KR100704168B1 - 갈근에서 분리되는 당뇨합병증 치료 또는 예방용 화합물 및그 분리방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 갈근에서 분리되는 당뇨합병증 치료 또는 예방용 화합물 및 그 분리방법에 대한 것으로서, 본 발명에 따른 갈근에서 분리되는 푸에라리아푸란 화합물의 분리방법은 갈근을 수용액, 수용성 알콜 또는 유기용매 중 선택되는 용매로 추출한 후 농축시켜 추출물을 얻는 단계와; 상기 추출물을 크로마토그래피를 반복 실시하여 2-아릴벤조푸란 유도체를 얻는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 갈근에서 분리되는 2-아릴벤조푸란 유도체인 푸에라리아푸란 화합물을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 천연 또는 합성 푸에라리아푸란 화합물 또는 그 유도체를 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 예방 또는 치료, 노화방지 또는 지연용, 항암 예방 또는 치료용 약학조성물 및 기능성 식품을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 갈근에서 분리되는 푸에라리아푸란, 쿠메스테롤, 다이드제인 및 제니스테인은 당뇨합병증 유발 원인 중의 하나인 최종당화산물의 생성을 효과적으로 억제하는 효과가 있다.
갈근, 푸에라리아푸란, 최종당화산물, 당뇨합병증
Description
도 1은 본 발명에 따른 갈근에서 분리되는 화합물의 분리과정을 나타내는 개략도이고,
도 2a는 본 발명에 따라 갈근에서 분리되는 푸에라리아푸란 화합물의 구조식이며,
도 2b는 본 발명에 따라 갈근에서 분리되는 쿠메스테롤 화합물의 구조식이고,
도 2c는 본 발명에 따른 갈근에서 분리되는 다이드제인 화합물 및 제니스테인 화합물의 구조식이며,
도 3은 본 발명에 따른 푸에라리아푸란의 COSY (━), HMBC (→), NOESY (↔) NMR 스펙트럼에서 관찰된 선택적인 상관관계이고,
도 4는 본 발명에 따른 푸에라리아푸란의 1H NMR 스펙트럼이며,
도 5는 본 발명에 따른 푸에라리아푸란의 13C NMR 스펙트럼이고,
도 6은 본 발명에 따른 푸에라리아푸란의 1H-1H COSY 스펙트럼이며,
도 7은 본 발명에 따른 푸에라리아푸란의 13C-1H HMBC 스펙트럼이고,
도 8은 본 발명에 따른 푸에라리아푸란의 NOESY스펙트럼이다.
본 발명은 갈근에서 분리되는 당뇨합병증 치료 또는 예방용 화합물 및 그 분리방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 갈근으로부터 분리되는 2-아릴벤조푸란 유도체인 푸에라리아푸란 및 쿠메스테롤, 다이드제인 및 제니스테인를 이용하여 당뇨합병증 발명의 주요한 인자인 AGEs형성을 억제하여 당뇨합병증의 예방 또는 치료, 노화방지 또는 지연 및 항암 예방 또는 치료에 효과적인 갈근에서 분리되는 푸에라리아푸란 화합물의 분리방법 및 푸에라리아푸란 화합물에 관한 것이다.
당뇨병은 전 세계적으로 중요한 성인병 중의 하나로서, 최근 우리나라에서도 급속한 경제 성장과 더불어 당뇨병 유병률이 7 ~ 8％에 달하며, 특히 합병증이 유발되기까지 전반적으로 수명이 길어짐에 따라 당뇨병 환자들은 합병증의 고통을 피할 수 없게 되었다. 일반적으로 당뇨병에 걸린 후 10 ~ 20년이 지나면 체내 거의 모든 기관이 손상을 받아 당뇨성 망막병증(diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장(diabetic cataract), 당뇨성 신증(diabetic nephropathy), 당뇨성 신경병 증(diabetic neuropathy) 등으로 나타난다. 만성 당뇨성 신증은 혈액 투석 치료 및 말기 신부전의 가장 중요한 원인이 되고 있으며, 당뇨성 백내장은 실명을 초래하고 결국엔 죽음에 이른다.
이러한 당뇨합병증을 유발하는 기전으로는 크게 단백질의 비효소적 당화반응(nonenzymatic glycation of proein), 폴리올 경로(polyol pathway) 및 산화적 스트레스(oxidative stress) 등으로 설명되고 있다.
단백질의 비효소적 당화반응(nonenzymatic glycation of protein)이란, 단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당이 효소 작용 없이 축합반응 즉 밀리아드 반응에 의한 것으로, 이 반응의 결과로 최종당화산물(advanced glycation endproducts, AGEs)이 생성된다. 단백질의 비효소적 당화반응은 (1)단백질의 리신 잔기 등의 아미노산 그룹과 환원당의 알데히드 또는 케톤이 효소 작용 없이 친핵성 첨가 반응을 하여 초기 단계 산물인 쉬프염기(schiff base)를 형성하고, 상기 쉬프염기와 인접한 케토아민 어닥트(ketoamine adduct)가 서로 축합하여 가역적인 아마도리형의 조기당화산물이 생성되는 단계와 (2)고혈당 상태가 지속되어 가역적인 아마도리(Amadori)형의 조기당화산물이 분해되지 않고 재배열(rearrangement)되어 단백질과 교차결합(cross-linking)하여 비가역적인 최종당화산물이 생성되는 단계로 나눌 수 있다.
가역적인 아마도리형의 조기당화산물과 달리 최종당화산물은 비가역적인 반응 산물이므로, 일단 생성되면 혈당이 정상으로 회복되어도 분해되지 않고 단백질 생존기간 동안 조직에 축적되어 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 조직 곳곳에서 합병증을 유발시킨다(Vinson, J. A. et al., 1996, J. Nutritinal Biochemistry 7: 559-663; Smith, P. R. et al., 1992, Eur . J. Biochem., 210: 729-739).
예를 들면, 포도당과 여러 종류의 단백질이 반응하여 생성된 최종당화산물 중 하나인 당화 알부민은 만성 당뇨성 신증을 일으키는 중요한 요인으로 작용한다. 당화 알부민은 당화가 진행되지 않은 정상 알부민에 비해 더 용이하게 신사구체 세포 내로 유입되고, 고농도의 포도당은 메산지움 세포를 자극하여 세포외 기질(extracellular matrix)합성을 증가시킨다. 과도하게 유입된 당화 알부민과 증가된 세포외 기질로 인하여 신사구체의 섬유화가 야기된다. 이와 같은 기전으로 신사구체가 계속 손상 받게 되어 혈액투석 또는 장기이식 등의 극단적인 치료방법을 쓸 수밖에 없는 단계에 이르게 되는 것이다. 또한, 만성 당뇨로 인하여 동맥벽에서는 콜라겐이, 신사구체에서는 기저막성 단백질이 최종당화산물과 결합되어 조직에 축적됨이 보고된바 있다(Brownlee, M., et al., 1986, Sciences, 232, 1629-1632).
이처럼 비효소적 단백질 당화반응에 의하여 기저막, 혈장 알부민, 수정체 단백질, 피브린, 콜라겐 등의 단백질에서 당화가 일어나며, 생성된 최종당화산물이 조직의 구조와 기능을 비정상적으로 변화시켜 당뇨성 망막병증(diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장(diabetic cataract), 당뇨성 신증(diabetic nephropathy), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy) 등의 만성 당뇨합병증을 유발시킨다.
또한, 고혈당 상태에서 최종당화산물이 생성되는 과정에서 지질대사 이상이 일어나고 동시에 생성되는 유해한 산소 자유라디칼에 대한 방어시스템 기능이 저하되어 산화적 스트레스가 유발된다고 보고된바 있다(Yokozawa, T., et al, 2001, J. of Trad . Med., 18: 107-112). 이처럼 비효소적 당화반응과 산화적 스트레스(oxidative stress) 작용 기전이 서로 연관되어 있다.
폴리올 경로란 (1)알도스나 케토스로부터 알도스 환원효소(AR)작용에 의해 환원되어 솔비톨을 형성하는 단계 및 (2)솔비톨이 솔비톨 탈수소효소에 의해 산화되어 과당을 생성하는 단계로 이루어지는 과정이다. 고혈당에 의하여 폴리올 경로가 활성화되고, 이로 인해 솔비톨과 과당이 과도하게 생성되고 조직에 축적되어 삼투압이 증가된다. 증가된 삼투압으로 인하여 수분이 인입되어 당뇨성 망막병증(diabetic retinopathy), 당뇨성 백내장diabetic (cataract), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy) 등으로 진행된다(당뇨병학, 김응진 외, 대한 당뇨병학회, 고려의학, 483쪽; Soulis-Liparota, T., et al., 1995, Diabetologia, 38: 357-394).
최종당화산물이 사람의 미세혈관 내피세포에서 폴리올 경로의 주효소인 알도스 환원효소(AR)를 활성화시키는 것이 보고된바 있다(Nakamura, N., et al., 2000, Free Radic Biol . Med., 29: 17-25). 정상상태에서는 알도스 환원효소가 포도당에 대하여 친화력이 매우 낮지만, 고농도의 포도당에서는 알도스 환원효소가 활성화되어 과도하게 포도당을 솔비톨로 환원시키고, 이 솔비톨이 솔비톨 탈수소효소에 의해 과당으로 전환된다. 이 과당은 포도당에 비하여 단백질의 비효소적 당화반응의 속도가 약 10배 정도 빠르다. 따라서 고농도의 과당이 단백질과 결합하여 결국은 최종당화산물의 형성을 가속화시킨다.
이와 같이 비효소적 당화반응, 폴리올 경로 및 산화적 스트레스(oxidative stress) 작용 기전들이 서로 연관되어 당뇨합병증을 유발시킨다. 따라서, 당뇨합병증의 발병을 지연하거나 예방 또는 치료하기 위해서는 최종당화산물의 형성을 억제하는 것이 매우 중요함이 밝혀졌다(Brownlee, M., et al., 1988, N. Engl . Med ., 318, 1315-1321).
현재, 단백질 당화 억제제로 합성제제인 아미노구아니딘(aminoguanidine)은 친핵성 히드라진(hydrazine)으로 아마도리 산물과 결합하여 단백질과의 교차결합을 방지함으로써 최종당화산물의 생성을 억제하여 합병증으로 진전되는 것을 지연 또는 방지한다(Brownlee, M., et al., 1986, Sciences, 232, 1629-1632; Edelstein, D. et al., 1992, Diabetes, 41, 26-29). 아미노구아니딘은 당뇨합병증의 예방 및 치료에 가장 유망한 합성 의약품으로 제 3상 임상실험까지 진행되었으나, 장기간 투여 시 독성이 유발되는 문제점이 나타나 중단되었다. 또한, 알도즈 리덕테이즈 효소 작용을 억제하여 소르비톨 축적을 방지하여 당뇨병성 망막증을 예방 치료효능이 우수한 일본의 에팔레스타트(epalrestat)도 시판 후 독성이 증명되어 시장에서 철수되었다.
그래서, 안전하고 효능이 우수한 천연약제의 개발이 요망되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 갈근에서 분리한 새로운 2-아릴벤조푸란 유도체인 푸에라리아푸란 및 쿠메스테롤, 다이드제인 및 제니스테인이 최종당화산물의 생성을 억 제하여 당뇨합병증의 치료 및 예방에 사용될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
이에 본 출원인은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 당뇨합병증의 원인, 처방 및 치료법 등에 대한 계속적인 연구를 하였으며, 본 발명은 당뇨합병증 유발 원인 중의 하나인 최종당화산물의 생성을 억제하는 효과를 갖는 푸에라리아푸란 화합물인 2-아릴벤조푸란 유도체, 쿠메스테롤 화합물, 다이드제인 화합물 또는 제니스테인 화합물을 갈근 추출물에서 계통분리하여 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 푸에라리아푸란 화합물인 2-아릴벤조푸란 유도체 또는 쿠메스테롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용, 노화방지 또는 지연용 및 항암예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 푸에라리아푸란 화합물인 2-아릴벤조푸란 유도체 또는 쿠메스테롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증의 예방 또는 치료용, 노화방지 또는 지연용 및 항암예방 또는 치료용 기능성 식품을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 갈근에서 분리되는 푸 에라리아푸란 화합물의 분리방법은 갈근을 수용액, 수용성 알콜 또는 유기용매 중 선택되는 용매로 추출한 후 농축시켜 추출물을 얻는 단계와; 상기 추출물을 크로마토그래피를 반복 실시하여 2-아릴벤조푸란 유도체를 얻는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 갈근에서 분리되는 2-아릴벤조푸란 유도체인 푸에라리아푸란 화합물을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 천연 또는 합성 푸에라리아푸란 화합물 또는 그 유도체를 유효성분으로 포함하는 당뇨합병증 예방 또는 치료, 노화방지 또는 지연용, 항암 예방 또는 치료용 약학조성물 및 기능성 식품을 특징으로 한다.
본 발명에 사용되는 갈근(Puerariae Radix)은 콩과에 속한 다년생 등본(藤本)인 칡(Pueraria thunbergiana Benth. 또는 Pueraria lobota Ohwi)의 뿌리를 건조한 것으로서 그 약성은 감(甘), 신(辛), 평(平)하며 비(脾), 위(胃)로 들어가 해표(解表), 수진(透疹), 생진(生津), 지사(止瀉)의 효능을 나타낸다. 약리작용으로는 해열작용, 혈압강하작용, 기억력증강, 뇌혈류량 증가, 관상동맥 확장작용, 심장기능 개선, 항부정맥 작용 등이 보고되었고(김호철, 한약약리학, 집문당, 92-94, 2001), 발한(發汗), 해열(解熱), 진경약(鎭痙藥) 등으로 폭넓게 사용되어 왔다(Kim, T.J. 1996. Korean resources plants, Vol. II, p. 232).
갈근의 구성성분과 생리활성 성분에 대해서도 광범위한 연구가 진행되어왔다(Kinjo J.-E. et al., 1987, Chem . Pharm . Bull. 35: 4846-4850; Ohshima Y. et al., 1988, Planta Med., 54: 250-254; Lee S.J. et al., 1994, Arch. Pharm . Res. 17: 31-35; Yasuda T. et al., 2005, Biol . Pharm . Bull. 28: 1224-1228). 하지만, 최종당화산물 형성 저해작용을 나타내는 갈근의 생리활성물질에 대한 연구는 지금까지 보고된 적이 없다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 푸에라리아프란, 쿠메스테롤, 다이드제인 및 제니스테인 화합물은 갈근을 수용액, 수용성 알콜 또는 유기용매 중 선택되는 용매로 추출한 후 농축시켜 추출물을 얻는 단계와; 상기 추출물을 크로마토그래피를 반복 실시하여 각각의 화합물을 얻는 단계로 이루어진다.
이하, 각각의 화합물에 대한 제조예를 상세히 설명하면 다음과 같다.
Ⅰ.
푸에라리아프란
화합물(
화합물1
)의 제조
1. 제1-1단계 : 갈근의 메탄올 추출물 제조
실험에 사용된 갈근[Pueraria lobata ( willd .) Ohwi 또는 Pueraria thunbergiana Benth.의 뿌리; Leguminosae]은 2005년 4월 대전시 유성구 전민동 일대에서 채집하였으며, 증거표본(no. KIOM-P041)은 한국한의학연구원 한약제제연구부의 식물표본실에 보관중이다.
채집된 갈근을 음건·세절한 갈근 4.9Kg을 메탄올 20ℓ에 넣고, 추출용기에서 상온상태로 3회 추출한 후, 40℃에서 감압 하에 농축시켜 메탄올 추출물 665g을 얻었다.
2. 제1-2단계 : 메탄올 추출물의 크로마토그래피(분획물 획득)
상기 제1-1단계에서 얻은 갈근의 메탄올 추출물 300g을 실리카겔(φ 12×50 cm, 70-230 mesh)을 고정상으로 하고, CHCl3:MeOH:H2O 혼합용매를 이동상으로 하여 크로마토그래피를 실시하여 12개의 분획(분획물 Fr.1 ~ Fr.12)으로 나눈다.
상기 CHCl3:MeOH:H2O 혼합용매의 농도구배는 9:1:0.1 → 4:1:0.1 → 7:3:0.2 → MeOH(각각 6ℓ)이다.
이때 상기 분획물 중 2번째(분획물 Fr.2)와 3번째(분획물 Fr.3)이 가장 강력한 in vitro 최종당화산물 생성 억제효능(IC50 값〈 5 ㎍/㎖)을 보였다.
3. 제1-3단계 : 분획물의 크로마토그래피(소분획물 획득)
상기 12개의 분획 중 2번째 분획물(Fr.2) 8.9g을 CHCl3:MeOH:H2O 혼합용매(9:1:0.1 v/v)로 용출한 다음, CHCl3:MeOH 혼합용매(농도구배 1:0 → 0:1)를 이용하여 실리카 겔(φ 7×36 cm, 230-400 mesh) 칼럼크로마토그래피를 실시함으로써 10개의 소분획(Fr.2-1 ~ Fr.2-10)으로 세분화하였다.
4. 제1-4단계 : 푸에라리아푸란 화합물의 생성
상기 10개의 소분획 중 5번째 분획물(Fr.2-5) 270㎎을 크로마토그래피를 반복 실시하여 2-아릴벤조푸란 유도체인 푸에라리아푸란 화합물 20㎎을 얻었다.
※ 상기 제1-1단계 내지 제1-4단계에 의해 분리된 푸에라리아푸란 화합물의 물리학적 성질 및 분광학적 자료
-. 푸에라리아푸란(Puerariafuran) : 3-포밀-2-(4-하이드로옥시-2-메톡시페닐)-6-하이드로벤조푸란
-. 상태 : 미황색 분말(pale yellowish powder)
-. 융점(mp) : 294 ~ 296 ℃ (dec)
-. IR (NaCl) cm-1: 3368, 3086, 2950, 2928, 1638, 1611, 1590, 1446, 1376, 1306, 1127, 1061, 960, 896
-. 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) : δ 9.89 s (1H, s, 3-CHO), 7.83 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-4), 7.46 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6'), 6.99 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-7), 6.85 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-5), 6.61 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-3'), 6.55 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-5'), 3.77 (3H, s, 2'-OCH3)
-. 13C-NMR (DMSO-d 6, 125 MHz) : δ 187.1 (CHO), 162.3 (C-2), 161.7 (C-4'), 158.6 (C-2'), 156.3 (C-6), 154.9 (C-8), 132.7 (C-6'), 121.6 (C-4), 116.5 (C-3/C-9), 113.6 (C-5), 107.8 (C-1'), 108.0 (C-5'), 99.7 (C-3'), 97.7 (C-7), 55.9 (OCH3)
-. LRESIMS m/z (rel. int.): 591 ([2M+Na]+), 307 ([M+Na]+), 285 ([M+H]+), 149; HRESIMS m/z: 307.0577 ([M+Na]+, Calcd for C16H12O5Na: 307.0585).
Ⅱ.
쿠메스테롤
화합물(
화합물2
)의 제조
1. 제2-1단계 : 갈근의 메탄올 추출물 제조
상기 푸에라리아푸란 화합물의 제조방법 중 제1-1단계와 동일하여 설명을 생략한다.
2. 제2-2단계 : 메탄올 추출물의 크로마토그래피(분획물 획득)
상기 푸에라리아푸란 화합물의 제조방법 중 제1-2단계와 동일하여 설명을 생략한다.
3. 제2-3단계 : 분획물의 크로마토그래피(소분획물 획득)
상기 12개의 분획 중 3번째 분획물(Fr.3) 1.14g을 CHCl3:MeOH:H2O 혼합용매(9:1:0.1 v/v)로 용출한 다음, CHCl3:MeOH 혼합용매(1:1 v/v)를 이용하여 세파텍스(sephadex; φ 3.6×47 cm) 칼럼 크로마토그래피를 실시함으로써 6개의 소분획(Fr.3-1 ~ Fr.3-6)으로 세분화하였다.
4. 제2-4단계 : 쿠메스테롤 화합물의 생성
상기 6개의 소분획 중 4번째 분획물(Fr.3-4) 210㎎을 역상 칼럼크로마토그래피(φ 3.6×35 cm, 12 nm S-150 μm; MeOH:H2O=7:3)를 실시하여 쿠메스테롤(coumestrol) 18㎎을 분리하였다.
※ 상기 제3-1단계 내지 제3-4단계에 의해 분리된 쿠메스테롤 화합물의 물리학적 성질 및 분광학적 자료
-. 쿠메스테롤(Coumestrol)
-. 상태 : 백색 분말(White powder)
-. 융점(mp) : 〉300 ℃
-. 1H-NMR (DMSO-d 6, 300 MHz) : δ 7.84 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-1), 7.68 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-7), 7.16 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-10), 6.94 (1H, dd, J = 8.7, 2.2 Hz, H-8), 6.93 (1H, dd, J = 8.4, 2.1 Hz, H-2), 6.90 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-4)
-. 13C-NMR (DMSO-d 6, 75 MHz) : δ 162.1 (C-3), 160.4 (C-11a), 158.57 (C-6), 157.9 (C-10a), 156.8 (C-9), 155.5 (C-4a), 123.6 (C-1), 121.5 (C-7), 115.4 (C-7a), 114.9 (C-8), 114.6 (C-2), 105.0 (C-1a), 103.9 (C-4), 102.9 (C-6a), 99.6 (C-10)
-. LRESIMS m/z (rel. int.): 292 ([M+Na]+), 285 ([M+H]+).
이상의 물리학적 및 분광학적 자료는 문헌의 자료와 일치하였다(Kinjo J.-E., et al., 1987. Chem . Pharm . Bull. 35: 4846-4850).
상기 화합물의 물리학적 및 분광학적 성질을 규명하기 위하여 실시한 실험에 사용된 기기 및 시약은 아래와 같다.
융점(melting point)은 IA9100 융점측정장치(Barnstead International, USA)를 사용하여 측정하였고, 광학활성도(optical rotation)는 P-1020 digital polarimeter(Jasco, Japan)를 IR 스펙트럼은 FTS 165 FT-IR spectrophotometer(Bio-Rad, CA)를 이용하여 얻었다.
LREI와 HRESIMS 실험에는 각각 Autospec (Micromass, UK)와 Mariner mass spectrometer(Perspective Biosystem, USA)를 사용하였고, NMR 실험은 DRX-300 또는 AVANCE-600 FT-NMR(Bruker, Germany)을 사용하였다.
1H NMR과 13C NMR의 화학적 이동값(chemical shifts)은 NMR 용매를 기준으로 하여 ppm으로 보고하였다. 실리카겔(silica gel; Merck 60A, 70~230 또는 230~400 mesh ASTM), 세파덱스(sephadex LH-20; Amersham Pharmacia Biotech), 및 역상실리카겔(reversed-phase silica gel ;YMC Co., ODS-A 12 nm S-150 μm)이 칼럼크로마토그래피에 사용되었다.
TLC 분석은 Kieselgel 60 F254 (Merck) plates(silica gel, 0.25 mm layer thickness)를 이용하였으며, 10%(v/v) H2SO4 시약(Aldrich)에 담근 후 110 ℃에 5분간 발색시켰다. 실험에 사용된 모든 유기용매는 증류한 후 사용하였다.
Ⅲ.
다이드제인
화합물(
화합물3
)의 제조
1. 제3-1단계 : 갈근의 메탄올 추출물 제조
상기 푸에라리아푸란 화합물의 제조방법 중 제1-1단계와 동일하여 설명을 생략한다.
2. 제3-2단계 : 메탄올 추출물의 크로마토그래피(분획물 획득)
상기 푸에라리아푸란 화합물의 제조방법 중 제1-2단계와 동일하여 설명을 생략한다.
3. 제3-3단계 : 분획물의 크로마토그래피(소분획물 획득)
상기 푸에라리아푸란 화합물의 제조방법 중 제1-3단계와 동일하여 설명을 생략한다.
4. 제3-4단계 : 다이드제인 화합물의 생성
상기 10개의 소분획 중 4번째 분획물(Fr.2-4) 690㎎을 크로마토그래피를 반복 실시하여 다이드제인 화합물 24㎎을 얻었다.
Ⅳ.
제니스테인
화합물(
화합물4
)의 제조
1. 제4-1단계 내지 제4-3단계는 상기 쿠메스테롤 화합물의 제조방법인 제2-1단계 내지 제2-3단계와 동일하여 설명을 생략한다.
다만, 제4-4단계는 제2-4단계와 같이 제2-3단계에서 분리되는 6개의 소분획 중 4번째 분획물(Fr.3-4) 210㎎을 역상 칼럼크로마토그래피(φ 3.6×35 cm, 12 nm S-150 μm; MeOH:H2O=7:3)를 실시하여 쿠메스테롤(coumestrol)과 별개로 제니스테 인(genistein) 35㎎을 얻었다.
Ⅴ.
갈근에서
분리되는 화합물들의 시험관 내에서 최종당화산물 생성억제 효능분석 실험
[실험예]
단백질원(原)으로 소혈청알부민(bovine serum albumin, 이하 BSA라고 한다: 미국 시그마 제품)을 택하였다. BSA을 10 ㎎/㎖의 농도가 되도록 50 mM 인산 완충 용액(phosphate buffer; pH 7.4)에 가하여 제조하였다. 당원(原)으로는 0.2 M 과당과 0.2 M 글루코스가 혼합된 액을 사용하였다. 제조된 BSA 용액에 과당과 글루코스 혼합액을 가하였다. 푸에라리아푸란은 0.05㎍/㎖, 0.1,㎍/㎖ 0.2㎍/㎖농도로, 쿠메스테롤은 0.01㎍/㎖, 0.025㎍/㎖, 0.05㎍/㎖의 농도로, 다이드제인은 5㎍/㎖, 10㎍/㎖, 25㎍/㎖의 농도로, 제니스테인은 65㎍/㎖, 80㎍/㎖, 95㎍/㎖의 농도로 조제한 후(모든 화합물을 DMSO에 녹인 후 15% tween 80를 가한다. 이때 총 DMSO의 함량은 0.2%), 이를 상기 BSA 와 당의 혼합액에 첨가하고 37℃에서 7일간 배양하였다.
이때 0.02% 소디움아자이드(sodium azide)와 안티마이코틱스 (antimycotics)를 항 박테리아제 및 항진균제로서 첨가하였다. 대조군은 BSA와 당 혼합액을 배양한 것이며, 시험군과 대조군의 공시험군(blank)은 각각 조제한 후 배양하지 않은 것이다. 한편 효능의 우수함을 비교할 수 있는 지표인 양성 대조군으로서 아미노구아니딘을 사용하였다. 모든 배양액은 4 개씩 준비하여 최대한 오차를 피하였다. 7 일 후 배양액에서 생성된 최종당화산물의 함량을 분석하여 그 결과를 나타내었다. 최종당화산물은 형광, 갈색을 띠고 있으며 교차결합을 할 수 있는 물리화학적인 특성을 지니고 있을 뿐 아니라 세포막 수용체가 인지할 수 있는 배위자를 지니고 있다. 이러한 특성을 지닌 최종당화산물의 양을 Microplate reader(Excitation: 350nm, Emission: 450nm)로 측정하여 그 생성 억제 정도를 분석하였다(Vinson, J.A. et al., J. Nutr . Biochem ., 7: 659-663, 1996).
생성억제율은 하기의 식으로 계산된다.
생성억제율(%)= 100-(시료군의 형광강도-시료 공시험군의 형광강도)/(대조군의 형광강도-대조군 공시험군의 형광강도)×100
-. 양성대조군 : 아미노구아니딘의 최종당화산물 생성억제 효능분석 실험
아미노구아니딘을 증류수에 용해하여 9.25 ㎍/㎖, 18.5㎍/㎖, 37 ㎍/㎖ 농도로 조제한 후 상기에 기재한 방법으로 37℃에서 7일 동안 배양하였다. 7일 후 배양액에서 생성된 최종당화산물의 양을 Microplate reader (Excitation: 350nm, Emission: 450nm)로 측정하였다.
Ⅵ. 실험결과
1. 갈근에서 분리된 화합물들의 규명
갈근의 MeOH 추출물로부터 in vitro 최종당화산물 생성억제실험과 크로마토 그래피법을 병용한 활성추적분획법(bioassay-guided fractionation)을 이용하여 새로운 2-아릴벤조푸란유도체인 푸에라리아푸란(화합물1)과 3종의 알려진 화합물인 쿠메스테롤(화합물2), 다이드제인(화합물3) 및 제니스테인(화합물4)이 분리되었다.
가. 푸에라리아푸란의 규명
상기 푸에라리아푸란(화합물1)은 미황색분말형태로 얻어졌다. 또한 HRESIMS에서 분자이온 [M+Na]+ m/z 307.0577을 보였으며, 이는 분자식 C16H12O5Na과 상응하는 것이다.
화합물1의 알데히드 그룹(aldehyde group)의 존재는 IR(1638 cm-1), 1H-NMR(δ 9.89) 과 13C-NMR(δ 187.1) 자료에서 확인되었다. 화합물1의 1H-NMR spectrum은 이 화합물이 두 개의 1,2,4-삼치환벤젠고리(trisubstituted benzene moiety)를 가지고 있음을 의미하는 두 세트의 ABX-type signal들[δ 7.83 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.99 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.85 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz); 7.46 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.61 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.55 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz)]과 하나의 메톡시기(methoxyl group; δ 3.77, 3H, s) signal의 공명을 보여주었다.
화합물1의 13C NMR과 DEPT NMR 스펙트럼은 δ 116.5의 상대적으로 강한 signal을 포함하여 총 15개의 탄소 signal을 보여주었다. 이 같은 사실과 화합물1의 HRMS에 의해 얻어진 분자식인 C16H12O5을 고려해볼 때, C-3과 C-9에 위치한 두개 의 방향족 사차 탄소(aromatic quaternary carbons)가 동일한 화학적 이동값(chemical shifts)을 가지고 있어 13C-NMR spectrum의 δ 116.5에서 두 signal들이 중첩되었다는 사실을 예상할 수 있었다.
이상의 결과와 COSY, HMQC 및 HMBC NMR data(도 3 내지 도 8 참조)의 자세한 분석을 토대로 화합물1은 2-aryl-3-formylbenzofuran 유도체 중 하나임을 확정할 수 있었다. 화합물1에 존재하는 모든 formyl, methoxyl 및 hydroxyl group들의 위치는 HMBC과 NOESY NMR 실험(도 2a 참조)을 통해 명백하게 결정하였다. 문헌의 자료(Tanaka H., et al., 2004. Chem . Biodiversity 1: 1101-1108)와 이상의 결과를 비교해볼 때, 화합물1의 구조는 C-5' 위치에 methoxyl group이 존재하지 않는 사실을 제외하고는2-aryl-3-formylbenzofuran 유도체 중 하나인 eryvarin P와 매우 유사함을 알 수 있었다.
따라서 이 새로운 arylbenzofuran계 화합물인 puerafuran (화합물1)의 구조를 푸에라리아푸란(fuerariafuran); 3-포밀-2-(4-하이드로옥시-2-메톡시페)-6-하이드로벤조퓨란(3-formyl-2-(4-hydroxy-2-methoxyphenyl)-6-hydroxybenzo furan)으로 확정하였다. 푸에라리아푸란은 식물계에서 매우 희귀한 formyl group을 가지고 있는 2-arylbenzofuran계 화합물이다(Tanaka H., et al., 2004. Chem . Biodiversity 1: 1101-1108; Tanaka H., et al., 2003. Phytochemistry 63: 597-602). 이는 Pueraria 속(Genus)에서는 2-aryl-3-formylbenzofuran계 화합물이 최초로 분리된 것이다.
나. 쿠메스테롤, 다이드제인 및 제니스테인의 규명
본 발명에 따라 분리되는 화합물들인 쿠메스테롤(화합물2), 다이드제인(화합물3) 및 제니스테인(화합물4)은 물리학적(physical), 분광학적(spectroscopic)자료 (mp, 1H-, 13C-NMR 및 MS)분석과 문헌의 수치와의 비교를 통해 이미 알려진 쿠메스테롤, 다이드제인 및 제니스테인으로 확인되었다(Kinjo J.-E., et al., 1987. Chem. Pharm . Bull. 35: 4846-4850)(도 2b, 도 2c 참조).
2. 갈근에서 분리된 화합물들의 최종당화산물 생성억제 효능
본 발명에 따라 갈근에서 분리된 4종의 화합물을 상기 실험예를 따라 실험하여 시험관 내에서 최종당화산물 생성 저해활성도를 측정하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
| 화합물＼효능 | ㎍ /mL | 억제효능 | 억제효능(IC50 값) (㎍/mL) | 억제효능(IC50 값) (μM) |
| 푸에라리아푸란(1) (3-포밀-2-(4-하이드로옥시-2-메톡시페닐)-6-하이드로벤조퓨란) | 0.05 | 4.88±1.42 | 0.15 | 0.53 |
| 0.1 | 22.03±2.41 | |||
| 0.2 | 71.84±1.88 | |||
| 쿠메스테롤(2) | 0.01 | 18.52±6.58 | 0.05 | 0.19 |
| 0.025 | 27.78±3.07 | |||
| 0.05 | 50.48±3.76 | |||
| 다이드제인(3) | 5 | 25.06±1.86 | 12.0 | 47.2 |
| 10 | 44.81±2.80 | |||
| 25 | 94.20±2.88 | |||
| 제니스테인(4) | 65 | 48.21±1.31 | 70.1 | 260 |
| 80 | 53.51±0.89 | |||
| 95 | 58.51±1.73 | |||
| 아미노구아니딘 Aminoguanidine | 9.25 | 25.29±3.22 | 34.56 | 473 |
| 18.5 | 54.63±0.88 | |||
| 37 | 69.69±0.88 |
표 1에서 보인대로 본 발명에 따라 갈근에서 분리되는 푸에라리아푸란(화합물1)과 쿠메스테롤(화합물2)의 최종당화산물 생성억제활성능력은 각각 IC50값이 0.53와 0.19 μM이며, 이는 양성대조물질인 아미노구아니딘(IC50 값: 473 μM)보다 각각 892배, 2489배 월등하게 우수하다.
또한, 나머지 두 화합물인 다이드제인(화합물3)과 제니스테인(화합물4)도 각각 IC50값이 47.2와 260 μM로 아미노구아니딘보다 10배, 1.8배 우수한 활성을 나타내었다.
따라서 본 연구를 통해 분리된 탁월한 효능을 가진 푸에라리아푸란, 쿠메스테롤, 다이드제인 및 제니스테인은 새로운 당뇨합병증 및 관련 질병 치료제로서의 개발가능성이 매우 크다고 판단된다.
상기에서 살펴본 바와같이, 본 발명에 따른 갈근에서 분리되는 푸에라리아푸란, 쿠메스테롤, 다이드제인 및 제니스테인은 당뇨합병증 유발 원인 중의 하나인 최종당화산물의 생성을 효과적으로 억제하는 효과가 있다.
이에따라, 본 발명에 따른 갈근에서 분리되는 푸에라리아푸란, 쿠메스테롤, 다이드제인 및 제니스테인은 최종당화산물의 생성을 억제하는 효능이 있어 당뇨합병증 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 및 기능성 식품으로도 응용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 갈근에서 분리되는 푸에라리아푸란, 쿠메스테롤, 다이드제인 및 제니스테인은 최종당화산물의 생성을 억제하는 경우 산화적 스트레스의 유발 비율이 줄어들어, 산화적 스트레스에 의한 노화의 방지 및 지연용 약학적 조성물 및 기능성 식품으로도 응용될 수 있다.
그리고, 최종당화산물이 발암(carcinogenesis)을 유발함이 이미 보고되었는바(Tokuda, H., et al., 2005. Book of Abstract of 53rd GA Congress joint with SIF, P076). 이로써 본 발명에 따라 갈근에서 분리되는 푸에라리아푸란, 쿠메스테롤, 다이드제인 및 제니스테인이 항암예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 기능성 식품으로도 응용될 수 있다.
Claims (18)
- 갈근을 수용액, 수용성 알콜 또는 유기용매 중 선택되는 용매로 추출한 후 농축시켜 추출물을 얻는 단계와;상기 추출물을 크로마토그래피를 반복 실시하여 2-아릴벤조푸란 유도체를 얻는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 갈근에서 분리되는 푸에라리아푸란 화합물의 분리방법.
- 갈근에서 분리되는 구조식 1로 표시되는 2-아릴벤조푸란 유도체를 특징으로 하는 푸에라리아푸란 화합물.<구조식 1>
- 제 2항의 구조식 1로 표시되는 푸에라리아푸란 화합물 또는 2-아릴벤조푸란 유도체를 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 또는 치료를 위한 약학조성물.
- 제 2항의 구조식 1로 표시되는 푸에라리아푸란 화합물 또는 2-아릴벤조푸란 유도체를 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 또는 치료를 위한 기능성 식품.
- 제 2항의 구조식 1로 표시되는 푸에라리아푸란 화합물 또는 2-아릴벤조푸란 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화방지 또는 지연용 약학조성물.
- 제 2항의 구조식 1로 표시되는 푸에라리아푸란 화합물 또는 2-아릴벤조푸란 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화방지 또는 지연용 기능성 식품.
- 제 2항의 구조식 1로 표시되는 푸에라리아푸란 화합물 또는 2-아릴벤조푸란 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 2항의 구조식 1로 표시되는 푸에라리아푸란 화합물 또는 2-아릴벤조푸란 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암 예방 또는 치료용 기능성 식품.
- 구조식 2로 표시되는 쿠메스테롤 화합물 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 또는 치료를 위한 약학조성물.<구조식 2>
- 제 9항의 구조식 2로 표시되는 쿠메스테롤 화합물 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 또는 치료를 위한 기능성 식품
- 제 9항의 구조식 2로 표시되는 쿠메스테롤 화합물 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화방지 또는 지연용 약학조성물.
- 제 9항의 구조식 2로 표시되는 쿠메스테롤 화합물 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화방지 또는 지연용 기능성 식품.
- 제 9항의 구조식 2로 표시되는 천연 또는 합성 쿠메스테롤 화합물 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 9항의 구조식 2로 표시되는 쿠메스테롤 화합물 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 항암 예방 또는 치료용 기능성 식품.
- 갈근에서 분리되는 다이드제인 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 또는 치료를 위한 약학조성물.
- 갈근에서 분리되는 다이드제인 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 또는 치료를 위한 기능성 식품.
- 갈근에서 분리되는 제니스테인 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 또는 치료를 위한 약학조성물.
- 갈근에서 분리되는 제니스테인 화합물을 유효성분으로 함유하는 당뇨합병증 예방 또는 치료를 위한 기능성 식품.
Priority Applications (2)
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