KR100550934B1 - 후박추출물, 강후박추출물, 그로부터 분리한 마그놀올 및이들을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 예방 또는치료용 약학적 조성물과 기능성 식품 - Google Patents

후박추출물, 강후박추출물, 그로부터 분리한 마그놀올 및이들을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 예방 또는치료용 약학적 조성물과 기능성 식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 최종당화산물의 생성억제에 효과적인 후박추출물, 강후박추출물, 그로부터 분리한 마그놀올 및 그들의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (1) 후박을 분쇄, 건조하고, 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출하는 추출단계; (2) 상기 추출액을 여과한 후, 감압 농축하는 단계로 이루어지는 후박추출물, 강후박추출물 및 이로부터 분리된 마그놀올에 관한 것이다. 본 발명의 후박추출물, 강후박추출물 및 마그놀올은 당뇨합병증 유발 원인 중의 하나인 최종당화산물의 생성을 효과적으로 억제하므로, 당뇨합병증의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 및 노화방지를 위한 기능성 식품 등으로 응용될 수 있다.
후박, 강후박추출물, 마그놀올, 최종당화산물, 당뇨합병증

Description

후박추출물, 강후박추출물, 그로부터 분리한 마그놀올 및 이들을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 기능성 식품 {Extract of unprocessed- and processed Magnolia bark, Magnolol and pharmaceutical compositions and functional food containing the same for prevention and treatment of diabetic complications}
도 1은 후박 추출물과 강후박 추출물의 최종당화산물 생성억제 효과를 나타낸 그래프이고,
도 2은 마그놀올의 최종당화산물 생성억제 효과를 나타낸 그래프이고,
도 3은 아미노구아니딘·HCl의 최종당화산물 생성억제 효과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 최종당화산물의 생성억제에 효과적인 후박추출물, 강후박추출물 및 그로부터 분리한 마그놀올 및 그들의 용도에 관한 것으로서, 당뇨합병증을 유발하는 인자 중의 하나인 최종당화산물의 생성을 억제하여 당뇨합병증의 예방 및 치료에 효과적인 후박추출물, 강후박추출물 및 이로부터 분리된 마그놀올에 관한 것 이다.
당뇨병은 전세계적으로 중요한 성인병 중의 하나로서, 최근 우리나라에서도 급속한 경제 성장과 더불어 당뇨병 유병율이 7-8％에 달하며, 60-70대의 경우 중요한 사망원인이 되고 있다. 당뇨병에 의한 사망원인 중 하나인 당뇨합병증은, 당뇨병에 걸린 후 10-20년이 지나면 체내 여러 기관이 손상을 받아 당뇨성 망막병증(retinopathy), 당뇨성 백내장(cataract), 당뇨성 신증(nephropathy), 당뇨성 신경병증(Neuropathy) 등으로 나타난다. 특히, 만성 당뇨성 신증은 혈액 투석 치료 및 말기 신부전의 가장 중요한 원인이 되고 있으며, 당뇨성 백내장은 실명까지 초래한다.
이러한 당뇨합병증을 유발하는 기전으로는 크게 단백질의 비효소적 당화반응(nonenzymatic glycation of proein), 폴리올 경로(polyol pathway), 죽상경화증(atherosclerosis) 및 산화적 스트레스(oxidative stress) 등으로 설명되고 있다.
단백질의 비효소적 당화반응(nonenzymatic glycation of protein)이란, 단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당이 효소 작용 없이 축합반응 즉 밀리아드 반응에 의한 것으로, 이 반응의 결과로 최종당화산물(advanced glycation endproducts, AGEs)이 생성된다. 단백질의 비효소적 당화반응은 (1)단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당의 알데히드 또는 케톤이 효소 작용 없이 친핵성 첨가 반응을 하여 초기 단계 산물인 쉬프염기(schiff base)를 형성하고, 상기 쉬프염기와 인접한 케토아민 어닥트(ketoamine adduct)가 서로 축합하여 가역적인 아마 도리형의 조기당화산물이 생성되는 단계와 (2) 고혈당 상태가 지속되어 가역적인 아마도리형의 조기당화산물이 분해되지 않고 재배열(rearrangement)되고 단백질과 교차결합(cross-linking)하여 비가역적인 최종당화산물이 생성되는 단계로 나눌 수 있다.
가역적인 아마도리형의 조기당화산물과 달리 최종당화산물은 비가역적인 반응 산물이므로, 일단 생성되면 혈당이 정상으로 회복되어도 분해되지 않고 단백질 생존기간동안 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시킨다(Vinson, J. A. et al., 1996, J. Nutritinal Biochemistry 7: 559-663; Smith, P. R. et al., 1992, Eur. J. Biochem., 210: 729-739).
예를 들면, 포도당과 여러 종류의 단백질과 반응하여 생성된 최종당화산물 중 하나인 당화 알부민은 만성 당뇨성 신증을 일으키는 중요한 요인으로 작용한다. 당화 알부민은 당화가 진행되지 않은 정상 알부민에 비해 더 용이하게 신사구체 세포 내로 유입되고, 고농도의 포도당은 메산지움 세포를 자극하여 세포외 기질(extracellular matrix)합성을 증가시킨다. 과도하게 유입된 당화 알부민과 증가된 세포외 기질로 인하여 신사구체의 섬유화가 야기된다. 이와 같은 기전으로 신사구체가 계속 손상 받게 되어 혈액투석 또는 장기이식 등의 극단적인 치료방법을 쓸 수밖에 없는 단계에 이르게 되는 것이다. 또한, 만성 당뇨로 인하여 동맥벽에서는 콜라겐이, 신사구체에서는 기저막성 단백질이 최종당화산물과 결합되어 조직에 축적됨이 보고된 바 있다(Brownlee, M., et al., 1986, Sciences, 232, 1629-1632).
이처럼 비효소적 단백질 당화반응에 의하여 기저막, 혈장 알부민, 수정체 단백질, 피브린, 콜라겐 등의 단백질에서 당화가 일어나며, 생성된 최종당화산물이 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 당뇨성 망막병증(retinopathy), 당뇨성 백내장(cataract), 당뇨성 신증(nephropathy), 당뇨성 신경병증(Neuropathy) 등의 만성 당뇨합병증을 유발시킨다.
또한 고혈당 상태에서 최종당화산물이 생성되는 과정에서 지질대사에 이상이 일어나고 동시에 생성되는 유해한 산소 자유라디칼에 대한 방어시스템 기능이 저하되어 산화적 스트레스가 유발된다고 보고된 바 있다(Yokozawa, T., et al, 2001, J. of Trad. Med., 18: 107-112). 이처럼 비효소적 당화반응과 산화적 스트레스(oxidative stress) 작용 기전이 서로 연관되어 있다.
폴리올 경로란 (1)알도스나 케토스로부터 알도스환원효소(AR)작용에 의해 환원되어 솔비톨을 형성하는 단계 및 (2) 솔비톨이 솔비톨탈수소효소에 의해 산화되어 과당을 생성하는 단계로 이루어지는 과정이다. 고혈당에 의하여 폴리올 경로가 활성화되고, 이로 인해 솔비톨과 과당이 과도하게 생성되고 조직에 축적되어 삼투압이 증가된다. 증가된 삼투압으로 인하여 수분이 인입되어 당뇨성 망막병증(retinopathy), 당뇨성 백내장(cataract), 당뇨성 신경병증(Neuropathy) 등으로 진행된다(당뇨병학, 김응진 외, 대한 당뇨병학회, 고려의학, 483쪽; Soulis-Liparota, T., et al., 1995, Diabetologia, 38: 357-394).
최종당화산물이 사람의 미세혈관 내피세포에서 폴리올 경로의 주효소인 알도스환원효소(AR)를 활성화시키는 것이 보고된 바 있다(Nakamura, N., et al., 2000, Free Radic Biol. Med., 29: 17-25). 정상상태에서는 알도스환원효소가 포도당에 대하여 친화력이 매우 낮지만, 고농도의 포도당에서는 알도스환원효소가 활성화되어 과도하게 포도당을 솔비톨로 환원시키고, 이 솔비톨이 솔비톨탈수소효소에 의해 과당으로 전환된다. 이 과당은 포도당에 비하여 단백질의 비효소적 당화반응의 속도가 약 10배 정도 빠르다. 따라서, 고농도의 과당이 단백질과 결합하여 결국은 최종당화산물의 형성을 가속화시킨다.
이와 같이 비효소적 당화반응, 폴리올 경로 및 산화적 스트레스(oxidative stress) 작용 기전들이 서로 연관되어 당뇨합병증을 유발시킨다. 따라서, 당뇨합병증의 발병을 지연하거나 예방 또는 치료하기 위해서는 최종당화산물의 형성을 억제하는 것이 매우 중요하다(Brownlee, M., et al., 1988, N. Engl. Med., 318, 1315-1321).
일단 당뇨병이 발생되어 혈당이 금방 떨어지지 않으면 당뇨합병증 예방제를 복용하여 당뇨합병증을 예방하여야 한다. 현재, 단백질 당화 억제제로 유일한 합성제제인 아미노구아니딘·HCl(aminoguanidine·HCl)은 친핵성 히드라진(hydrazine)으로 아마도리 산물과 결합하여 단백질과의 교차결합을 방지함으로써 최종당화산물의 생성을 억제하여 합병증으로 진전되는 것을 지연 또는 방지한다(Brownlee, M., et al., 1986, Sciences, 232, 1629-1632; Edelstein, D. et al., 1992, Diabetes, 41, 26-29). 아미노구아니딘·HCl은 당뇨합병증의 예방 및 치료에 가장 유망한 합성 의약품으로 제 3상 임상실험까지 진행되었으나, 장기간 투여시 독성이 유발되는 문제점이 있어 보다 안전한 약제의 개발이 요망되고 있다.
후박(Magnolia bark)은 낙엽교목과인 목련과에 속하는 일본목련(Magnolia obovata, M. officinalis, M. officinalis var. biloba)의 나무껍질을 건조한 것이다. 후박은 한방적으로 조습소담(燥濕消痰), 하기제만(下氣除滿)의 효능을 지니고 있어 습체상중(濕滯傷中), 완비토사(脘??吐瀉), 식적기체(食積氣滯), 복창변비(腹脹便秘), 담음천해(痰飮喘咳)를 치료한다(국가약전위원회, 중화민국공화국약전, I부, 204, 화학공업출판사, 북경).
후박(Magnolia bark)의 성분으로는 알파, 베타, 감마-오이데스몰(α, β, γ-eudesmol) 등의 정유, 마그놀올(magnolol), 호노키올(honokiol), 테트라하이드로마그놀올(tetrahydromagnolol), 마그노큐라린(magnocurarin), 오보바톨(obovatol), 오보바탈데하이드(obovataldehyde), 알카로이드, 사포닌 등이 함유되어 있다. 후박(Magnolia bark)의 지표물질은「생약·한약재 품질표준화 연구」에 의해서 마그놀올로 결정된 바 있다(생약·한약재 품질 표준화연구보고서, 1996, 199, 식품의약품안전청, 서울).
후박의 약리효과에 관한 연구를 보면, 후박의 물추출물이 즉시형 과민 반응에 대한 항알러지 효능 있음이 시험관 실험 및 동물실험에서 증명된 바 있으며(Shin, T. Y., et al., 2001, Arch. Pharm., Res., 24: 249-255), 세포 사멸효과(Park, H. J., et al., 2001, Arch. Pharm., Res., 24: 342-348), NO합성 억제효과, TNF-α발현 억제 효과(Son, H. J., et al., 2000, Planata med., 66:467-471), 항진균 효과(Bang, K. H., et al., 2000, Arch. Pharm, Res., 23: 46-49), 정신안정 효과(Kuribara, H., et al, 1999, J. Pharm. Pharmacol., 51: 97-103) 및 피부암 억제효과(Komoshima, T. et al., 1991, J. Nat. Prod., 54: 816-822) 등의 다양한 효능이 있음이 보고된 바 있다. 그러나 후박과 강후박 및 마그놀올의 당뇨합병증 치료 효과에 관한 연구사례는 전혀 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 후박추출물 및 그 구성성분인 마그놀올이 최종당화산물의 생성을 억제하여 당뇨합병증의 치료 및 예방에 사용될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 후박추출물, 후박을 수치한 강후박추출물 및 상기 추출물들의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 후박의 지표물질인 마그놀올을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 후박추출물, 강후박추출물 및 마그놀올을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증의 예방 및 치료용 또는 노화방지 및 지연용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 후박추출물, 강후박추출물 및 마그놀올을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 예방 및 치료용 또는 노화방지 및 지연용 기능성 식품을 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 후박추출물 및 후박을 수치한 강후박추출물을 제공하고, 상기 추출물들의 제조방법을 제공한다.
Ⅰ. 후박추출물
본 발명의 후박추출물의 제조방법은 다음과 같다.
(1) 후박을 분쇄, 건조하고, 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출하는 추출단계; (2) 상기 추출액을 여과한 후, 감압 농축하는 단계로 이루어진다.
상기 알콜 또는 알콜 수용액이 30-100 ％의 메틸알콜, 에틸알콜 또는 그 알콜 수용액인 것이 바람직하다.
보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저 후박을 분쇄하여 분말로 한 후 전기 건조기에서 건조한다. 상기 분말의 5배 -10배(w/v)량의 30- 100 ％의 메틸알콜, 에틸알콜 또는 그 알콜 수용액을 가하여 상온에서 2-5회 연속 추출한다. 상기 추출액을 여과한 후 감압 상태에서 농축한다. 이때, 구성성분의 분해 및 가수분해를 방지할 수 있도록 농축시 온도를 45℃ 이하로 유지한다. 상기 방법에 의해 추출함으로 써 아그리콘(aglycon)에 결합된 당(단당류에서 다당류) 및 메틸기(-CH3) 등의 모든 치환기들이 분해되지 않은 형태로 모두 추출할 수 있다.
본 발명의 후박추출물은 시험관내 실험에서, 소혈청알부민(bovine serum albumin;BSA)의 당화를 억제함을 확인하였고, 최종당화산물의 생성 50％ 억제 농도 즉 IC50이 55.17μg/ml(표 1)로 우수한 생성 억제 효과를 나타내며, 또한 100 μg/ml에서는 100％ 생성을 억제함을 확인하였다.
Ⅱ. 강후박추출물
강후박은 후박을 수치한 것으로서, 이러한 강후박으로부터 추출된 후박추출물의 제조방법은 다음과 같다.
먼저, 상기 (1)단계의 후박에 건강과 물을 가하고, 70 ℃-100 ℃의 온도를 유지하며 가열하여 강후박을 제조하는 단계; 및 제조된 강후박을 사용하여 상기 후박추출물의 제조 단계 즉 후박을 분쇄, 건조하고, 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출하는 추출단계; (2) 상기 추출액을 여과한 후, 감압 농축하는 단계로 이루어진다.
생약의 수치(processing 또는 preparation)란 생약내 독성 성분의 약화 등 특별한 효능을 위하여 다양한 방법으로 여러가지 보조재료를 첨가하여 가공하는 것으로서, 대표적인 예로는 독성이 강한 한약재인 부자(Aconiti tuber)를 아코니틴(aconitine), 하이파코니틴(hypaconitine), 메사코니틴(mesaconitine) 등의 독성성분을 감량 또는 제거하기 위하여 일정한 방법으로 가공하는 것이다.
본 발명의 수치방법을 보다 자세히 설명하면 다음과 같다.
미리 50 ℃-100 ℃로 달구어진 용기에 후박 100중량부에 대하여 에 건강 3중량부를 가하고, 상기 생약재의 5-10배(w/v)의 물을 넣어 후박이 물에 완전히 잠기게 한다. 70 ℃-100 ℃의 온도를 유지하도록 가열한다. 물이 거의 증발된 때 후박을 꺼낸다.
상기의 방법으로 후박을 수치하여 제조된 강후박을 분쇄하여 분말로 한 후 전기 건조기에서 건조한다. 30-100 ％의 메틸알콜, 에틸알콜 또는 그 알콜 수용액 을 상기 분말의 5배-10배량(w/v)을 가하여 상온에서 2-5회 연속 추출한다. 상기 추출액을 여과한 후 감압 상태에서 농축한다.
상기와 같이 후박을 수치한 강후박의 추출물은 시험관내 실험에서, 소혈청알부민(bovine serum albumin;BSA)의 당화를 억제함을 확인하였고, 최종당화산물의 생성 억제 농도 즉 IC50이 28.60μg/ml(표 1)로서 우수한 생성 억제 효과를 나타냄을 확인하였으며, 그 IC50이 55.17μg/ml(표 1)인 후박추출물에 비하여 훨씬 향상된 억제 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 상기 수치과정을 거침으로써 후박의 최종당화산물의 생성억제 효능이 현저히 증가함을 확인하였다.
Ⅲ. 마그놀올 및 그 약제학적으로 허용가능한 염
후박으로부터 마그놀올을 분리하는 방법을 제공한다.
마그놀올은 화학식 1로 표시된다.
마그놀올은 후박의 지표물질로서, 히스타민 유리 억제 효과가 보고된 바 있으나, 최종당화산물의 생성억제 효능에 관하여는 본 발명에서 처음으로 확인한 것이다.
Figure 112003021624002-pat00001
후박으로부터 마그놀올을 분리하는 방법은 다음과 같다.
(1) 후박을 80％ 에탄올 수용액으로 상온에서 24시간 추출하는 단계, (2) 상기 추출물을 노르말헥산, 에칠아세테이트, 노르말부탄올 순으로 계통분리하는 단계, (3) 노르말헥산층을 선택하여 노르말 실리카겔(340g) 크로마토그라피에 의해 전 분획을 분리하는 단계(이때의 이동상은 노르말 헥산과 에칠아세테이트 혼합물), (4) 전 분획들을 표준품 마그놀올과 TLC상에서 비교하여 마그놀올이 많이 존재하는 분획을 확인하는 단계 및 (5) 노르말 실리카겔 크로마토그라피로 마그놀올을 분리하는 단계로 이루어지며, 이렇게 분리된 마그놀올을 핵자기공명기, 질량분석, IR 등의 기기분석을 통하여 동정하였다.
상기 마그놀올은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 브롬산, 요오드산, 황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플루오르아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.
상기와 같이 분리된 마그놀올은 시험관내 실험에서, 소혈청알부민(bovine serum albumin;BSA)의 당화를 억제함을 확인하였고, 최종당화산물의 50% 생성 억제 농도 즉 IC50이 5.36μg/ml(표 1)로서 우수한 생성 억제 효과를 나타냄을 확인하였고, 그 IC50이 34.90μg/ml(표 1)인 아미노구아니딘·HCl에 비하여 훨씬 향상된 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
Ⅳ. 후박추출물, 강후박추출물 또는 마그놀올을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물
본 발명은 또한 후박추출물, 강후박추출물 또는 마그놀올을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 또는, 노화방지 또는 지연용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 후박추출물 및 강후박추출물을 유효성분으로 함유하는 경우, 그 유효용량은 100-2000mg/kg/day 이고, 바람직하기로는 100-400mg/kg/day 이며, 하루 1-3 회로 나누어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물중 마그놀올을 유효성분으로 함유하는 경우, 그 유효용량은 50-200mg/kg/day 이고, 바람직하기로는 50-100 mg/kg/day 이며, 하루 1-3 회로 나누어 투여될 수 있다.
Ⅴ. 후박추출물, 강후박추출물 또는 마그놀올을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품
본 발명은 또한 후박추출물, 강후박추출물 또는 마그놀올을 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 기능성 식품; 또는 노화방지 및 지연용 기능성 식품에 관한 것으로서, 상기 기능성 식품은 최종 제품의 상품성과 소비자 기호도에 따라 다른 식품소재를 첨가할 수 있다.
최종당화산물이 생성되는 과정에서 지질대사에 이상이 일어나고, 동시에 생성되는 유해 산소 자유라디칼에 대한 방어시스템 기능이 저하되어 산화적 스트레스가 유발된다고 보고한 바 있고, 한편, 산화적 스트레스는 안정한 상태로 체내에 존재하던 산소가 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학 반응과 같은 환경적 및 생화학적 요인 등에 의해 반응성이 큰 활성산소로 전환되어 인체의 세포구성 성분인 단백질, 지질 및 DNA 등을 비가역적으로 파괴되는 것으로서, 최종당화산물의 생성을 억제하는 경우 산화적 스트레스의 유발 비율이 줄어들 것으로 판단된다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 후박추출물의 제조
후박 4.38g을 분말로 한 후 전기건조기(약 90 ℃)에서 1 시간 건조하였다. 분말상태의 후박에 80％의 에틸알콜 수용액 25ml(에틸알콜: 증류수 = 80 : 20)을 가하여 상온에서 24 시간 동안 추출하였다. 에틸알콜 추출액을 여과지로 여과한 후, 동일한 방법으로 5회 반복하여 추출하였다. 모든 추출액을 모아 감압 상태에서 농축하였다. 이때 구성성분의 분해 및 가수분해를 방지하기 위하여 워터베이스(water bath)를 40-45 ℃로 유지하였다. 감압농축으로 에틸알콜을 완전히 제거한 후 동결건조기에서 수분을 완전히 건조하였다. 건조 결과 0.211g의 추출물을 획득하였다(수득율: 4.82%)
[실시예 2] 강후박추출물의 제조
미리 50 ℃-100 ℃로 달구어진 용기에 절단한 후박 10g에 절단한 건강 0.3g을 첨가하고, 물 50㎖를 넣어 후박이 물에 완전히 잠기게 하였다. 약재를 50 ℃에서 가열하다가 10분 후에 70 ℃로 온도를 높이고 70 ℃을 유지하며 50분간 가열하였다. 50분 후 물이 거의 없어질 때 후박을 꺼내여 자르고 건조하여 강후박을 제조하였다. 이렇게 제조한 강후박 8.02g을 분말로 하여 사용한 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 강후박추출물을 제조하여 0.85g의 추출물을 획득하였다(수득율: 10.6%).
[실시예 3] 마그놀올의 분리
경동시장에서 구입한 후박 2 ㎏을 80％ 에틸알콜수용액(10 리터)으로 상온에 서 24시간 추출한 후 여과하였다. 이러한 과정을 3번 반복하여 얻은 모든 추출물을 감압상태에서 농축, 건조하여 암갈색의 엑스(250g; 수득율: 12.5%)을 얻었다. 이 추출물을 노르말헥산, 에칠아세테이트, 노르말부탄올 순으로 계통 분리하였다. 이 중에서 마그놀올이 분포되어있는 노르말헥산 층을 택하여 노르말실리카겔(340g) 크로마토그라피를 하여 전분획을 얻었다. 이때의 이동상은 노르말 헥산 : 에칠아세테이트 = 1 : 0 → 6 : 4로 그레디엔트(gradient)로 용출하여 전분획 pre-f1 → pre-f 6을 얻었다. 이때 전분획들을 표준품 마그놀올과 TLC상에서 비교하여 pre-f4가 마그놀올이 많이 존재하는 분획임을 확인하였다. 이 pre-f4를 다시 노르말 실리카겔 크로마토그라피를 하여 마그놀올을 분리하였다(15㎎). 이것을 NMR, Mass, IR 등의 기기분석 결과를 종합분석하여 마그놀올임을 확인하엿다.
[실험예 1] 후박과 강후박추출물 및 마그놀올의 시험관내에서 최종당화산물 생성억제 효능분석
단백질원(原)으로 소혈청알부민(bovine serum albumin, 이하 BSA라고 한다: 미국 시그마 제품)을 택하였다. BSA을 10㎎/㎖의 농도가 되도록 50mM 인산 완충 용액(phosphate buffer; pH 7.4)에 가하여 제조하였다. 당원(原)으로는 0.1 M 과당과 0.1 M글루코스가 혼합된 액을 사용하였다. 제조된 BSA 용액에 과당과 글루코스 혼합액을 가하였다. 실시 예 1과 2에서 제조된 후박추출물, 강후박추출물 및 실시예 3에서 분리된 마그놀올을 시료군으로 하여, 각각을 증류수에 용해한 후, 이를 상기 BSA 와 당의 혼합액에 첨가하고 37℃에서 30일간 배양하였다. 이때 0.02% 소디움아자이드(sodium azide)를 항박테리아제로서 첨가하였다. 대조군은 BSA와 당 혼합액을 배양한 것이며, 시험군과 대조군의 공시험군(blank)은 각각 조제한 후 배양하지 않은 것이다. 한편 효능의 우수함을 비교할 수 있는 지표인 양성 대조군으로서 아미노구아니딘· HCl을 사용하였다. 모든 배양액은 4 개씩 준비하여 최대한 오차를 피하였으며, 배양 직전에 질소가스(순도: 99.999%)를 충진하여 오염을 방지하였다. 30일 후 배양액에서 생성된 최종당화산물의 함량을 분석하여 그 결과를 나타내었다. 최종당화산물은 형광, 갈색을 띠고 있으며 교차결합을 할 수 있는 물리화학적인 특성을 지니고 있을 뿐 아니라 세포막 수용체가 인지할 수 있는 배위자를 지니고 있다. 이러한 특성을 지닌 최종당화산물의 양을 spectrofluorometer(Excitation: 350nm, Emission: 450nm)로 측정하여 그 생성 억제 정도를 분석하였다.
[실험예 2] 후박추출물의 최종당화산물 생성억제 효능
실시예 1에서 제조된 후박의 80% 에틸알콜 추출물을 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖의 농도로 조제한 후, 상기 실험예 1에 기재한 방법으로 37℃에서 30일동안 배양하였다. 30일 후 배양액에서 생성된 최종당화산물의 양을 spectrofluorometer(Excitation: 350nm, Emission: 450nm)로 측정하고 그 결과를 도 1 및 표1에 나타내었다.
[실험예 3] 강후박추출물의 최종당화산물 생성억제 효능
실시예 2에서 제조된 강후박의 80% 에틸알콜 추출물을 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖의 농도로 조제한 후, 상기 실험예 1에 기재한 방법으로 37℃에서 30일동안 배양하였다. 30일 후 배양액에서 생성된 최종당화산물의 양을 spectrofluorometer(Excitation: 350nm, Emission: 450nm)로 측정하고 그 결과를 도 1 및 표1에 나타내었다.
[실험예 4] 마그놀올의 최종당화산물 생성억제 효능
실시예 3에서 분리된 마그놀올을 증류수에 용해하여 3.33㎍/㎖, 6.66㎍/㎖, 13.32㎍/㎖, 26.6㎍/㎖의 농도로 조제한 후 상기 실험예 1에 기재한 방법으로 37℃에서 30일동안 배양하였다. 30일 후 배양액에서 생성된 최종당화산물의 양을spectrofluorometer(Excitation: 350nm, Emission: 450nm)로 측정하고 그 결과를 도 2 및 표1에 나타내었다.
생성억제율은 하기의 식으로 계산된다.
생성억제율(%)= 100 -(시료군의 형광강도-시료 공시험군의 형광강도)/(대조군의 형광강도-대조군 공시험군의 형광강도)×100
[비교예 1] 아미노구아니딘·HCl의 최종당화산물 생성억제 효능
아미노구아니딘·HCl을 증류수에 용해하여 27.5㎍/㎖, 55㎍/㎖, 110㎍/㎖, 550㎍/㎖의 농도로 조제한 후 상기 실험예 1에 기재한 방법으로 37℃에서 30일동안 배양하였다. 30일 후 배양액에서 생성된 최종당화산물의 양을 spectrofluorometer(Excitation: 350nm, Emission: 450nm)로 측정하고 그 결과를 도 3 및 표1에 나타내었다.
Figure 112003021624002-pat00002
표 1에서 보인대로 후박추출물은 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖에서 각각 최종당화산물 생성억제 효과가 11.66±0.23％, 49.27±1.54％, 100％였으며, 강후박추 출물은 45.61±2.11％, 70.25±3.66％, 100％ 였다(도 1).
강후박추출물은 그 IC50가 28.60㎍/㎖으로서 양성대조군인 아미노구아니딘·HCl(34.90㎍/㎖)보다 저농도에서 나타난 것으로 보아 그 효능이 매우 우수함을 알 수 있었다.
마그놀올은 3.33㎍/㎖, 6.66㎍/㎖, 13.32㎍/㎖, 26.6㎍/㎖에서 각각 최종당화산물 생성억제 효과가 36.36±1.61％, 55.75±2.11％, 77.05±1.70％, 100％였으며(도 2), 시그마 플롯으로 분석한 결과 마그놀올의 회귀방정식은 y=70.5091x-1.3822(r2=0.99858451)이었고, IC50는 5.36㎍/㎖로 나타났다(표. 2). 이는 양성대조군인 아미노구아니딘·HCl(34.90㎍/㎖)보다 약 5.6배 적은 저용량에서 나타난 결과이다. 또한 26.64㎍/㎖의 저농도에서 최종당화산물 생성이 100％ 억제됨을 나타내었다.
본 발명의 후박추출물, 강후박추출물 및 마그놀올은 당뇨합병증 유발 원인 중의 하나인 최종당화산물의 생성을 억제하고, 양성대조군인 아미노구아니딘·HCl에 비하여 월등히 낮은 저농도에서 최종당화산물의 생성을 억제한다. 최종당화산물은 아미노기를 함유한 펩타이드, 단백질등과 포도당 또는 과당의 환원당간의 반응에 의하여 생성되는 것이므로, 생체내 모든 단백질은 최종당화산물로 전환될 수 있으며, 특히 콜라겐, 수정체단백질, 신경단백질과 같이 교체기간이 늦거나 재생되 지 않는 단백질의 최종당화산물로의 전환은 당뇨성 망막병증(retinopathy), 당뇨성 백내장(cataract), 당뇨성 신증(nephropathy), 당뇨성 신경병증(Neuropathy) 등의 당뇨합병증 및 노화 등을 유발한다. 따라서 본 발명의 후박추출물, 강후박추출물 및 마그놀올은 최종당화산물의 생성에서 기인되는 당뇨합병증 즉, 당뇨성 망막병증(retinopathy), 당뇨성 백내장(cataract), 당뇨성 신증(nephropathy), 당뇨성 신경병증(Neuropathy) 등의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 및 기능성 식품으로 응용될 수 있다. 또한, 최종당화산물의 생성을 억제하는 경우 산화적 스트레스의 유발 비율이 줄어들어, 산화적 스트레스에 의한 노화의 방지 및 지연용 약학적 조성물 및 기능성 식품으로 응용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 삭제
  2. (1) 후박 10 중량부에 대하여 건강 3 중량부 및 상기 생약재의 5-10배(w/v)의 물을 가하고, 70 ℃-100 ℃의 온도로 유지, 가열하여 강후박을 제조하는 단계 ; 및 상기 강후박을 분쇄, 건조하고, 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출하는 추출단계;
    (2) 상기 추출액을 여과한 후, 감압 농축하는 단계로 이루어지는 강후박추출물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 알콜 또는 알콜 수용액이 30-100 ％의 메틸알콜, 에틸알콜 또는 그 알콜 수용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항의 강후박추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 2항의 강후박추출물을 유효성분으로 함유하는 노화방지 또는 지연용 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 마그놀올 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 마그놀올 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 노화방지 또는 지연용 약학적 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
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