KR100588096B1

KR100588096B1 - 2-([(3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 화합물 및 약학적으로 수용가능한 그 염을 이용한 증식성 질병 치료방법

Info

Publication number: KR100588096B1
Application number: KR1019980007157A
Authority: KR
Inventors: 하브리섹 리보; 스트르나드 미로슬라브
Original assignee: 싸이클라셀 리미티드
Priority date: 1998-03-04
Filing date: 1998-03-04
Publication date: 2006-09-22
Also published as: KR19990073908A

Abstract

본 발명은 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 화합물 및 약학적으로 수용가능한 그 염을 이용하여 증식성 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.

상기 화합물을 증식성 질병, 예를 들어 암 또는 백혈병에 적용함으로써 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 조건 모두에서 cdk7 키나아제를 억제하는데 OC(올로모우신) 유도된 합성 CDKI이 능력있음을 알 수 있다.

Description

2-([(3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 화합물 및 약학적으로 수용가능한 그 염을 이용한 증식성 질병 치료 방법{A method of treating proliferative disease using 2-([3-hydroxypropyl)amino]-6-benzylamino)-9-isopropylpurine or salts thereof}

상기 화합물은 암 및 백혈병(leukaemia)와 같은 증식성 질병의 치료에 특히 유익한 것으로 관찰되어 왔다. 하기 기술된 바와 같이, 상기 화합물읕 종래에는 보고되지 않은 특정 이익을 제공하는 작용 기구를 갖는 것으로 관찰되었으며, 예를 들면 유전자 전사에 변화를 유도하지 않는, 즉 유전자 발현의 조절을 포함하지 않는 세포 주기 조절 제어 시스템에서 일정 수준으로 작용하는 방식으로 세포 증식을 억제하는 것으로 나타났다.

종래 기술은 시클린(cyclin) 의존 키나아제를 억제하는 것에 의하여 세포 주기를 조절할 수 있는 여러 가지 화합물을 기술하고 있다. 이들 화합물로는 부티로락톤, 플라보피리돌 및 2-(2-히드록시에틸아미노)-6-벤질아미노-9-메틸퓨린(올로모우신)을 포함한다. 올로모우신 및 연관된 화합물은 세포 주기 조절에 관련되는 시클린 의존 키나아제군의 촉매성 소단위인 cdc2(일명 cdk1으로도 알려짐)의 억제제인 것으로 나타났다.

이들 키나아제는 최소 2개의 소단위, 즉 촉매성 소단위(catalitic sub-unit)(그 cdc2는 기본형)와 조절 소단위(regulatory sub-unit)(시클린)으로 이루어진다. 상기 cdk들은 다음 다수의 시클린군과의 전이성 관련 전이에 의해 조절된다: Cyclin A(cdc2, cdk2), Cyclin B1-C3(cdc 2), Cyclin C(cdk8), Cyclin D1-D3(cdk2-cdk4-cdk5-cdk6), Cyclin E(cdk2), Cyclin H(cdk 7).

이들 각각의 복합물은 세포 주기의 위상에 관련된다. cdk 활성은 후-전이 연속변이에 의해, 다른 단백질과의 전이 관련에 의해 그리고 세포내 국소화(localisation)의 변이에 의해 조절된다. 상기 cdk조절자는 활성자(시클린, cdk7/시클린 H, cdc 25 포스파테제), p9^CKS 및 p15^cdk-BP 소단위, 및 저해 단백질(p16^INK4A, p15^INK4B, p21^Cipi, p18, p27^KipI)으로 이루어진다.

현재 cdk과 그 조절 단백질이 인간 종양의 발달에 현저한 역할을 한다는 가설이 문헌상 상당한 지지되고 있다. 따라서 다수의 종양에서 시클린-의존 키나아제의 일시적 비정상적인 발현 및 단백질 저해제의 주된 탈-조절(돌연변이, 결손)이 관찰되었다.

화합물 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린은 이 화합물이 증식 조직 및 건강하지 않은 조직에 있어서 세포 증식을 억제할 수 있으며, 나아가 증식성 세포에서 파괴(apoptosis)(프로그램된 세포 사망)를 유도할 수 있는 큰 잇점을 제공하는 cdk2, cdk4 및 cdk7의 강력한 생체내(in vivo) 저해제이다.

따라서 본 발명은 이 화합물 및 그 염을 사용하여 암 및 백혈병과 같은 증식성 질병을 치료하고자 한다.

본 발명의 제1 견지에 의하면, 화합물 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 혹은 약학적으로 수용가능한 그 염을 치료적으로 유효한 양으로 투여함을 특징으로 하는 백혈병으로 부터 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 화합물 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 혹은 약학적으로 수용가능한 그 염을 치료적으로 유효한 양으로 투여함을 특징으로 하는 암으로 부터 환자를 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 화합물 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 혹은 2-[(1-에틸-2-히드록시에틸)아미노]-6-벤질아미노-9-이소프로필퓨린 혹은 약학적으로 수용가능한 그 염을 치료적으로 유효한 양으로 투여함으로써 cdk4 및/또는 cdk7효소를 억제함을 포함하는 암 또는 백혈병 증식 질병을 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또다른 견지에 의하면, 화합물 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 혹은 2-[(1-에틸-2-히드록시에틸)아미노]-6-벤질아미노-9-이소프로필퓨린 혹은 약학적으로 수용가능한 그 염을 치료적으로 유효한 양으로 투여함을 포함하는 증식 세포내에 세포 치사를 유도하는 방법이 제공된다.

이들 세가지 견지 및 측면에 있어서, 상기 증식 세포는 암 내지는 백혈병 세포일 수 있으며, 상기 암 혹은 백혈병은 바람직하게는 p53 독립적이다.

본 발명의 화합물은 염, 특히 약학적으로 수용가능한 염으로 존재할 수 있다. 예를 들면 이들은 황산, 인산 혹은 하이드로(hydrohalic) 산과 같은 무기산과 같은 강한 무기산으로, 치환되지 않거나 혹은 예를 들어 할로겐으로 치환된, 아세트산과 같은 1-4개의 탄소 원자를 갖는 알칸카르복시산, 포화되거나 혹은 예를 들어 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 퓨마르산, 프탈산 혹은 테레프탈산과 같은 포화되지 않은 디카르복시산, 예를 들어 아스코로브산, 글리콜산, 락산, 말산, 타르타르산, 혹은 시트르산과 같은 히드록시카르복시산, 예를 들어 아스파르트산 혹은 글루탐산과 같은 아미노산, 혹은 벤조산과 같은 강한 유기 카르복시산, 혹은 치환되지 않거나 혹은 예를 들어 할로겐으로 치환된, 메탄- 혹은 p-톨루엔-술폰산과 같은 (C₁-C₄)-알킬- 혹은 아릴-술폰산과 같은 유기 술폰산으로 형성된다.

본 발명은 또한 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 혹은 약학적으로 수용가능한 그 염을 최소 하나의 약학적으로 수용가능한 부형제를 포함하여 이루어진 약제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 약제 조성물은 경구, 항문, 질, 비경구, 근육내, 복강내, 피하, 정맥내, 코 혹은 구강 경로에 도입될 수 있다.

경구 투여를 위해, 실제적인 이용은 압축된 정제, 환약(pill), 겔(gellule), 조제(drop) 및 캡슐등으로 이루어진다. 이들 조성물은 이익적으로 허용량당 활성 성분을 1-100mg 그리고 바람직하게는 10-40mg을 포함한다.

투여의 다른 형태는 정맥내, 피하 혹은 근육내로 주입될 수 있고, 멸균 혹은 멸균가능한 용액으로 부터 제조되는 용액을 포함한다. 이들은 또한 좌약, 질좌약, 서스펜션, 에멀션, 로션, 연고, 크림, 겔 및 스프레이의 형태일 수 있다.

주입가능한 형태는 허용량당 활성 성분을 1-50-mg, 바람직하게는 10-30mg을 포함할 수 있다.

조성물은 단위 허용량 형태, 즉 단위 복용량, 혹은 단위 허용량의 다중 혹은 소단위를 포함하는 불연속 분획의 형태로 배합될 수 있다.

예를 들어, 인간에게 사용될 수 있는 용량학은 다음과 같은 투여량에 상응한다: 따라서 예를 들면 환자는 종양 치료용으로 1회이상의 1일당 10-50mg 복용량을 투여할 수 있다.

<실시예>

실시예 1: 2-[(3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노-9-이소프로필퓨린(보헤민)의 제조

물질 및 방법

Kofier 블록상에서 용융점을 측정하였고 보정하지 않았다. 평가는 디메틸 술폭시드 및 아민의 경우에는 회전 오일 펌프 혹은 물-펌프 진공하에서, 회전 증발기로 증박을 수행하였다. 'H NMR스펙트럼(δ, ppm; J. Hz)이 Varian VXR-400(400MHz) 혹은 Varian Unity 200(200MHR)상에서 측정되었다. 모든 스펙트럼은 내부 표준으로서 테트라메틸실란을 사용하여 25℃에서 얻었다. 전자 충격 질량 스펙트럼(m/z,rel %)은 VG 7070E 분광기(70eV, 200℃, 직접 유입)이나 Finnigan MAT 90 분광기(70eV, 250℃, 직접 유입) 혹은 Jeol JMS-DIOO(80eV, 200℃, 직접 유입)상에서 평가하였다. 높은 분해능 측정은 표준으로서 Ultramarck 1600F(PCR Inc., FL, USA)를 사용한 피크-조합 방법에 의해 수행하였다. 상기 기구는 8,000의 용해도(10% 홈 정의)로 조절하였다. 적외선 스펙트럼은 KBr 디스크로서 FTIR Nicolet 205 기구상에서 기록하였다. Merck 실리카 겔 Kiesel겔 60(230-400메쉬)이 칼럼 크로마토그래피를 위해 사용되었다. TLC는 Merck DC Alufolien Kiesel 겔 60 F254 플레이트상에서 수행되었다.

6-벤질아미노-2-클로로-9-이소프로필퓨린(2)

건조 디메틸 술폭시드 35ml내에 6-벤질아미노-2-클로로퓨린(1)(1.32g, 5.08mmol), 탄산칼륨(4.3g, 31mmol) 및 이소프로필브로마이드(5.5ml, 58mmol)를 혼합시킨 혼합물을 밤새 격렬하게 교반하였다. 상기 반응 혼합물은 진공에서 증발시킨 다음 물과 에틸아세테이트사이를 층분리하였다. 상기 유기층을 건조시키고(황산나트륨) 증발시켰다. 메탄올로 부터 결정화하여 산물 2를 1,305g(85%)를 얻었으며, 그 m.p는 181-182℃였다.

C₁₅H₁₆N₅Cl(301.78)은 C 59.70%, H 5.34%, N 23.21%, Cl 11.75%로 계산되었다.

실제값: C 59.52%, H 5.36%, N 23.01%

FTIR 스펙스럼(cm^-1): 1713, 1626, 1572, 1537, 1497, 1471, 1456, 1425, 1398, 1355, 1314, 1292, 1255, 1228, 1202.

¹H NMR(400MHz, (CH₃)₂SO):1.48d(6H, J=6.8, (CH₃)₂CH); 4.57m(1H, CH(CH₃)₂; 4.66d(2H, J=6.1, CH₂); 7.19ft(1H, J=7.2, J=1.7, H-p); 7.27dd(2H, J=7.2, H-m); 7.34dd(2H, J=7.2, J=1.7, H-o); 7.69s(1H, H-C⁸).

2-[(3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노-9-이소프로필퓨린(3)

2-클로로유도체(2)(0.5mmol) 및 3-아미노프로판올 3ml을 3시간동안 160℃로 가열하였다(밀폐된 앰플). 과량의 아민을 70℃이하의 온도에서 증발시키고 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(CHCl₃내 MEOD 0;1;2%단계별)로 정제시키고, 디에틸렌 에테르로 부터 결정화하여 산물을 82% 수율로 얻었으며 그 m.p.은 98-101℃였다.

C₁₈H₂₄N₆₀(340.43)에 대한 계산치는 C 63.51%, H 7.11%, N 24.69%였으며; C 63.43%, H 7.05%, N 24.60%인 것으로 발견되었다.

질량 스펙트럼(Finnigan MAT 90): 341(21), 340.21 10(M+-, C₁₈H₂₄N₆0, caic 340.2012, 100%), 339(4), 310(9), 309(33), 297(11), 296(28), 295(38), 282(9), 253(6), 251(4), 239(4), 191(6), 134(6), 106(8), 92(4), 91(44), 43(9), 41(7).

¹H NMR(200MHz, CDCl₃): 1.53d(6H, J=7, (CH₃)₂CH); 1.68-1.81m(2H, CH₂CH₂CH₂); 3.55-3.71m(4H, CH₂N + CH₂0); 4.62hept(1H, J=7, CH(CH₃)₂); 4.76bd(2H, J=4.5, CH₂Ph); 4.96bt(1H, NHC₂); 5.10bs(OH 혹은 NH); 6.00bs(NH 혹은 OH), 7.22-7.38m(5H, Ph), 7.47s(1H, HㅁC₈).

대체 합성 혹은 6-벤질아미노-2-클로로-9-이소프로필퓨린(2):

2,6-디클로로-9-이소프로필퓨린

2.6-디클로로퓨린 1g(5.3mmol), 분말화 탄산칼륨 2g(14mmol)으로된 혼합물을 DMF 35ml에 가혹하게 교반시켰다. 이소프로필요오다이드 3ml(30mmol)을 10시간내에 5분획으로 나눠 첨가하였다. TLC(EtOAc/헵탄; 1/1)에 의해 반응의 모니터 결과, 반응이 거의 완결된 것을 확인하였다.

주요 산물을 헵탄내 EtOAc 20, 30, 40%로 단계적으로 칼럼 크로마토그래피에 의해 분리하였고 EtOAc/펜탄으로 결정화하고; 0.54g(44%)를 수득하였으며; 그 m.p은 148-150℃였다.

C₁₈H₈N₄Cl₂에 대하여는 C 41.58%; H 3.49%; N 24.25%; Cl 30.68%;로 계산되었으며 C 41.29%; H 3.71%; N 24.01%;로 발견되었다.

¹H NMR(400MHz, CD30D): 1.67(6H, d, J=6.8, (CH₃)₂CH), 4.93(1H, mt, CH(CH₃)₂), 8.67(1H, s, H-C₈)

¹³C NMR(100MHz, CD30D): 22.74Qqd(J=128.0, J=4.6, J=4.6), 50.79Dseq(J=143.4, J=4.4), 132.41d(J=11.6), 147.67Dd(J=214.0, J=4.4), 152.24s, 153.91s, 154.75br mt.

6-벤질아미노-2-클로로-9-이소프로필퓨린(2)

2,6-디클로로-9-이소프로필퓨린(1mmol)과 벤질아민(3.5mmol)을 n-부탄올(3시간, 110℃) 3ml내에서 교반하면서 가열하였다. 반응 혼합물(n-부탄올의 증발후)를 화합물 2에 대하여 상기와 같은 작업하여 85-90% 수율을 얻었다.

참고 문헌:

1. Hocart C.H., Letham D. S., Parker C. W.: Phytochemistry 30, 2477(1991).

실시예 2; 2-[(3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노-9-이소프로필퓨린의 생물학적 활성

2.1 보헤민의 시험관내 세포독성(cytotoxic) 활성

시험관내 MTT-검정

비색(colorimetric) 검정에 기준으로서 사용된 파라미터중 하나는 생균 세포의 대사 활성이다. 예를 들면, 테트라졸리움염 MTT를 사용한 마이크로적정(microtiter) 검정이 현재 세포 증식과 세포독성도를 정량화하는데 폭넓게 사용되고 있다. 예를 들면, 이 검정은 약품 선별(drug screening) 프로그램 및 화학적 민감성 시험에서 사용된다. 테트라졸리움염은 대사적으로 활성있는 세포에만 분열되기 때문에, 이들 검정은 배타적으로 생균 세포를 검출한다. MTT-검정의 경우에, 황색 용해성 테트라졸리움염은 착색된 물-불용성 포르마잔염으로 환원된다. 이들이 용해된 다음 형성된 포르마잔은 570nm(최대 흡수도)에서 통상의 ELISA 플레이트 판독기에서 용이하고 신속하게 정량화될 수 있다. 환원된 포르마잔의 양은 배지내에 생체 세포의 수에 상응한다.

물질

인간 T-임파아세포(lymphoblastic) 백혈병 세포 계통 CEM, 전골수세포(promyelocytic) 백혈병 HL-60, 인간 유방암 세포 계통 MCF-7, 자궁암세포 HELA, 쥐 섬유아세포(fibroblast) NIH3T3, 쥐 영구뼈 골수(marrow) 마이크로위상 B2.4 및 B10A.4, P388D1 및 L1210 백혈병, B16 및 B16F10 흑색종이 화합물의 경로 선별용으로 사용되었다. 상기 세포는 Nunc/Corning 80㎠ 플라스틱 조직 배지 플라스크내에서 유지시키고 세포 배지 매질(글루코오스 5g/l, 글루타민 2mM, 페니실린 100U/ml, 스트렙토마이신 100㎍/ml, 10% 태(fetal) 송아지 혈청 및 탄산수소나트륨를 갖는 DMEM)내에서 배양시켰다. 상기 화합물 로스코보틴(roscovotine) 2-[(1-에틸-2-히드록시에틸)아미노]-6-벤질아미노-9-이소프로필퓨린을 WO97/20842에 기술된 바와 같이 제조하였다. 상기 기술된 바와 같이 제조된 화합물 2-[(3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노-9-이소프로필퓨린을 하기에서 보헤민이라 한다.

방법

특정 세포 형태 및 예상된 표적 세포 밀도(세포성장 특성을 기준으로 1웰(well)당 2,500-30,000세포)에 따라 제조되고 희석된 세포 서스펜션을 96웰 마이크로적정판내로 피펫으로 첨가하였다(80㎕). 접종물은 37℃ 및 5% CO₂에서 24시간의 예비배양 시간동안 안정화하였다. 의도된 시험 농도의 4배 희석물을 0시간에 마이크로적정판 웰에 20㎕ 분획으로 첨가하였다. 일반적으로 시험 화합물은 6개의 4배 희석물에서 평가하였다. 경로 시험에 있어서, 최고 웰 농도는 266.7μM이었으나, 제제에 따라변경될 수 있다. 모든 약품 농도는 이중으로 조사되었다. 세포를 시험 화합물로 5% CO₂ 분위기 및 100% 습도에서, 37℃에서 72시간동안 배양하였다. 배양 시간의 말기에 세포를 MTT를 사용하여 검정하였다. MTT 모액 10㎕를 피펫으로 각 웰에 첨가하고 1-4시간동안 추가 배양시켰다. 이 배양기후에, 포르마잔을 웰당 물내 10% SDS 100㎕(pH=5.5)를 첨가하여 안정화시키고 나아가 37℃에서 밤새 배양하였다. 최적 밀도(OD)는 Labsystem iEMS Reader MF(UK)로 540nm에서 측정하였다. 상기 종양 세포 생존(TCS)는 다음 방정식을 사용하여 계산하였다: TCS=(OD_{약품 노출된 웰}/OD_{조절 웰})ㅧ100%. 상기 TCS₅₀값, 종양 세포의 50%를 치사하는 약품 농도를 얻어진 복용량 반응 곡선으로 부터 계산하였다.

2.2 보헤민의 생체내 항종양 활성

사이토키닌 유도체가 이식된 종양의 성장에 미치는 효과를 분석하기 위하여, 복강내로 이식된 P388D1 백혈병(4ㅧ1mg/일 i.p.) 및 피하 접종된 B16 흑색종 모델을 적용하였다.

1. 쥐 흑색종 B16

쥐 흑색종 세포 B16을 DMEM내에서 글루코오스 5g/l, 글루타민 2mM, 페니실린 100U/ml, 스트렙토마이신 100㎍/ml, 10% 송아지 태혈청 및 탄산수소나트륨으로 최대 80% 융합도(confluency)까지 성장시켰다. 세포를 트립신화하고 PBS로 세척하고 0.5% 소혈청 알부민으로 PBS내에서 부유시켰다. 이 서스펜션으로 부터 오십만 세포를 C57BL-10쥐에 피하 적용하였다. 하루후, 동물을 전파자(vehicle) 혹은 지시된 화합물: 이소펜테닐아데닌(IP), 올로모우신(OC), 보헤민(BOH), 로스코비틴(ROSC)로 처리하였다. 상기 화합물(1mg)을 매일 4회씩 7일간 피하 적용하였다. 매질 생존 시간(MST)는 도 1에 도시된 모든 실험 그룹에서 평가하였다.

1. 쥐 백혈병 P388D1

쥐 P388D1 백혈병을 DMEM내에서 글루코오스 5g/l, 글루타민 2mM, 페니실린 100U/ml, 스트렙토마이신 100㎍/ml, 10% 송아지 태 혈청 및 탄산수소나트륨으로 최대 80% 융합도까지 성장시켰다. 세포를 긁고 PBS로 세척하고 0.5% 소혈청 알부민으로 PBS내에서 부유시켰다. 이 서스펜션으로 부터 오십만 세포를 DBA-2쥐에 복강내적용하였다. 하루후, 동물을 전파자 혹은 지시된 화합물: 이소펜테닐아데닌(IP), 올로모우신(OC), 보헤민(BOH), 로스코비틴(ROSC)로 처리하였다. 상기 화합물(1mg)을 매일 4회씩 7일간 피하 적용하였다. 생존율(%)은 도 1에 도시된 모든 실험 그룹에서 평가하였다.

배합 물질

시험관내 세포독성도/항증식 검정: 생리 식염수(0.9% w/v 염화나트륨)내에 10% 디메틸술폭시드(DMSO), HCl 80mM.

생체내 항암 활성 검정: 물 불용성 화합물: 식염수내에 50% DMSO, HCl 10mM.

결과

2.1 보헤민의 시험관내 세포독성 활성

IP, OC, BOH 및 ROSC의 항암활성을 평가하기 위하여, 이들 화합물의 독성을 다른 조직형성 및 종 기원의 세포 계통의 패널에서 시험하였다(표 1).

IC50(μM)
	CEM	HL-60	B16	B16F10	MCF7	HELA	B10#4	B2#4	U937	L1210	P388D1	NIH3T3	임파구
IP	168.9	157.41	266.7	266.7	266.7	266.7	266.7	266.7	266.7	266.7	266.7	266.7	266.7
OC	20.68	28.9	50.4	20.6	30.53	100.4	20.26	8.1	63.8	23.5	14.5	266.7	266.7
BOH	6.16	16.7	22.6	4.3	17.0	11.1	8.3	6.4	20.1	12.8	6.3	266.7	266.7
ROSC	4.3	11.7	15.8	4.0	5.27	7.55	15.9	6.9	19.4	8.7	5.8	266.7	266.7

본 발명자들은 시험된 모든 종양 세포 계통에서 동일한 활성을 발견하였으나, 비-악성 세포, 예를 들면 NIH3T3 섬유아세포와 정상적인 인간 임파구는 합성 CDKI 유도된 독성에 저항성이 있다. 상기표 1에서 예시된 바와 같이, IP는 현저한 독성을 보이지 않으며, OC는 적당한 효과가 있는 반면, BOH와 ROSC는 10-20μM에 근접한 농도에서 종양 세포를 치사시켰다.

2.2 보헤민의 생체내 항종양 활성

그러나, 시험관내 검정과는 대조적으로, 단지 올로모우신과 보헤민만이 쥐 P388D1 백혈병과 B16 흑색종 모델 모두에 현저한 생체내 활성을 보였다(도 1). 이소펜테닐아데닌은 생체내에서 활성 및 독성을 보이지 않는 반면, 로스코비틴은 비활성이고 나아가 적용 결과 피하/복강내 적용후 심한 표피/복강 괴사성 병소를 유도하였다. 이들 결과는 CDKI의 효소 억제 활성 및 시험관내 세포독성도가 자동적으로 항암 활성을 예측하지 않는 것을 나타낸다.

실시예 3: 시험관내 및 생체내 조건하에 서올로모우신 유도된 합성 CDKI가 cdk4 및 cdk7활성에 미치는 영향

시클린 의존 키나아제는 이들의 활성을 위해 Thr 160/161상에서 시클린과의 연합 및 포스포릴화를 필요로 한다. Cdk7은 이 활성화 포스포릴화를 위하여 필요한 효소인 것으로 앞서 인식되었다. 올로모우신 유도된 합성 CDKI에 대한 초기 연구 결과 이들 화합물은 후기 G1 위상에서 세포 주기 진행을 억제하는 것으로 나타났다. cdk4/cdk6 키나아제의 활성은 암세포가 G1 억제점을 통과하는데 필요하기 때문에, 본 발명자들은 본 화합물의 시험관내 및 생체내 조건 모두에서 cdk4 키나아제를 억제하는 성능을 조사하였다. 앞선 관찰에서와 같이, cdk4는 시험관내(IC50>250μM)에서 올로모우신 유도체로 억제되지 않는 반면(WO97/20842참조), 동일한 물질로 처리된 세포로 부터 면역침전된 cdk4의 활성은 급속히 감소되었다. 가능한 해석중 하나는 시토키닌 유도된 CDKI는 cdk7의 활성을 하향 규제하고 따라서 Thr161상에서 활성 포스폴릴화로 부터 cdk4를 보호한다는 것이다. 여기서 처음으로 화합물 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-0-이소프로필퓨린이 cdk4 억제가 또한 관찰되는 시험관내 및 생체내조건 모두에서 cdk7의 강력한 억제제인 것으로 기술되어 있으며, 보다 일반적으로 본 발명은 cdk7 및/또는 cdk4의 증가된 활성으로 종양 치료를 위하여 이들 화합물군을 적용함을 포함한다.

단백질 반응물

바큐로비루스(baculovirus) 엔코드된 인간 cdc2 및 시클린 B1, (Dr. David Lane 제공)을 다른 곳에 기술된 바와 같이 Sf9 세포내에서 발현시켰다. cdk2 및 cdk4에 대한 복수의 포스포릴화 부위를 포함하는 글루타티온 S-트란스페라제-카르복시 말단 망막아세포종 단백질(GST-Rb)(Cr. Jiti barteek 제공)을 E.콜리(E.coli)내에서 발현시켰고 친화도를 정제하였다.

cdk7 활성 연구를 위해, cdc2/시클린 B1 착물은 기질로서 사용되었다. 이들 자동촉매화 활성은 키나아제의 ATP 결합 자리에 대한 ATP 동족체(analog) 5-p-플루오로술포닐벤조일아데노신(FSBA)의 공유 결합에 의해 저지되었다. 간략하게, 동시 발현된 cdc2/시클린 B1을 함유하는 바쿠로비루스 용해질 200㎕를 50NaCl 1800㎕로 희석하고, MgCl₂ 10mM, 오발부민 1mg/ml, 10% DMSO, 프로테아제 억제제를 갖는 칼륨-HEPES 완충액 50mM, FSBA 20mM함유 DMSO 200㎕를 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 30분간 배양하였다. 배양기간후, 혼합물을 EB 완충액(MgCl₂ 15mM, 칼륨 EGTA 20mM, 디티오트레이톨 10mM, 글리세롤-2-포스페이트, pH 7.3, 80mmol 소디움 바나데이트 1mM, NaF 1mM, 페닐포스페이트 1mM, 루펩틴 10㎍/ml, 아프로티닌 10㎍/ml, 콩 트립신 억제제 10㎍/ml, 벤즈아미드 100μmol)에 대하여 마이크로-투석에 의해 밤새 4℃방에서 급냉시켰다. 비활성 cdc2/시클린 B1 용액을 한외여과에 의해 최종 부피 200㎕로 농축시키고 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

cdk4 활성

cdk4 단백질을 단지 하나의 변이로, 예를 들어 RIPA 완충액 대신에 2개의 최종 세척을 키나아제 완충액(글리세롤-2-포스페이트 60mmol, p-니트로페닐 포스페이트 15mmol, MOPS 125mmol, pH 7.2, EGTA 5mmol, EGTA 15mmol, MgCl₂ 15mmol, 디티오트레이톨 1mmol, 소디움 바나데이트 1mmolm, NaF 1mM, 페닐 포스페이트 1mmol, 루펩탄 10㎍/ml, 아프로티닌 10㎍/ml, 콩 트립신 억제제 10㎍/ml, 벤즈아미드 10μmol) 내에서 수행하면서 기술된 바와 같이 항-cdk4 모노클론 항체 및 프로테인-G 세파로제를 사용하여 로그 위상 성장 세포(log phase growing cell)로 부터 면역침전시켰다. 최종 세척후, 키나아제 완충액내의 106세포와 등가인 면역침전된 cdk4 단백질을 Rb-GST 단백질 1㎕(10mg/ml), 15μmol γ-32P/ATP(3000μCi/mmol, 1mCi/ml), DMSO 0.3㎕ 총 부피 30㎕의 적절한 농도에서 DMSO 용해된 시험 화합물과 얼음상에서 혼합하였다. 키나아제 반응은 30℃에서 15분간 수행되었으며, 5개의 SDS-PAGE 시료 완충액 7㎕를 첨가함으로써 중단시켰다. 이들 시료의 분획(25㎕)을 10% 폴리아크릴아미드 겔에 전기영동시키고 밀도계로 정량화하였다.

cdk7 활성

cdk7 단백질을 단지 하나의 변이로, 예를 들어 RIPA 완충액 대신 2개의 최종 세척물을 키나아제 완충액내에서 수행하면서 기술된 바와 같이 항-cdk4 항체를 사용하여 로그 위상 세포 성장으로 부터 면역침전시켰다. 최종 세척후, 키나아제 10⁶세포와 등가인 면역침전된 cdk7 단백질을 기질로서 FSBA 비활성 cdc2/시클린 B1 착물 10㎕, MgCl₂ 3㎕, 15μmol γ-32P/ATP(3000μCi/mmol, 1mCi/ml) 및 DMSO 1㎕ 혹은 전체 100㎕의 EB 완충액내에서 각각 적절한 농도로 시험된 화합물 DMSO 용액과 얼음상에서 혼합하였다. 반응 혼합물을 30℃에서 배양하였으며, 반응을 30분후 5개의 SDS-PAGE 시료 완충액 20㎕를 첨가함으로써 급냉시켰다. 이들 시료의 분획 25㎕을 12% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시키고 밀도계로 정량화하였다.

상기한 바에 따르면, 시토키닌 유도체는 생체내에서 cdk4 활성을 대체하는 것으로 보이는 반면, 동일 화합물은 시험관내 조건하에서는 전혀 비활성인 것을 보여준다(도 2). 이 관찰은 Try 15 탈포스포릴화 반응의 변질조절(dysregulation) 및 cdc 25 포스파타제 활성으로 설명될 수 있음에도 불구하고, 본 발명자는 cdk7에 대한 억제로 인해 생체내에서의 cdk4 활성이 감소된다는 것을 증명하였다(도 2). 이는 시험관내 및 생체내 조건 모두에서 cdk7 키나아제를 억제하는데 OC 유도된 합성 CDKI의 능력을 처음으로 증명한 것이다.

도 1은 p338D8 백혈병 및 큰 흑색종(melanoma)의 모델에 대해 분석된 합성 CDKI의 생체내 활성을 도시한 그래프,

도 2는 cdk4 및 cdk7에 대한 사이토키닌 유도체의 시험관내 및 생체내 활성을 도시한 그래프이다.

Claims

화합물 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 혹은 약학적으로 수용가능한 그 염, 및 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부형제를 치료적으로 유효한 양으로 포함함을 특징으로 하는 백혈병 치료용 약학 조성물.
화합물 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 혹은 약학적으로 수용가능한 그 염, 및 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부형제를 치료적으로 유효한 양으로 포함함을 특징으로 하는 암 치료용 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 백혈병 또는 암은 p53에 의존적이지 않음을 특징으로 하는 약학 조성물.
화합물 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 혹은 2-[(1-에틸-2-히드록시에틸)아미노]-6-벤질아미노-9-이소프로필퓨린 혹은 약학적으로 수용가능한 그 염, 및 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부형제를 치료적으로 유효한 양으로 포함함을 특징으로 하며 cdk4 및/또는 cdk7 효소 억제활성을 갖는 암 치료용 약학 조성물.
화합물 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 혹은 2-[(1-에틸-2-히드록시에틸)아미노]-6-벤질아미노-9-이소프로필퓨린 혹은 약학적으로 수용가능한 그 염, 및 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부형제를 치료적으로 유효한 양으로 포함함을 특징으로 하며 cdk4 및/또는 cdk7 효소 억제활성을 갖는 백혈병 치료용 약학 조성물.
화합물 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 혹은 2-[(1-에틸-2-히드록시에틸)아미노]-6-벤질아미노-9-이소프로필퓨린 혹은 약학적으로 수용가능한 그 염, 및 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부형제를 치료적으로 유효한 양으로 포함함을 특징으로 하며 증식 조직 및 건강하지 않은 조직에서 세포 증식을 억제하는 활성을 갖는 암 또는 증식성 질병 치료용 약학 조성물.
화합물 2-([3-히드록시프로필)아미노]-6-벤질아미노)-9-이소프로필퓨린 혹은 2-[(1-에틸-2-히드록시에틸)아미노]-6-벤질아미노-9-이소프로필퓨린 혹은 약학적으로 수용가능한 그 염, 및 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부형제를 치료적으로 유효한 양으로 포함함을 특징으로 하며 증식성 세포에서의 세포 치사 유도 활성을 갖는 암 또는 증식성 질병 치료용 약학 조성물.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 암 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 백혈병 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 증식성 세포는 암 또는 백혈성 세포임을 특징으로 하는 약학 조성물.