NOESY 반응을 분석한 도이고,

도 9 는 본 발명 화합물의 구조결정을 위하여 HMBC 반응을 분석한 도이며,

도 10 은 본 발명 화합물의 구조결정을 위하여 HMQC 반응을 분석한 도이다.

본 발명은 인지력 향상효과를 갖는 신규 알칼로이드 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

최근 노인성 치매를 비롯하여 치매질환으로 인한 사회문제가 크게 대두되고 있다. 알츠하이머형 치매증 및 뇌졸중 후나 혹은 뇌동맥경화에 의한 광범위한 뇌병변이 발생함으로써 유발되는 뇌혈관성 치매증이 치매질환의 약 90%를 차지하며, 이외 픽(Pick)병, 크로이츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병, 두부손상에 의한 치매, 파킨슨(Parkinson)병 등이 있다.

치매질환은 단기간 및 장기간 기억장해가 기본적이며 또한 중핵증상으로 관찰되며, 기억장해와 이것에 기인한 부위감각상실(disorientation) 및 이것에 대한 고도의 뇌기능 장해로 이루어지는 것으로 생각되어 진다. 치매 환자는, 주로 대뇌 피질 및 대뇌 변연계에서 다양한 신경전달물질계의 현저한 기능 저하 및 대뇌 에너지 물질 대사의 기능저하를 나타낸다. 특히 알츠하이머형 치매증(Alzheimer's Disease, 이하 'AD'로 약칭함)에 있어서는, 환자의 아세틸콜린(acetylcholine, 이하 'ACh'로 약칭함)계, 글루타민산(glutamic acid)계, 신경펩티드(neuropeptides)계 및 모노아민(monoamine)계에서의 신경전달의 기능저하가 나타나, 이들 신경전달 계의 기능 장해가 AD의 주된 원인인 것으로 추정되고 있다(Coyle JT., et al., Science, 219, pp1184-1190, 1983; Gottfries, CG., et al., Psychopharmacology, 86, pp245-252, 1985). 또한, β-아밀로이드 펩티드(β-amyloid peptide)에 의해 유발된 신경세포 독성작용의 관점으로부터, β-아밀로이드 펩티드의 세포 밖으로의 노인 반점의 집적을 통한 해마 신경세포의 탈락에 의한 발증 기전도 AD의 주요 원인 중 하나로 추정되고 있다(Selkoe DJ., Annu. Rev. Neurosci., 12, pp463-490, 1989).

이에 따라, 치매 질환의 치료를 위한 의약품이나 기능성 식품을 개발하기 위하여 여러 가지 연구가 진행되고 있기는 하지만 극히 일부 어느 정도의 효능을 보이는 정도의 치료제가 있을 뿐이지, 치료효과가 뚜렷한 치료제가 아직까지 개발되고 있지 못한 실정이다.

치료제 개발의 예로, ACh와 관련한 신경기능의 현저한 저하가 치매증에 있어서 기억장해의 원인이라는 발견을 기초로, ACh를 활성시킴으로써 치매증상을 개선하는 치료제가 개발되고 있다. 라미레즈 등의 문헌 (Ramirez MJ., et al., Brain Res. 712(2), pp274-80, 1996; Crespi D., et al., Pharmacol. Res., 35(4), pp351-4, 1997; Roychoudhury M., et al., Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 19(1), pp43-6, 1997)에서 세로토닌 수용체 5-HT3에 대한 길항물질이 ACh의 신경 방출을 상승시키는 것을 개시하고 있다. 또한, 바르네스 등의 문헌(Barnes NM., et al., Neuroreport., 1(3-4), pp253-4, 1990)에서는 AD 환자에서 5-HT3 수용체 인식 부위의 밀도는 연령-짝 대조군에 비해 변화되지 않는다는 것이 보고 되었으며, 파 르키쉬 등의 문헌(Parkish PM., et al., Indian J. Cancer., 33(1), pp17-20, 1996)에서는 5-HT3 수용체에 대한 길항물질은 또한 구토를 억제하는 것으로 보고되었다.

또한, 글루타민산 신경단위 및 글루타민산의 수용체 중 하나인 N-메틸-D-아스파르트산(N-methyl-D-aspartic acid, 이하, 'NMDA'로 약칭함) 수용체의 감소에 주목한 NMDA 수용체의 활성화에 의한 치료제의 개발도 행해지고 있으며 또한, 최근에는 치매증상의 개선을 목적으로 하는 치료제로서 말초형 벤조디아제핀(benzodiazepine, 이하, 임의로 'BZω3'로 약칭함) 수용체 작용약(agonist)를 개발하려는 시도가 있다. 예를 들어, BZω3 수용체에 대한 작용약인 N, N-디-n-헥실-2-(4-플루오로페닐)인돌-3-아세트아미드(N,N-di-n-hexyl-2-(4-fluorophenyl)indol-3-aceteamide, 이하, 'FGIN-1-27'로 약칭함) 및 어떤 종류의 뉴로스테로이드(neurosteroids) (예를 들어, 프레그네놀론 설페이트, 알로프레그나놀론)은 동물의 학습장해모델(능동적조건 회피반응 시험, 방사상 미로시험 및 물 미로 시험)에서 약한 개선 작용을 갖는 것이 보고되어 있다 (Flood JF., et al., Brain Res., 448, pp178-181, 1988; Flood JF., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, pp1567-1571, 1992; Romeo E., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 270, pp89-96, 1994).

또한, AD 환자에서 시냅스의 ACh이 제거되는 비율을 늦춤으로써 콜린 기능 손실을 조절하고 결과적으로 AD 증상을 개선하기 위한 접근법으로 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase, 이하 'AChE'라 약칭함)의 억제가 시도되고 있다.

AChE는 신경전달물질 ACh을 퇴화시키는 효소로, AChE 억제제(acetylcholinesterase inhibitor)는 이 퇴화 과정을 억제함으로써, ACh 신경전달물질은 증가된 시간 동안 신경 클레프트(cleft)에 남게 되고, 따라서 신경전달물질의 화학적 및 기능적 효과를 상승시켜, 예를 들어 인지 작용을 향상시킨다.

지금까지 개발된 AChE 억제제로 1,2,3,4-테트라히드로-9-아크리딘아민(1,2,3,4-tetrahydro-9-acridine amine; 타크린(tacrine), THA; '코그넥스' (COGNEX)), 도네페질(Done Pezyl, E2020; '아리셉트' (ARICEPT)) 및 리바스티그민(Rivastigmine, ENA713; '엑셀론' (EXELON))이 있다. 이들 약품은 치매를 다스리는 작용기전이 중추신경전달계에 중심적인 역할을 하는 AChE의 활성억제를 통해 신경전달물질인 ACh의 농도를 증가시킴으로써 알츠하이머 질환을 예방 및 치료하는 약제로 알려지고 있다.

그러나, 이러한 AChE 억제 약물들은 콜린성 신경이 기능적으로 손상되지 않았을 때 가장 효과적이다. 즉, 이들 약물의 효능은 콜린성 신경 기능의 감퇴와 함께 감소되기 때문에, 경증이나 중등도의 노인성 치매의 초기 단계에만 효과가 있다. 또한, 대부분이 말초신경의 콜린성 부작용을 나타내며, 반감기가 너무 짧고, 간 독성 등의 심각한 부작용이 있다(Christie JE. et al., Br.J.Psychiatry, 138, pp46-50, 1981). 특히 코그넥스(Cognex)의 유효성분인 9-아미노-1,2,3,4-테트라히드로아크리딘(THA)은 경구 투여시, 지각능력 향상의 소견을 보이기는 하지만(Summers WK., et al., N. Engl. J. Med., 315(20), pp1241-5, 1986) 떨림증, 어지럼증, 간 독성 등의 심각한 부작용을 수반하고 있어 널리 활용되지 못하고 있는 실정이다.

한편, 이러한 AChE 억제 약물의 단점을 발현하지 아니하는 생약으로서 인삼을 주성분으로 하여 수종의 생약을 혼합 추출한 제품이 한국특허공개 제99-85202호와 미국특허 제 6,010,702호에 개시되어 있다. 그러나 이러한 생약 혼합 추출물의 경우 노인성 치매에 어느 정도의 약효를 보이고 있기는 하지만, 부작용 등 아직도 확실하고 안정적인 효과를 보장하지 못하며, 종래의 다른 치매 치료제와는 작용기전이 다른 것으로 추측되고 있을 뿐이지 확실한 처방이라고 볼 수 없는 불완전한 조성물로 나타나고 있다. 특히, 인삼성분이 주성분으로 구성되어 있어서 고혈압 환자의 경우는 심계항진과 같은 부작용을 초래하거나 신체의 항상성 불균형을 초래할 수 있는 경향이 있어서 또 다른 문제가 될 수 있다.

이와 같이 종래의 치매 치료용 조성물의 경우, 그 부작용이 가장 커다란 문제가 되고 있으며, 특히 생약제의 경우 다른 약물에 비하여 부작용이 크게 적은 특징으로 보여주고는 있으나 경우에 따라서는 또 다른 부작용이 우려되고, 치료효과도 아직까지는 충분하지 않아서 효과적인 임상적 효능의 증진이 필요한 실정이므로 이에 관한 개선이 절실히 요구되고 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 상기와 같은 부작용에 대한 우려가 없으며 AChE의 효과적인 억제를 통한 치매 환자 특히, 알츠하이머병 환자의 인지능력 개선 효능을 가진 식물소재를 도출하기 위해 다양한 식물을 대상으로 하여 연구를 수행하였다.

음양곽(Epimedii Herba)은 대한약전에 수재되어 있으며, 매자나무과에 속하 는 삼지구엽초 및 동속 근연식물의 지상부로 이카린(icariin)을 함유 잎에는 더욱 정유, 세릴알코올(ceryl alcohol), 탄닌(tannin), 유지가 함유되어 있으며, 지방산은 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올렌산(oleic acid), 리놀렌산(linoleic acid)이다. 최음(催淫)작용이 있으며 말초혈관을 확장시키는 것에 의한 지속성이 뚜렷한 혈압강하 작용을 가진다. 또한 혈당강하작용을 가지며 소량에서는 이뇨(利尿), 대량에서는 항이뇨(抗利尿)작용이 있으며 항균(抗菌)검사에서는 폴리오바이러스(Poliovirus) 및 다른 장도병독(腸道病毒)에 대한 모든 것에 억제작용을 가지고 있다. 보신(補腎), 강양(强陽), 거풍(祛風), 제습(除濕)의 효능이 있다 (정보섭, 신민교저, 향약대사전, 영림사, pp461-462, 1998).

그러나 지금까지 음양곽 추출물의 AChE 저해활성 및 이를 이용한 치매질환 예방 및 치료를 위한 약제에 대해서는 연구가 거의 이루어진 바 없다.

이에 본 발명자는 7 여종의 식물을 수집하여 각각으로부터 수득한 메탄올 가용 조추출물에 대하여 AChE에 대한 저해활성을 스크리닝한 결과, 음양곽 줄기와 잎의 메탄올 가용 조추출물이 강한 아세틸콜린에스테라제 저해활성을 나타냄을 확인하였고, 이 조추출물을 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 물 등의 용매를 이용하여 극성에 따른 분획화를 실시한 후 각 용매추출물에 대한 아세틸콜린에스테라제 저해활성을 측정한 결과, 특히 디클로로메탄 가용 조추출물이 가장 높은 아세틸콜린에스테라제 저해활성을 가짐을 발견하였다. 따라서 이 음양곽 추출물에 대한 효소억제반응을 병행하며 분획화하면서 새로운 성분으로서 인지력 향상효과를 갖는 신규 알칼로이 드 유도체 화합물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인지력 향상효과를 갖는 신규 알칼로이드 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 인지력 향상 및 치매 특히, 아세틸콜린의 감소를 포함하는 콜린성 신경기능 퇴화로 인한 알츠하이머병의 예방 및 치료를 위한 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 인지력 향상효과를 갖는 하기 일반식 Ⅰ로 표기되는 신규 알칼로이드 유도체 화합물을 제공한다.

(Ⅰ)

상기 식에서,

R₁, R₂ 및 R₃ 는 각각 독립적으로 수소원자 또는 C1 내지 C3의 저급 알킬기이 다.

상기 일반식 Ⅰ의 화합물군 중에서 바람직하기로는, R₁이 수소원자, R₂ 및 R ₃가 각각 저급 알킬기, 더욱 바람직하게는 각각 메틸기인 화합물이다.

또한, 본 발명은 상기 일반식 Ⅰ의 신규 알칼로이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 치매질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 일반식 Ⅰ의 신규 알칼로이드 유도체 화합물의 화합물 군 중에서 R₁이 수소원자, R₂ 및 R₃가 각각 메틸기인 화합물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 치매질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기의 신규 알칼로이드 유도체 화합물은 음양곽 추출물로부터 통상의 추출 및 분리공정을 통하여 수득가능한데,

예를 들어, 음양곽의 추출물로부터 신규 알칼로이드 유도체 화합물을 수득하기 위한 분리공정을 보다 구체적으로 설명하면,

햇볕에 건조하여 세절한 음양곽의 줄기와 잎부위를 그 중량의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 약 2 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:3의 혼합비를 갖는 혼합용매 로 20 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 50℃의 추출 온도에서 약 1 시간 내지 5일, 바람직하게는 1 일 내지 5일 동안 열수 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 초음파 추출의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 3회 반복하여 추출물을 수득한 후, 감압여과하고 여과한 추출물을 혼합하여 회전진공농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 70℃에서 감압 농축하여 용매를 제거하여 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 따른 가용추출물인 조추출물을 얻는 1단계;

상기 조추출물을 물에 현탁한 후 이 현탁액의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 클로로포름, 에틸아세테이트, 에테르, 디클로로메탄 등과 같은 비극성 용매, 바람직하게는 디클로로메탄을 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 디클로로메탄 가용성 분획부인 비극성 용매에 가용한 추출물과 수가용성 추출물을 얻고, 이어서 상기의 비극성 용매 가용추출물로부터 프래쉬 컬럼 크로마토그래피(Flash column chromatography)법을 수행하여 메탄올(MeHO)을 전개용매로 한 분획물을 얻는 제 2단계;

또한 2단계의 비극성용매에 가용한 분획물으로부터 오픈 컬럼 크로마토그래피(open column chromatography)를 실리카겔을 고정상으로 하여 순차적으로 극성이 증가되는 전개용매 조건(예를 들어, 클로로포름:메탄올:초산 1:0:0 내지 0:1:0.01(w/w)비)으로 컬럼을 전개시켜 분획 후, 효소 저해 활성이 높은 분획물을 선정하는 제 3단계;

이어서 3단계의 분획물로부터 분취용 박층 크로마토그래피(prep-TLC)를 수행 하는데, 실리카겔을 고정상으로 하여 순차적으로 극성이 증가되는 전개용매 조건(예를 들어, 클로로포름:메탄올:초산 5:1: 0.05 내지 0.05:1:5(w/w)비)으로 전개시켜 분획 후, 수득한 분획물을 모아 세파덱스 LH20(sephadex LH20)을 고정상으로 하고 메탄올을 이동상으로 하는 오픈 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 정제된 분획물을 얻고 이 분획물로부터 본 발명의 신규 알칼로이드 유도체 화합물들을 분리하는 제 4단계의 제조공정을 통하여 수득이 가능하다.

또한, 본 발명의 화합물들은 당업계에서 잘 알려진 합성방법이나 제조공정을 통하여 당업자가 용이하게 제조가능하다.

본 발명은 상기 제조방법에 따라 얻어진 인지력 향상효과를 갖는 일반식 Ⅰ의 신규 알칼로이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 치매질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 얻어진 인지력 향상효과를 갖는 일반식 Ⅰ의 신규 알칼로이드 유도체 화합물의 화합물 군 중에서 R₁이 수소원자, R₂ 및 R₃가 각각 메틸기인 화합물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 치매질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물은 아세티콜린에스테라제 효소에 강력한 억제 활성을 나타 내므로, 노인성 치매 및 알츠하이머병의 예방 및 치료에 효과적으로 사용이 가능하다.

상기 신규 알칼로이드 유도체 화합물은 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 천연물로부터 분리해낸 성분으로써, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

상기 치매질환은 알츠하이머형 치매증, 뇌혈관성 치매증, 픽(Pick)병, 크로이츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병, 두부손상에 의한 치매, 파킨슨(Parkinson)병을 포함하며, 특히 본 발명의 조성물은 아세틸콜린의 감소를 포함하는 콜린성 신경기능 퇴화로 인한 알츠하이머병의 예방 및 치료에 유효하다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 신규 알칼로이드 유도체 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 신규 알칼로이드 유도체 화합물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 화합물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 성분은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 화합물의 투여량은 투여경로, 질 병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 본 발명의 화합물 제조

단계 1 : 음양곽 조추출물의 제조

경동시장 구입하여 중앙대학교 약학대학 약품자원식물학실에서 감별한 음양곽 500g을 세절하여 메탄올 2ℓ를 가한 후 5일 동안 실온에서 3회 초음파 추출하여 여과한 후 감압농축하고 이와 같은 추출공정을 2회 반복하여 건조된 음양곽 조추출물인 메탄올 건조엑스 50g을 얻었다. 이상의 과정을 2회 반복하여 음양곽 조추출물인 메탄올 건조엑스 100 g을 얻었다.

단계 2 : 음양곽의 디클로로메탄 가용추출물 및 수가용추출물의 제조

상기 단계 1에서 얻은 음양곽 조추출물 50g에 1ℓ의 증류수를 가하여 현탁하고, 디클로로메탄 1ℓ를 가하여 혼합한 후 디클로로메탄 가용성 분획부 및 수가용성 분획부로 분리하였다. 동일 과정을 3회 반복한 후 각각의 분획물을 여과하고 감압건조하여 디클로로메탄 가용추출물 분말 7 g 및 수가용성 추출물 분말 41 g을 얻었다. 이상의 과정을 2회 반복하여 디클로로메탄 가용추출물 분말 14 g 및 수가용성 추출물 분말 82 g을 얻었다.

단계 3 : 음양곽 디클로로메탄 가용추출물의 분획화 및 본 발명의 화합물의 분리

상기 단계 2에서 얻은 음양곽의 디클로로메탄 가용추출물 11g을 프레쉬 컬럼 크로마토그래피(Flash column chromatography)법을 수행하여 표 1에 나타난 이동상 용매의 조건으로 전개시켜 7개의 분획물(fraction)을 얻어서 140 ㎍/㎖ 농도에서 아세틸콜린에스테라제 활성저해효과를 측정하기 위한 효소저해반응(Enzyme inhibition test)을 실시하였다(표 1 참조).

이동상	분획 (fraction)	수율(g)	효소억제반응(%) (meanㅁSD, N=3)
디클로로메탄	1	2.6	15.2±2.8
디클로로메탄:메탄올(9:1)	2	5.4	9.9±5.7
디클로로메탄:메탄올(6:1)	3	0.5	20.9±6.4
디클로로메탄:메탄올(6:1)	4	0.96	77.8±1.2
디클로로메탄:메탄올(3:1)	5	0.56	38.7±2.0
디클로로메탄:메탄올(1:1)	6	0.58	9.0±9.1
메탄올	7	0.20	25.4±8.3

상기의 활성 실험결과, 가장 활성이 우수한 것으로 나타난 7번 분획물로부터 실리카겔을 고정상으로 하고 클로로포름:메탄올:초산 (100:0:0, 95:5:1, 90:10:1, 80:20:1, 50:50:1, 0:100:1)을 각각 전개용매로 하여 오픈 컬럼 크로마토그래피(open column chromatography)법을 수행하여 15개의 분획물을 얻고 94 ㎍/㎖ 농도에서 아세틸콜린에스테라제 활성저해효과를 측정하기 위한 효소저해반응을 실시하였다.

분획	수율(㎎)	아세틸콜린에스테라제억제반응(%)
1	50	23.1
2	20	21.2
3	70	7.8
4	30	13.6
5	30	6.6
6	30	6.5
7	30	0
8	13	21.2
9	19	10.0
10	20	18.9
11	50	15.0
12	60	71.8
13	60	49.8
14	40	25.0
15	300	4.9

상기 실험 결과, 아세틸콜린에스테라제 억제효과가 가장 우수한 것으로 나타난 12와 13번 분획물을 모아서 실라카겔을 고정상으로 하고 클로로포름:메탄올:초산(75:25:1)을 전개용매로하여, 분취용 박층크로마토그래피(prep-TLC)법을 실시하여 4개의 준 순수 화합물(semi purified compound)을 얻었다. 아세틸콜린에스테라제 활성저해효과 실험으로 효소억제반응을 평가한 결과, 화합물 EK-7이 가장 유효한 것으로 판단되었다(표 2 참조).

EK-7으로부터 세파덱스(sephadex) LH20을 고정상으로 하고 메탄올을 이동상으로 이용하여 오픈 컬럼 크로마토그래피법을 실시하여 정제된 화합물을 수득하였다. 상기의 과정을 수회 반복하여 구조결정에 필요한 화합물의 양을 확보하였다.

단계 4 : EK-7의 동정

상기 단계 3에서 얻어진 화합물은 드라겐돌프 시약에 양성반응을 보였고, 분 자량은 EIMS에서 323으로 나타났으며 이는 분자식 C₁₉H₁₇NO₄와 일치하였다. UV 흡광도(absorptions)에서는 λ 209와 247에서 강한 흡수극대피크가 관찰되었고, λ 332와 348에서 약한 흡수극대피크가 관찰되었으며, IR 스펙트럼에서는 OH그룹이 확인되었고 아포르핀(aporphine)계 알칼로이드로 확인되었다. H¹-NMR, C¹³-NMR 및 DEPT를 분석한 결과 EK-7은 기존에 분리 보고된 적이 없는 새로운 물질로 추정되었으므로, 계속적으로 COSY, NOESY, HMBC 및 HMQC의 2D NMR 반응(response)을 분석하였다(도 2 내지 도 10 참조). 이상의 기기분석결과 EK-7은 하기 물성치를 나타내 이를 2,10-디메톡시(dimethoxy)-7-(하이드록시(hydroxy)-6a,7-디하이드로아포르핀(dehydroaporphine)으로 동정하였다("에피메디핀(epimediphine)"으로 명명).

EIMS (Jeol AX505W): 324(M+1)

UV (325nm, υ^max): 348, 332, 247, 209

IR (V_max, ㎝^-1): 3425, 2924, 2851, 1750, 1603, 1291, 1139, 1091

DEPT: 도 5 참조

H¹-NMR (400 MHz, CDCl₃+CD₃OD) δ(ppm): 2.60(s, N-CH₃), 3.90(t, 4-CH₂), 3.56(t, 5-CH₂), 4.13, 4.14(s, O-CH₃), 7.30(d, 8-CH), 7.41(s, 3-CH), 8.22(d, J=1.082Hz, 9-CH)

COSY & C-NMR (100 MHz, CDCl₃+CD₃OD): 도 7 참조

NOESY : 도 8 참조

HMBC : 도 9 참조

HMQC : 도 10 참조

실험예 1. 본 발명 화합물의 아세틸콜린에스테라제 활성 저해 효과

상기 본 발명의 화합물에 대하여 아세틸콜린에스테라제 활성저해효과를 측정하였다.

아세틸콜린에스테라제 저해활성실험에서 효소활성은 엘만(Ellman) 방법을 변형하여 개선한 방법을 이용하였다. 기질인 아세틸티오콜린(acetylthiocholine)이 아세틸콜린에스테라제에 의해 가수분해되어 유리되어 나오는 티오콜린(thiocholine)을 DTNB(디티오니트로벤조산)와 반응시켜 생성되는 디티오 화합물과 니트로벤조산의 티오음이온(노란색)을 412nm UV로 검출하여 효소활성을 측정하였다. 기질인 아세틸콜린은 불안전하여 아세틸콜린에스테라제 이외의 요인에 의하여 분해되므로 이를 보정하기 위하여 대조군(Blank Control)을 두었다. 신규 알칼로이드 유도체 화합물 자체의 색깔에 의한 오차를 줄이기 위하여 효능군에도 대조군(Activity Control)을 하기와 같이 설정하였다(Ellman, GL., et al., Biochem. Pharmacol., 7, pp88-95, 1961; Perry NS., et al, J. Pharm. Pharmacol., 52, pp895-902, 2000).

아세틸콜린에스테라제

아세틸콜린 ------------------------> 티오콜린 + 아세테이트

티오콜린 + 다이티오비스니트로벤조에이트 -> 노란색

AE (Activity Efficacy) : 음양곽 분획 또는 신규 알칼로이드 유도체 화합물을 포함하는 실험군에서 추출물에 의해 활성이 억제된 AChE에 의한 흡광도와 추출물자체에 의한 흡광도의 합;

AC (Activity Control) : 음양곽 분획 또는 신규 알칼로이드 유도체 화합물을 포함하는 실험군에서 추출물자체에 의한 흡광도;

BE (Blank Efficacy) : AChE에 의한 흡광도;

BC (Blank Control) : 피소스티그민을 포함하는 실험군에서 피소스티그민에 의해 억제된 AChE에 의한 흡광도;

상기와 같이, AE, AC, BE 및 BC의 4개 군으로 나눈 후, AE 군에는 0.36단위/㎖ 아세틸콜린에스테라제(AChE, 시그마사) 40㎕와 함께 pH 8.0 완충용액 2.0㎖에 넣고 용매별 추출물들 각각 20㎕를 넣었다. AC군에는 AE군과 동일하게 준비하고 마지막으로 시험관에 0.1 mM 피소스티그민(시그마사) 용액 20㎕를 넣었다. BE 및 BC 군은 각각 AE 및 AC군과 동일하게 조작하되 신규 알칼로이드 유도체 화합물들 각각 20㎕ 대신에 녹인 용매를 넣었다. 시험관의 반응물을 잘 석은후 4℃에서 30분간 preincubation시켰다. 0.5mM 디티오비스-니트로벤조산(Dithiobis-nitrobenzoic acid, 시그마사) 용액 20㎕와 0.6mM 아세틸티오콜린(ACh, 시그마사) 20 ㎕를 처리하여 37 ℃에서 20분간 반응시켰다. 반응의 마지막 단계에서 0.1 mM 피소스티그민 용액 20 ㎕를 첨가 하여 반응을 완전히 중지시키고, 즉시 25 ℃의 실온에서 분광광도계(UV-2101PC UV/Vis Spectrophotometer, Shimadzu사, Japan)를 이용하여 412㎚에서 흡광도를 측정하였다. 효소활성의 저해도는 하기의 수학식을 통해 계산하여 백분율로 나타내었다.

저해율(%) = { (BE-BC)-(AE-AC) } / { (BE-BC) } × 100

화합물	아세틸콜린에스테라제 억제반응(%)
신규 알칼로이드 유도체 화합물(Epimediphine)	53.8
타크린(Tacrine)	18.9
디하이드로에보디아민(Dehydroevodiamine)	86.5
피조스티그민(Physostigmine)	7.6

실험예 2. 본 발명 화합물의 아세틸콜린에스테라제 50% 저해농도(IC ₅₀ 값) 측정

상기 본 발명의 화합물에 대하여 농도의존적인 아세틸콜린에스테라제 50% 저해농도(IC₅₀값)를 측정하기 위하여 12, 0.3, 0.071, 0.018, 0.0045 ㎍/㎖을 각각 20㎕ 가지고 실험예 1의 방법으로 아세틸콜린에스테라제 저해활성을 측정하였다. 측정결과를 가지고 프리즘(통계 및 그래픽 프로그램)을 이용하여 50% 저해농도 (IC₅₀값)를 측정하였고(도 1 참조), 분자량(323)을 이용하여 계산한 결과 3.1 uM로 나타났으며(표 4 참조), 신규 알칼로이드 유도체 화합물은 우수한 아세틸콜린에스테라제 저해활성을 나타내었다.

화합물	IC₅₀
신규 알칼로이드 유도체 화합물(Epimediphine)	3.1 uM
타크린(Tacrine)	0.4 uM
디하이드로에보디아민(Dehydroevodiamine)	37.9 uM
피조스티그민(Physostigmine)	0.12 uM

실험예 3. 급성독성 실험

3-1. 경구투여

ICR계 마우스(몸무게 25±5 g)와 스프라그-도올리계(sprague-dawly) 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 조성물을 각각 100, 250, 500 및 1000 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

3-2. 복강투여

ICR계 마우스(몸무게 25±5 g)와 스프라그-도올리계(sprague-dawly) 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 조성물을 각각 25, 50, 100 및 200㎎/㎏의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

실험 결과, 본 발명의 조성물은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.

본 발명의 신규 알칼로이드 유도체 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

EK-7 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

EK-7 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

EK-7 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

EK-7 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

EK-7 1000 ㎎

설탕 20 g

이성화당 20 g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1000 ㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

본 발명의 신규 알칼로이드 유도체 화합물은 탁월한 아세틸콜린에스테라제 저해활성을 나타내므로, 이를 포함하는 조성물은 인지력 향상 및 치매 특히, 아세틸콜린의 감소를 포함하는 콜린성 신경기능 퇴화로 인한 알츠하이머병의 예방 및 치료에 유용한 의약품으로 이용할 수 있다.

Claims

하기 일반식 Ⅰ로 표기되는 신규 알칼로이드 유도체 화합물:

(Ⅰ)

상기 식에서,

R₁, R₂ 및 R₃ 는 각각 독립적으로 수소원자 또는 C1 내지 C3의 저급 알킬기이다.
제 1항에 있어서, R₁이 수소원자이고, R₂ 및 R₃가 각각 C1 내지 C3의 저급 알킬기인 화합물.
제 2항에 있어서, R₁이 수소원자이고, R₂ 및 R₃가 각각 메틸기인 화합물.
제 1항의 일반식 Ⅰ의 알칼로이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 알츠하이머형 치매질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항의 일반식 Ⅰ의 R₁이 수소원자, R₂ 및 R₃가 각각 메틸기인 화합물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 알츠하이머형 치매질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
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