KR100577003B1 - 곤충병원성 미포자충의 감염 진단을 위한 프라이머 및상기 프라이머를 이용한 감염 진단방법 - Google Patents

곤충병원성 미포자충의 감염 진단을 위한 프라이머 및상기 프라이머를 이용한 감염 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 곤충병원 미포자충병 조기진단을 위하여 특이적 PCR 프라이머 및 이를 이용한 PCR 기법으로 곤충병원성 미포자충의 감염여부를 효과적으로 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 자원화 곤충에 병을 일으키는 미포자충에 특이적으로 존재하는 small subunit ribosomal RNA 유전자의 염기서열로부터 본 발명에 이용하기에 가장 적합한 프라이머를 제작하였고, 이 제작된 프라이머로 PCR을 수행하면 미포자충의 감염여부를 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 미포자충의 small subunit ribosomal RNA의 특정 염기서열에 상응하는 프라이머를 사용하여 PCR 기법으로 곤충병원성 미포자충을 조기 진단함으로서, 미포자충병 예방과 방제에 시간과 비용을 절약하여 자원화 곤충의 안정적인 대량생산에 기여할 수 있다.
곤충, 미포자충, 조기진단

Description

곤충병원성 미포자충의 감염 진단을 위한 프라이머 및 상기 프라이머를 이용한 감염 진단방법{Primers for Diagnosing the Disease by Entomopathogenic Microsporidia, and Diagnostic Method using Thereof}
도 1은 small subunit ribosomal RNA 유전자와, 본 발명에 의한 프라이머들의 관계 및 상기 프라이머들에 의한 증폭산물의 크기를 보여주는 개략도.
도 2는 NS1과 NS2 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행한 결과 블럿 사진.
도 3은 NS1과 NS4 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행한 결과 블럿 사진.
도 4는 NS3과 NS4 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행한 결과 블럿 사진.
도 5는 본 발명에 의한 PCR 기법의 진단감도를 보여주는 블럿사진.
본 발명은 곤충에 병을 일으키는 미포자충에 특이적으로 존재하는 16S rRNA의 특정 염기서열에 상응하는 PCR 증폭용 프라이머에 관한 것이다. 또한, 상기 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 곤충 충체나 배설물에서 미포자충 감염여부 를 진단하는 방법에 관한 것이다.
미포자충(microsporidia)은 극사를 내장하고 있는 단세포성 진핵미생물이다. 모든 종이 활물기생체이며 원생동물에서 사람에 이르기까지 광범위한 기주범위를 가진다. 그 수는 1,100종 정도가 알려져 있으며, 이중 많은 종이 곤충에 기생하는데 병원성이 높아 곤충에 치명적인 영향을 주는 것이 대부분이다. 미포자충은 대표적인 산업곤충인 누에와 꿀벌에도 큰 피해를 초래하였다. 누에에서는 미립자병(Nosema bombycis)을 일으키며, 주요 전염경로는 경구감염(oral infection)과 경란전염(transovarial transmission)이다. 꿀벌의 경우 노제마병(Nosema apis)을 일으키며 성충에 감염되어 봉세를 약화시키고 생산량을 크게 감소시킨다. 또한, 국내 자원화 곤충 중 나비목의 경우 병사충의 40∼87%가 미포자충에 기인한 것이 확인되는 등 그 피해가 심각하다. 따라서 곤충의 안정적인 대량생산을 위해서는 미포자충의 방제가 중요하며, 특히 감염충의 조기진단에 의한 병원체 확산 차단이 가장 효과적인 대책이 될 수 있다.
종래, 곤충의 미포자충의 감염을 진단하고 미포자충을 검출-동정하는 방법으로는 외부병징의 육안 및 현미경관찰법, 항혈청에 의한 효소면역항체법, 배양-동정법 등이 알려져 있다.
그러나 일반적인 외부병징의 육안 또는 현미경 관찰은 미포자충 감염 후기에나 진단이 가능하기 때문에 미포자충병의 조기발견에 의한 효과적인 방제는 불가능 한 문제가 있다. 효소면역항체법의 경우 상당한 시간과 비용이 요구될 뿐아니라 경우에 따라서는 종간의 교차 반응성으로 인해 특이성이 감소되는 단점이 있고, 배양하여 검출하는 방법은 상당한 기간을 요할 만큼 느리고, 종 동정을 위해서는 전형적으로 다양한 생화학적 시험을 거쳐야만 한다는 문제점이 있다.
PCR(중합효소연쇄반응) 기법은 1983년 미국의 캐리 멀리스에 의해 발명된 유전자 증폭 기법을 말한다. 이 기법은 프라이머라고 불리는 10∼20bp로 구성된 특정 DNA 단편(프라이머)을 생물체로부터 분리한 게놈유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase)를 첨가하여 합성반응을 반복적으로 행하여 프라이머가 결합된 영역을 증폭시킨 후, 그 PCR 증폭산물을 아가로스겔(agarose gel)에서 전기영동하고 에티듐브로마이드(ethidium bromide)로 DNA를 염색하여 검출하는 방법으로서, 민감도 및 특이성이 뛰어나며 샘플의 처리과정 및 수행과정이 비교적 간편하다. PCR 기법의 정립에 의해서 기존에 소량으로 존재하였기 때문에 검출이 불가능하였던 세포에 존재하는 핵산을 신속하게 검출할 수 있게 되었다. PCR 증폭법을 사용하면, 단일사본의 표적핵산 조차도 검출할 수 있을 정도로 특이적인 진단 시험이 가능하다. 그러나, 모든 프라이머 세트가 유용한 것은 아니기 때문에 특정 유전자(또는 독특한 유전자를 가지는 미생물)를 검출하기 위해서 그 유전자에만 특유한 프라이머의 선택과 함께 증폭시킬 영역의 선택이 검출의 특이성과 감도를 결정하게 된다.
따라서, 상기와 같이 유용한 특징을 가지는 PCR 증폭법을 활용하여 곤충병원 성 미포자충을 신속하게 검출할 수 있는 프라이머의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 이러한 PCR 기법을 미포자충병 진단에 적용하는 경우 신속 간단하게 감염 여부를 확인할 수 있을 것으로 기대하여, 자원화 곤충의 미포자충병 진단을 위한 PCR 프라이머를 제작하고, 이를 사용하는 PCR 기법을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 곤충의 미포자충병 진단을 위한 PCR 기법에 사용되는 특이적 프라이머 및 특이적 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 곤충 충체나 배설물로부터 미포자충 감염여부를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 곤충병원 미포자충병 조기진단을 위하여 특이적 PCR 프라이머, 프라이머 세트 및 상기 특이적 PCR 프라이머를 이용하여 곤충병원성 미포자충의 감염여부를 효과적으로 진단하는 방법에 관한 것이다.
미포자충은 진핵미생물이지만 미토콘드리아가 없고, 일부 원핵미생물 rRNA의 특성을 가지고 있기 때문에, 미포자충의 small subunit ribosomal RNA(ssu rRNA = 16S rRNA)는 진핵미생물인 미포자충만이 가지는 특이 유전자라고 할 수 있다. 본 발명은 이와 같은 사실에 기초하여 완성된 것이다.
본 발명자들은 자원화 곤충에 병을 일으키는 미포자충에 존재하는 16S rRNA 유전자의 염기서열로부터 PCR 검출용으로 이용하기에 가장 적합한 프라이머를 제작하였고, 이 제작된 프라이머로 PCR을 수행하면 미포자충의 감염여부를 효과적으로 진단할 수 있었다.
본 발명에 의한 미포자충 감염을 진단하는데 효과적으로 사용될 수 있는 프라이머는 하기 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나이다.
① forward primer NS1
5'-CTGCCTGACGTAGACGCTAT-3' (서열번호 1)
② reverse primer NS2
5'-CTTCGA(C)TCCTCTAGCTTACG-3' (서열번호 2)
③ forward primer NS3
5'-GCAGCCGCGGTAATACTTGT-3' (서열번호 3)
④ reverse primer NS4
5'-GTTCTCCAACAGCAACCATG-3' (서열번호 4)
상기 4가지의 선택된 프라이머 중 NS1, NS3는 정방향프라이머(forward primer)이고, 나머지 NS2, NS4는 역방향프라이머(reverse primer)이다.
본 발명에 의한 프라이머 세트는 상기 프라이머 중 정방향프라이머의 어느 하나와 역방향프라이머의 어느 하나로 이루어진 특이적 프라이머 세트이다.
본 발명에 따라 곤충병원성 미포자충 감염여부 진단을 위하여 PCR을 수행하는 경우에 상기 정방향프라이머와 역방향 프라이머의 세트조합은 NS1-NS2, NS1-NS4, NS3-NS4인 것이, 검출의 정확성과 분별력을 높일 수 있어 더욱 바람직하다.
다른 한편으로 본 발명은, 상기 설명한 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행함으로써 미포자충에 의한 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다. 특히, 미포자충 감염 진단은 곤충의 충체 또는 배설물을 검체로 하여 이루어질 수 있으며, 이에 의해 곤충이 미포자충에 감염되었는지 여부를 간편-신속하게 진단할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하고자 하는 예시적인 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 본질 및 내용이 변경되거나 축소되는 것은 아니다. 본 발명의 기술적 사상 및 하기 실시예를 참조하여 다양한 변형이 얻어질 수 있음은 당업자에게 당연할 것이다.
실시예 1: 미포자충의 게놈 DNA 분리와 PCR 조건 확립
미포자충에 감염된 병사충(질병으로 죽은 곤충, 애벌레 또는 번데기)을 마쇄하여 가제로 거른 후 1,000g에서 4분 동안 원심하였다. 침전물을 pH 7.0 으로 조정된 Percoll에 부유시킨 후 73,000g에 30분 동안 초원심 분리하여 미포자형성층(band)에서 미포자충을 채취하였다.
분리한 미포자충에 유리구슬(glass bead)과 proteinase K를 넣고 55℃에서 2 시간 처리하고, Qiamp Tissue Kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 메뉴얼에 기재된 방법으로 DNA를 분리하였다.
PCR 반응조건은 주형이 되는 DNA를 1본쇄로 변성시키기 위하여 95℃에서 2분간 열처리한 후, 95℃에서 30초간 DNA를 변성시키는 단계(denaturation), 58℃에서 30초간 프라이머와 접촉시키는 단계(annealing), 72℃에서 1분간 DNA를 합성하는 단계(extension)의 3단계를 반응주기로 35회 반복하여 PCR증폭을 실시하며, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켜 PCR반응을 종료하였다. 총 PCR 소요시간은 1시간 48분이었다.
실시예 2: PCR 증폭용 특이적 프라이머의 제작
아래와 같이 종래(Vossbrinck et al., 1987. Ribosomal RNA sequence suggests microsporidia are extremely ancient eukaryotes. Nature. 326 : 411-414) 알려져 있는 Varimorph necatrix ribosomal RNA 유전자 프라이머 세트를 사용하여 국내 나비목 곤충에서 분리한 미포자충의 16S rRNA 유전자를 클로닝하여 염기서열을 결정하였다(GenBank 등록번호 : AF485270).
⑤ forward primer
5'-CACCAGGTTGATTCTGCCTGA-3' (서열번호 5)
⑥ reverse primer
5'-ACTCAGGTGTTATACTCACGTC-3' (서열번호 6)
결정된 염기서열을 토대로 곤충병원성 미포자충에서만 공통적으로 있는 염기서열 중 GC함량이 50% 이상이 되는 20bp 크기의 상기 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 가지는 프라이머를 제작하고, 이들 각각을 NS1∼NS4로 명명하였다. NS1, NS3는 정방향프라이머(forward primer)이고, 나머지 NS2, NS4는 역방향프라이머(reverse primer)이며, NS1-NS2 프라이머 세트에 의해 증폭되는 염기는 597bp, NS1-NS4 프라이머 세트에 의해 증폭되는 염기는 1,246bp, NS3-NS4 프라이머 세트에 의해 증폭되는 염기는 854bp 크기인 것으로 나타났다. 제작된 각 프라이머의 16S rRNA 유전자 내 위치 및 반응산물(증폭된 염기)의 크기는 도 1에 나타내었다.
실시예 3: 제작된 PCR 프라이머를 이용한 미포자충의 진단
실시예 2에서 제작된 NS1∼NS4 프라이머가 곤충병원성 미포자충의 진단에 효과적으로 적용될 수 있는지의 여부를 PCR기법을 이용하여 확인하였다.
국내에서 분리한 5종의 미포자충(분리된 곤충 : 나비나라 배추흰나비(시료번호 1), 잠사곤충부 배추흰나비(시료번호 2), 함평곤충연구소 배추흰나비(시료번호 3), 함평곤충연구소 호랑나비(시료번호 4), 제주도 꿀벌(시료번호 5))과 나비나라 배추흰나비의 배설물(시료번호 6) 및 5종의 곤충병원성 미생물(Metarhizium anisopliae(시료번호 7), Aeromonas hydrophila(시료번호 8), Pseudomonas sp.(시료번호 9), Chryseobacterium joostei(시료번호 10), Paecilomyces teunipes(시료번호11)로부터 총 DNA를 분리한 다음, 상기 프라이머 세트들을 사용하여 PCR 증폭실험을 수행하였다.
NS1-NS2 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행한 결과 다른 곤충병원성 미생물(시료번호 7 내지 11)에서는 반응산물이 생성되지 않았으나, 5종의 미포자충(시료번호 1 내지 5)과 나비나라 배추흰나비의 배설물(시료번호 6)에서는 예상했던 대로 597bp 길이의 반응산물이 생성되었다(도 2). 마찬가지로, NS1-NS4 프라이머 세트를 사용한 경우에도 1,246bp 길이의, NS3-NS4 세트를 사용한 경우에도 854bp 길이의 생성된 반응산물을 관찰할 수 있었다(도 3 및 도 4).
도 2 내지 도 4에서, M은 1kb DNA ladder Marker, lane 1∼5은 미포자충, lane 6∼12는 각각 나비나라 배추흰나비의 배설물, Metarhizium anisopliae, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas sp., Chryseobacterium joostei, Paecilomyces tenuipes 및 distilled water를 나타낸다.
이러한 결과로부터 본 발명자들에 의해 선정된 프라이머를 사용하여 PCR 기법을 수행함으로써 곤충 충체 및 배설물에서의 미포자충 감염 여부를 정확히 진단할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4: PCR에 의한 미포자충 진단 감도(diagnostic sensitivity)
유전자 증폭에 의해 곤충병원성 미포자충이 감지되는 최저 농도는 질병진단에 있어서 매우 중요하다. 실제로 PCR을 이용한 진단은 순수분리한 미포자충을 사용하는 대신 병사충 또는 배설물을 PCR 재료로 사용하기 때문이다.
본 발명에 의한 프라이머 세트 및 PCR 증폭법에 의한 미포자충 진단 감도를 측정하기 위하여, 미포자충의 농도를 각기 달리하여 PCR 증폭을 실시하였다(도 5). NS1과 NS2 프라이머 세트를 사용하였다.
도에서, M은 1kb DNA ladder Marker를, lane 1 ∼ 9은 각각 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108spores/mL를 나타낸다.
도 5에서 볼 수 있듯이, 101spores/mL 이상의 농도에서 곤충병원성 미포자충이 감지되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 본 발명에 의한 진단방법은 다른 미포자충 진단방법에 비해 검출감도가 매우 높음을 알 수 있다.
따라서, 이러한 PCR 기법에 의한 곤충병원성 미포자충의 진단방법은 미포자충병 진단뿐만 아니라 기존에 불가능하였던 저농도로 감염된 곤충 알이나 배설물에 대한 감염여부를 진단하는데에도 매우 유용하게 이용할 수 있으므로 미포자충병을 예방 및 방제하는데 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명은 미포자충의 small subunit ribosomal RNA의 특정 염기서열에 상응하는 프라이머를 개발하고, 이를 이용하여 PCR 기법으로 곤충병원성 미포자충을 조기 진단함으로서, 미포자충병 예방과 방제에 시간과 비용을 절약하여 자원화 곤충의 안정적인 대량생산에 기여할 수 있다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Primers for Diagnosing the Disease by Entomopathogenic Microsporidia, and Diagnostic Method using Thereof <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Microsporidia <400> 1 ctgcctgacg tagacgctat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Microspordia <400> 2 cttcgatcct ctagcttacg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Microsporidia <400> 3 gcagccgcgg taatacttgt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Microsporidia <400> 4 gttctccaac agcaaccatg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Microsporidia <400> 5 caccaggttg attctgcctg a 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for detecting Microsporidia <400> 6 actcaggtgt tatactcacg tc 22

Claims (9)

  1. NS1 프라이머(서열번호 1)와 NS2 프라이머(서열번호 2)로 이루어진 미포자충 검출용 PCR 프라이머 세트.
  2. NS3 프라이머(서열번호 3)와 NS4 프라이머(서열번호 4)로 이루어진 미포자충 검출용 PCR 프라이머 세트.
  3. NS1 프라이머(서열번호 1)와 NS4 프라이머(서열번호 4)로 이루어진 미포자충 검출용 PCR 프라이머 세트.
  4. 제 1 항에 의한 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하는 것을 특징으로 하는 미포자충 검출방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    곤충 또는 곤충의 배설물을 샘플로 하는 것을 특징으로 하는 미포자충 검출방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 2 항에 의한 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하는 것을 특징으로 하는 미포자충 검출방법.
  9. 제 3 항에 의한 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하는 것을 특징으로 하는 미포자충 검출방법.
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