KR20210115164A

KR20210115164A - 폰시린을 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방, 치료 또는 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20210115164A
Application number: KR1020200030550A
Authority: KR
Inventors: 장문석; 박성규
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2020-03-12
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2021-09-27
Also published as: KR20220063143A; KR20230062525A

Abstract

본 발명은 폰시린을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 폰시린을 포함하는 조성물은 α-글루코시다아제, HRAR 및 RLAR을 억제하고, AGE 형성을 억제하며, 인슐린 신호 경로를 활성화시키고, 인슐린 감수성을 개선시키는 효과가 있어, 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 유용할 수 있다.

Description

폰시린을 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방, 치료 또는 개선용 조성물{Composition for preventing, treating or improving of diabetes or diabetic complications comprising poncirin}

본 발명은 폰시린을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

당뇨병(Diabetes mellitus, DM)은 인간의 건강과 삶의 질을 심각하게 위협하는 만성 대사 질환이다. 당뇨병 환자의 수는 지난 20년 동안 전 세계적으로 급격히 증가했다. 이러한 사례의 대부분은 제2형 당뇨병(type 2 diabetes mellitus, T2DM)과 관련이 있으며, 생활 방식이 바뀌기 때문에 발병 연령도 더 젊어지고 있다. T2DM은 인슐린 분비 결핍, 인슐린 작용 또는 둘 다로 인한 고혈당 수치를 특징으로 한다. 현재 T2DM은 전 세계적으로 확산되는 보급률과 만성 당뇨병 합병증과 관련된 높은 이환율과 사망률로 인해 건강 문제를 주도하고 있다. 또한, 지속적인 고혈당증은 신경 병증, 백내장, 망막 병증, 신장 병증, 배아 병증, 죽상 동맥 경화증 및 상처의 치유 지연과 같은 장기 당뇨병 합병증의 원인이된다.

현재 알려져 있는 당뇨병의 치료법으로는 a) 탄수화물의 소화 및 흡수를 지연시키는 α-글루코시다아제 억제제, b) 인슐린 요법과 함께 인슐린 수용체 인산화를 조절하는 단백질 티로신 포스파타아제 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B) 억제제, 및 c) 고혈당을 감소시키고 정상 혈당을 유지하기 위한 폴리올 및 최종당화산물(advanced glycation end-product, AGE) 형성 경로의 조절 등이 제안되고 있다.

당뇨병의 병리 생리학에 대한 현재의 이해에 기초하여, 혈당 조절을 개선하고 질병 진행을 늦추기 위해, 인슐린 및 그의 유사체, 티아졸리딘디온, 설포닐우레아 유도체, 디펩티딜 펩티다제 4 (dipeptidyl peptidase 4, DPP-4), 비구아나이드, 글루카곤 유사 펩티드 1 (glucagon-like peptide 1, GLP-1) 작용제, 나트륨-글루코스 공동 수송체 2 (sodium-glucose cotransporter 2, SGL-2), PTP1B 및 α-글루코시다아제 억제제가 개발되었다. 이러한 강력한 합성 및 반합성 항당뇨병 약물의 확인에도 불구하고 아직 임상에 도달하지 못했기 때문에, 이들 분자는 여전히 생체 내 효능이 약하고, 경구 생체 이용률이 약하고, 막 투과성이 약하고, 선택성이 약하며, 수많은 부작용이있다. 따라서 이러한 대사 장애를 관리하는 데 사용할 수 있는 안전성과 효능이 더 우수한 새로운 억제제가 필요하다.

알도스 환원효소(Aldose reductase)는 폴리올 경로에서 첫 번째 속도 결정 효소이며 NADPH의 NADP⁺로의 전환으로 수반되는 포도당의 소르비톨로의 환원을 촉진한다. 소르비톨은 소르비톨 탈수소 효소에 의한 NAD+의 환원과 함께 과당으로 전환된다. 고혈당증 동안, 폴리올 대사 경로가 활성화되고 폴리올 경로를 통한 포도당의 증가된 플럭스는 소르비톨의 축적을 유발하는데, 이는 주로 렌즈, 신장, 망막 및 말초 신경과 같은 포도당의 인슐린 비의존적 흡수를 나타내는 조직에서 발생한다. 과도한 소르비톨로 인해 렌즈는 물을 흡수하여 삼투성 불균형, 나트륨 증가 및 칼륨 수치 감소 및 글루타치온 수치 감소로 백내장 형성을 유발한다. 따라서, 알도스 환원효소의 억제는 저혈당 위험없이 DM에서 2차 합병증을 제어하는데에 중요한 전략을 구성 할 것이다.

식후 고혈당증은 DM 및 그와 관련된 합병증의 발달에 중요한 역할을 한다. 고혈당증과 당뇨병을 예방하는 가장 효과적인 방법은 혈액의 포도당 수준을 조절하는 것이다. 혈액 내 당은 탄수화물의 가수분해에서 비롯되며 소화 효소, 예를 들어 α-글루코시다아제(α-glucosidase)에 의해 촉매된다. 포유 동물 α-글루코시다아제 (EC 3.2.1.20)는 소장 세포의 브러시 경계면 막에있는 가수분해 효소 패밀리를 포함한다. α-글루코시다아제 억제제는 글루코시다아제 활성을 경쟁적으로 차단함으로써 소화 과정 및 탄수화물의 흡수를 늦춘다. 결과적으로 식후 혈당의 최고 농도가 감소하고 혈당 수준이 조절된다. 아카르보스(acarbose) 및 보글리보스(voglibose)와 같은 천연 공급원으로부터 얻은 몇가지 α-글루코시다아제 억제제는 음식 섭취 후 혈당 수준을 효과적으로 제어하며 임상적으로 DM을 치료하는 데 사용되었다. 소수의 α-글루코시다아제 억제제만이 시판되고 있으나, 임상적으로 심각한 위장 부작용과 관련이 있음이 보고되었다. 따라서 부작용없이 α-글루코시다아제 억제 활성을 나타내는 대안 개발이 필요하다.

PTP1B는 주요 비막 통과 단백질 티로신 포스파타아제(protein tyrosine phosphatase)이며 비인슐린-의존성 DM에서 중요한 인자이다. PTP1B는 소포체의 세포질면에 위치하며 골격근, 간 및 지방과 같은 고전적인 인슐린 표적 조직을 포함하여 편재적으로 발현된다. 생화학적, 유전적, 약리학적 연구로부터의 증거는 인슐린과 렙틴 신호 전달 모두에서 음성 조절 인자로서 PTP1B의 역할을 지지한다. PTP1B는 활성화된 인슐린 수용체 또는 인슐린 수용체 (IR) 기질과 결합 및 탈인산화 할 수 있다. PTP1B 유전자 녹아웃이 있는 마우스는 고지방식이를 먹었을 때도 인슐린 감수성이 향상되고 체중이 감소된다. 따라서 이 효소의 과잉 생산이 T2DM의 발병에 연루되어 있다는 것은 놀라운 일이 아니며, PTP1B의 억제제는 T2DM의 예방 및 치료에 유용할 수 있고, 유망한 인슐린 감수성 약물 표적일 수 있다.

T2DM의 특징인 인슐린 저항성은 인슐린 수용체 (IR)의 자동 인산화 및 티로신 키나아제 활성의 불균형에 기인한다. 골격근의 인슐린 저항성은 T2DM의 발병 기전에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 체내에서 골격근은 포도당을 섭취하고 인슐린 자극으로 인한 식후 포도당 섭취 및 소비의 약 80%를 완료하는 주요 대상 기관이다. 인슐린 표적으로서, 근육 세포는 에너지 균형, 소비 및 저장의 중요한 부위이다. 따라서, 골격근에서 인슐린 저항성을 향상시키는 것은 당뇨병 약물 개발에 효과적인 전략이다.

포스파티딜 이노시톨-3-키나아제/인산화 단백질 키나아제 B (Phosphatidyl inositol-3-kinase/phosphorylated protein kinase B, PI3K/Akt) 경로는 인슐린의 대사 효과에 관여하는 가장 중요한 신호 경로 중 하나이다. 신호 전달 캐스케이드는 인슐린이 표적 세포의 막 수용체와 연결될 때 트리거된다. 활성화된 인슐린 수용체에 의해 인산화된 인슐린 수용체 기질-1 (insulin receptor substrate 1, IRS-1)은 PI3K 및 Akt 활성화를 유발한다. 이어서 Akt는 GSK3β(glycogen synthasekinase-3β)를 인산화하여 포도당 수송을 촉진할 수 있다. 또한, 포도당 대사에서 속도 제한 단계인 포도당 흡수는 인슐린 신호 전달 경로에 의해 골격근 세포에서 자극되는 것으로 나타났다. 인슐린 신호는 인슐린 IRS-1/PI3-키나아제/Akt 경로를 통해 활성화되고 세포 내 풀에서 원형질막으로 포도당 수송체 유형 4 (glucose transporter type 4, GLUT-4) 전좌를 촉진한다. GLUT4는 최고 수준의 인슐린 자극 포도당 섭취를 통해 골격근 세포에서 매우 높은 수준으로 발현된다. 따라서, GLUT4 및 PI3K의 하류는 포도당 섭취 및 글리코겐 대사를 조절하는데 중요한 단백질이다. 더욱이, IRS-1의 활성이 부족하면 PI3K의 인산화가 감소되어 골격근 세포내 GLUT4 발현이 감소하여 인슐린 저항성이 발생한다. T2DM 동안, 골격근의 인슐린에 대한 감수성이 감소될뿐만 아니라 GLUT4의 발현이 감소하여 결과적으로 포도당 섭취 및 이용이 감소되고 혈당 수준이 상승한다.

AGE는 단백질, 핵산 또는 지질상의 당 및 아민 잔기의 환원 사이의 비효소 반응을 통해 형성된 복잡한 분자 그룹이다. 이 반응은 종종 집합적으로 AGE로 지칭되는 불완전하게 특성화된 이종 생성물을 초래하는 복잡한 재배열, 응축, 산화 변형 및 단편화를 개시한다. 다양한 유형의 조직에 AGE가 축적되면 단백질이 변경되어 특성, 물리 화학적 및 생화학적 특성이 변화한다. 고혈당으로 인한 AGE 과잉 생산은 노화과정 뿐만 아니라 당뇨병 합병증, 알츠하이머 병, 결합 조직 질환 및 말기 신장 질환을 포함한 노화 관련 장애의 발병에서 주요한 역할을 한다. 또한 AGE와 AGE 수용체 (receptor of AGE, RAGE)의 상호 작용은 산화 스트레스를 일으켜 혈관 염증과 혈전증을 유발한다. 또 다른 연구는 AGE에 의해 형성된 반응성 산소 종 (ROS)이 DNA 손상과 세포아폽토시스 유도를 유발한다는 것을 보여주었다. 따라서, 최근 당뇨 합병증을 완화시키기 위해 항당화를 사용하는 많은 연구가 이루어지고 있다. 혈액 순환에서 발견되는 가장 일반적인 환원당인 포도당과 과당은 AGE에 단백질의 아미노기와 자발적으로 반응한다. 포도당은 AGE 형성에 중요한 역할을 하지만 과당은 포도당보다 훨씬 빠르게 단백질 당화를 겪는 것으로 알려져있다.

Nε-(카르복시메틸)라이신 ((Nε-carboxymethyl) lysine, CML)은 비형광성 AGE로, 아모도리(Amodori) 생성물의 산화성 분해로부터 발생하는 AGE 형성의 지표이거나 글리옥살, 메틸글리옥살 및 3-데옥시글루코손과 같은 α-옥소알데하이드에 의해 매개되는 폴리올 경로에서 생성된다. 또한, CML은 Amadori 생성물의 하이드 록실 라디칼에 의해 매개되는 산화 분해에 의해, 및 단백질의 존재하에 다중 불포화 지방산의 금속 촉매 산화 동안 형성되는 인간에서 가장 화학적으로 특성화된 AGE 중 하나이다. 제2형 당뇨병 환자의 망막 혈관에서 CML은 다른 AGE와 함께 발견되었다. 또한, 당뇨병 환자의 말초 신경에서 높은 수준의 CML이 보고되었으며, 이는 미세 혈관 병증 및 신경 병증을 유발한다. 따라서, CML 생성을 감소시킬 수 있거나 CML을 포함하는 손상 경로를 방해 할 수있는 화합물은 망막 병증 및 신경 병증 둘 다의 발달 또는 진행을 감소시킬 가능성을 가질 수 있다.

당화의 초기 단계에서, 단백질의 유리 아미노기와 환원당의 카르보닐기 사이의 친핵성 첨가 반응은 자유 가역적 쉬프 염기를 생성한 다음 프럭토사민(fructosamin)과 같은 보다 안정적인 케토아민 아마도리(Amadori) 생성물로 변한다. 프럭토사민은 임상적으로 당뇨병 환자의 혈당을 단기적으로 조절하기 위한 지표로 사용된다. 또한, 과당류 형성은 신장 병증, 신경 병증 및 망막 병증과 같은 당뇨병의 합병증을 증가시킨다. 따라서, 과당류의 감소는 혈관 합병증을 지연시키는 치료 방법이다.

당화 과정 동안 카르보닐 단백질의 형성 및 단백질 티올의 손실은 단백질 산화의 지표이다. 메틸글리옥살 (methylglyoxal), 글리옥살알데하이드 (glyoxalaldehyde) 및 3-데옥시글루코손 (3-deoxyglucosone)과 같은 다른 반응성 카보닐 화합물은 세포 내 또는 세포 외 단백질의 아미노기와 반응하여 AGE를 형성 할 수 있다. 시스테인 잔기의 변형에 의한 카르보닐 함량의 증가 및 유리 티올기의 손실은 BSA의 단백질 산화를 직접 반영하는 것으로 보고되었다. 과산화수소와 같은 당화 및 당 산화 동안 생성된 ROS는 단백질에서 아미노산 잔기의 측쇄를 산화시켜 카보닐 유도체를 형성하고 티올기를 감소시켜 단백질의 산화 방어를 감소시켜 세포 단백질의 손상을 초래할 수 있다. 반응성 카르보닐종의 축적은 DM에서 산화 스트레스, 세포 자멸사 및 혈관 손상을 유발한다.

일반적으로 단백질 당화는 폴리펩티드, 특히 아밀로이드 교차-β 구조(amyloid cross-β structure)의 구조적 변화에 영향을 미치는 중요한 중요한 요소이다. 불용성 응집체는 아밀로이드 교차-β 구조를 형성하여 단백질 구조 및 안정성을 변화시킬 수 있다. 아밀로이드 교차-β는 알츠하이머 병과 같은 당화 관련 질환이 있는 환자의 뇌에 퇴적된 소섬유로 축적되는 단백질의 응집된 구조이다. 또한, 췌장의 β-아밀로이드 침착물은 제2형 당뇨병 환자의 췌장 β-세포에서의 병리학적 병변인 것으로 밝혀졌고, 조직에서 아밀로이드 교차-β 구조의 장기 축적은 췌장 섬 아밀로이드증의 진행을 유발할 수 있으며, 이는 β-세포를 직접 파괴하고 인슐린 분비를 손상시킨다.

한편, 이소사쿠라네틴(isosakuranetin)의 7-O-네오헤스페리도사이드 (7-O-neohesperidoside)인 폰시린 (Poncirin)은 많은 감귤류의 종에 풍부하게 존재하는 플라바논 글리코사이드이다. 폰시린은 주로 Poncirus trifoliata의 식용 감귤류에서 고농도로 발견되었다. 폰시린이 잠재적 위 질환, 항염증제 특성, 항알츠하이머병, 박테리아 또는 바이러스 감염 및 스트레스에 대한 방어 및 보호 효과, 중간엽 줄기 세포에서의 조골 세포 분화 촉진, 항암 효과 및 항-H. pylori 효과와 같은 여러가지 활성을 가지고 있음이 약리학적 연구 및 임상 실험을 통해 입증되었다. 마우스 또는 래트에서 경구투여 된 폰시린은 장 미생물총에 의해 폰시레틴(pnciretin)으로 대사된다. 폰시린의 잠재적인 건강상의 이점이 많이 보고되었지만, 현재까지 항당뇨병 가능성에 관한 연구는 없다.

이에, 본 발명자들은 PTP1B, α-글루코시다아제, 랫트 렌즈 알도스 환원효소 (rat lens aldose reductase, RLAR), 인간 재조합 알도스 환원효소 (human recombinant aldose reductase, HRAR) 및 AGE 억제 분석을 통해 폰시린의 항당뇨병 가능성을 조사하였으며, 폰시린의 포도당 흡수 자극 효과 및 인슐린 저항성 C2C12 세포에서 인슐린 신호 전달 경로의 활성화 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2014-0025914호

본 발명의 목적은 폰시린(poncirin), 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 폰시린(poncirin), 이의 이성질체, 유도체, 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 및 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 폰시린(poncirin), 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 PTP1B 효소 활성 억제를 통한 인슐린 감수성 증진제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 폰시린(poncirin), 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 폰시린(poncirin), 이의 이성질체, 유도체, 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 및 건강식품 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 폰시린(poncirin), 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 PTP1B 효소 활성 억제를 통한 인슐린 감수성 증진제를 제공한다.

본 발명의 폰시린은 α-글루코시다아제, HRAR 및 RLAR을 억제하고, AGE 형성을 억제하며, 인슐린 신호 경로를 활성화시키고, 인슐린 감수성을 개선시키는 효과가 있어, 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 유용할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 폰시린은 PTP1B 특정 부위에 결합하여 포도당 섭취를 자극하고 PTP1B 발현을 감소시킬 수 있으며, IRS-1, PI3K, GSK3β 및 Akt의 인산화를 증가시키고 인슐린 저항성 C2C12 근육 세포에서 GLUT4의 발현 수준을 향상시켜 인슐린 감수성을 개선시키는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 폰시린은 형광성 AGE 및 비형광성 AGE, 예를 들어 CML 및 프럭토사민 수준의 형성을 효과적으로 억제할 수 있고, 단백질 카르보닐기의 형성을 감소 및 단백질 티올기의 변형을 억제함으로써 당화 단백질 산화를 억제할 수 있으며, BSA에서 아밀로이드 교차-β 구조의 형성을 억제할 수 있다.

나아가, 폰시린은 α-글루코시다아제의 억제를 통해 고혈당증을 제어하고, PTP1B 억제를 통해 인슐린 신호 전달 경로를 활성화시키고, AR 및 AGE 관련 경로의 억제를 통해 당뇨병 관련 합병증을 개선시키는데 유용할 수 있다.

도 1은 폰시린에 의한 PTP1B, α-글루코시다아제, RLAR 및 HRAR 억제에 대한 효소 동역학적 플롯을 나타낸 것이다; (a) 폰시린에 의한 PTP1B 억제에 대한 Lineweaver-Burk 플롯: 폰시린 0μM (Δ), 2.0μM (▼), 10μM (○) 및 50μM (●)), (b) 폰시린에 의한 PTP1B 억제에 대한 Dixon 플롯: pNPP 2.0mM (●), 1.0mM (○) 및 0.5mM (▼), (c) 폰시린에 의한 α-글루코시다아제 억제에 대한 Lineweaver-Burk 플롯: 폰시린 0μM (■), 7.81μM (Δ), 15.62μM (▼), 31.25μM (○) 및 62.5μM (●), (d) 폰시린에 의한 α-글루코시다아제 억제에 대한 Dixon 플롯: pNPG 2.5mM (●), 1.25mM (○) 및 0.625mM (▼), (e) 폰시린에 의한 RLAR 억제에 대한 Lineweaver-Burk 플롯: 폰시린 0μM (Δ), 5.0μM (▼), 10μM (○) 및 20μM (●), (f) 폰시린에 의한 RLAR 억제에 대한 Dixon 플롯: DL-글리세르 알데하이드 25mM (●), 50mM (○) 및 100mM (▼), (g) 폰시린에 의한 HRAR 억제에 대한 Lineweaver-Burk 플롯: 폰시린 0μM (Δ), 0.2μM (▼), 1.0μM (○) 및 5.0μM (●), 및 (h) 폰시린에 의한 HRAR 억제에 대한 Dixon 플롯: DL-글리세르알데하이드 0.005 M (●), 0.01 M (○) 및 0.02 M (▼).
도 2는 단백질 티로신 포스파타아제 1B (1NNY)의 활성 부위 내 화합물 23 (a) 및 폰시린 (b); 및 α-글루코시다아제 (3A4A)의 활성 부위 내의 α-D-글루코스 (c), 아카르보스 (d) 및 폰시린 (e);의 공-결정(co-crystalline) 리간드의 3D 결합 포즈 및 인간 알도스 환원효소 (1IEI)의 활성 부위 내에서 제나레스타트 (f) 및 폰시린 (g); 및 인간 알도스 환원효소 (3RX2)의 활성 부위 내 술린닥 (h), 퀘르세틴 (i) 및 폰 시린 (j);의 동족 리간드의 3D 상호 작용 포즈를 나타낸 것이다.
도 3은 (a) 폰시린의 화학구조; (b) 폰시린이 C2C12세포 생존력에 미치는 영향을 평가하기 위해 MTT 분석을 통해 세포 생존율을 확인한 결과; (c) 폰시린이 인슐린 저항성 C2C12 세포에서 포도당 섭취에 미치는 영향을 평가하기 위해 인슐린-자극 된 2-NBDG 흡수를 측정한 결과; (d) 폰시린이 인슐린 저항성 C2C12 세포에서 PTP1B 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해 PTP1B 대 β-액틴(β-actin)의 상대 밀도를 측정한 결과; 및 (e) β-액틴 수준에 대해 PTP1B 단백질 밴드 강도를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 폰시린이 인슐린 저항성 C2C12 세포에서 총 및 인산화된 IRS-1, Akt, PI3K, GSK-3 및 GLUT-4의 수준에 미치는 영향을 평가하기 위해 웨스턴 블랏팅으로 각 단백질 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 폰시린과 아미노구아니딘 (AG)이 BSA-포도당-과당 시스템에서 형광성 AGE 형성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 6은 도 5는 폰시린과 아미노구아니딘 (AG)이 BSA-포도당-과당 시스템에서 프럭토사민 형성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 7은 폰시린과 아미노구아니딘 (AG)이 BSA-포도당-과당 시스템에서 (Nε-카르복시메틸)라이신 (CML) 형성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 8은 도 5는 폰시린과 아미노구아니딘 (AG)이 BSA-포도당-과당 시스템에서 단백질 카르보닐 함량에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 9는 폰시린과 아미노구아니딘 (AG)이 BSA-포도당-과당 시스템에서 티올 형성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 10은 폰시린과 아미노구아니딘 (AG)이 BSA-포도당-과당 시스템에서 아밀로이드 교차-β 구조 형성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물

본 발명은 폰시린(poncirin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 당뇨병은 인슐린 저항성 당뇨병인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 당뇨병 또는 당뇨병 합병증은 α-글루코시다아제(α-glucosidase), 단백질 티로신 포스파타아제(PTP), 랫트 렌즈 알도스 환원효소 (RLAR) 및 인간 재조합 알도스 환원효소 (HRAR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소 관련 경로 의존성 당뇨병 또는 당뇨병 합병증인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 α-글루코시다아제 억제 효과를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 단백질 티로신 포스파타아제 1B(PTP1B) 억제 활성을 통해 인슐린 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 인슐린 저항성을 개선시키는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 단백질 티로신 포스파타아제 1B(PTP1B) 억제 활성을 통해 포도당 흡수를 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 알도스 환원효소 (aldose reductase) 및 최종당화산물(advanced glycation end-product) 억제 효과를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 당화 단백질 산화를 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 폰시린은 PTP1B, α-글루코시다아제, RLAR 및 HRAR을 억제하고, AGE 형성을 억제하는 활성을 가지며, 효소 동역학적으로 PTP1B 및 RLAR은 혼합형 억제, α-글루코시다아제 및 HRAR은 경쟁형 억제를 나타내는 것일 수 있다(실험예 1 내지 2 참조).

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 폰시린은 경쟁력있는 α-글루코시다아제 억제제로서, α-글루코시다아제-폰시린 억제제 복합체는 음의 결합 자유 에너지 및 효소의 촉매 포켓 내에서 안정한 입체 구조를 나타낼 수 있다(실험예 3 참조). α-글루코시다아제의 억제를 통해 고혈당증을 제어하는 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 폰시린은 PTP1B의 활성 포켓 내에서 음의 결합 자유 에너지를 갖는 다수의 수소 결합을 나타낼 수 있으며, 이에 따라 PTP1B 단백질 내부에서 이를 안정화시키고 억제하는 우수한 효과를 나타낼 수 있다(실험예 3 참조).

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 폰시린은 인슐린 저항성 C2C12 세포에 의한 인슐린 자극 2-NBDG 흡수를 현저하게 향상시키는 효과 및 PTP1B 발현을 감소시키는 효과가 있고, 이를 통해 근육세포에서 포도당 섭취 신호 전달 경로에 관여하는 것일 수 있다(실험예 4 참조).

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 폰시린은 인슐린 저항성 C2C12 근육 세포에서 p-IRS-1 발현(Tyr-895) 수준을 증가 및 다운 스트림 PI3K/Akt/GSK-3β신호 전달 경로를 활성화시켜 IRS-1, PI3K, GSK3β및 Akt의 인산화를 증가시키며, 이에 따라 포도당 흡수를 자극 및 IRS-1/PI3K/Akt 및 GSK3β신호 경로 활성화를 통한 GLUT4 활성화 효과를 나타냄으로써 인슐린 감수성을 향상시킬 수 있다(실험예 5 참조).

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 폰시린은 당화 BSA에서 AGE 형성을 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 폰시린은 당화 BSA에서 프럭토사민 억제 활성을 통해 당뇨병 혈관 합병증을 감소시키는 효과를 나타낼 수 있고, CML의 형성을 억제함으로써 미세 혈관 병증 및 신경 병증 억제하는 효과를 나타낼 수 있으며, 단백질 카르보닐기 형성 억제 및 티올기 손실 억제를 통해 고혈당으로 인한 단백질 산화적 손상 예방, 세포 자멸사 및 혈관 손상 억제 효과를 나타낼 수 있고, 아밀로이드 교차-β 구조 형성 억제를 통해 쇠약성 퇴행성 질환 발생을 억제하는 효과를 나타낼 수 있다(실험예 6 참조).

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 당뇨 합병증은 당뇨성 신경병증, 당뇨성 망막증, 백내장, 당뇨성 신증, 신부전증, 성기능 장애, 피부질환, 고혈압, 동맥 경화증, 뇌졸증, 뇌경색, 심장병, 배아 병증, 괴저 및 상처의 치유 지연으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것일 수 있다.

상기 용어 "이성질체(isomer)"는 분자식은 같지만 분재 내에 있는 구성 원자의 연결 방식이나 공간 배열이 동일하지 않은 화합물을 말한다. 이성질체는 예를 들면, 구조 이성질체(structural isomers), 및 입체 이성질체(stereoisomer)를 포함한다. 상기 입체이성질체는 부분입체 이성질체(diasteromer) 또는 거울상 이성질체(enantiomer)일 수 있다. 거울상이성질체는 왼손과 오른손의 관계처럼 그 거울상과 겹쳐지지 않는 이성질체를 말하고, 광학 이성질체(optical isomer)라고도 한다. 거울상 이성질체는 키랄 중심 탄소에 4개 이상의 치환기가 서로 다른 경우 R(Rectus: 시계방향) 및 S(sinister: 반시계 방향)로 구분한다. 부분입체이성질체는 거울상 관계가 아닌 입체 이성질체를 말하고, 원자의 공간 배열이 달라 생기 시스(cis)-트랜스(trans) 이성질체로 나뉠 수 있다.

상기 용어 "유도체(derivative)"는 상기 화합물의 구조 일부를 다른 원자나 원자단으로 치환하여 얻어지는 화합물을 말한다.

상기 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란 표현은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 폰시린의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 폰시린의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 폰시린을 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은 염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

나아가, 본 발명은 상기 폰시린 및 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 이성질체, 광학 이성질체 등을 모두 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폰시린은 지실(Poncirus trifoliata의 과실)로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 시중에서 구입한 것을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폰시린은 지실에서 추출된 추출물 또는 분획물 대비 현저히 더 우수한 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 경구 투여용, 근육내 투여용, 정맥내 투여용, 복강내 투여용, 피하 투여용, 피내 투여용, 또는 국소 투여용으로 제제화되는 것일 수 있다.

본 발명의 폰시린, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제, 또는 희석제는 예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 폰시린, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염은 조성물 전체 중량 대비 0.001 내지 99.9 중량% 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 폰시린, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001~100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01~35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07~7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7~2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 치료 활성을 갖는 공지의 유효성분을 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.

당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 건강식품 조성물

본 발명은 폰시린(poncirin), 이의 이성질체, 유도체, 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캡슐제, 환제, 액제, 분말 및 과립 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품 유래 성분을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 치료제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

또한, 본 발명은 폰시린(poncirin), 이의 이성질체, 유도체, 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 건강기능식품 조성물 또는 건강식품 조성물에 있어서, 상기 당뇨병은 인슐린 저항성 당뇨병인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 건강기능식품 조성물 또는 건강식품 조성물에 있어서, 상기 당뇨병 또는 당뇨병 합병증은 α-글루코시다아제(α-glucosidase), 단백질 티로신 포스파타아제(PTP), 랫트 렌즈 알도스 환원효소 (RLAR) 및 인간 재조합 알도스 환원효소 (HRAR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소 관련 경로 의존성 당뇨병 또는 당뇨병 합병증인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 건강기능식품 조성물 또는 건강식품 조성물은 항당뇨병 또는 항당뇨병 합병증 활성을 통해 관련 질환을 예방 또는 개선시키기 위한 목적으로 상기 폰시린, 이의 이성질체, 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 식품, 음료 등의 건강기능식품 또는 건강식품에 첨가할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명에 따른 폰시린, 이의 이성질체, 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품 및 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강식품 및 건강기능식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 폰시린, 이의 이성질체, 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 및 건강기능식품 중의 상기 폰시린, 이의 이성질체, 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강식품 및 건강기능식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명에 따른 폰시린, 이의 이성질체, 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능성 식품 조성물 100 g당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명에 따른 폰시린, 이의 이성질체, 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 함유하는 건강식품 및 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품 및 건강기능식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 유효물질을 함유하는 건강식품 및 건강기능식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

PTP1B 효소 활성 억제를 통한 인슐린 감수성 증진제

본 발명은 폰시린(poncirin), 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 PTP1B 효소 활성 억제를 통한 인슐린 감수성 증진제를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 폰시린이 PTP1B 효소 활성부위를 불활성화시킴으로서 PTP1B 억제제로서 기능할 수 있으므로, 이러한 폰시린, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인슐린 감수성 증진제로서 유용하게 사용될 수 있다.

즉, 폰시린, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물이 PTP1B 활성을 억제하는 경우, 세포 내 인슐린 신호가 증가되게 되므로, 인슐린 저항성을 개선하여 인슐린 감수성을 증진시킬 수 있다. 따라서 상기 조성물은 높은 혈중 글루코오스 농도와 관련된 질환, 인슐린 저항성을 보이는 제2형 당뇨병 및 당뇨-관련 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

특히 본 발명의 인슐린 감수성 증진제를 인슐린과 함께 병용 사용하는 경우, 더욱 높은 효과를 기대할 수 있다.

이하 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

<준비예> 시료 및 화합물 준비와 통계분석

p-니트로페닐 포스페이트 (p-nitrophenyl phosphate, pNPP), p- 니트로페닐 α-D-글루코피라노사이드 (p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside, pNPG), 효모 α-글루코시다아제 (yeast α-glucosidase), 아카르보스 (acarbose), 우르솔릭산 (ursolic acid, >90% 순도), 폰시린 (poncirin, >98% 순도), 퀘르세틴 (quercetin, >95% 순도), 로지글리타존 (rosiglitazone, >98% 순도), 소 췌장의 인슐린 (insulin from bovine pancreas), 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF), 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin, BSA), 디메틸 설폭사이드 (dimethyl sulfoxide, DMSO), 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT), β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH), 구아니딘 하이드로클로라이드 (guanidine hydrochloride), 2,4-디니트로페닐하이드라진 (2,4-dinitrophenylhydrazine, DNPH), 니트로블루 테트라졸륨 (nitroblue tetrazolium, NBT), 5,5'-디티오비스(2-니트로 벤조산) (5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), DTNB), 티오플라빈 T (thioflavin T), 1-데옥시-1-데모르폴리노-D-프럭토스 (1-deoxy-1-demorpholino-D-fructose, DMF), L- 시스테인 (L-cysteine), DL-글리세르알데하이드 이량체(DL-glyceraldehyde dimer), D-(-)-프럭토스 (D-(-)-fructose), D-(+)-글루코스 (D-(+)-glucose) 및 아미노구아니딘 하이드로클로라이드(aminoguanidine hydrochloride)는 Sigma-Aldrich Co.(St Louis, MO, USA)로부터 구매 하였다. PTP1B (인간 재조합체)는 Biomol® International LP (Plymouth Meeting, PA, USA)에서 구입하였다. 둘베코의 변형된 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM), 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin), 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산 (trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 태아 소 혈청 (fetal bovine serum, FBS), 피루브산 나트륨 (sodium pyruvate) 및 비필수 아미노산은 Gibco-BRL Life Technologies(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. OxiSelect ™ Nε-(카르복시메틸)라이신 (CML) ELISA 키트는 Cell Biolabs (San Diego, CA, USA)에서 구입 하였다. 디티오트레이톨 (dithiothreitol, DTT)은 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA)에서 구입하였다. 형광성(fluorescent) D-글루코스 유사체(analogue) 및 글루코스 트레이서(tracer) 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]-2-데옥시-D-글루코스 (2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl) amino]-2-deoxy-D-glucose, 2-NBDG)는 Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)로부터 구매하였다. 포스포-Akt (Phospho-Akt, Ser473), (D9E) 토끼 모노클로날 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)로부터 얻었다. PTP1B, IRS, p-IRS-1 (Tyr 895), Akt, PI3-kinase, p-PI3-kinase, anti-GSK-3β, anti-GLUT4 및 anti-phospho-ser9-GSK-3β, β-actin 및 모든 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)로부터 입수하였다. 아지드화 나트륨(Sodium azide)은 Junsei Chemical Co. (도쿄, 일본)에서 구입하였다. 인간 재조합 AR (0.4 단위)은 Wako Chemicals (오사카, 일본)에서 구입하였다. 그 외에 본 발명에서 사용된 다른 모든 화학 물질 및 용매는 E. Merck, Fluka 또는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.

모든 실험은 3회 실험의 평균±SEM으로 표현되었다. 통계학적으로 중요한 값은 분산 분석 (ANOVA) 및 Duncan's test (Systat Inc., Evanston, IL, USA)을 사용하여 분석하였다. <0.05의 P-값(P-value)은 통계적으로 유의 한 것으로 간주되었다.

<실험예 1> PTP1B, α-글루코시다아제, RLAR, HRAR 및 AGE에 대한 폰시린의 억제 활성

1-1. 폰시린의 PTP1B 억제 활성 분석

폰시린의 단백질 티로신 포스파타아제 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B) 억제 활성을 p-니트로페닐 포스페이트 (p-nitrophenyl phosphate, pNPP) 분석 방법(Ali, M.Y., et al., Chem. Biol. Interact. 2019, 305, 180-194)을 사용하여 평가 하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에, 40 μL의 PTP1B 효소 [50mM citrate (pH 6.0), 0.1 M NaCl, 1mM EDTA 및 1mM DTT를 함유하는 PTP1B 반응 완충액으로 희석된 0.5 단위] 및/또는 샘플을 10% DMSO에 용해하여 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 10분 동안 사전 인큐베이션 한 다음, 2mM의 pNPP를 포함하는 PTP1B 반응 완충액을 50 μL 첨가 하였다. 37℃에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 10M의 NaOH를 첨가하여 반응을 종결시켰다. pNPP의 효소적 탈인산화 후 생성된 p-니트로페닐의 양은 마이크로플레이트 분광광도계 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정함으로써 분석하였다. 우르솔릭산 (Ursolic acid)을 양성 대조군으로 사용 하였다.

1-2. 폰시린의 α-글루코시다아제 억제 활성 분석

폰시린의 α-글루코시다아제 억제 활성은 p- 니트로페닐 α-D-글루코피라노사이드 (p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside, pNPG)를 이용하여 보고된 절차(Ali, M.Y., et al., Chem. Biol. Interact. 2019, 305, 180-194)에 의해 평가되었다. 100μM의 포스페이트 완충액 (pH 6.8) 20 μL, 2.5mM의 pNPG 20 μL 및 10% DMSO에 용해된 샘플 20 μL를 포함하는 총 60 μL의 반응 혼합물을 각 웰에 첨가한 후 20 μL의 α-글루코시다아제 [10mM 포스페이트 완충액 중 0.2 U/mL (pH 6.8)]를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션 한 다음, 80 μL의 0.2M 탄산나트륨 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 후, 마이크로 플레이트 분광 광도계 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 기록 하였다. 아카르보스(Acarbose)는 양성 대조군으로 사용되었다.

1-3. 폰시린의 RLAR 억제 활성 분석

폰시린의 랫트 렌즈 알도스 환원효소 (rat lens aldose reductase, RLAR) 억제 활성을 평가하기 위하여, 랫트 렌즈 균질물을 약간의 변형된 기존에 알려진 방법(Ali, M.Y., et al., Chem. Biol. Interact. 2019, 305, 180-194; Hayman, S. & Kinoshita, J.H., J. Biol. Chem. 1965, 240, 877-882)에 따라 제조하였다. 100 mL의 이중 증류된 H₂O에 이염기성 인산 나트륨 (Na₂HPO₄·H₂O, 0.66 g) 및 일염기성 인산 나트륨 (NaH₂PO₄·H₂O, 1.27 g)을 첨가하여 제조된 인산 나트륨 완충액 (pH 6.2)에서 렌즈를 균질화시켰다. 균질액을 20분 동안 4℃에서 10,000 rpm으로 원심 분리하여 정제하고, 생성된 상청액을 사용할 때까지 동결시켰다. 6.5 U/mg의 특이적 활성을 갖는 미정제 AR 균질물을 모든 효소 억제 평가에 사용하였다. 반응용액은 620 μL의 100mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.2), 90 μL의 AR 균질물, 90 μL의 1.6mM NADPH 및 9 μL의 샘플로 구성되었다. 기질은 90 μL의 50mM DL-글리세르알데하이드를 포함하였다. AR 활성은 Ultrospec®2100pro UV/Visible 분광 광도계를 이용하여 340nm에서 4분 동안 NADPH 흡수 감소를 측정하여 결정되었다. 모든 데이터 분석에는 SWIFT II Applications 소프트웨어 (Amersham Biosciences)가 사용되었다. 잘알려진 AR 억제제(ARI)인 퀘르세틴(quercetin)을 대조군으로 사용하였다.

1-4. 폰시린의 HRAR 억제 활성 분석

폰시린의 인간 재조합 알도스 환원효소 (human recombinant aldose reductase, HRAR) 억제 활성은 상기 RLAR과 동일한 방법(Ali, M.Y., et al., Chem. Biol. Interact. 2019, 305, 180-194)으로 조사되었다. Ultrospec®2100pro UV/Visible 분광 광도계를 이용하여 340nm에서 1분 동안 NADPH 흡수 감소를 측정하여 AR 활성을 측정하였다. 모든 데이터 분석에는 SWIFT II Applications 소프트웨어 (Amersham Biosciences, NJ, USA)가 사용되었다. 잘 알려진 ARI 인 퀘르세틴을 양성 대조군으로 사용하였다.

1-5. 폰시린의 AGE 억제 활성 분석

최종당화산물(advanced glycation end-product, AGE) 생성 저해활성은 기존에 알려진 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 10mg/ml의 우혈청알부민(bovine serum albumin)을 0.2M phosphate buffer(pH7.4)에 용해시키고, 박테리아 억제제로 아지드화나트륨(sodium azide) 0.02%와 0.2M의 프락토오스(fructose)와 0.2M 글루코오스(glucose)를 첨가하여 사용하였다. 시료는 10%의 DMSO에 녹여 0.5 내지 500 μM 사이의 다양한 농도가 되게 반응혼합액(950 μL)에 섞어 사용하였다. 37℃에서 배양하고 spectrofluorometric detector (FLx800 microplate fluorescence reader, Bio-Tek Instrument, Inc., Winooski, USA)을 이용하여 형광도(Ex: 350 nm, Em:450 nm)를 측정하였다.

1-6. 폰시린의 PTP1B, α-글루코시다아제, RLAR, HRAR 및 AGE 억제 활성 분석 결과

상기 실험예 1-1 내지 1-5의 방법으로 분석된 PTP1B, α-글루코시다아제, RLAR, HRAR 및 AGE에 대한 폰시린의 억제 활성 측정 결과를 표 1에 IC₅₀ 값으로 나타내었다.

Test sample	IC₅₀(μM)^a
Test sample	α-Glucosidase	PTP1B	RLAR	HRAR	AGE
Poncirin	21.31±1.26	7.76±0.21	11.91±0.21	3.56±0.33	3.23±0.09
Acarbose^b	122.34±1.56
Ursolic acid^c		6.69±0.62
Quercetin^d			5.47±0.63	4.93±0.23
Zenarestat^e				0.79±0.14
Aminoguanidine^f					471.32±2.58
^a50% 억제 농도(μM)는 로그-용량 억제 곡선으로 계산되며 3회 실험을 통해 평균±SEM으로 표시하였다. ^b-f 양성 대조군

폰시린의 항당뇨병 활성을 평가하기 위해, PTP1B 및 α-글루코시다아제의 억제 가능성을 pNPP 및 pNPG를 기질로 사용하여 평가한 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, PTP1B 및 α-글루코시다아제의 억제 활성에 대한 각 분석에서 양성대조군으로 사용된 우르솔릭산(IC₅₀ 값 6.69±0.62μM) 및 아카르보스(Acarbose, IC₅₀ 값 122.34±1.56μM)와 비교하여 폰시린은 각각 7.76±0.21 및 21.31±1.26μM의 IC₅₀ 값으로 PTP1B 및 α-글루코시다아제에 대한 강력한 억제 활성을 나타냈다.

또한, 폰시린은 HRAR에 대한 IC₅₀값이 4.91±0.23μM이고 RLAR에 대해 5.47±0.63μM 인 양성 대조군 퀘르세틴(Quercetin)과 비교하여 각각 11.91±0.21 및 3.56±0.33μM의 IC₅₀ 값으로 강력한 RLAR 및 HRAR 억제 활성을 나타냈다(표 1). 폰시린은 RLAR보다 HRAR에 대해 더 강한 억제 활성을 나타냈으며, 이러한 결과로부터 인간에서 당뇨병 합병증을 치료하는데 효과적인 치료제로 이용할 수 있음을 확인하였다.

표 1에 나타난 바와 같이, 폰시린은 IC₅₀ 값이 3.23±0.09μM 인 강력한 AGE 억제 활성을 나타내었고, 양성 대조군(아미노구아니딘, Aminoguanidine)은 471.32±2.58μM의 IC₅₀ 값을 가졌다. 이러한 결과는 폰시린이 강력한 AGE 형성 억제 활성을 가짐을 보여준다. 특히, 폰시린은 AGE 형성 억제제로 잘알려진 아미노구아니딘보다 145배 더 강한 AGE 형성 억제를 나타냈다.

<실험예 2> PTP1B, α-글루코시다아제, RLAR 및 HRAR 억제에 대한 폰시린의 효소 동역학

2-1. PTP1B, α-글루코시다아제, HRAR 및 RLAR 억제에서의 폰시린의 효소 동역학 분석

폰시린에 의한 PTP1B, α-글루코시다아제, RLAR 및 HRAR 억제에 대한 효소 동역학 분석을 위해 Lineweaver-Burk 및 Dixon 플롯을 생성하였다. 각 분석에서의 기질 및 농도는 하기와 같다.

(a) 폰시린에 의한 PTP1B 억제에 대한 Lineweaver-Burk 플롯: 폰시린 0μM (Δ), 2.0μM (▼), 10μM (○) 및 50μM (●));

(b) 폰시린에 의한 PTP1B 억제에 대한 Dixon 플롯: pNPP 2.0mM (●), 1.0mM (○) 및 0.5mM (▼);

(c) 폰시린에 의한 α-글루코시다아제 억제에 대한 Lineweaver-Burk 플롯: 폰시린 0μM (■), 7.81μM (Δ), 15.62μM (▼), 31.25μM (○) 및 62.5μM (●);

(d) 폰시린에 의한 α-글루코시다아제 억제에 대한 Dixon 플롯: pNPG 2.5mM (●), 1.25mM (○) 및 0.625mM (▼);

(e) 폰시린에 의한 RLAR 억제에 대한 Lineweaver-Burk 플롯: 폰시린 0μM (Δ), 5.0μM (▼), 10μM (○) 및 20μM (●);

(f) 폰시린에 의한 RLAR 억제에 대한 Dixon 플롯: DL-글리세르 알데하이드 25mM (●), 50mM (○) 및 100mM (▼);

(g) 폰시린에 의한 HRAR 억제에 대한 Lineweaver-Burk 플롯: 폰시린 0μM (Δ), 0.2μM (▼), 1.0μM (○) 및 5.0μM (●); 및

(h) 폰시린에 의한 HRAR 억제에 대한 Dixon 플롯: DL-글리세르알데하이드 0.005 M (●), 0.01 M (○) 및 0.02 M (▼).

효소 억제의 유형은 Lineweaver-Burk 이중 왕복 플롯 [1/효소 속도(1/V) vs. 1/기판 농도(1/[S])] 해석에 의해 결정되었고, 억제 상수 (K _i )는 x 축상의 값이 K _i 를 나타내는 딕슨(Dixon) 플롯의 해석에 의해 결정되었다.

2-2. PTP1B, α-글루코시다아제, RLAR 및 HRAR 억제에 대한 폰시린의 효소 동역학 분석 결과

폰시린의 효소적 억제 모드를 설명하기 위하여, 상이한 농도의 상응하는 기질(PTP1B의 경우 pNPP 및 α-글루코시다아제의 경우 pNPG) 및 다양한 억제제 농도에서 동역학적 분석을 수행한 결과를 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다.

Test sample	kinetic parameters
Test sample	α-Glucosidase	PTP1B	RLAR	HRAR	AGE
K _i ^b	23.26	7.35	10.47	3.03	-
Inhibition type^c	Competitive	Mixed	Mixed	Competitive	-
^a억제 상수(K _i )는 딕슨 플롯을 사용하여 결정되었다. ^bDixon 플롯과 Lineweaver-Burk 플롯을 해석하여 억제 유형을 결정했다.

도 1a-b에 도시 된 바와 같이, Lineweaver-Burk 및 Dixon 플롯 분석 결과, 폰시린은 유리 효소의 알로스테릭 부위 또는 효소-기질 복합체에 결합할 수 있는 7.35μM의 K _i 값을 갖는 혼합형 PTP1B 억제를 나타냈다(표 2). 반면, 폰시린은 α-글루코시다아제에 대해서는 상이한 억제 모드, 즉 K _i 값이 52.33μM 인 경쟁형 억제를 나타냈다(도 1c-d 및 표 2).

또한, 폰시린이 RLAR 및 HRAR을 억제하는 방식을 결정하기 위해, 상이한 농도의 기질(RLAR의 경우 25, 50 및 100mM 및 HRAR의 경우 0.005, 0.01 및 0.02M) 및 억제제를 사용한 결과, 도 1e-f에 도시 된 바와 같이, 폰시린은 K _i 값이 10.47μM 인 혼합형 RLAR 억제를 나타내었고(표 2), 3.03μM의 K _i 값을 갖는 경쟁형 HRAR 억제를 나타냈다(도 1g-h 및 표 2).

<실험예 3> 폰시린 및 표적 단백질의 분자 도킹 분석

3-1. 단백질 구조의 선택 및 리간드의 준비

폰시린과 표적 단백질의 도킹 연구를 위해, 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank)로부터 표적 단백질 PTP1B (PDB ID: 1NNY), α-글루코시다아제 (PDB ID: 3A4A), HRAR (PDB ID: 1IEI) 및 RLAR (PDB ID: 3RX2)의 X-선 구조를 추출하였다. 폰시린과 단백질의 동족 리간드의 상호 작용을 활성 부위 내에서 조사하고 결과를 3D 포즈의 형태로 제시 하였다. Molecular Operating Environment (MOE) 내 사이트 파인더 프로그램을 사용하여 각 수용체의 활성 포켓을 찾았다(http://www.chemcomp.com/MOE Molecular_Operating_Environment.htm). AMBER99 force field를 사용하여 표적 단백질의 구조를 양성화한 후, 0.05 kcal/mol의 RMSD 구배에서 에너지를 최소화 하였다. 폰시린, 아카르보스 및 퀘르세틴의 구조 준비에는 MOE 빌더 기본 매개 변수가 사용되었다. 이러한 구조에 대한 에너지 최소화는 MOE에서 0.01 kcal/mol Å의 RMSD에서mMFF94x force field를 적용하여 수행되었다. 한편, 동족 리간드는 단백질 데이터 뱅크로부터 다운로드하였다.

3-2. 도킹 분석 방법

LeadIT 소프트웨어 (BioSolveIT GmbH, Germany)의 도움으로 분자 모델링을 수행했으며 도킹 연구 동안 기본 설정을 유지하였다. 도킹 분석 전에, 확인 단계는 각각의 단백질 내에 동족 리간드를 도킹함으로써 수행하였고, 그 후 폰시린은 표적 단백질의 활성 부위 내에 도킹되었다. HYDE 시각 친화도에 대해 상위 50개의 결합 자세를 분석하였다. HYDE 평가는 모든 리간드에 대해 유리하고 불리한 상호 작용을 염두에 두고 최종 포즈를 선택하기 위해 이용하였다. 결합 점수가 가장 낮고 가장 선호도가 높은 자세를 Discovery Studio Visualizer로 선택하고 시각화했다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

Target Enzymes	PDB ID	Ligands	H-bonds interacting residues	π-π interacting residues	Other interacting residues
PTP1B	1NNY	Poncirin	Gly183, Arg221, Gly220, Gln266, Cys215, Asp48, Gln262	-	π-alkyl linkage with Ala217, alkyl interactions with Val49 and Ile219
PTP1B	1NNY	Compound 23	Gly259, Asp48, Gln266, Gln262, Gly220, Gly218, Ala217, Tyr20, Arg221	Tyr46	Salt bridge interaction with Arg254, charge to charge and pi-cation interactions with Arg24 and charge to charge interaction with Arg221, carbon hydrogen bond with Gln266, π-sigma and π-alkyl with Ala217 and pi-alkyl interactions with Arg24
α-Glucosidase)	3A4A	Poncirin	Tyr158, Pro312, Glu277, Ser157, Asp69, Asp215	Tyr72, Phe303	π-alkyl interactions with Val216, alkyl linkage with Lys156, pi-cation with Arg442 and pi-anion with Glu277
		Acarbose	Tyr158, Ser240, Glu277, Arg213, Asp352, Asp242	-	Charge to charge salt bridge with Glu277 and charge-charge with Asp352 and pi-sigma with Phe303
		Alpha-D-Glucose	Arg213, Arg442, Asp352, Glu277, Asp69, Asp215	-	pi-donar bond with Tyr72 and pi-sigma with Phe178
HRAR	1IEI	Poncirin	Gln49, Val47, Tyr48, Gln183, His110	Trp20	Pi-alkyl with Cys298 and pi-donar with Tyr48
HRAR	1IEI	Zenarestat	Typ111, Tyr48, Cys298 and Tyr309	Trp111, Trp20	Charge to charge interactions with Lys77, pi-alkyl with Tyr48, Trp111, Val47, Trp20 and Tyr309, alkyl linkage with Val47 and Cys303, pi-sigma with Leu300
RLAR	3RX2	Poncirin	Trp111, Arg296, His110, Val297, Val47	Trp20	Pi-sigma with Val47, pi-lone pair with Trp20 and pi-alkyl linkage with Trp219 and Cys298
		Quercetin	Thr19, Tyr48, Trp111, Ser210, Ile260, Asp43, Gly18	His110 and Tyr209	Pi-sigma bond with Ile260, pi-sulfur with Cys298
		Sulandic	Ser302, Trp111 and Tyr48	Trp20 and Phe122	Pi-alkyl linkage with Trp219, Trp111 and Val47, alkyl with Cys298 and Val47, charge to charge interactions with Lys77

3-3. 폰시린 및 PTP1B 동족 리간드의 도킹 상호 작용 분석

단백질 티로신 포스파타아제 1B (protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)의 동족 리간드(cognate ligand), 3-({5-[(N-아세틸-3-{4-[(카르복시카르보닐)(2-카르복시페닐)아미노]-1-나프틸}-L-알라닐)아미노]펜틸}옥시)-2-나프토익산 (3-({5-[(N-acetyl-3-{4-[(carboxycarbonyl)(2-carboxyphenyl)amino]-1-naphthyl}-L-alanyl)amino]pentyl}oxy)-2-naphthoic acid, 화합물 23)의 분자 모델링은 수소 결합 및 pi-pi 상호 작용을 포함하는 상호 작용 네트워크를 보여 주었다.

도 2a에 나타난 바와 같이, 수소 결합에 관여하는 것으로 밝혀진 아미노산 잔기는 Tyr20 (2.14Å), Ser216 (2.98Å), Ala217 (2.90Å), Gly218 (3.25Å), Ile219 (2.83Å), Gly220 (2.62Å), Gln262 (3.19Å), Gln266 (3.18Å), Asp48 (1.89Å 및 1.73Å), Arg221 (2.76Å) 및 (2.53Å)이었고, 탄소 H 결합은 Gln266 (3.76Å), Gly259 (3.46Å) 및 Asp48 (2.77Å)으로 확인되었다. 또한, 화합물 23과 Tyr46 (5.47Å) 및 (4.87Å) 사이에서 pi-pi 적층 상호 작용이 관찰되었다. 일부 아미노산은 Arg254 (4.06Å 및 4.63Å) 및 Arg24 (4.49Å)와 같은 pi-양이온 상호 작용을 나타냈고, 다른 아미노산은 Ala217 (4.62Å) 및 Arg24 (4.68Å 및 4.94Å)와 같은 pi-알킬 상호 작용을 나타냈다. pi-시그마 상호 작용은 Ala217 (3.60Å) 및 Tyr46 (2.63Å)과 염다리 사이에서 Arg254 (3.07Å)에 의해 관찰되었다.

본 발명의 화합물 폰시린은 PTP1B 활성 포켓 내에서 다수의 수소 결합을 나타내었고, 이러한 이유로 단백질 내부에서의 안정화 및 단백질의 우수한 억제제 역할이 가능하게 된 것으로 보인다. 도 2b는 폰시린이 PTP1B 활성 포켓 내부에 잘 수용되었으며, 촉매 공동 내에 폰시린의 존재로 인해 단백질의 입체 형태 변화가 가능하였음을 나타낸다. 중요한 상호 작용에는 Gly183 (2.53Å), Gly220 (2.79Å), Arg221 (2.78Å), Gln266 (3.10Å), Cys215 (2.94Å), Asp48 (2.12Å 및 1.65Å), Gln262 (2.50Å)와의 수소 결합이 포함되며, Ala217 (4.57Å)과의 pi-알킬 결합 외에, Val49 (3.92Å) 및 Ile219 (4.67Å)와의 알킬 결합이 확인되었다.

3-4. 폰시린, 아카르보스 및 α-글루코시다아제 동족 리간드의 도킹 상호 작용

도 2c 및 표 3에 나타낸 바와 같이, α-글루코시다아제 효소의 동족 리간드인 알파-D-글루코스는 통상적인 수소 결합 (Arg213 (2.98Å), Arg442 (2.90Å), Asp352 (1.87Å 및 2.59Å), Glu277 (2.30Å) 및 Asp69 (1.54Å)) 및 탄소 수소 결합 (Asp352 (2.78Å) Glu277 (2.58Å) Asp69 (2.80Å 및 2.35Å) 및 Asp215 (2.27Å 및 1.97Å) 형태의 여러 상호작용을 야기하였다. 또한, Tyr72 (2.17Å)와의 pi-공여체 (donor) 상호 작용 및 Phe178 (2.55Å)과의 pi-시그마 연결이 폰시린의 α-글루코시다아제 억제 활성에 중요한 역할을 수행하였다. 알파-D-글루코스의 결합 포즈(binding pose)는 글루코시다아제의 촉매 공동 내부 깊숙하게 위치되었다.

아카르보스의 타당한 결합 포즈는 수소 결합에 관여하는 아미노산이 Arg213 (2.98Å), Tyr158 (1.94Å 및 1.78Å), Ser240 (2.96Å), Asp352 (1.51Å) 및 Glu277 (1.55Å)임을 암시하였고, Asp242 (2.20Å 및 2.05Å) 및 Glu277 (3.02Å)은 탄소 수소 결합을 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 2d).

또한, α-글루코시다아제 내에 아카르보스가 도킹되었을 때, Phe303 (2.31Å)에 의한 pi-시그마 상호 작용 및 Glu277 (2.04Å 염다리) 및 Asp352 (3.29Å)와의 상호 작용을 충전하는 전하가 관찰되었다.

도 2e 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 폰시린은 α-글루코시다아제의 Tyr158 (2.05Å) 및 Pro312 (3.00Å)와의 통상적인 수소 결합 및 Glu277 (2.60Å), Ser157 (2.46Å), Asp69 (2.49Å 및 3.00Å) 및 Asp215 (3.06Å)와의 탄소 수소 결합을 나타냈다. Arg442와의 pi-양이온 (4.31Å) 및 Glu277 (3.50Å)과의 pi-음이온과 같은 다른 상호 작용도 관찰되었다. 폰시린은 Tyr72 (5.86Å) 및 Phe303 (4.79Å)과 pi-pi T 모양의 상호 작용 및 Val216 (5.10 Å)와의 pi-알킬 결합을 만들었다.

3-5. 폰시린 및 인간 알도스 환원효소 동족 리간드의 도킹 상호 작용

제나레스타트(zenarestat)의 타당한 모드, 동족 리간드는 인간 알도스 환원효소의 활성 부위 내에서 중요하고 핵심적인 상호 작용을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 상기 상호 작용은 수소 결합 Tyr48 (2.67Å), Trp111 (2.95Å), Tyr309 (3.09Å) 및 Cys298 (2.84Å)과의 탄소-수소 결합을 포함한다.

도 2f 및 표 3에 나타낸 바와 같이, pi-pi 적층 상호 작용을 나타내는 아미노산은 Trp20 (4.16Å, 4.82Å, 4.59Å 및 4.24Å) 및 Trp111 (4.27Å 및 3.70Å)이며, pi-알킬 결합은 아미노산 Tyr48 (4.52Å 및 4.52Å), Trp111 (4.14Å 및 4.00Å), Trp20 (4.25Å), Tyr309 (5.07Å) 및 Val47 (4.79Å)에서 관찰되었다. 알킬 결합은 Val47 (2.99Å 및 3.82Å) 및 Cys303 (4.36Å)에 의해 확인되었다. 또한, 제나레스타트는 Leu300 (3.70Å)과의 pi-시그마 상호 작용 및 Lys77 (4.46A)과의 전하-전하 상호 작용을 보여 주었다. 제나레스타트의 7-클로로-2,4-다이옥소퀴나졸린-1-일 부분은 보조 인자인 NAP350쪽으로 더 위치되었다. 한편, 제나레스타트의 4-브로모-2-플루오로페닐 부분은 친수성 포켓의 별개의 부위 근처에 정렬되는 것으로 나타났다.

도 2g 및 표 3에 도시된 바와 같이, 인간 알도스 환원효소의 결합 부위 내에서 폰시린의 주요 상호 작용은 NAP350 근처의 Trp20 (5.35Å)과의 pi-pi 적층 상호 작용, Tyr48 (3.89A)과의 pi-공여체 상호 작용 및 Cys298 (5.02 A)과의 pi-알킬 상호 작용이다. 또한, 수소 결합은 효소의 소수성 포켓 근처에 위치한 Gln49 (1.99 Å, 2.06 Å 및 1.54 Å) 및 Val47 (2.10 Å)에서 나타났고, Tyr48 (2.15Å), Gln183 (1.73Å) 및 His110 (3.08Å)과의 친수성 공동 내에서 탄소 수소 결합이 관찰되었다.

3-6. 폰시린 및 RLAR 동족 리간드의 도킹 상호 작용

인간 알도스 환원효소 내의 술린닥(sulindac)의 도킹 결과(도 2h)는 pi-pi 적층 상호 작용에 관여하는 아미노산이 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NAP) 이외에도 Trp20 (4.95Å, 4.78Å, 5.36Å 및 4.66Å) 및 Phe122 (5.98Å)인 것으로 밝혀졌다. 기질 결합 공동을 형성하는 술린닥과 아미노산 사이에서 Tyr48 (3.24Å), Ser302 (3.01Å) 및 Trp111 (2.91Å)의 수소 결합이 발견되었고, Lys77 (5.24Å)은 전하-전하 상호 작용에 있었다(표 3). 잔류물 Trp111 (5.23Å), Val47 (4.87Å) 및 Trp219 (5.32Å)는 술린닥과의 pi-알킬 결합에 있었고, 알킬 결합은 Cys298 (3.21Å) 및 Val47 (2.81Å)에 의해 나타났다.

효소의 활성 포켓 내에서 퀘르세틴 (2-(3,4-디하이드록시페닐)-3,5,7-트리하이드록시-4H-크로멘-4-온)의 타당한 결합 모드는 다수의 수소 결합이 친수성 헤드 및 소수성 공동의 입구 공동으로 퀘르세틴의 안정화를 담당하는 것으로 밝혀졌다(도 2i). 표 3에 나타낸 바와 같이, 수소 결합을 형성하는 아미노산은 Thr19 (2.81A), Tyr48 (2.15Å), Trp111 (2.65Å), Ser210 (2.74Å, 2.62Å 및 2.27Å), Asp43 (2.32Å) 및 Ile260 (2.09Å)을 포함하고, Gly18 (2.94Å)과 탄소 H 결합을 형성하였다. 마찬가지로, pi-pi T 형태의 상호 작용을 담당하는 아미노산은 His110 (4.87Å) 및 Tyr209 (5.38Å)였다. 또한, 퀘르세틴은 Ile260 (3.98Å)과의 pi-시그마 상호 작용 및 Cys298 (5.78Å 및 4.36Å)과의 pi-설퍼(sulfur) 상호 작용을 나타냈다.

폰시린이 도킹되는 포즈를 조사한 결과, 주요 아미노산 잔기 Trp111 (2.91Å), His110 (2.31Å), Val297 (2.71Å), Val47 (2.97Å) 및 Arg296 (2.29Å)은 효소의 활성 포켓 내에서 수소 결합 네트워크를 형성하는 것으로 나타났다(도 2j 및 표 3). 폰시린은 Val47 (3.44Å 및 3.68Å)과의 pi-시그마 결합 및 Trp20 (2.98Å 및 2.54Å)과의 pi-론(lone) 쌍(pair) 상호 작용을 나타냈다. 또한, Trp20 (5.14Å)과의 pi-pi T 형 상호 작용 및 Trp219 (5.30Å) 및 Cys298 (3.61Å)과의 pi-알킬 결합은 폰시린이 효소의 입구 공동을 향한 결합에 기여하는 요인인 것으로 확인되었다.

3-7. 모든 표적에 대한 화합물의 HYDE 평가

α-글루코시다아제 (3A4A), RLAR (3RX2), PTP1B (1NNY) 및 HRAR (1IEI)의 활성 포켓 내에서 리간드의 효율을 조사하기 위해 선택적 포즈의 결합에 대한 HYDE 시각 친화성을 분석하였다. HYDE는 Gibbs-Helmholtz 방정식에서 파생되었으며 결합 친화도와 직접 관련이 있고, 포즈의 육안 검사 및 단백질에 대한 친화력이 가장 높은 최고 포즈의 결과를 제공한다.

표 4에 모든 표적 단백질 내의 폰시린, 동족 리간드 및 양성 대조군에 대한 결합 자유 에너지 및 FlexX 도킹 점수를 나타내었다.

Ligands	FlexX score of the top-ranking pose	Binding free energy ΔG (kJ mol^-1)
α-glucosidase (3A4A)
Porcirin	-26.57	-14
Acarbose	-17.28	-18
Alpha-D-Glucose	-31.43	-31
RLAR (3RX2)
Porcirin	-25.74	-29
Quercetin	-31.05	-22
Sulandic	-28.92	-24
PTP1B (1NNY)
Porcirin	-19.21	-14
Compound 23	-67.05	-20
HRAR (1IEI)
Porcirin	-24.87	-28
Zenarestat	-27.52	-41

상기 표 4에 나타난 바와 같이, α-글루코시다아제에 대한 폰시린의 억제능을 확인한 결과, 현재 사용되는 α-글루코시다제 억제제인 아카르보스보다 억제 ㅎ활성이 5.7 배 더 강한 것으로 밝혀졌다. 또한, 폰시린은 경쟁력있는 α-글루코시다아제 억제제로서, α-글루코시다아제 효소의 활성 부위에 결합하여 효소-기질 복합체 형성을 방지하며, 분자 도킹 분석은 α-글루코시다아제-폰시린 억제제 복합체가 -14.00 kJ mol^-1의 결합 자유 에너지 및 효소의 촉매 포켓 내에서 안정한 입체 구조를 나타냈다는 것을 밝혀냈다.

폰시린의 분자 도킹은 PTP1B의 활성 포켓 내에서 음의 결합 자유 에너지 (-17.98kJ mol^-1)를 갖는 다수의 수소 결합을 나타내었으며, 이는 PTP1B 단백질 내부에서 이를 안정화시키고 우수한 단백질 억제 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.

<실험예 4> 폰시린이 인슐린 저항성 C2C12 골격근 세포에서 포도당 섭취 및 PTP1B 발현 수준에 미치는 영향

폰시린의 화학 구조는 도 3a에 나타난 바와 같다.

4-1. 세포 배양 및 세포 생존력 분석

폰시린의 포도당 흡수를 증가시키는 능력을 조사하기에 앞서, C2C12 세포에서 폰시린의 세포 독성을 MTT 분석에 의해 측정 하였다.

C2C12 세포(골격근 세포) 라인은 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입 하였다. C2C12 세포를 5% CO₂의 가습된 분위기에서 10% FBS 및 스트렙토마이신-페니실린 (Hyclone, Mordialloc, VIC, Australia)으로 보충된 DMEM에서 37℃에서 배양하였다. 테트라졸륨 염료 비색 시험 (MTT)을 사용하여 C2C12 세포의 생존력을 결정하였다. 처음에 C2C12 세포를 96-웰 플레이트 (2×10⁵ 세포/웰)에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 밀집도가 90%에 도달된 후, 다양한 농도의 폰시린으로 처리하였다. 24시간 배양 후, MTT 시약을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고, 웰을 PBS (pH 7.4)로 2회 세척하였다. 생존 세포의 비율을 측정하기 위해, 배지를 100 μL DMSO (100%)로 교체하였다. 생성된 흡광도 값은 마이크로 플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 570 nm에서 측정되었다.

C2C12 세포를 24시간 동안 인큐베이션 한 후 폰시린으로 20μM 이하의 농도로 전처리한 결과, 도 3b에 도시 된 바와 같이, 폰시린은 15μM 이하에서 세포 독성이 나타나지 않았으므로, 15μM 이하의 농도로 후속 포도당 흡수 분석을 수행하였다.

4-2. 근육 세포 분화 및 포도당 섭취 분석

포도당 흡수를 증가시키는 폰시린의 능력을 조사하기 위하여, 인슐린-저항성 C2C12 세포로 인슐린-자극된 2-NBDG 흡수 분석을 수행하였다.

C2C12 세포를 37℃에서 10% FBS 및 1% P/S를 함유하는 DMEM과 함께 96-웰 플레이트(2×10⁵세포/웰)에서 배양하고 5% CO₂ 대기에 노출시켰다. 세포가 목적 밀집도에 도달했을 때, 2% 말 혈청(horse serum)이 보충된 DMEM에서 5일 동안 분화되었다. 이어서, 세포를 저혈당 무혈청 DMEM에서 24시간 동안 굶기고, 이어서 2-NBDG 분석을 수행하여 포도당 섭취를 평가했다. 간략하게, 인슐린 (100 nM)으로 12시간 동안 처리하여 인슐린 저항성을 유도한 다음, 세포를 다양한 농도의 폰시린 또는 5.0μM의 로시글리타존(rosiglitazone)으로 24시간동안 처리하고, 20μM의 2-NBDG를 24시간 동안 처리하였다. 반응을 중지시키기 위해, 세포를 빙냉(ice-cold) PBS로 3회 세척하고, 490 nm 여기 및 535 nm 방출 파장에서 마이크로플레이트 판독기 (Bio-Tek Instruments Inc., FL×800, Winooski, USA)에서 2-NBDG 형광 강도를 측정하여 정량화하였다. 5개의 복제 웰을 확립하고, 각 실험을 3회 반복 하였다.

그 결과, 양성 대조군 로시글리타존은 인슐린-저항성 C2C12 세포에서 현저하게 인슐린-자극된 포도당 흡수를 증가시켰다. 폰시린은 대조군과 비교하여 2.5, 10 및 15μM의 농도에서 인슐린 저항성 C2C12 세포에 의한 인슐린 자극 2-NBDG 흡수를 현저하게 향상시켰다(도 3c). 이러한 결과는 폰시린이 근육 세포에서 포도당 섭취 신호 전달 경로에 관여함을 시사한다.

4-3. PTP1B 발현 분석

폰시린이 인슐린 저항성 C2C12 세포에서 단백질 티로신 포스파타아제 1B (PTP1B) 발현 수준에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 인슐린 저항성 C2C12 세포를 선택된 농도의 폰시린과 함께 24시간 동안 인큐베이션 하였다. PTP1B 대 β-액틴(β-actin)의 상대 밀도를 측정하여 도 3d에 나타내었고, PTP1B 단백질 밴드 강도를 밀도 측정법을 통해 β-액틴 수준에 대해 정규화한 정량값을 도 3e에 내었다.

그 결과, 도 3d 및 도 3e에 도시된 바와 같이, 10 및 15μM 폰시린으로 인슐린 저항성 C2C12 세포를 처리하면 PTP1B 발현 수준이 감소되었다.

<실험예 5> 폰시린이 IRS-1/PI3K/Akt 및 GSK3β 신호 경로를 통한 GLUT4 활성화에 미치는 영향

폰시린의 인슐린 신호에 영향을 미치는 분자 메커니즘을 결정하기 위해, 본 발명자들은 웨스턴 블롯팅을 통해 인슐린-신호 경로에 관련된 다양한 단백질의 발현 수준을 조사하였다. 로지글리타존(Rosiglitazone)이 양성 대조군으로 사용되었다.

5-1. 단백질 용해물의 제조 및 웨스턴 블롯 분석

구체적으로, 6-웰 플레이트에서 인슐린-저항성 C2C12 세포 (2×10⁵ 세포/웰)를 24시간 동안 상이한 농도의 폰시린으로 처리하였다. 37℃에서 30분 동안 100nM 인슐린으로 자극 한 후, 세포를 빙냉 PBS로 3회 세척하고 수집한 다음 샘플 완충액 (50mM HEPES, pH 7.5, 150mM NaCl, 2.5mM EDTA, 0.5 % NP-40, 1mM PMSF, 1mM DTT, 0.2 % 아프로 티닌, 0.5 % 류펩틴, 20mM NaF 및 1mM Na₃VO₄)으로 얼음상에서 용해시켰다. 30분 동안 인큐베이션 한 후, 불용성 물질을 25,000×g에서 20분 동안 원심 분리하여 제거하였다.

폰시린이 인슐린 저항성 C2C12 세포에서 총 및 인산화 된 인슐린 수용체 기질 1(sulin receptor substrate 1, IRS-1), 인산화 단백질 키나아제 (phosphorylated protein kinase, Akt), 포스파티딜 이노시톨-3-키나아제 (Phosphatidyl inositol-3-kinase, PI3K), 글리코겐 신타제키나아제-3 (glycogen synthasekinase-3, GSK-3), 및 포도당 수송체 유형 4(glucose transporter type 4, GLUT-4)의 수준에 미치는 영향을 평가하기 위하여 웨스턴 블롯팅에 의해 발현 수준을 측정하였다. 각 단백질 농도는 변형된 브래드포드(Bradford) 단백질 분석 키트에 의해 결정되었다. 총 단백질 (50 μg)을 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에서 전기영동 한 후, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막으로 옮겼다. 막을 차단 완충액 (0.1% 트윈 20을 함유하는 트리스 완충 식염수(TBST) 중 5% 탈지유)에서 차단하고 4℃에서 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션 한 후, 실온에서 4시간 동안 적절한 2차 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 막을 TBST로 40분 동안 3회 세척 하였다. 밴드는 제조사의 지시에 따라 Super signal West Pico chemiluminescence 기질 (Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 검출되었다. 오디세이 스캐닝 시스템 (LI-COR, Lincoln, NE, USA)을 사용하여 면역-반응성 단백질 밴드를 검출 하였다. 냉각 CCD 카메라 시스템 EZ-Capture II 및 CS analyzer version 3.00 소프트웨어 (ATTO Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 데이터의 밀도 측정 분석을 수행하였다.

5-2. 폰시린이 IRS-1/PI3K/Akt 및 GSK3β 신호 경로를 통한 GLUT4 활성화에 미치는 영향 분석 결과

도 4에 도시된 바와 같이, 폰시린이 컨트롤 인슐린에 민감한 세포에서 관찰되는 수준으로 티로신 895(Tyr 895)에서 인산화를 향상시켜 IRS-1을 활성화시켰음을 확인하였다. 폰시린은 또한 총 Akt, PI3K 또는 GSK-3β의 발현 수준을 변화시키지 않으면서 p-Akt, p-PI3K 및 p-GSK3β의 상대적 발현량을 상당히 증가시켰다(도 4).

이러한 결과는 폰시린이 p-IRS-1 발현(Tyr-895) 수준을 증가시키고 다운 스트림 PI3K/Akt/GSK-3β 신호 전달 경로를 활성화시키며, 이에 따라 포도당 흡수를 자극함으로써 인슐린 저항성 C2C12 근육 세포에서 인슐린 감수성을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.

골격근 세포에서, GLUT4는 인슐린-의존적 및/또는 기저 상태에서 포도당의 흡수에 중추적인 역할을 한다. 폰시린을 10 및 15μM 농도로 처리시 GLUT4의 세포 발현을 유의하게 향상시켰다(도 4).

이전 여러 연구에서 PTP1B 억제제가 인슐린 수용체 (IR)의 티로신 인산화를 증가시키고 IRS-1, Akt, PI3K 및 GSK-3β와 같은 인슐린 신호의 다운 스트림 분자를 활성화시키는 것으로 보고되었다. 따라서, PTP1B의 억제제는 T2DM에서 인슐린 감수성을 향상시키기 때문에 잠재적인 항당뇨병제이다. 상기와 같은 결과로부터 폰시린이 인슐린 저항성 C2C12 골격근 세포에서 IRS-1, PI3K, GSK3β, Akt 및 GLUT4의 인산화를 증가시키는 PTP1B 발현을 감소시키는 것으로 밝혀졌으며, 이에 따라 폰시린이 T2DM의 치료에 도움이될 PTP1B의 잠재적 조절제이면서, PTP1B-IRS1-Akt-GLUT4 신호 전달 경로를 조절함으로써 골격근에서 인슐린 저항성을 개선함으로써 항당뇨병 효과를 발휘할 수 있음을 확인하였다.

<실험예 6> 폰시린이 당화 과정에 미치는 영향

6-1. BSA의 시험관내 당화

당화된 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin, BSA)의 형성은 변형된 방법(Islam, M.N, et al., Food Chem. Toxicol. 2014, 69, 55-62)에 따라 조사되었다. 최종당화산물(advanced glycation end-product, AGE) 반응 용액을 제조하기 위해, 50mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.4) 중 10mg/mL의 소 혈청 알부민(BSA)을 0.2M 과당 및 0.2M 포도당에 첨가하였고 박테리아 성장을 방지하기 위하여 0.02% 나트륨아지드를 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물(3.8mL)을 다양한 농도의 폰시린 및 아미노구아니딘 하이드로클로라이드를 용해시킨 10% DMSO 200μL와 혼합하였다. 대조군은 BSA 및 당을 사용하여 제조하였고, 블랭크는 동일한 완충액에서 BSA만을 사용하여 제조하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 4주 동안 인큐베이션 하였다. 반응 혼합물의 분취량을 AGE 형성 억제 활성 결정을 위해 분석하였다.

6-2. AGE 형성의 억제 분석

최종당화산물의 형성에 대한 억제 활성은 약간의 변형으로 이전에 보고된 방법(Islam, M.N 등, Food Chem. Toxicol. 2014, 69, 55-62)에 따라 평가되었다. AGE 반응 용액을 제조하기 위해, 박테리아 성장을 방지하기 위한 0.02% 나트륨아지드아 함께 50mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.4) 중 10mg/mL의 소 혈청 알부민(BSA)을 0.2M 과당 및 0.2M 포도당에 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물(950 ㎕)을 10% DMSO에 용해된 다양한 농도의 샘플(50 ㎕, 시험 농도 범위 0.5 내지 500μM)과 합하였다. 37℃에서 인큐베이션한 후, 350 nm 및 450 nm에서 각각 여기 및 방출 파장을 갖는 분광 형광 검출기(FLx800 microplate fluorescence reader, Bio-Tek Instrument, Inc., Winooski, USA)를 사용하여 분취량내의 AGE의 형성을 4주 동안 매주 간격으로 측정하였다. 친핵성 히드라진 화합물인 아미노구아니딘을 AGE 분석에서 대조군으로 사용하였다.

6-3. 폰시린이 형광성 AGE 형성에 미치는 영향

BSA-포도당-과당 용액의 형광 강도를 측정함으로써 매주 AGE의 형성을 모니터링한 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 배양 시간이 증가함에 따라 형광이 증가하여, BSA 당화가 상당히 증가하였음을 확인하였다. 폰시린이 BSA-포도당-과당 시스템을 함유하는 반응 매질에 첨가되었을 때, 실험 기간동안 형광 강도의 현저한 감소가 관찰되었다. 인큐베이션 4주차에, 폰시린에 의한 AGE 형성의 억제 백분율은 각각 0.5, 2.0, 10 및 50μM의 농도에서 19.42%, 31.65%, 60.90% 및 81.68% 인 것으로 나타났난 한편, 양성 대조군 아미노구아니딘은 500μM의 농도에서 AGE 형성을 47.50% 억제하였다. 특히, 50μM 농도의 폰시린은 아미노구아니딘 (500μM)과 비교하여 당화된 BSA 형성에 대해 더 강한 억제를 나타냈다.

6-4. 폰시린이 프럭토사민 형성에 미치는 영향

아마도리 생성물 프럭토사민의 수준은 약간의 변형을 갖는 이전의 방법(Ardestani, A.& Yazdanparast, R, Int. J. Biol. Macromol. 2007, 41, 572-578)에 따라 니트로블루-테트라졸륨 (NBT) 염료를 사용하여 상기 AGE를 측정한 동일한 반응 혼합물에서 측정되었다. 간략하게, 10 μL의 당화된 BSA를 0.1 M 탄산염 완충액 (pH 10.4) 중 100 μL의 0.5mM NBT에 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 배양하였다. VERSA max 마이크로플레이트 리더를 사용하여 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. 프럭토사민의 농도를 계산하고 표준으로서 DMF와 비교 하였다.

프럭토사민의 수준에 대한 폰시린의 효과는 도 6에 나타난 바와 같다.

포도당-과당-당화된 BSA의 프럭토사민 수준은 실험 4주 동안 현저히 증가하였다. 실험 기간이 끝날 무렵, BSA-포도당-과당 시스템에서 양성 대조군인 아미노구아니딘 500μM에 의해 프럭토사민 형성이 15.4% 억제된 것에 비해, 0.5, 2.0, 10 및 50μM 농도의 폰시린은 프럭토사민 형성을 각각 9.8%, 17.9%, 30.3% 및 31.5% 억제하였다. 따라서 폰시린이 당뇨병 혈관 합병증을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.

6-5. 폰시린이 CML 형성에 미치는 영향

1, 2, 3 및 4주의 배양 후, 주요 항원성 AGE 구조인 Nε-(카르복시메틸)라이신 (CML)을 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA 키트를 사용하여 상기 AGE를 측정한 동일한 반응 혼합물에서 결정하였다. 샘플의 흡광도를 450 nm에서 측정하고 분석 키트에 제공된 CML-BSA 표준의 흡광도와 비교 하였다.

비형광성 AGE 형성을 위한 바이오마커인 Nε-CML의 수준을 인큐베이션 4 주차에 측정한 결과, 포도당-과당-유도 당화 BSA는 4주차 비당화 BSA 대비 CML 형성에서 9.6배 증가를 나타냈다(도 7). 반면, 폰시린 처리시 농도 의존적으로 CML 형성을 억제하였고, 4주차에서 0.5, 2.0, 10 및 50μM의 농도의 폰시린 처리가 CML의 형성을 각각 6.64%, 20.49%, 38.10% 및 46.21%만큼 현저히 억제한 것으로 나타났다. 아미노구아니딘은 500μM의 농도에서 CML 수준을 약 41.9% 감소시켰다.

6-6. 폰시린이 단백질 카르보닐기 형성에 미치는 영향

1, 2, 3 및 4주 동안 배양한 후 단백질 산화 손상의 지표인 당화 BSA의 카르 보닐 그룹을 이전의 Levine 및 colleagues의 방법(Adisakwattana, S., et al., Int. J. Mol. Sci. 2012, 13, 1778-1789)과 약간의 변형된 방법에 따라 분석했다. 간략하게, 2.5M HCl에 용해된 400μL의 10mM DNPH를 100μL의 당화된 샘플에 첨가 하였다. 암실에서 60분 동안 인큐베이션 한 후, 0.50 mL의 20% (w/v) TCA를 단백질 침전에 사용하고(얼음상에서 5분), 이어서 4℃에서 10분 동안 10,000 g에서 원심분리하였다. 단백질 펠렛을 500 ㎕의 에탄올/에틸아세테이트 (1:1) 혼합물로 3회 세척하고, 250 ㎕의 6.0 M 구아니딘하이드로 클로라이드에 재현탁시켰다. 370 nm에서 흡광도를 측정하였다. DNPH의 흡광 계수(ε= 22,000 M^-1 cm^-1)를 기준으로 각 샘플의 카르보닐 함량을 계산 하였다. 결과는 nM 카보르보닐/mg 단백질로 표현된다.

당화 과정 중 단백질 산화의 지표로서 카르보닐 함량의 수준을 평가한 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 고 포도당-과당에 대한 BSA의 노출은 노출 시간이 증가함에 따라 당화되지 않은 BSA에 비해 단백질 카르보닐 함량을 유의하게 증가시켰고, BSA-포도당-과당 시스템에서 4주차에 카르보닐 함량은 당화되지 않은 BSA와 비교하여 7.8배 이상 증가하였다. 인큐베이션 4주차에, BSA-포도당-과당 시스템에서 폰시린은 각각 0.5, 2.0, 10 및 50μM의 농도에서 단백질 카르보닐 수준을 34.0%, 42.9%, 49.8% 및 55.29%만큼 현저하게 감소시켰다. 아미노구아니딘은 500μM의 농도에서 단백질 카르보닐 함량을 50.12% 감소시킨 것으로 나타나, 10μM 이상의 폰시린이 아미노구아니딘(500μM)보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 폰시린은 고혈당으로 인한 단백질의 산화적 손상을 예방하는데 효과적 일 수 있다.

6-7. 폰시린이 티올기 형성에 미치는 영향

단백질 티올 그룹은 약간 수정된 이전의 공개된 방법(Islam, M.N., et al., Food Chem. Toxicol. 2014, 69, 55-62)에 따라 측정되었다. 간략하게, 70 μL의 당화된 샘플을 25℃에서 15분 동안 0.1 M PBS, pH 7.4에서 5mM DTNB와 함께 배양 하였다. 샘플의 흡광도는 410 nm에서 측정되었다. 유리 티올의 농도는 L-시스테인 표준으로부터 계산되었고μM로 표시된다.

당화 공정에 의해 매개되는 단백질 산화를 알아보기 위해 티올기의 형성을 분석한 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, BSA의 포도당-과당-매개된 당화는 배양 시간 증가에 따라 BSA에서 티올기의 점진적인 감소를 야기하였고, 4주차에, BSA에서 51.2%의 티올 손실이 있었다. 반면에, 폰시린 처리시 농도 의존적으로 티올기의 손실을 유의하게 억제하였으며, 4주차에, 폰시린 0.5, 2.0, 10 및 50μM의 농도에서 각각 티올기의 손실이 62.59%, 67.95%, 69.59% 및 74.69% 억제되었다. 또한 아미노구아니딘을 첨가한 후 티올의 수준이 현저히 개선되어 500μM의 농도에서 티올 손실이 67.5% 방지되었다.

6-8. 폰시린이 아밀로이드 교차-β 구조에 미치는 영향

단백질 응집에 대한 공통 마커인 아밀로이드 교차-β 구조는 약간의 변형된 이전 방법(Islam, M.N., et al., Food Chem. Toxicol. 2014, 69, 55-62)에 따라 티오플라빈 T 분석을 사용하여 상기 AGE를 측정한 동일한 반응 혼합물에서 측정되었다. 간략하게, pH 7.4의 0.1 M PBS 중 100 μL의 64μM 티오플라빈 T 100 g을 당화된 샘플 10 μL에 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 배양 하였다. 형광 강도는 여기 파장 435 nm 및 방출 파장 485 nm에서 측정되었다.

도 10에 도시된 바와 같이, 당화되지 않은 BSA와 비교하여, 당화된 BSA는 실험 기간 4주에 걸쳐 아밀로이드 교차-β 입체 형태가 증가되었다. 4주차에, 당화 된 BSA는 당화되지 않은 BSA와 비교하여 아밀로이드 교차-β 입체 구조에서 2.9 배 증가를 나타냈다. 반면에, 폰시린 처리는 0.5, 2.0, 10 및 50μM의 농도에서 아밀로이드 교차-β 구조의 수준을 각각 19.3%, 33.2%, 66.1% 및 68.8% 감소시켰다. 유사하게, 아미노구아니딘은 500μM의 농도에서 아밀로이드 교차-β 구조의 수준을 30.1% 감소시켰다. 결과적으로, 10 및 50μM의 농도의 폰시린으로 처리하면 아밀로이드 교차-β 구조의 수준이 정상 수준으로 감소하였고, 폰시린은 아미노구아니딘 (500μM)보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이러한 폰시린의 유익한 효과는 당뇨병 환자에서 쇠약성 퇴행성 질환이 발생할 위험을 줄이는 데 도움이 될 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

폰시린(poncirin), 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 당뇨병은 인슐린 저항성 당뇨병인 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 당뇨병 또는 당뇨병 합병증은 α-글루코시다아제(α-glucosidase), 단백질 티로신 포스파타아제(PTP), 랫트 렌즈 알도스 환원효소 (RLAR) 및 인간 재조합 알도스 환원효소 (HRAR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소 관련 경로 의존성 당뇨병 또는 당뇨병 합병증인 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 α-글루코시다아제 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 단백질 티로신 포스파타아제 1B(PTP1B) 억제 활성을 통해 인슐린 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 인슐린 저항성을 개선하는 것을 특징으로 하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 단백질 티로신 포스파타아제 1B(PTP1B) 억제 활성을 통해 포도당 흡수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 알도스 환원효소 (aldose reductase) 및 최종당화산물(advanced glycation end-product) 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 당화 단백질 산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 당뇨 합병증은 당뇨성 신경병증, 당뇨성 망막증, 백내장, 당뇨성 신증, 신부전증, 성기능 장애, 피부질환, 고혈압, 동맥 경화증, 뇌졸증, 뇌경색, 심장병, 배아 병증, 괴저 및 상처의 치유 지연으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환인 것인, 약학적 조성물.
폰시린(poncirin), 이의 이성질체, 유도체, 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제10항에 있어서,
상기 당뇨병은 인슐린 저항성 당뇨병인 것인, 건강기능식품 조성물.
제10항에 있어서,
상기 당뇨병 또는 당뇨병 합병증은 α-글루코시다아제(α-glucosidase), 단백질 티로신 포스파타아제(PTP), 랫트 렌즈 알도스 환원효소 (RLAR) 및 인간 재조합 알도스 환원효소 (HRAR)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소 관련 경로 의존성 당뇨병 또는 당뇨병 합병증인 것인, 건강기능식품 조성물.
제10항에 있어서,
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태의 식품인 것인, 건강기능식품 조성물.
폰시린(poncirin), 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 PTP1B 효소 활성 억제를 통한 인슐린 감수성 증진제.