KR100539575B1

KR100539575B1 - 녹차 카테킨을 유효성분으로 하는 당뇨병성 신부전증 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100539575B1
Application number: KR10-2001-0087349A
Authority: KR
Inventors: 이순재; 양정아; 최정화; 김미지; 채영미; 이인구; 김관유; 곽오계
Original assignee: 이인구
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2001-12-28
Publication date: 2005-12-30
Also published as: KR20030056987A

Abstract

본 발명은 녹차의 주요성분인 카테킨을 유효성분으로 하는 당뇨병의 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 스트렙토조토신으로 유발된 당뇨병 흰쥐의 신장조직에서 신기능 및 심장조직에서의 항산화계에 대해 녹차의 주요성분인 카테킨이 신조직의 기능을 개선시켜 신부전증을 예방하는데 뛰어난 효과가 있으며, 심장조직에서 자유 라디칼의 생성계를 억제시키고 제거계인 항산화 방어효소의 활성을 증가시킴으로써 산화적 손상과 노화를 완화시키는데 뛰어난 효과가 있다.

Description

녹차 카테킨을 유효성분으로 하는 당뇨병성 신부전증 예방 및 치료용 조성물{The compound for preventing and treatmenting from disease related to renal insufficiecy in diabetes by using green tea catechins as effective component}

본 발명은 녹차의 주요성분인 카테킨을 유효성분으로 하는 당뇨병의 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 스트렙토조토신으로 유발된 당뇨쥐의 신장조직에서 신기능을 조절하며 심장조직에서 산화적 손상과 노화를 완화시키는 데 효과가 있는 녹차의 주요성분인 카테킨을 유효성분으로 하는 조성물에 관한 것이다.

당뇨병은 최근 인구의 고령화와 운동부족, 비만, 불건전한 식습관 등으로 특히 선진국과 개발도상국에서 급증세를 보이고 있다. 최근 우리나라에서도 당뇨병 환자의 발생이 증가하는 추세이며, 그에 동반된 합병증으로 나타나는 심혈관계 질환에 의한 사망률도 점차 증가하고 있다. 일반적으로 당뇨병 환자는 눈의 병변(retinopathy), 신경염(neuropathy) 및 신장 병변 (nephropathy)등의 3가지 병변(triopathy)을 동반하며 그외에도 여러 가지 대사성질환을 초래한다. 또한, 당뇨병 환자에서는 망막증, 신증과 같은 미소혈관증과 고혈압, 심근경색, 협심증, 뇌졸중, 뇌경색 및 동맥경화와 같은 대혈관성 장애등의 전신의 혈관장애 합병증을 발생시킨다. 이러한 혈관순환계 질환은 당뇨로 인한 사망의 약 75-80%의 비중을 차지하므로 그 문제가 매우 심각하며 이들 질환에서 혈전은 뇌졸증이나 심근 경색 및 신부전증 등의 심각한 합병증 유발의 원인이 될 수 있다.

동맥경화증을 비롯한 심혈관성 장애가 빈발하는 주된 요인의 하나로 당뇨병환자의 조직에서는 산화적 스트레스에 대한 감수성이 높고 자유 라디칼의 생성이 증가함으로써 지질과산화가 촉진된다는 보고가 있다. 자유 라디칼은 특히 불포화지방산을 포함한 여러 지질을 쉽게 산화시켜 지질과산화를 초래하고 결국 여러 세포막 구조의 기능을 상실케 하여 미토콘드리아의 산화성 인산화과정에 장애를 초래하거나 직접 심장 조직을 손상시킬 가능성이 있다고 보고되어 있다. 생물학적 반응으로 생성된 유리기를 제거시켜 생체를 보호하는 항산화제로서는 토코페놀(비타민 E), 베타카로틴(β-carotene), 비타민 C등이 알려져 있다. 그러나 여러 요인에 의해 이러한 항산화계와 같은 유리기 제거계와 생성계의 사이에 그 균형이 깨졌을 때 조직의 과산화적 손상이 초래된다. 따라서, 이러한 심장의 손상을 방지하거나 치료하기 위한 방법으로 자유 라디칼을 제거하는 항산화효소의 강화나 다양한 항산화 물질들의 공급이 실험적으로 시도되고 있다.

또한, 미세혈관성 장애로 발병되는 신부전을 비롯한 신장질환은 발생율이 높을뿐 아니라 일단 유발되면 이 질환의 진행을 막기 위한 어떠한 시도도 별로 효과적이지 못하다. 현재 당뇨 환자의 약 40∼50%가 신부전으로 사망하고 있다고 보고되고 있으나 그 심각성에 비해 이와 관련된 미세혈관성 병리기전과 관련된 영양학적 측면에서의 연구는 미흡한 상태이다. 신장은 대사적 노폐물인 비휘발성 물질을 배설시키므로, 사구체 여과율을 포함한 신장기능에서는 신(腎)혈류 조절이 중요하며, 프로스타글란딘에 의한 혈관확장과 레닌-안지오텐신계(renin-angiotensin system)과 함께 상호작용이 중요하다고 알려져 있다. 최근에 신장세포에서 합성된 아라키돈산(arachidonic acid)의 대사산물인 에이코사노이드(eicosanoid)들은 신혈류, 사구체여과율, 나트륨 배설, 레닌 분비, 뇨농축 등에 영향을 준다고 보고되어 있다. 정상적인 신장에서는 아라키돈산의 대사 부산물인 트롬복산 A₂(thromboxane A₂(TXA₂))생성과 프로스타글란딘 I₂(prostaglandin I₂(PGI₂; prostacyclin))생성이 정상적으로 조절되며 이들간의 균형은 생체내 항상성 유지에 중요한 역할을 하지만, 만성신장질환자에서는 이들의 균형이 깨지는데, 특히 PGI₂는 혈소판 응집을 저해하고 혈관을 확장시키며 TXA₂는 혈소판 응집을 촉진하고 혈관을 수축시키므로 PGI2는 사구체 여과율을 높이는 반면 TXA₂는 반대효과를 나타낸다고 알려져 있다. 따라서, PGI₂/TXA₂비에 균형이 깨뜨려지면 신미세혈관의 혈전생성, 동맥경화나 노화를 촉진시키게 되므로 이들의 균형을 개선시키는 것은 곧 신세동맥의 경화를 완화시키고 나아가 신혈류량과 사구체 여과율을 조절하여 신기능을 개선시키므로서 당뇨병성 신부전증을 예방하는데 기여한다고 볼 수 있다.

한편, 녹차중의 주요성분인 폴리페놀성 화합물인 카테킨은 혈청 콜레스테롤 저하 효과, 항산화작용, 항고혈압작용과 혈소판 응집능 억제 가능성 등의 여러 가지 약리작용이 있음이 보고되고 있다. 사람의 정맥혈을 이용하여 각종 차추출액의 혈소판 응집억제작용을 보고한 木和子의 보고와 또 녹차 카테킨의 혈소판 응집 및 혈전 억제에 관한 시험관내(in vitro)에서의 연구는 다소 보고되고 있으나 생체내(in vivo)에서 이를 연구한 사례는 매우 미흡한 실정이며 더욱이 그 메카니즘에 대한 구체적인 연구 보고는 없는 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은 스트렙토조토신 유발 당뇨쥐에서 당뇨병과 관련된 심혈관계의 질환을 예방 및 치료함에 있어 항산화 기능과 항혈소판 응집능이 우수하다고 알려져 있는 녹차 카테킨(catechin)을 유효성분으로 하는 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 녹차 카테킨의 항산화적 효과를 생체내에서 규명하고자 함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 실험쥐에 녹차의 카테킨을 농도에 따라 공급하여 사육하고 스트렙토조토신을 실험쥐에 투여하여 당뇨를 유발한 다음 상기 실험군과 정상군으로부터 장기를 적출한 후 적출된 신장조직에서 대사적 조절 및 아라키돈산의 cascade계를 관찰하며 적출된 심장조직에서 산화적 손상 및 항산화계 효소의 활성을 측정함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 설명한다.

본 발명은 실험쥐에 녹차의 카테킨을 공급하여 사육하는 단계; 스트렙토조토신을 실험쥐에 투여하여 당뇨를 유발하는 단계; 사육된 실험군과 정상군의 장기를 적출하는 단계; 적출된 신장조직에서 대사적 조절 및 아라키돈산의 cascade계 관찰 및 적출된 심장조직에서 산화적 손상 및 항산화계 효소의 활성을 측정하는 단계로 구성된다.

녹차의 카테킨을 유효성분으로 하는 당뇨병의 심혈관계 질환 예방 및 치료용 조성물과 약제학적으로 허용되는 담체를 혼합하여 약학 조성물을 제조할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 항미제등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 경구투여용 제제 또는 비경구투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 본 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구투여하거나 경구투여할 수 있으며, 하루에 체중 1kg당 녹차의 카테킨은 0.005 내지 0.02g을 투여할 수 있으며, 바람직하게는 0.012g를 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1 : 당뇨쥐의 신장조직의 대사 기능에 대한 카테킨의 효과

스트렙토조토신 유발 당뇨쥐로부터 적출한 신장조직의 대사적 기능 및 신장세포에서 합성되는 아라키돈산의 대사산물들의 조절을 알아보기 위하여, 하기의 방법에 따라 실험하였다.

실험동물의 사육 및 당뇨유발

식이용 카테킨의 제조

식이용 catechin은 Matzuzaki와 Hata의 방법으로 조제하였다.

실험동물의 사육

실험동물은 체중 100 g 내외의 Sprague-Dawley종 숫컷을 구입하여 실험에 사용하였다. 실험 동물은 실험동물의 관리와 이용에 대한 대구효성가톨릭 대학교의 기준에 따라 본 연구를 행하였다. 환경에 적응시키기 위해 일주일간 예비사육한 후, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 표 1과 같이 정상군과 실험군을 나눈 후, 실험군을 식이내 녹차 카테킨의 공급 수준에 따라 카테킨을 공급하지 않은 군 (DM-0C), 카테킨을 0.25g/kg diet (DM-0.25C) 공급한 군, 카테킨을 0.5g/kg diet (DM-0.5C) 공급한 군 등 각 10마리씩 4군으로 나누어 4주간 사육하였다. 실험기간중 식이는 매일 일정 시간에 공급하여 자유로이 섭취케 했으며 기본 실험 식이조성은 표 2와 같다. 사육실의 온도는 22±1℃ 였고, 습도는 50±10% 였다. 본 실험은 STZ 투여후 6일만에 사육을 종료하였다.

실험군의 분류

군	(%/kg diet)	스트렙토조토신^a(55 mg/kg B.W.)
정상DM-0CDM-0.25CDM-0.5C	000.25%(2.5g/kg diet)0.5%(5g/kgdiet)	-+++

a: 시트레이트 완충액(pH 4.3)에 녹인 스트렙토조토신(55 mg/kg B.W.)을 정맥주사1)

정상군: 정상 식이후 스트렙토조토신을 주사하지 않음

DM-0C 군: 식이내에 카테킨을 공급하지않고 식이후 스트렙토조토신 주사

DM-0.25C 군: 카테킨 0.25% (2.5g /kg diet) 공급후 스트렙토조토신 주사

DM-0.5C 군: 카테킨 0.5% (5g /kg diet ) 공급후 스트렙토조토신 주사

기본 실험 식이 조성표

성분	양(g/kg diet)
옥수수 전분카제인DL-메티오닌옥수수 기름혼합염종합비타민셀룰로우즈	668180250401050
Kcal/kg	3850

당뇨 유발

실험동물은 일주일의 예비사육과 식이내 카테킨의 농도에 따른 식이를 4주간 공급한 후 실험동물에 스트렙토조토신(streptozotocin (STZ)), 55 mg/kg B.W.을 신선한 0.1 M 소디윰 시트레이트 완충액(pH 4.3)에 녹여서 꼬리 정맥을 통하여 주사하여 당뇨를 유발시켰으며 STZ 주사 후 6일째에 혈당농도가 300 mg/dl 이상인 동물만 희생하여 본 실험에 사용하였다.

사구체 분리

신장조직중의 사구체 분리는 Spiro 의 방법에 따라 신장의 캡슐 부분을 벗긴 후 신우 부분을 면도칼로 잘라내어 길이로 절단하여 잘게 세절하였다. 80 mesh, 100mesh, 170 mesh의 순서로 체를 통과시키면서 셀라인으로 씻어낸 후 1400-1500 rpm으로 10분간 원심분리하여 펠렛층에 셀라인 1 ㎖을 넣어 부유한 후 -80℃에 보관하였다.

뇨의 분석

미세알부민 측정

STZ 유발 당뇨쥐에서 희생전 6일간 매일 24시간 동안의 뇨를 수집하였고 DPC RIA kit(U.S.A)를 사용하여 1분간 γ-카운터로 뇨중 미세알부민을 측정하였다.

β ₂ -미세글로불린 측정

STZ 유발 당뇨쥐에서 희생전 6일간 매일 24시간 동안의 뇨를 수집하여 DSL-6200 RIA kit(U.S.A)를 사용하여 1분간 γ-카운터로 뇨중 β₂-미세글로불린을 측정하였다.

사구체 여과율 측정

혈청과 뇨의 크레아티닌 측정은 시크디아 크레아틴 리에이전츠 키트(sicdia creatinine reagent kit)를 이용하였다. 혈청과 뇨의 크레아티닌 값으로부터 GFR을 구하였다.

즉, 뇨 크레아틴 ×1 min 간 뇨량

GFR = --------------------------------

혈청 크레아틴 농도

도 1에 나타난 바와 같이, 사구체 여과율(GFR)의 변화는 신장의 대사기능을 알아보는데 기준이 되므로 당뇨유발 후사구체 여과율을 측정한 결과, 정상군에 비해 당뇨군에서는 당뇨 유발 1일째는 큰 차이가 없었으나 3일째부터는 정상군에 비해 DM-0C군에서는 크게 증가하기 시작하여 6일째에는 291.7% 상승하였다. 그러나 식이중 카테킨을 공급한 군인 DM-0.25C군 및 DM-0.5C군에서는 전 실험기간동안 정상군 수준을 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 신세뇨관 손상의 지표가 되는 β₂- 미세글로불린의 함량을 조사한 결과, 당뇨유발 후 1일째부터 유의적으로 증가하였고 6일째에는 정상군에 비해 DM-0C 군 및 DM-0.25C군 은 각각 3.47배, 1.15배 증가하였으며 DM-0.5C 군은 정상수준을 유지하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 신장 사구체의 손상을 관찰하기 위하여 뇨중 미세알부민의 함량을 기간별로 관찰한 결과 당뇨유발 1일째부터 유의적으로 증가하였으며 3일째부터 급격히 증가하기 시작하여 6일째에는 정상군에 비해 DM-0C군은 5.4배 증가되었고 DM-0.25C 군 및 DM-0.5C군은 각각 4.02배 3.87배씩 증가되어 카테킨 공급수준이 증가함에 따라 감소되었다.

실시예 2 : 당뇨쥐의 신장조직에서 아라키돈산 cascade 계에 대한 카테킨의 효과

트롬복산 A₂, 프로스타글란딘 I₂등의 에이코사노이드 생성량은 아라키돈산 cascade의 전단계의 율속효소인 포스포리파아제 A₂(phospholipase A₂(PLA₂))활성과 그 생성물인 지방산조성에 달려있다고 보고되고 있고, 혈소판 및 신장조직에서의 PLA₂활성은 TBARS농도에 의존되므로 하기의 방법에 따라 포스포리파아제 A₂활성 및 아라키돈산의 대사산물들에 대한 카테킨의 효과를 측정하였다.

실험예 1 : 포스포리파아제 A ₂ 활성의 측정

신장조직 채취

실험 종료 후 실험 동물을 가벼운 에테르 마취하에서 신장조직을 적출하여 생리 식염수로 씻어내고 무게를 측정한 후 액체 질소로 급속 동결시켜 -80℃에 보관하였다.

시료의 전처리

신장조직의 마이크로좀 분획은 0.25 M 슈크로우즈 5 ml로 약 1 g의 신장조직을 균질화 시킨 후 8,000 ×g 에서 4분간 원심분리 하였다. 상기 결과로 얻은 상층액을 다시 105,000 ×g 에서 1시간 원심분리하여 상층액인 시토졸 분획과 하층액인 마이크로좀 분획을 분리하였다. 다시 펠렛층에 0.25 M 슈크로우즈를 3 ml 넣어 105,000 ×g 에서 60분간 원심분리한 후 펠렛을 0.25 M 슈크로우즈 4 ml로 부유시킨 후 1 ml 씩 나누어 -80℃에서 보관하였다가 실험에 사용하였다.

신장 마이크로좀에서의 포스포리파아제 A ₂ 의 활성 측정

기질로는 1-팔-2-[1-¹⁴C] 리놀레오일 PE(1-pal-2-〔1-¹⁴C〕linoleoyl PE)를 사용하였고 유리된 리놀레산을 측정하는 Dole과 Meinertz 방법을 사용하였다.

효소로는 분리해 놓은 마이크로좀을 1 mg protein/ml로 희석한 것 20 ㎕를 사용하며 0.05 M Tris-HCl (pH 7.0) 20 ㎕, 40 mM CaCl₂10㎕, 기질은 1-팔-2-[1-¹⁴C] 리놀레오일 PE(1000 cpm/nmol) 20 nmol, 증류수 30 ㎕를 넣은 후 37℃에서 20분간 반응시켰다. 여기에 Dole시약 (N-H₂SO₂1 ml + 이소프로파놀 39 ml + N-헵탄 4 ml) 560 ㎕와 증류수 110 ㎕를 넣고 1분간 교반한 후 3,000 rpm에서 원심분리하여 얻어진 상층액 150 ㎕를 헵탄 0.8 ml에 넣는다. 1분간 교반한 후, 3분간 원심분리하여 얻어진 상층액 0.8 ml를 톨루엔계 칵테일 솔루션 0.5 ml에 넣은 후 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)에서 유리된 리놀레산을 측정하였다.

스트렙토조토신 유도성 당뇨쥐에서 마이크로좀의 포스포리파아제 A₂활성에 대한 녹차 카테킨 공급의 효과

군	포스포리파아제 A₂(dpm/mg 단백질)
정상	971±85
DM-OC	1590±198
DM-0.25C	1097±68
DM-0.5C	986±42

표 3에 나타난 바와 같이, 포스포리파아제 A₂의 활성은 정상군에 비해 DM-OC군에서 63% 증가되었고, 카테킨 투여군인 DM-0.25C군과 DM-0.5C군은 모두 정상군 수준을 나타내었다. 따라서, 실험쥐의 사육중 공급된 카테킨이 포스포리파아제 A₂의 활성을 저해시키는 것을 알 수 있다.

실험예 2 : 신장조직의 인지질 분자종의 가수분해에 대한 녹차 카테킨의 효과 측정

생체막이 자유 라디칼 생성계에 노출되었을 때 내인성 리조포스포리피드

(lysophospholipid)의 수준이 증가되므로 당뇨쥐의 신장조직의 인지질 분자종의 가수분해율을 하기의 방법에 따라 조사하였다.

신장 마이크로좀에서의 인지질 분자종 측정

신장 마이크로좀을 5 mg protein/ml로 희석한 것 1 ml를 시료로 하여 클로로포름 1.2 ml와 메탄올 2.4 ml를 넣은 후 격렬하게 교반하였다. 여기에 클로로포름 1.2 ml와 증류수 1.4ml를 넣어 격렬하게 교반한 후 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 이때 하층액을 취하고, 상층액에 클로로포름 2.4 ml를 넣어 교반하여 얻은 하층액을 합하여 유기용매를 질소가스로 날린 후 지질막을 형성하였다. Marinetti 방법으로 지질막에 200 ㎕ 클로로포름을 넣은 후 여기에 20 ㎕를 취한 것을 시료로 하고, 3 mM KH₂PO₄를 표준액으로 하며 온침액(digestion reagent (60% HClO₄: c-H₂SO₄= 1:1)) 0.35 ml를 넣은 후 황색에서 무색, 무색에서 다시 황색으로 변할때까지 태웠다. 실온에서 식힌 후 증류수 0.25 ml, 암모니움몰리브데이트 2 ml, 환원제〔1-아미노-2-나프톨-4-술폰산 1 g을 유발에서 혼화시킨 후, 15% 황산나트륨 100 ml와 섞은 후 여과함〕 0.1 ml를 넣어 95℃에서 10분간 가열시켰다. 다시 실온에서 식힌 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였다.

인지질 분자종의 분리

인지질의 분리는 2차원 TLC로 분리하며, 1차 전개용매로는 클로로포름: 메탄올: 아세트산 = 65 : 25 : 10을 사용하였다. TLC 플레이트는 MERCK사의 5721번 (20 cm×20 cm, 실리카겔 60, 형광유도체 없음)을 사용하였고 I2 로 발색시킨 후 다시 닌히드린으로 발색하였다. TLC 플레이트상에 나타난 인지질 분자종은 각각 긁어내어 전술한 방법으로 인정량하였다. 인지질 분자종 중 포스파티딜콜린(PC), 리조포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 리조포스파티딜에탄올아민

(Lyso PE)의 인정량 값을 이용하여 PC와 PE의 가수분해율을 구하였다.

lyso PC

PC 가수분해율(%) = ×100

lyso PC + PC

lyso PE

PE 가수분해율(%) = ×100

lyso PE + PE

녹차 카테킨의 농도별 공급에 따른 스트렙토조토신 유도성 당뇨쥐의 신장조직에서 마이크로좀의 포스파티딜콜린과 포스파티딜에탄올아민 가수분해의 변화

군	PC 가수분해(%)	PE 가수분해(%)
정상	6.43±0.63	6.88±0.84
DM-OC	8.41±0.81	16.75±1.79
DM-0.25C	8.17±0.91	11.91±1.27
DM-0.5C	8.30±0.85	12.04±1.63

표 4에 나타난 바와 같이, 신장 마이크로좀에서의 PC와 PE 가수분해율의 변화는 정상군에 비해 당뇨유발군 모두에서 증가하였으나 유의적인 차이는 없었다. 신장 마이크로좀에서의 포스파티딜에탄올아민 (PE) 가수분해율(표 4)은 정상군에 비해 DM-0C군, DM-0.25C군, DM-0.5C군에서 115%, 41% 및 55%씩 각각 증가하여 녹차 카테킨의 공급수준에 따라 PE 가수분해가 저하되는 것으로 나타났다. 따라서, 카테킨은 신장 마이크로좀에서의 PC 가수분해에는 영향이 없었으나 PE 가수분해는 감소시키는 것을 알 수 있었다.

실험예 3 :신장 마이크로좀에서의 트롬복산 A ₂ (TXA ₂ ) 생성 측정

아라키돈산의 대사산물중에서 신장기능 혹은 신장질환과 관련이 있는 것으로, 혈관수축을 자극하고 혈소판 응집을 촉진하여 혈전생성을 야기시킨다고 알려진 트롬복산 A₂에 대한 녹차 카테킨의 효과를 알아보기 위하여 하기의 방법을 실시하였다.

신장 마이크로좀의 TXA₂생성량은 아머샴사로부터 구입한 TXB₂용 RIA kit 를 사용하여 측정하였다. 미리 조제해 놓은 반응 상등액은 인산염으로 완충된 살린 겔로 희석하여 이 희석액 100㎕에 〔¹²⁵I〕- TXB₂에 100 ㎕와 항혈청 100 ㎕를 가하여 잘 혼합하고, 4℃ 콜드 챔버(cold chamber) 내에서 16시간 방치하여 반응액 중의 TXB₂와 〔¹²⁵I〕- TXB₂가 항혈청과 결합하도록 하였다. 냉욕상에 반응액을 방치하면서, 여기에 잘 흔들어 균질화시킨 Amerlex-M second antibody 용액 500 ㎕를 가해 잘 섞은 후, 냉욕상에서 10분간 방치하므로서 유리 상태의 trace를 첨가한〔¹²⁵I〕-TXB2와 시료 중의 TXB2가 항체와 경쟁적으로 결합하게 하였다. 그 다음 4℃에서 10분간 1,500×g로 원심분리한 후 상층액을 버리고 펠렛층에 결합된 상태로 〔¹²⁵I〕-TXB₂를 감마 카운터로 측정하였다. 시료 중의 TXB2의 농도는 표준곡선으로 부터 얻었다.

실험예 4 : 신장 마이크로좀에서의 프로스타글란딘 (PGI ₂ ) 생성 측정

아라키돈산의 대사산물중에서 신장기능 혹은 신장질환과 관련이 있는 것으로, 혈관을 확장시키고 혈소판 응집을 저해한다고 알려진 프로스타글란딘에 대한 녹차 카테킨의 효과를 알아보기 위하여 하기의 방법을 실시하였다.

PGI₂는 반감기가 매우 짧으므로 생리적으로 안정된 PGI₂를 대사물질인 6-케토 프로스타글란딘 F_1α를 측정하여 PGI₂생성량을 대신하며 아머샴사의 RIA kit를 사용하여 측정하였다. 즉, 미리 조제해 놓은 반응 상등액은 인산염으로 완충된 살린 겔로 희석하여 이 희석액 100 ㎕에〔¹²⁵I〕- PGI₂에 100 ㎕와 항혈청 100 ㎕를 가하여 잘 혼합하고, 4℃ 저온실 내에서 16시간 방치하여 반응액 중의 PGI2와〔¹²⁵I〕-PGI₂가 항혈청과 결합하도록 하였다. 냉욕상에 반응액을 방치하면서, 여기에 잘 흔들어 균질화시킨 Amerlex-M second antibody 용액 500 ㎕를 가해 잘 섞은 후, 냉욕상에서 10분간 방치하므로서 극소량 첨가한 유리형〔¹²⁵I〕-PGI₂와 시료중의 PGI₂가 항체와 경쟁적으로 결합하게 한다. 4℃에서 10분간 1,500×g로 원심분리한 후 상층액을 버리고 펠렛층에 결합된 상태로 〔¹²⁵I〕-PGI₂를 감마 카운터로 측정하였다. 시료중의 PGI₂의 농도는 표준곡선으로 부터 얻었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 신장의 마이크로좀에서의 트롬복산 A₂(TXA₂)의 함량을 조사한 결과 정상군에 비해 DM-0C군과 DM-0.25C군에서는 각각 159%, 143%의 유의적인 (P<0.05)증가를 보였으나 식이내 0.5% 의 카테킨을 공급한 DM-0.5C군에서는 정상군의 수준을 보였다. 대동맥에서 생성되는 항혈소판 응집물질인 PGI₂함량 (도 4)은 정상군에 비해 DM-0C군에서 44% 감소하였으나 DM-0.25C군과 DM-0.5C군에서는 모두 정상군 수준으로 감소하였다. 또한, PGI₂/TXA₂비는 정상군에 비해 DM-0C군과 DM-0.25C군에서 각각 67%, 44% 감소하였으나 DM-0.5C군에서는 정상군 수준으로 증가하였다. 이와같이 녹차 카테킨은 신장 마이크로좀에서의 PGI₂/TXA₂비를 정상화시켰다.

실험예 5: TBARS 정량

생체조직의 과산화적 손상의 지표로서 알려진 과산화지질의 정량은 티오바비튜린산(thiobarbituric acid(TBA))과 반응하는 물질을 n-부탄올로 추출하는 Satoh의 방법을 이용하였다.

* 통계처리

모든 실험 결과에 대한 통계처리는 각 실험군별로 평균차이가 있는가를 검증하기 위하여 분산분석 (ANOVA 검증)을 수행하였으며, 분산분석의 결과 유의성이 발견된 경우 식이군간의 유의도는 Tukey's-HSD test 86)에 의해 분석하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 생체조직의 과산화적 손상의 지표로 알려진 신장 마이크로좀에서의 TBARS 함량은 정상군에 비해 DM-0C군, DM-0.25C군에서 각각 162%, 128%씩 증가하였고, 카테킨을 0.5% 공급한 DM-0.5C군은 정상군 수준으로 감소하였다.

상기의 실시예 1와 실시예 2을 종합해보면, 녹차의 카테킨은 산화적 스트레스가 높은 당뇨 신장조직 마이크로좀에서 지질과산화물의 농도를 저하시키고 포스포리파아제 A₂활성과 PE 가수분해를 감소시켰다. 또한, 녹차 카테킨은 당뇨쥐의 신장 마이크로좀에서 트롬복산 A₂합성을 감소시키고 프로스타글란딘 I₂합성을 증가시켜 PGI₂/TXA₂비를 증가시킴으로써 당뇨병성 신장 혈관장애를 개선시키는 기능이 뚜렷하다고 사료된다. 또한, 사구체 여과율을 조절함으로써 당뇨병성 신혈류 장애를 개선시킬뿐 아니라 미세알부민, 미세글로부린 같은 신기능 손상의 지표를 개선시킴으로써 당뇨병에서의 신기능적 손상예방에 크게 기여함을 알 수 있었다.

실시예 3 : 당뇨쥐의 심장조직에서 산화적 손상 및 항산화계 효소의 활성에 대한 카테킨의 효과

식이용 카테킨의 제조

실험에 사용된 식이용 카테킨은 T 회사에 의뢰하여 Matzuzaki와 Hata의 방법에 따라 정제하지 않은 카테킨 분말을 조제하여 사용하였다.

녹차의 정제하지 않은 카테킨 함량

카테킨/100㎍ power	EGC	EC	EGCG	ECG	Total
카테킨/100㎍ power	24.2㎍	7.0㎍	45.38㎍	10.92㎍	87.5㎍

EGC: 에피갈로 카테킨 EC: 에피카테킨

EGCG: 에피갈로 카테킨 갈레이트 ECG: 에피카테킨 갈레이트

실험동물 및 사육

실험동물은 실험동물은 체중 100 g 내외의 Sprague-Dawley종 숫컷을 구입하여 실험에 사용하였다. 환경에 적응시키기 위해 일주일간 예비사육한 후, 난괴법에 의해 당뇨를 유발하지 않은 정상군과 당뇨 실험군으로 나눈 후 실험군을 다시 식이내 카테킨의 공급수준에 따라 나누었다. 식이내에 카테킨을 공급하지 않은 군 (DM-0C), 카테킨을 0.5g/kg diet (DM-0.5C) 공급한 군, 카테킨을 1.0g/kg diet (DM-1.0C) 공급한 군 등 각 10마리씩 4군으로 나누어 4주간 사육하였다. 실험기간중 식이는 매일 일정 시간에 공급하여 자유로이 섭취케 했으며 기본 실험 식이조성은 표 2와 같다. 사육실의 온도는 22±1℃ 였고, 습도는 50±10% 였다. 본 실험은 STZ 투여후 6일만에 사육을 종료하였다.

당뇨유발

실시예 1과 동일한 방법으로 하였다.

시료채취

실험동물은 실험 종료후 12시간 절식시켜 가벼운 에테르 마취하에서 심장을 절제하고 0.9% NaCl로 씻어내고 무게를 측정한 후 액체 질소로 급속 동결시켜 -80℃에 보관하였다.

단백질 정량

각 시료의 단백질량은 표준품으로 보바인 시럼 알부민을 사용하였고 각 효소의 단백질 정량은 Lowry 등의 방법을 이용하여 정량하였다.

실험예 1 : 산화적 손상의 관찰

TBARS 함량의 측정

실시예 2의 실험예 5의 방법과 동일하게 실시하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 생체조직의 과산화적 손상의 지표로서 성인병 및 발암의 요인물질로 알려진 지질과산화물을 측정한 결과 정상군에 비해 당뇨군은 73% 증가하였고 카테킨을 투여한 DM-0.5C군과 DM-1.0C군은 정상군 수준으로 회복되었다.

리포푹신 함량 측정

생체내에서 말론디알데히드와 단백질 성분이 결합하여 생성되는 것으로 알려진 소모성 노화색소인 리포푹신의 측정은 Fletcher 등의 방법에 따라 측정하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 생체노화의 중요한 지표로 사용되고 있는 리포푹신의 생성에 미치는 카테킨의 효과를 조사한 결과 식이중 카테킨 투여량이 증가할 수 록 심장조직의 리포푹신의 생성량이 현저히 감소됨을 알 수 있었다. 즉, 정상군에 비해 당뇨군은 73% 증가하였고 카테킨을 공급한 DM-0.5C군과 DM-1.0C군은 정상군 수준으로 되었다.

실험예 2 : 항산화계 효소 활성 측정

분석시료의 전처리

심장조직을 일정량을 취하여 Potter-Elvejhem homogenizer를 사용하여 0.25M 슈크로우즈/0.5mM EDTA/5mM HEPES 용액으로써 10%(w/v) 마쇄액을 만들었다. 마쇄액의 일부를 8,000 x g 에서 20분간 원심분리하여 그 상층액을 과산화지질 정량에 사용하였고 나며지는 10,000 x g에서 30분간 원심분리하여 그 상층액 중 일정량을 취해 0.4 배 량의 에탄올:클로로포름 냉혼합액(5:3)을 가하고 진탕한 다음 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(Superoxide dismutase, SOD)는 10,000 x g에서 30분간 크산틴 옥시다아제(xanthin oxidase, XOD), 글루타티온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase, GSHPx)는 105,000 x g에서 30분간 원심분리하여 얻은 상층액을 사용하였다.

크산틴 옥시다아제의 활성 측정

심장조직의 크산틴 옥시다아제 활성도 측정은 크산틴을 기질로 하여 30℃에서 100분간 반응시켜 생성된 유릭산(uric acid)을 파장 292nm에서 흡광도를 측정하는 Stipe and Della Corte의 방법을 이용하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 정상군에 비해 당뇨군은 그 활성이 51% 증가하였고 카테킨 투여군인 DM-0.5C군과 DM-1.0C군은 정상군과 비슷한 수준이었다.

수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 활성 측정

생체내의 항산화 방어기구중에서 효소적 방어계의 하나로 O₂·를 환원하여 H₂O₂로 전환시킴으로써 산소독으로부터 생체를 보호하는 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 활성은 알칼리 상태에서 피로갈롤의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Marklund and Marklund의 방법에 따라 측정하였다.

표 5에 나타난 바와 같이, 정상군에 비해 DM-OC군과 DM-0.5C군은 각각 61%, 39% 감소하였고 카테킨 투여군인 DM-0.5C군과 DM-1.0C군을 카테킨 비투여 당뇨군인 DM-0C군에 비교했을 때 각각 67%, 135% 정도 증가하였다.

글루타티온 퍼옥시다아제 활성 측정

항산화 효소로써 체내에서 H₂O₂를 H₂O로 무독화시킴으로써 과산화적 손상을 방지하는 글루타티온 퍼옥시다아제의 활성은 산화형 글루타티온이 글루타티온 리덕타아제와 NADPH에 의해 환원될 때 NADPH의 흡광도가 340nm에서 감소하는 것을 이용한 Lawerence 과 Burk의 방법에 따라 측정하였다.

표 5에 나타난 바와 같이, 정상군에 비해 당뇨군은 10% 저하되었고 카테킨 투여군인 DM-0.5C군과 DM-1.0C군에서는 정상군 수준이었다.

스트렙토조토신 유발 당뇨쥐에서 심장조직의 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 및 글루타티온 퍼옥시다아제의 활성에 대한 녹차 카테킨의 효과

군	SOD 활성	GSHpx 활성
군	nmol/mg protein	nmol NADPH/mg protein/min
정상DM-0CDM-0.5CDM-1.0C	1.518±0.2040.594±0.0920.932±0.0681.395±0.272	141.04±4.783127.97±4.699136.52±8.390144.69±4.271

상기 실시예의 결과 스트렙토조토신 유발 당뇨군인 DM-OC군이 정상군에 비해 XOD 활성이 51%정도 증가하였으나 카테킨을 투여한 DM-0.5C군과 DM-1.0C군은 정상군과 비슷한 수준이었다. 따라서 스트렙토조토신 유발 당뇨쥐에서 XOD 활성이 증가되므로 이때 수퍼옥사이드 라디칼 생성이 증가되어 지질과산화가 촉진되는 것으로 생각되며 이러한 결과로 미루어 보아 XOD 활성 증가가 산화적 손상의 요인중 하나로 작용했다고 볼 수 있으며 카테킨 투여는 XOD 활성을 저해하는 효과가 있음을 알 수 있었다. 한편, 생체대사 과정중에 생기는 자유 라디칼의 축적을 방지하기 위해서는 여러 종류의 산화 방어 작용이 있으며 주로 SOD, GSHpx 등이 이러한 역할을 담당한다. 상기 실시예 결과 심장조직내에서 SOD 활성은 정상군에 비해 당뇨군은 활성이 저하되었으나 카테킨을 공급한 군에서는 정상군 수준이었으며, GSHpx 활성 역시 정상군에 비해 당뇨군은 20% 저하되었으나 카테킨을 처리한 군에서는 정상군 수준이었다. 상기의 결과로 보아 녹차의 카테킨은 당뇨쥐 심장조직에서의 자유라디칼 생성계를 억제시키고 제거계인 항산화 방어효소의 활성을 증가시킴으로써 산화적 손상과 노화를 완화시켰다.

이상과 같이 본 발명은 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 녹차 카테킨은 스트렙토조토신 유발 당뇨쥐의 사구체 여과율을 조절함으로써 당뇨병성 신혈류 장애를 개선시킬뿐 아니라 미세알부민, 미세글로부린 같은 신기능 손상의 지표를 개선시킴으로써 당뇨병에서의 신기능적 손상의 예방에 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 당뇨쥐 심장조직에서의 자유라디칼 생성계를 억제시키고 제거계인 항산화 방어효소의 활성을 증가시킴으로써 산화적 손상과 노화를 완화시키는 데 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 당뇨쥐의 심혈관계 질환을 예방하고 치료하는데 있어 녹차 카테킨을 유효성분으로 하는 우수한 기능성제품을 제공할 수 있어 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 스트렙토조토신 유발성 당뇨쥐의 사구체 여과율(GFR)에 대한 카테킨의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 스트렙토조토신 유발성 당뇨쥐에서 β₂-미세글로불린에 대한 카테킨의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 3은 스트렙토조토신 유발성 당뇨쥐에서 미세알부민에 대한 카테킨의 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 4는 스트렙토조토신 유발 당뇨쥐(STZ-induced diabetic rats)의 신장에서 마이크로좀의 트롬복산 A₂(A), 프로스타사이클린 합성(B) 및 PGI₂/TXA₂ 비(C)에 대한 녹차 카테킨의 공급 효과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 스트렙토조토신 유발 당뇨쥐의 신장에서 마이크로좀의 TBARS 함량에 대한 녹차 카테킨의 공급 효과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 스트렙토조토신 유발 당뇨쥐의 심장조직에서 TBARS 함량에 대한 녹차 카테킨의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 스트렙토조토신 유발 당뇨쥐의 심장조직에서 리포푹신 함량에 대한 녹차 카테킨의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 스트렙토조토신 유발 당뇨쥐의 심장조직에서 크산틴 옥시다아제 활성에 대한 녹차 카테킨의 효과를 나타낸 그래프이다.

Claims

삭제
녹차 카테킨을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 당뇨병성 신부전증 예방 및 치료용 조성물.