KR100549598B1

KR100549598B1 - 아미드화합물의 제조방법

Info

Publication number: KR100549598B1
Application number: KR1020017015327A
Authority: KR
Inventors: 아베타케야; 이토키요시; 사사키켄주; 와타나베세이이치; 타치바나토시히사; 아사노타모츠
Original assignee: 미쯔이카가쿠 가부시기가이샤
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2001-03-23
Publication date: 2006-02-03
Also published as: DE60132053D1; US6849432B2; KR20020020898A; AU767517B2; EP1182260A1; CN1279175C; WO2001073101A1; CN1320705A; EP1182260A4; TWI296652B; EP1182260B1; US20020160466A1; AU4276901A; DE60132053T2

Abstract

본 발명은, 니트릴히드라타제를 함유하는 미생물균체 또는 해당 미생물균체의 처리물을 수성 매체중에서 니트릴화합물과 반응시켜 아미드화합물을 연속적으로 제조하는 방법에 있어서, 상기 균체 또는 해당 균체의 처리물을, 교반기를 구비한 통형 반응기를 이용해서, 수성 매체중에서 상기 니트릴화합물과 접촉시킨 후, 이와 같이 해서 얻어진 반응액을 플러그플로성의 유역을 지닌 조건하에 더욱 반응시키는 것을 특징으로 하며, 이러한 본 발명에 의하면, 니트릴화합물의 전화율이 극히 높고, 농축공정이 불필요하며, 고순도 또 고농도의 아미드화합물수용액을 용이하게 얻을 수 있다.

Description

아미드화합물의 제조방법{PROCESS FOR PRODUCING AMIDE COMPOUNDS}

본 발명은, 아미드화합물의 제조방법에 관한 것으로, 특히, 니트릴화합물을 고전화율로 수화함으로써, 반응후의 잔류니트릴화합물의 양이 적어, 공업적으로 적합한 고농도의 아미드화합물수용액을 연속적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

아미드화합물을 제조하는 주된 방법의 하나로서, 니트릴화합물을 원료로서 사용하는 수화법을 사용하고, 특히, 원료로서의 아크릴로니트릴로부터, 라네이구리 등의 금속성 구리촉매에 의해, 최근에는 니트릴히드라타제를 함유하는 미생물균체 또는 그 미생물균체의 처리물 등의 수화촉매에 의해 아크릴아미드를 제조하는 것이 공지되어 있다.

상기 방법에 있어서, 제품인 아크릴아미드는, 수용액 또는 결정의 형태로 공급되는 것이 일반적이며, 그 사용시에는, 수성 용매로 희석하거나 용해시킨 후 사용하는 것이 일반적이다. 따라서, 특히 근년에는, 수용액의 형태로 거의 공급된다.

아크릴아미드수용액의 공급시, 운송, 저장 등의 비용의 관점에서 제품으로서는 고농도인 것이 요구되고 있으나, 운송, 저장 등을 하는 동안에는 결정의 석출을 방지할 필요가 있다. 따라서, 상온부근에서 운송, 저장 등에 적합한 아크릴아미드의 농도는 일반적으로 40 내지 50중량%이다.

그러나, 종래의 공업적인 제조기술에 있어서의 반응공정에서의 아크릴아미드의 농도는, 사용된 촉매의 종류와 제법에 따라 통상 40중량%미만이다. 그 이유는, 반응공정에서 아크릴로니트릴 및/또는 아크릴아미드의 농도가 높은 경우, 촉매활성을 잃는 경향이 있어, 반응이 불완전하여 원료로서의 아크릴로니트릴이 남게 되고, 부산물의 양이 증대하며, 그와 같은 현상에 의해, 반응열의 제거능력에 기인한 규제가 있다고 하는 문제가 있어, 일반적으로 아크릴아미드의 제품 농도를 지닌 최종생성물이 상기 반응종료시 그대로 얻어지기 곤란하다.

따라서, 현재 아크릴아미드의 공업적인 제조방법에 있어서는, 원료로서의 아크릴로니트릴을 다단법으로 공급하는 방법(일본국 공고특허 소 57-1234호), 반응액의 일부를 순환시키는 원료희석방법(일본국 공고특허 소 58-35077호) 등에 의해 아크릴아미드의 농도를 제한하거나, 또는 원료로서의 아크릴로니트릴의 전화율이 보다 낮은 수준으로 억제됨으로써, 반응액중의 아크릴아미드의 농도를 40중량%이하로 유지해서 촉매의 비활성 및 부산물의 양의 증가를 억제한다. 따라서, 농축을 행하여, 얻어지는 아크릴아미드수용액의 농도를 증가시키거나 및/또는 잔류아크릴로니트릴을 제거하는 것이 일반적이다.

그러나, 일반적으로 아크릴아미드함유용액의 농축을 감압하에 행하지만, 아크릴아미드는 극히 높은 반응성을 지닌 중합성 단량체이기 때문에 농축동안 중합의 위험이 있다. 따라서, 이러한 대응책으로 농축시 산소를 도입함으로써 안정화시키는 방법, 일산화질소를 공존시키는 방법, 금속 이온을 공존시키는 방법 등을 행 하나, 중합을 완전히 방지하는 것은 곤란하다.

일본국 공개 특허 평 11-89575호에는, 미생물균체 또는 그 균체의 처리물을 이용해서, 반응의 개시시 혹은 반응동안 아크릴로니트릴의 농도를 수성 매체중에서 아크릴로니트릴의 포화농도이상으로 해서, 소량의 균체로 고농도의 아크릴아미드를 얻을 수 있는 아크릴아미드의 제조방법이 개시되어 있다. 농도가 40중량%이상인 아크릴아미드수용액을 농축시키지 않고 얻을 수 있다고 해도, 반응용의 촉매의 사용량이나 반응온도와 반응의 개시시 혹은 반응중의 아크릴로니트릴의 농도와의 관계에 따라 문제가 발생할 경우도 종종 있다. 예를 들면, 단기간에 반응을 완료한 경우에, 초기단계에서의 반응열이 커서 반응기에 대해서 비교적 큰 열교환기를 필요로 하는 한편, 아크릴로니트릴의 전화율이 99%이상인 경우, 긴 반응시간을 요한다.

상기 환경하에서, 이러한 아미드화합물의 공업적인 제조방법은, 니트릴화합물의 전화율이 높고, 농축공정이 불필요하며, 아미드화합물을 고농도로 효과적으로 얻을 수 있는 것이 요구되고 있다.

발명의 개시

본 발명은 상기 문제를 해결하기 위해 개발된 것으로, 그 목적은, 니트릴화합물을 고전화율로 전환함으로써, 잔류니트릴화합물의 양이 극히 적어, 연속적으로 작업을 행할 수 있으므로, 공업적인 제조에 적합한 고농도의 아미드화합물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구한 결과, 니트릴히드라타제를 함유하는 미생물균체 또는 그 미생물균체의 처리물을 수성 매체중에서 니트릴화합물과 접촉시켜 반응을 행한 후, 그 반응액을 플러그플로성의 유역(plug flow region)을 지닌 조건하에 더욱 반응시키는 효과적인 대응책에 의해 상기 목적을 달성할 수 있다는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명은, 다음과 같다.

(1) 니트릴히드라타제를 함유하는 미생물균체 또는 해당 미생물균체의 처리물을 수성 매체중에서 니트릴화합물과 반응시켜 아미드화합물을 연속적으로 제조하는 방법에 있어서, 상기 미생물균체 또는 해당 미생물균체의 처리물을, 교반기를 구비한 통형(槽形: vessel type) 반응기를 이용해서, 수성 매체중에서 상기 니트릴화합물과 접촉시킨 후, 이와 같이 해서 얻어진 반응액을 플러그플로성의 유역을 지닌 조건하에 더욱 반응시키는 것을 특징으로 하는 아미드화합물의 연속 제조방법;

(2) 상기 (1)항에 있어서, 상기 니트릴화합물이 아크릴로니트릴이고, 상기 균체 또는 해당 균체의 처리물과의 접촉시 물과 아크릴로니트릴의 비는 물 1.0중량부에 대해서 아크릴로니트릴 0. 4 내지 1.5중량부인 것을 특징으로 하는 아미드화합물의 연속 제조방법; 및

(3) 상기 (1)항 또는 상기 (2)항에 있어서, 상기 미생물균체가, 임의의 숙주에서 해당 미생물로부터 클로닝된 니트릴히드라타제유전자를 발현시킴으로써 얻어진 형질전환체인 것을 특징으로 하는 아미드화합물의 연속 제조방법.

발명을 수행하기 위한 최량의 형태

본 발명에서 중요한 것은, 니트릴화합물중의 니트릴기의 아미드화용의 아미드화촉매로서 니트릴히드라타제를 함유하는 미생물균체 또는 해당 미생물균체의 처리물을 사용하고, 부산물의 생성을 억제하면서 고농도의 아미드화합물수용액을 효율적으로 고전화율로 제조하는 점에 있다.

본 발명에 있어서의 니트릴히드라타제란, 니트릴화합물을 가수분해해서 대응하는 아미드화합물을 생성하는 능력을 지닌 효소를 의미한다.

니트릴히드라타제를 함유하는 미생물은, 니트릴화합물을 가수분해해서 대응하는 아미드화합물을 생성하는 능력을 지닌 니트릴히드라타제를 생산하고, 30중량%의 아크릴아미드 수용액중에서 니트릴히드라타제로서의 활성을 유지할 수 있는 한 특히 제한되지 않는다. 구체적으로는, 그 바람직한 예로서는, 노카르디아속(Nocardia), 코리네박테리움속(Corynebacterium), 바실루스속(Bacillus), 호열성 바실루스속(thermophillic Bacillus), 슈도모나스속(Pseudomonas), 미크로코커스속(Micrococcus), 로도크로스(Rhodochrous)로 대표되는 로도코커스속(Rhodococcus), 아시네토박터속(Acinetobacter), 크산토박터속(Xanthobacter), 스트렙토마이세스속(Streptomyces), 리조비움속(Rhizobium), 클레브시엘라속(Klebsiella), 엔테로박터속(Enterobacter), 에르위니아속(Erwinia), 아에로모나스속(Aeromonas), 시트로박터속(Citrobacter), 아크로모박터속(Achromobacter), 아그로박테리움속(Agrobacterium), 써모필라(Themophilla)로 대표되는 슈도노카르디아속(Pseudonocardia)에 속하는 미생물을 들 수 있다.

임의의 숙주에서 해당 미생물로부터 클로닝된 니트릴히드라타제유전자를 발현시킴으로써 얻어진 형질전환체도 본 발명의 미생물에 포함된다. 여기서 말하는 임의의 숙주의 대표적인 예로서는 후술하는 바와 같이 대장균(Escherichia coli)을 예로 들 수 있으나, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등의 바실루스, 효모, 방선균 등의 기타 미생물균체도 포함된다. 그 예로서는, MT-10822(이 균주는, 특허수속상의 미생물기탁의 국제적 승인에 의한 부다페스트조약에 의거한 수탁번호 FERM BP-5785하에 1996년 2월 7일자로 일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1쪼메 1-3에 소재한 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되어 있음)를 들 수 있다. 본 발명의 미생물로서는, 효소의 구성 아미노산의 1개 혹은 2개이상을 DNA편집(splicing)수법을 이용해서 다른 아미노산과 치환, 결실, 삭제 혹은 삽입해서 아미드화합물내성, 니트릴화합물내성 및 내온성을 보다 개량시킨 돌연변이성 니트릴히드라타제를 발현시킴으로써 얻어진 형질전환체도 포함한다.

상기 미생물을 이용해서 아미드화합물을 제조할 때, 균체 또는 균체의 처리물을 통상 이용한다. 이 균체는, 분자생물학, 생명공학 및 유전공학분야에서 공지된 통상의 방법을 이용함으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법으로서는, LB배지, M9배지 등의 통상의 액상 배지에 미생물을 식균한 후, 적절한 배양온도(통상 20 내지 50℃이고, 50℃이상은 호열성에 대해서 가능함)에서 성장시키고 나서, 미생물을 원심분리에 의해 배양액으로부터 분리·회수하는 방법을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 미생물균체의 처리물이란, 미생물균체의 추출·분쇄물, 상기 추출·분쇄물의 니트릴히드라타제활성분획을 분리·정제해서 얻어진 후분리물, 미생물균체 또는 해당 균체의 추출물, 분쇄물 혹은 후분리물을 적절한 담체에 고정시켜 얻어진 고정물을 말하며, 이들은, 니트릴히드라타제로서 활성을 지니는 한 본 발명의 균체의 처리물에 포함된다. 이들은 단일종으로서 단독으로 혹은 2종이상을 동시에 혹은 교대로 사용해도 된다.

본 발명에 있어서의 니트릴히드라타제를 함유하는 미생물균체 또는 해당 미생물균체의 처리물을 이용해서 니트릴화합물로부터 아미드화합물을 얻을 경우의 반응의 형태는, 2개이상의 반응기를 이용해서 행해도 되며, 전치반응기에 미생물 균체 혹은 해당 균체의 처리물, 니트릴화합물 및 수성 매체를 공급한다. 이 때, 이 반응의 형태는, 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 현탁상 혹은 고정상의 어느 것이어도 되며, 교반기를 구비한 통형 반응기중에서 현탁상을 사용하는 것이, 반응열의 제거가 용이하므로 바람직하다.

본 발명에 있어서, 니트릴화합물의 종류는 특히 제한되지 않고, 그 구체예로서는, 탄소수 2 내지 20개를 지닌 니트릴화합물을 들 수 있고, 넓은 범위의 니트릴, 예를 들면, 지방족 니트릴, 방향족 니트릴 등을 들 수 있다. 지방족 니트릴의 예로서는, 예를 들면, 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 부티로니트릴, 이소부티로니트릴, 발레로니트릴, 이소발레로니트릴, 카프로니트릴 등의 탄소수 2 내지 6개의 포화 또는 불포화 니트릴; 말로노니트릴, 숙시노니트릴, 아디포니트릴 등의 지방족 포화 디니트릴; 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, 크로토노니트릴 등의 지 방족 불포화 니트릴 등을 들 수 있다. 방향족 니트릴의 예로서는, 벤조니트릴, o-, m- 또는 p-클로로벤조니트릴, o-, m- 또는 p-플루오로벤조니트릴, o-, m- 또는 p-니트로벤조니트릴, o-, m- 또는 p-톨루니트릴, 벤질시아나이드 등을 들 수 있다. 이들중 바람직한 예로서는, 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, 크로토노니트릴 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 수성 매체로서는, 물; 인산 등의 완충제, 황산염, 탄산염 등의 무기염류, 알칼리금속의 수산화물, 아미드화합물 등이 적절한 농도로 용해되어있는 수용액을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 전치반응기에 공급된 니트릴화합물의 농도는, 반응개시시의 니트릴화합물의 포화농도보다도 높은 농도이다. 이 농도의 상한은, 특히 한정되지 않지만, 니트릴화합물을 지나치게 과잉량 공급하면 다량의 촉매가 필요하고, 반응을 행하는 데 지나치게 큰 용적의 반응기가 필요하고, 또, 열을 제거하기 위한 열교환기도 지나치게 커져, 장비의 경제적인 비용의 증가를 초래하므로, 니트릴화합물의 공급농도는, 전체 니트릴화합물을 대응하는 아미드화합물로 변환시킬 때, 이와 같이 해서 제조된 용액의 이론적인 농도가 아크릴아미드의 경우 40 내지 80중량%의 농도가 바람직하고, 보다 구체적으로는, 아크릴로니트릴의 양은 바람직하게는 물 1.0중량부에 대해서 0.4 내지 1.5중량부이다. 메타크릴아미드의 경우, 니트릴화합물과 물의 공급농도는, 이와 같이 해서 제조된 용액의 이론적인 농도가 10 내지 40중량%로 되도록, 보다 구체적으로는 메타크릴로니트릴의 양은 바람직하게는 물 1.0중량부에 대해서 0.08 내지 0.5중량부이다.

본 발명에 있어서, 전치반응기로부터 회수한 반응액은, 플러그플로성의 유역을 지닌 조건하에 더욱 반응을 행한다. 구체적으로는, 전치반응기로부터 회수한 반응액을 플러그플로성의 유역을 지닌 후속의 반응기로 공급한다. 여기서 말하는 플로그플로성의 유역을 지닌 반응기란, 일반적으로 관형상 반응기를 의미할 경우가 많고, 여기에서는, 파이프형상의 관내부에서 피스톤흐름으로 반응액이 이동하고, 2중배관형식의 것과 셸 및 관형상을 지닌 것은 반응열을 제거하는 데 사용할 수 있다.

그러나, 본 발명에 있어서의 플러그플로성의 유역을 지닌 반응기는, 상기 형태로 제한되지 않고, 반응액의 불충분한 통과가 일어나기 어려운 형상을 지닌 것인 한 기타 다른 형태의 반응기도 양호하게 사용할 수 있다. 즉, 유속 등의 조건에 따라 반응액이 플러그플로성의 유역을 지닐 수 있고, 반응열이 제거될 수 있는 플러그플로성의 유역을 지닌 반응기로서 이러한 구조를 지닌 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 열교환기에 있어서 나선형 혹은 판형인 것, 탑형 반응기 등의 각종 구조를 이용할 수 있다. 또, 반응액의 유동상태를 균일하게 하기 위하여 반응기내부에 배플판이나 패킹을 설치할 경우, 유속 등의 조건에 따라 반응액의 플러그플로성의 유역을 지니는 한 플러그플로성의 유역을 지닌 반응기로서 사용할 수 있다.

상기 각 설명에 있어서 전치반응기 및 플러그플로성의 유역을 지닌 후속의 반응기는 각각 1개의 반응기로 한정되지 않고, 단일의 반응기 혹은 직렬 또는 병렬로 배열된 복수의 반응기이어도 된다. 전치반응기 및 후속의 반응기에 있어서 반응시의 반응시간(체류시간)은, 촉매의 사용량, 온도 등의 조건에 의존하므로 일정하지는 않지만, 각 시간은 0.5 내지 40시간, 바람직하게는 1시간 내지 20시간이다. 전치반응기중의 반응시간은, 총반응시간의 20 내지 99%이고, 바람직하게는 40 내지 90%이고, 후속반응기에서의 반응시간은, 총 반응시간의 1 내지 80%, 바람직하게는 10 내지 60%이다.

촉매의 사용량은 반응조건, 촉매의 종류와 형태 등에 따라 다르나, 통상, 미생물균체의 건조중량으로 환산한 반응액에 의거해서 10 내지 50,000중량ppm, 바람직하게는 50 내지 30,000중량ppm이다.

아미드화반응은 통상 상압 또는 상압부근의 압력하에 행하나, 수성 매체중의 니트릴화합물의 용해성을 증가시키기 위해 승압하에 행해도 된다. 반응온도는, 수성 매체의 빙점이상인 한 특히 한정되지 않고, 바람직하게는 0 내지 50℃, 보다 바람직하게는 10 내지 40℃이다. 반응액중에서 생성물이 결정화된 슬러리상태에서 반응을 행해도 된다.

아미드화반응시의 반응액의 pH는, 니트릴히드라타제의 활성을 유지할 수 있는 한 특히 한정되지 않고, 바람직하게는 pH 6 내지 10, 보다 바람직하게는 pH 7 내지 9의 범위이다.

상기 예에 있어서, 니트릴히드라타제활성을 유지하는 아미노산치환체의 획득은, 부위특이적 변이에 의해 행한다. 그러나, 이 예에서 개시된 치환된 염기의 종류 및 변이점에 의거해서 부위특이적 변이이외의 다른 방법에 의해 편집된 플라스미드를 얻은 후, 숙주에 도입하는 방법에 의해 상기 예와 마찬가지의 결과를 얻는 것이 가능하다.

예를 들면, 이 예에서 개시된 변이점에 대응하는 영역에 있어서의 DNA의 염기서열이 아미노산의 치환후의 서열로 되는 염기서열을 지닌 DNA단편을, DNA합성기 등에 의해 합성하고, 얻어진 단편 및 해당 단편에 대응해서 분리된 pPT-DB1의 영역을 서로 치환함으로써, 목적으로 하는 편집된 플라스미드를 얻을 수 있다.

이하, 실시예를 참조해서 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다. 이하의 설명에 있어서, 반응액의 HPLC분석은, 컬럼으로서 울트론(ULTRON) 80HG(직경 50㎜×8㎜)를, 전개제로서 10mM 인산수용액을 이용해서 행하고, 아크릴아미드 및 아크릴로니트릴은, 220nm에서의 흡광도에 의해 검출하여 농도를 측정하였다.

실시예 1

(1) 니트릴히드라타제활성을 유지하는 아미노산치환체의 획득

α서브유닛상의 6번째 Leu을 Met으로 치환하기 위해, 주형으로서 일본국 공개특허 평 9-275978호 공보에 따라 얻어진 pPT-DB1 플라스미드 DNA를 이용하고, 타카라슈조사제품인 "LA PCR in vitro mutagenesis Kit"를 이용해서 부위특이적 변이도입을 행하였다. 이하, "LA PCR in vitro mutagenesis Kit"를 간단히 "키트"라 칭한다. 이하의 예는 기본적으로 상기 키트의 원리와 조작방법에 의거한 것이다.

30㎖시험관에 LB액체배지 10㎖를 넣고, 오토클레이브속에서 121℃에서 20분간 멸균하였다. 상기 배지에 암피실린을 첨가하여 최종 농도를 100㎍/㎖로 한 후, MT-10822균주를 1백금이 식균하고, 37℃, 300rpm에서 20시간 배양하였다. 적절한 원심관에 상기 배양액 1㎖를 분별한 후, 원심분리(15,000rpm, 5분)에 의해 균 체를 분리하였다. 이어서, 상기 균체로부터 알칼리 SDS추출법에 의해 pPT-DB1의 플라스미드 DNA를 제조하였다.

주형으로서 상기 pPT-DB1의 플라스미드 DNA 1㎍을 이용해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. 제 1 PCR반응은, 서열목록의 서열번호 1번에 기재된 프라이머 및 M13 프라이머 M4(서열목록의 서열번호 2번에 기재된 구성임)를 각각 50pmol 함유하는 총량 50㎕의 계(조성은 상기 키트에 기재된 조건에 따른 것임)에서 15초간의 열변성(98℃), 30초간의 어닐링(55℃) 및 120초간의 신장반응(72℃)을 25회 반복함으로써 행하였다. 제 2 PCR반응은, MUT4 프라이머(서열목록의 서열번호 3번에 기재된 구성임) 및 M13 프라이머 RV(서열목록의 서열번호 4번에 기재된 구성임)를 각각 50pmol 함유하는 총량 50㎕의 계(조성은 상기 키트에 기재된 조건에 따른 것임)에서 상기 제 1 PCR반응과 마찬가지 절차에 의해 행하였다. 아가로즈전기영동(아가로즈농도: 1.0중량%)에 의해 제 1 및 제 2 PCR반응의 반응종결액 각각 5㎕에 대해 DNA증폭물의 분석을 행하여, DNA증폭물의 존재를 확인하였다. 미크로콘 100(타카라슈조사 제품)을 이용해서 각각의 PCR반응종결액으로부터 과잉의 프라이머 및 dNTP를 제거한 후, 여기에 TE(트리스하이드록시메틸아미노메탄 EDTA완충액)를 첨가하여 각각 50㎕의 용액을 제조하였다. 상기 각 TE용액 0.5㎕를 함유하는 총량 47.5㎕의 어닐링용액(조성은 상기 키트에 기재된 조건에 따른 것임)을 제조하여, 10분간 열변성처리(98℃)를 행한 후, 일정속도로 60분에 걸쳐 37℃까지 냉각하고 나서, 37℃에서 15분간 유지하여, 어닐링처리를 행하였다. 이 어닐링처리액에 타카랄라 택(KAKARALA Taq) 0.5㎕를 첨가하고, 72℃에서 3분간 열처리하여 이형 이본쇄(heterodouble strand)를 완성하였다. 또, M13프라이머 M4(서열목록의 서열번호 2번에 기재된 구성임) 및 M13 프라이머 RV(서열목록의 서열번호 4번에 기재된 구성임)의 각각 50pmol을 첨가하여 총량을 50㎕로 한 후, 15초간의 열변성(98℃), 30초간의 어닐링(55℃) 및 120초간의 신장반응(72℃)을 25회 반복함으로써 제 3 PCR반응을 행하였다. 아가로즈전기영동(시그마알드리히 재팬사 제품인 저융점 아가로스형 VII, 아가로즈농도: 0.8중량부)에 의해 제 3 PCR반응의 반응종결액 5㎕에 대해 DNA증폭물의 분석을 행하여, DNA증폭물 약 2.0kbp의 존재를 확인하였다. 이어서, 상기 아가로즈겔로부터 약 2.0kbp의 DNA단편만을 절단하고, 해당 아가로즈단편(약 0.1g)을 미세하게 분쇄한 후, TE용액 1㎖에 현탁시키고, 55℃에서 1시간 유지하여 해당 아가로즈를 완전히 용융시켰다. 해당 용융액에 대해 통상의 절차에 따라 페놀/클로로포름추출 및 에탄올침전을 행하여 DNA단편을 정제하고, 최종적으로 TE 10㎕에 용해시켰다. 정제된 DNA단편 약 2.0kbp를 제한효소 EcoRI 및 HindIII에 의해 절단한 후, 해당 제한효소처리액에 대해 페놀/클로로포름추출 및 에탄올침전을 행하고, 최종적으로 TE 10㎕에 용해시켰다. 마찬가지로, pPT-DB1상의 단독 제한효소부위로서 EcoRI 및 HindIII에 의해 pPT-DB1을 절단하고, 아가로즈전기영동을 행하여(시그마알드리히 재팬사 제품인 저융점 아가로스형 VII, 아가로즈농도: 0.7중량부), 해당 아가로즈겔로부터 DNA단편 약 2.7kbp만을 절단하였다. 이와 같이 해서 아가로즈단편(약 0.1g)을 미세하게 분쇄하고 TE용액에 현탁시킨 후, 55℃에서 1시간 유지하여 해당 아가로즈를 완전히 용융시켰다. 해당 용융액에 대해 통상의 절차에 따라 페놀/클로로포름추출 및 에탄올침전을 행하여 DNA단편을 정제하고, 최종적으로 TE 10㎕에 용해시켰다. 이와 같이 해서 얻어진 증폭된 DNA생성물 및 pPT-DB1단편을, DNA결찰키트(타가라슈조사 제품)를 이용해서 결찰시킨 후, 대장균 HB101(토요보사 제품)의 컴피턴트(competent)세포를 형질전환시켜 대장균뱅크를 작성하였다.

30㎖ 시험관에, 황산 제 2철·7수화물 40㎍/㎖ 및 염화코발트·2수화물 10㎍/㎖를 함유하는 LB배지(이하, "활성발현배지"라 칭함) 10㎖를 넣고, 오토클레이브속에서 121℃에서 20분간 멸균하였다. 상기 배지에 암피실린을 첨가하여 최종 농도를 100㎍/㎖로 한 후, 상기 대장균뱅크에서 임의로 선택된 5종의 클론을 각각 1백금이(one platinum loop) 식균하고, 37℃, 300rpm에서 20시간 배양하였다. 적절한 원심관에 상기 배양액 1㎖를 분별한 후, 원심분리(15,000rpm, 5분)에 의해 균체를 분리하였다. 해당 균체를 인산칼륨완충액(pH 7.0) 200㎕에 현탁시키고, 여기에 아크릴로니트릴을 1중량% 첨가한 후, 10℃에서 2분간 반응시켰다. 이 반응액에 해당 반응액과 동일한 양의 1M 인산수용액을 첨가하고, 이와 같이 해서 얻어진 아크릴아미드의 농도를 상기한 바와 마찬가지의 HPLC분석에 의해 측정한 결과, 5종의 클론중 4종의 클론에서 아크릴아미드의 생성이 확인되어, 니트릴히드라타제활성이 유지되어 있는 것으로 확인되었다.

니트릴히드라타제활성의 측정을 실시한 상기 배지의 나머지부분 각 1㎖로부터 상기 4종의 클론의 균체를 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 작성하였다. 이어서, ABI사에서 제작한 오토시퀀서 373A 및 시퀀싱키트를 이용해서 각 클론의 니트릴히드라타제구성유전자의 염기서열을 구한 결과, 하기 표 1에 표시한 바와 같은 클론번호 1에 있어서, 니트릴히드라타제의 α서브유 닛상의 6번째 Leu이 Met으로 치환되어 있었다.

클론번호	변이점 (α서브유닛내)	아미노산서열의 변화		염기서열의 변화
클론번호	변이점 (α서브유닛내)	치환전	치환후	치환전	치환후
1	α-6번째	Leu	Met	CTG	ATG

이어서, α서브유닛상의 126번째 Phe을 Tyr으로 치환하기 위해, 상기와 마찬가지 절차에 의해, 주형으로서 클론번호 1의 플라스미드 DNA를 이용해서 부위특이적 변이도입을 행하였다.

즉, 30㎖시험관에 LB액체배지 10㎖를 넣고, 오토클레이브속에서 121℃에서 20분간 멸균하였다. 상기 배지에 암피실린을 첨가하여 최종 농도를 100㎍/㎖로 한 후, 클론번호 1균주를 1백금이 식균하고, 37℃, 300rpm에서 20시간 배양하였다. 적절한 원심관에 상기 배양액 1㎖를 분별한 후, 원심분리(15,000rpm, 5분)에 의해 균체를 분리하였다. 이어서, 상기 균체로부터 알칼리 SDS추출법에 의해 클론번호 1의 플라스미드 DNA를 제조하였다.

주형으로서 상기 클론번호 1균주의 플라스미드 DNA 1㎍을 이용해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. 제 4 PCR반응은, 서열목록의 서열번호 5번에 기재된 프라이머 및 M13 프라이머 M4(서열목록의 서열번호 2번에 기재된 구성임)를 각각 50pmol 함유하는 총량 50㎕의 계(조성은 상기 키트에 기재된 조건에 따른 것임)에서 15초간의 열변성(98℃), 30초간의 어닐링(55℃) 및 120초간의 신장반응(72℃)을 25회 반복함으로써 행하였다. 제 5 PCR반응은, MUT4 프라이머(서열목록의 서열번호 3번에 기재된 구성임) 및 M13 프라이머 RV(서열목록의 서열번호 4번에 기재된 구성임)를 각각 50pmol 함유하는 총량 50㎕의 계(조성은 상기 키트에 기재된 조건에 따른 것임)에서 상기 제 4 PCR반응과 마찬가지 절차에 의해 행하였다. 아가로즈전기영동(아가로즈농도: 1.0중량%)에 의해 제 4 및 제 5 PCR반응의 반응종결액 각각 5㎕에 대해 DNA증폭물의 분석을 행하여, DNA증폭물의 존재를 확인하였다. 클론번호 1의 경우와 마찬가지로 대장균뱅크를 작성하였다.

클론번호 1의 경우와 마찬가지의 활성발현배지 10㎖에 상기 대장균뱅크에서 임의로 선택된 5종의 클론을 각각 1백금이 식균하고, 37℃, 300rpm에서 20시간 배양하였다. 적절한 원심관에 상기 배양액 1㎖를 분별한 후, 니트릴히드라타제활성을 측정하였다. 그 결과, 5종의 클론중 4종의 클론에서 아크릴아미드의 생성이 확인되어, 니트릴히드라타제활성이 유지되어 있는 것으로 확인되었다.

니트릴히드라타제활성의 측정을 실시한 상기 배지의 나머지부분 각 1㎖로부터 상기 4종의 클론의 균체를 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 작성하였다. 이어서, 상기 클론번호 1의 경우와 마찬가지 절차에 의해, 각 클론의 니트릴히드라타제구성유전자의 염기서열을 구한 결과, 하기 표 2에 표시한 바와 같은 클론번호 2에 있어서, 니트릴히드라타제의 α서브유닛상의 6번째 Leu이 Met으로 치환되어 있었고, 또 α서브유닛상의 126번째 Phe이 Tyr으로 치환되어 있었다.

클론번호	변이점 (α서브유닛내)	아미노산서열의 변화		염기서열의 변화
클론번호	변이점 (α서브유닛내)	정상형	변이형	정상형	변이형
2	α-6번째 α-126번째	Leu Phe	Met Tyr	CTG TTC	ATG TAC

다음에, β서브유닛상의 212번째 Ser을 Tyr으로 치환하기 위해, 상기와 마찬가지 절차에 의해, 주형으로서 클론번호 2의 플라스미드 DNA를 이용해서 부위특이적 변이도입을 행하였다.

즉, 30㎖시험관에 LB액체배지 10㎖를 넣고, 오토클레이브속에서 121℃에서 20분간 멸균하였다. 상기 배지에 암피실린을 첨가하여 최종 농도를 100㎍/㎖로 한 후, 클론번호 2균주를 1백금이 식균하고, 37℃, 300rpm에서 20시간 배양하였다. 적절한 원심관에 상기 배양액 1㎖를 분별한 후, 원심분리(15,000rpm, 5분)에 의해 균체를 분리하였다. 이어서, 상기 균체로부터 알칼리 SDS추출법에 의해 클론번호 2의 플라스미드 DNA를 제조하였다.

주형으로서 상기 클론번호 2균주의 플라스미드 DNA 1㎍을 이용해서 2종류의 PCR반응을 행하였다. 제 6 PCR반응은, 서열목록의 서열번호 6번에 기재된 프라이머 및 M13 프라이머 M4(서열목록의 서열번호 2번에 기재된 구성임)를 각각 50pmol 함유하는 총량 50㎕의 계(조성은 상기 키트에 기재된 조건에 따른 것임)에서 15초간의 열변성(98℃), 30초간의 어닐링(55℃) 및 120초간의 신장반응(72℃)을 25회 반복함으로써 행하였다. 제 7 PCR반응은, MUT4 프라이머(서열목록의 서열번호 3번에 기재된 구성임) 및 M13 프라이머 RV(서열목록의 서열번호 4번에 기재된 구성임)를 각각 50pmol 함유하는 총량 50㎕의 계(조성은 상기 키트에 기재된 조건에 따른 것임)에서 상기 제 6 PCR반응과 마찬가지 절차에 의해 행하였다. 아가로즈전기영동(아가로즈농도: 1.0중량%)에 의해 제 6 및 제 7 PCR반응의 반응종결액 각각 5㎕에 대해 DNA증폭물의 분석을 행하여, DNA증폭물의 존재를 확인하였다. 클론번호 1의 경우와 마찬가지로 대장균뱅크를 작성하였다.

니트릴히드라타제활성의 측정을 실시한 상기 배지의 나머지부분 각 1㎖로부터 상기 4종의 클론의 균체를 분리하고, 알칼리 SDS추출법에 의해 각 클론의 플라스미드 DNA를 작성하였다. 이어서, 상기 클론번호 1의 경우와 마찬가지 절차에 의해, 각 클론의 니트릴히드라타제구성유전자의 염기서열을 구한 결과, 하기 표 3에 표시한 바와 같은 클론번호 3에 있어서, β서브유닛상의 212번째 Ser이 Tyr으로 치환되어 있었다.

클론번호	변이점	아미노산서열의 변화		염기서열의 변화
클론번호	변이점	정상형	변이형	정상형	변이형
3	α-6번째 α-126번째 β-212번째	Leu Phe Ser	Met Tyr Tyr	CTG TTC TCC	ATG TAC TAC

클론번호 3의 균체를 배양하여 반응에 필요한 균체를 얻었다. 전형적인 배양예를 하기에 표시한다.

배플이 부착된 500㎖ 삼각플라스크에 하기 조성물의 배지 100㎖를 넣고, 오토클레이브속에서 121℃에서 20분간 멸균하였다. 상기 배지에 암피실린을 첨가하여 최종 농도를 50㎍/㎖로 한 후, 클론번호 3의 균체를 1백금이 식균하고, 37℃, 130rpm에서 20시간 배양하였다. 원심분리(15,000G, 15분)에 의해 배양액으로부터 균체를 분리하고, 해당 균체를 50㎖의 생리식염수에 재현탁시킨 후, 재차 원심분리를 행함으로써 젖은 균체를 얻었다.

배지조성

효모엑스 5.0g/ℓ

폴리펩톤 10.0g/ℓ

NaCl 5.0g/ℓ

염화코발트·6수화물 10.0㎎/ℓ

황산 제 2철·7수화물 40.0㎎/ℓ

pH 7.5

(2) 아크릴로니트릴의 수화에 의한 아크릴아미드의 합성반응

상기 배양법에 의해 얻어진 젖은 균체 2중량부를 0.3mM-NaOH수용액 98중량부에 현탁시키고, 교반하 물 400g이 주입된 제 1반응기로서의 1ℓ유리제 플라스크에, 해당 현탁액 및 아크릴로니트릴을 연속적으로 각각 50g/h 및 30g/h 공급하는 한편, 반응액을 80g/h로 계속적으로 인출하여 액체레벨을 일정 레벨로 유지하였다. 이 용액을, 제 2반응기로서 내부직경이 5㎜인 20m의 테플론관에 공급하고, 반응온도는, 제 1반응기 및 제 2반응기를 10 내지 20℃정도의 수조에 침지하여 내부액체온도를 15℃로 조정하도록 제어하였다.

반응개시로부터 200시간후, HPLC분석에 의해 제 2반응기의 출구에서 반응액의 분석을 행한 결과, 해당 반응액중에는 아크릴아미드(농도: 50중량%)만이 존재하 였고, 아크릴로니트릴은 검출한계(100중량ppm)이하였다.

비교예 1

반응기로서 제 1반응기인 교반통만을 사용하고, 반응시간은 상기 실시예와 마찬가지로 해서 반응절차를 행하였다. 즉, 반응기를 2ℓ유리제 플라스크로 변경하고, 그 내부의 액체의 양을 800g으로 변경한 이외에는 상기 실시예와 마찬가지로 행하였다.

반응개시로부터 200시간후, HPLC분석에 의해 상기 반응기의 출구에서 반응액의 분석을 행한 결과, 해당 반응액중에는 아크릴아미드가 48중량%, 아크릴로니트릴이 1.9중량% 검출되었다. 그 결과, 본 비교예에서는 미반응의 아크릴로니트릴이 잔류하여, 반응이 불완전한 것으로 확인되었다.

비교예 2

제 1반응기와 마찬가지로 교반하 물 400g이 주입된 제 2반응기로서의 1ℓ유리제 플라스크에 제 1반응기의 출구에서의 반응액을 계속적으로 공급하는 한편, 반응액을 계속적으로 인출하여 액체레벨을 일정 레벨로 유지한 이외에는 실시예 1과 마찬가지 절차를 수행하였다.

반응개시로부터 200시간후, HPLC분석에 의해 제 2 반응기의 출구에서 반응액의 분석을 행한 결과, 해당 반응액중에는 아크릴아미드가 49.5중량%, 아크릴로니트릴이 3,000중량ppm 검출되었다. 그 결과, 본 비교예에서는 미반응의 아크릴로니트릴이 잔류하여, 반응이 불완전한 것으로 확인되었다.

본 발명에 의하면, 니트릴화합물을 고전화율로 수화함으로써, 잔존하는 니트릴화합물이 없는 고농도의 아미드화합물수용액을 제조할 수 있으며, 또, 비교적 단시간에 제조를 용이하게 행할 수 있으므로, 본 발명의 방법은 아미드화합물의 공업적인 제법으로서 적절하게 사용할 수 있다.

<110> Mitsui Chemicals, Inc. <120> Process for Producing Amide Compounds <150> PCT/JP2000-91203 <151> 2000-03-29 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:0ligonuclaeotide for PCR primer <400> 1 aacatcatgc gcaagtcg 18 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:0ligonuclaeotide for PCR primer <400> 2 caggaaacag ctatgac 17 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:0ligonuclaeotide for PCR primer <400> 3 ggccagtgcc tagcttacat 20 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:0ligonuclaeotide for PCR primer <400> 4 gttttcccag tcacgac 17 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:0ligonuclaeotide for PCR primer <400> 5 aactggtaca aggagccg 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:0ligonuclaeotide for PCR primer <400> 6 ccgaactaca gcgtctac 18

Claims

니트릴히드라타제를 함유하는 미생물균체 또는 해당 미생물균체의 처리물을 수성 매체중에서 니트릴화합물과 반응시켜 아미드화합물을 연속적으로 제조하는 방법에 있어서, 상기 균체 또는 해당 균체의 처리물을, 교반기를 구비한 통형 반응기를 이용해서, 수성 매체중에서 상기 니트릴화합물과 접촉시킨 후, 이와 같이 해서 얻어진 반응액을 플러그플로성의 유역을 지닌 조건하에 더욱 반응시키는 것을 특징으로 하는 아미드화합물의 연속 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 니트릴화합물이 아크릴로니트릴이고, 상기 균체 또는 해당 균체의 처리물과의 접촉시 물과 아크릴로니트릴의 비는 물 1.0중량부에 대해서 아크릴로니트릴 0. 4 내지 1.5중량부인 것을 특징으로 하는 아미드화합물의 연속 제조방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 미생물균체가, 임의의 숙주에서 해당 미생물로부터 클로닝된 니트릴히드라타제유전자를 발현시킴으로써 얻어진 형질전환체인 것을 특징으로 하는 아미드화합물의 연속 제조방법.