KR100534556B1 - 알파１ｇ 단백질의 기능을 억제하여 간질을 일으키지 않게하는 방법 - Google Patents
알파１ｇ 단백질의 기능을 억제하여 간질을 일으키지 않게하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 기능을 억제하여 간질을 일으키지 않게 하는 방법, 알파1G 단백질의 기능 억제제를 간질 예방제 또는 치료제로 사용하는 용도, 유전자 적중법에 의해 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 기능을 상실시켜 간질을 일으키지 않는 유전자 변이 생쥐 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 기능을 억제하면 간질을 일으키지 않고, 또한 알파1G 단백질의 기능이 상실된 유전자 변이 생쥐는 간질과 관련된 기작을 연구하는 동물모델로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 기능을 억제하여 간질을 일으키지 않게 하는 방법, 알파1G 단백질의 기능 억제제를 간질 예방제 또는 치료제로 사용하는 용도, 유전자 적중법에 의해 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 기능을 상실시켜 간질을 일으키지 않는 유전자 변이 생쥐 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
간질(epilepsy)은 뇌세포를 구성하는 신경세포 중 일부가 다양한 원인에 의하여 기능 이상을 일으키고, 이에따라 뇌세포가 비정상적으로 탈분극(depolarization)하여 비정상적인 뇌파가 만성적 또는 재발적으로 발생하여 발작(seizure)을 일으키는 신경계 질환이다. 간질발작은 누구에게나 일어날 수 있으며, 이 중 지속적인 치료가 필요한 간질환자는 인구 200명 당 1명 정도로 우리나라에서는 약 30만 명 정도의 간질환자가 있을 것으로 추산되며, 매년 약 3만 명의 새로운 간질환자가 발생될 것으로 추산된다. 간질 발생률은 성별 및 연령에 따라 차이가 있으며, 대체로 남자가 여자보다 약간 많은 것으로 알려져 있다. 20세 이전에 발병하는 경우가 전체 환자 수의 75%를 차지하며, 특히 출생 후부터 4세까지가 약 30%로 가장 높고, 20세가 지나면서 차차 낮아지다가 60세 이후에 다시 발생률이 높아진다.
간질발작은 사람마다 다양하게 나타나는데 이러한 발작이 뇌의 한 부위에서 국소적으로 발생하는냐, 아니면 뇌의 전반에 걸쳐 나타나느냐에 따라 부분(국소성) 발작(partial or focal seizures)과 전신성 발작(generalized seizures)으로 나눌 수 있다.
부분 발작(partial or focal seizures)은 비정상적으로 폭발되는 발작뇌파가 뇌피질의 어는 한 부분 또는 한쪽 반구에서 시작될 때 나타나는 발작 증세로, 이것은 경련하는 동안 의식이 있느냐 아니면 의식이 혼미해지느냐에 따라, 의식이 있는 상태에서 나타나는 단순 부분 발작(simple partial seizures), 의식을 잃은 상태에서 나타나는 복잡 부분 발작(complex partial seizures) 및 발작의 처음은 부분발작으로 시작하였다가 점차 진행하여 전신성 발작의 모양으로 바뀌는 2차성 전범화 발작(partial seizure evolving to secondarily generalized seizures)으로 나뉜다.
전신성 발작(generalized seizures)은 비정상적으로 발생하는 발작뇌파가 뇌전반에 걸쳐 한꺼번에 발생되는 발작 증세로, 발작하는 모양이나 뇌파에 따라 하기와 같이 여러 가지 형으로 나눈다. 결신발작(Absence seizures)은 잠깐 동안 의식이 소실되는 발작으로 멍하게 눈을 뜨고 있거나 눈을 깜박거리는 증세를 나타내며, 소발작이라고도 한다. 긴장-간대성 발작(tonic-clonic seizures)은 정신을 잃은 상태에서 전신이 굳어지거나 사지가 힘이 들어갔다가 풀렸다가 하는 모양이 반복하는 증세를 나타내며, 대발작이라고도 한다. 근간대성 발작(myoclonic seizures)은 매우 짧은 기간 동안 쇼크와 같은 근육의 경연을 일으키는 증세를 나타내며, 비긴장성(실조성) 발작(Atonic seizures)은 갑자기 전신의 힘이 빠지면서 쓰러지거나 고개를 떨어뜨리는 증세를 나타내며, 소운동 발작이라고도 한다.
이상의 발작들이 전체 간질 발작 중에 차지하는 비율은 복합 부분 발작의 경우가 36%, 전신성 발직이 23%, 단순 부분 발작이 14% 및 불확실 부분 발작이나 미분류 발작들이 27%를 차지한다.
이러한, 간질의 치료방법으로는 항발작제를 이용한 약물 치료가 일부 사용되어지고 있는데 대부분의 항발작제는 혈관이나 기관에 이상을 가져오는 등 부작용이 많이 나타나고 있다. 이렇게 간질의 치료가 어려운 실정은 발작에 대한 기전이 거의 규명되어 있지 아니하여 사용할 수 있는 치료제가 극히 제한되어 있기 때문이다. 따라서 발작의 기전을 이해하고 이에 따른 간질 치료제의 개발이 매우 시급한 실정이다.
기존에 발작의 기전에 대한 연구 결과를 살펴보면 다음과 같다. 결신발작(absence seizures)은 잠깐동안 의식을 잃는 것으로 뇌파계에서 3 Hz의 대칭적으로 동일한 SWDs(spike-and-wave discharges; 이하 "SWDs"라 약칭한다)로 나타난다(Niedermeyer, clin. Electroencephalogr., 1996, 27, 1-21; Willams, Brain, 1950, 67, 50-69). 기존의 연구에 의하면 신피질(neocortical)과 시상(thalamic) 뉴런이 SWDs의 생성에 관련이 있다(Steriade and Contreras, J. Neurophysiol., 1998, 80, 1439-1455; Avoli and Gloor, Epilepsial, 1981, 22, 443-452; Pellegrini et al., Exp. Neurol., 1979, 64, 155-173). γ-부티로락톤(γ-butyrolactone), (RS) γ-바크로펜((RS) γ-baclofen) 혹은 비큐큘린메토브로마이드(bicucullinemethobromide)를 복강 내에 주사하면 SWDs가 유발되어 결신발작을 일으키는 것으로 알려져 있고, 4-아미노피리딘(4-amynopyridine)은 긴장-간대성 발작을 유발한다.
여러 약학적 연구에 의하면 GABAB 수용체가 SWDs의 생성에 중요한 역할을 한다고 알려졌다(Crunelli and Leresche, Trends Neurosci., 1991, 14, 16-21). GABAB 수용체의 촉진제(agonist)는 발작을 악화시키는 반면 GABAB 수용체의 길항제(antagonist)는 발작을 억제한다(Hosford et al., Science, 1992, 257, 393-401; Smith and Fisher, Brain. Res., 1996, 729, 147-150; Snead, Eur. J. Pharmacol., 1992, 213, 343-349). 항발작제인 크로나제팜(clonazepam)은 시상피질 중계 뉴런(thalamocortical relay neuron; 이하 "TC 뉴런"이라 약칭한다)에서 GABAB-매개적 저해 후시냅스 전위(GABAB-mediated inhibitory postsynaptic potentials; IPSPs)를 감소시키는 작용을 한다고 생각되어지고 있다(Gibbs et al., J. Neurophysiol., 1996, 76, 2568-79; Huguenare and prince, 1994).
GABAB 수용체의 활성에 의해 유도된 막 전위의 과분극(hyperpolarization)은 TC 뉴런에서 반발 폭발 방전(rebound burst discharges)을 유발한다(Crunelli and leresche, Trends. Neurosci., 1991, 14, 16-21; McCormick and Bal, Curr. Opin. Neurobiol, 1994, 4, 550-56). 이러한 TC 뉴런의 발화(firing) 형태는 저역치 칼슘 전위(low-threshold Ca2+ potentials; 이하 "LTCPs"라 약칭한다)에 의해 유발된다. 따라서 저역치 T-타입 칼슘 이온 통로(low-threshold T-type Ca2+ channels)는 시상피질(thalamocortical) 네트워크에서 결신발작의 발생에 관련되어 있을 것이라 생각되어 왔다(Coulter et al., Ann. Neurol., 1989, 25, 582-593; Crunelli and Leresche, Trends. Neurosci., 1991, 14, 16-21 1991). 상기와 같은 보고들은 결신발작의 치료에 효과적인 에토석시미드(ethosuximide)와 같은 약이 시상 뉴런에서 T-타입 칼슘 이온 전류(I
T)를 감소시킴으로서 항-결신(anti-absence) 작용을 나타내는 것으로 알려져 왔다(Coulter et al., Ann. Neurol., 1989, 25, 582-593; Kostyuk et al., Neuroscience, 1992, 51, 755-758). 또한 T-타입 칼슘 이온 통로는 자연적 결여 간질의 모델인 스트라스보그로부터의 유전적 결신 간질 쥐(genetic absence epilepsy rat from Strasbourg; GAERS)의 시상 뉴런에서 점차 증가한다는 보고가 있었다(Talley et al., Brain. Res. Mol., 2000, 75, 159-165; Tsakiridou et al., J. Neurosci., 1995, 15, 3110-7)
그러나, 최근의 연구결과에 의하면 결신발작의 발생에 T-타입 칼슘 이온 전류(I
T)의 역할에 대해 확신할 수 없게 되었다. 그 예로 에토석시미드는 T-타입 칼슘 이온 전류를 억제하지 못했고, 대신에 TC 뉴런에서 불활성이 아닌 소듐 이온 통로와 칼슘-활성(calcium activated) 통로와 같은 다른 통로에 영향을 주었다(Leresche et al., J. Neurosci., 1998, 18:4842-53). 다른 연구는 생체 내(in vivo)에서 GARES의 TC 뉴런의 세포 내 레코딩에서 대다수의 뉴런이 GABAA-매개 IPSPs와 흥분 후시냅스 전위(excitatory postsynaptic potentials; EPSPs)가 주기적으로 생기고, 뉴런의 단지 5%만이 SWDs 동안 긴장 과분극(tonic hyperpolarization)/LTCPs를 나타낸다(Pinault et al., J. Physio(Lond)., 1998, 509, 449-456). 따라서 TC 뉴런에서 T-타입 칼슘 이온 통로가 SWDs의 생성에 관련이 있는지에 대한 직접적인 증거가 없는 상태이다.
이에, 본 발명자들은 TC 뉴런에서 T-타입 칼슘 이온 통로가 SWDs를 유발하는 결신발작의 생성에 직접적으로 관련이 있는지에 대하여 연구한 결과, T-타입 칼슘 이온 통로의 구성 성분인 알파1G 단백질의 기능이 상실된 유전자 변이 생쥐가 결신발작을 일으키지 않는다는 것을 밝혀내어 알파1G 단백질의 기능을 억제하면 간질을 일으키지 않는다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 기능을 억제하여 간질을 일으키지 않게 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 기능을 억제하여 간질을 일으키지 않게 하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 알파1G 단백질의 기능 억제제를 간질 예방제 또는 치료제로의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유전자 적중법에 의해 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 기능을 상실한 유전자 변이 생쥐를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 알파1G 유전자 변이 생쥐의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 기능을 억제하여 간질을 일으키지 않게 하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 작용을 알아보기 위하여, 유전자 적중법을 사용하여 알파1G 유전자 변이 생쥐를 제조하였다. 유전자 적중법(gene targeting)은 적중 벡터를 염색체 상의 특정 유전자에 도입함으로써 게놈 중의 특정 유전자를 파괴한 후 이 파괴된 유전자를 가지는 생물의 병리 현상을 통해 개체 수준에서 파괴된 유전자의 본래 기능을 연구하는 방법이다.
본 발명에서는 T-타입 칼슘 이온 통로의 소공형성 구성단위(subunit)를 암호화하는 알파1G 유전자의 일부를 결실시켜, 알파1G 단백질의 기능을 억제시킨 유전자 변이 생쥐를 만들고 상기 알파1G 유전자 변이 생쥐를 이용하여 발작의 기작을 연구하였다.
알파1G는 T-타입 칼슘 이온 통로의 소공형성 구성 단위를 이루는 단백질로 주로 시상피질 중계 뉴런(thalamocortical relay neuron; 이하 "TC 뉴런"이라 약칭한다)에서 현저하게 발현되고 시상 망상 뉴런(thalamic reticular neuron; 이하 "nRT 뉴런"이라 약칭한다)에서는 거의 발현되지 않는 것으로 알려져 있으나(Talley et al., J. Neurosci., 1999, 19, 1895-1911; Talley et al., Brain. Res. Mol., 2000, 75, 159-165), 알파1G의 생체 내 고유한 역할에 대해서는 현재까지 알려져 있지 않다.
이에, 본 발명자들은 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G의 생체 내 역할을 정확하게 규명하기 위하여, 바람직한 실시예로서 형질전환 동물의 생산 및 유전자 적중법에 의한 돌연변이 연구에 가장 널리 사용되는 생쥐를 이용하여 칼슘 이온 통로 알파1G 단백질의 기능을 상실한 유전자 변이 생쥐를 제조하였다. 본 발명의 유전자 변이 생쥐는 알파1G 유전자의 결손이 두 벌의 상동염색체 모두에서 발생한 것으로 칼슘 이온 통로 알파1G -/-의 유전자형을 가지는 동형접합체(homozygotes)이다. 상기 유전자 변이 생쥐는 정상적으로 출생하여 정상 생쥐와 같은 수명을 갖고 있고, 암수 둘 다 정상 생쥐와 교배했을 때 정상적인 생식능력을 갖고 있다. 또한, 시상, 피질 및 소뇌에서 알파1G 유전자 발현은 변화가 없고 심장, 췌장, 간 및 신장과 같은 기관에서도 해부학적 결함은 찾을 수 없다.
정상적인 TC 세포에서는 대기 전위(holding potentials)가 변하면 LVA(low-voltage activated; 이하, "LVA"라 약칭한하다) 칼슘 이온 전류가 생기지만, 본 발명의 알파1G -/- 생쥐의 TC 뉴런에서는 칼슘 이온 전류가 변하지 않는 것으로 보아 알파1G가 TC 뉴런에서 T-타입 칼슘 이온 통로의 중요한 성분임을 알 수 있다. 또한, TC 세포에서 HVA(high-voltage activated) 칼슘 이온 전류를 측정하였을 때는 정상과 알파1G -/- 생쥐에서 양적인 차이가 거의 나타나지 않는 것으로 보아, 본 발명의 알파1G -/- 생쥐는 TC 뉴런에서 HVA 칼슘 이온 전류에는 정상적인 활성을 나타내고, LVA 칼슘 이온 전류의 활성에만 반응을 나타내지 않는다는 것을 알 수 있다. HVA 칼슘 이온 전류는 휴지막 전위(-55 ~ -65 mV)보다 높은 전위에서 활성화되는 칼슘이온전류이고, LVA 칼슘 이온 전류는 휴지막 전위(-55 ~ -65mV)보다 낮은 전위에서 활성화되는 칼슘이온전류이다.
또한, 본 발명의 알파1G -/- 생쥐의 TC 뉴런에서 T-타입 칼슘 이온 전류의 상실이 내재 발화 성질(intrinsic firing properties)에 어떠한 영향을 주는지 알아보면, 본 발명의 알파1G -/- 생쥐는 긴장 모드 발화(tonic mode firing)는 정상적인 패턴을 보여주는 반면 폭발 모드 발화(burst mode firing)는 거의 나타나지 않고, 특히 시상(thalamus)에서 결신발작을 일으키는 GABAB 수용체의 활성에 대한 반응인 SWDs의 발생을 억제한다. 따라서, 알파1G를 포함하는 T-타입 칼슘 이온 통로에 의해 매개되는 내재 발화(intrinsic firing) 패턴의 조절은 결신발작의 생성에 중요한 역할을 한다. 알파1G -/- 생쥐는 긴장-간대성 발작이나 결신발작을 제외한 다른 전신성 발작에는 정상적인 반응을 나타내는 것으로 보아, 결신발작만 특이적으로 생성되지 않는다는 것을 알 수 있다.
따라서, 알파1G 단백질의 기능을 억제하면 결신발작을 일으키지 않으므로, 알파1G 단백질의 기능을 억제하면 결신발작 증세를 나타내는 간질이 나타나지 않게 된다.
또한, 본 발명은 상기 알파1G 단백질의 기능 억제제를 간질 예방제 또는 치료제로의 용도를 제공한다.
본 발명은 알파1G 단백질 기능 억제제를 중추신경계에 투여하여 간질을 예방하거나 치료할 수 있다. 중추신경계에서 T-타입 칼슘 이온 통로의 구성성분인 알파1G 단백질의 기능을 억제하면 결신발작을 일으키지 않는다. 따라서, 알파1G 단백질의 기능 억제제를 투여하면 알파1G 단백질의 기능이 억제되어 결국은 결신발작을 일으키지 않게 되고, 결신발작 증세를 나타내는 간질을 치료할 수 있게 된다.
T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 기능을 억제하는 물질로는 니켈 (Nickel) 및 미베프라딜(mibefradil)등이 있다. 상기와 같은 알파 1G 단백질의 기능을 억제하는 물질들은 간질 예방제 또는 치료제로서 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 유전자 적중법에 의해 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 기능을 상실한 유전자 변이 생쥐를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 T-타입 칼슘 이온 통로의 구성성분인 알파1G 단백질의 기능을 상실한 알파1G -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자 변이 생쥐를 제공한다.
본 발명자들은 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G +/- 유전자형을 갖는 유전자 변이 생쥐의 수정란을 2001년 10월 4일부로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 10086BP). 본 발명의 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G -/- 유전자형을 갖는 유전자 변이 생쥐는 상기 알파1G +/- 형질을 갖는 수정란으로부터 얻어진 생쥐끼리의 교배를 통해서 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자 변이 생쥐의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은
(1) T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 유전자에 대한 적중벡터(targeting vector)를 생쥐 배아간세포에 도입하는 단계;
(2) 상기 배아간세포를 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 생쥐(chimera mouse)를 얻는 단계;
(3) 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 알파1G +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 생쥐를 얻는 단계; 및
(4) 상기 이형접합체 생쥐의 암컷과 수컷을 교배시키는 단계로 구성된다.
본 발명에서는 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 N-말단 부위가 상실된 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 적중 벡터를 유전자 적중(gene targeting) 방법을 사용하여 제조하였다. 본 발명의 적중벡터는 칼슘 이온 통로 알파1G N-말단 일부가 상실된 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 상동절편, PGK-neo 카셋트 및 3' 말단에 위치하는 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자 카셋트를 포함한다. 상기의 적중벡터는 상동 절편에서 동형재조합(homologous recombination)이 발생하고, 알파1G 단백질의 N-말단 부분이 상실되었기 때문에 정상적인 칼슘 이온 통로 알파1G 유전자가 발현되지 않는다.
알파1G 유전자의 적중이 확인된 배아간세포 클론을 배양한 후 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 생쥐를 제조하였다. 배아간세포가 주입된 포배아를 정관수술한 수컷과 교배시킨 후 2.5 p.c.된 가임신 대리모 생쥐의 자궁에 이식하여 키메라 생쥐로의 발생을 유도하고, 이로부터 약 19일이 경과된 후에 배아간세포 클론 및 생쥐의 포배아로부터 생성된 이형세포 교잡종의 일종인 키메라 생쥐가 생산되었다. 상기에서 선별된 알파1G +/-의 유전자형을 갖는 이형접합체 F1 생쥐 암컷과 수컷을 교배하여 본 발명의 알파1G -/- 유전자형을 갖는 동형접합체 F2 형질전환 생쥐를 얻었다.
이형접합체 생쥐의 교배에 의해 생산된 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G +/- 유전자형을 갖는 수정란을 2001년 10월 4일자로 생명공학 연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10086 BP).
본 발명은 또한 상기 수정란을 대리모에 이식하여 알파1G +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 유전자 변이 생쥐를 얻고, 이형접합체 유전자 변이 생쥐의 암컷과 수컷을 교배시켜 알파1G -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자 변이 생쥐의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 유전자가 결실된 적중벡터의 제작 및 형질도입
<1-1> 적중벡터의 제작
본 발명자들은 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 유전자의 일부가 결실된 유전자 변이 생쥐를 제조하기 위하여, 일반적으로 사용되는 유전자 적중법(gene targeting method)을 이용하였다.
우선, 생쥐 게놈으로부터 칼슘 이온 통로 알파1G 유전자(cacna1G)를 분리하기 위하여, 랫트의 칼슘 이온 통로 알파1G 유전자의 cDNA의 688-1008 부분에 해당하는 부위를 RT-PCR로 분리해 내고 이를 탐침(probe)으로 사용하여 129/svJae 생쥐 게놈 DNA 라이브러리(LamdaFixII, Stratagene)에 혼성화 반응을 수행하였다. 이로부터, 칼슘 이온 통로 알파1G 유전자를 가진 게놈 클론 파지를 선별한 후 제한 효소 지도, 서던 블럿 분석 및 염기서열 결정 등에 의하여 상기 파지 클론이 칼슘 이온 통로 알파1G 유전자인 것을 확인하였다.
칼슘 이온 통로 알파1G 유전자가 결실된 적중벡터를 제조하기 위하여, 상기 알파1G 유전자 클론에서 알파1G 단백질의 N-말단 부위 중 82-118 부분을 암호하는 부분을 제거하여 PSK-플라스미드 벡터(Stratagene Inc.) 에 클로닝하였다. 상기 알파1G 유전자의 일부가 결실된 것을 포함하는 적중벡터의 3' 상동절편 말단에는 유전자의 적중 효율을 높이기 위하여 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자 카셋트 및 음성선별 마커(negative selection marker)를 삽입하였다(도 1의 A).
<1-2> 배아간세포의 배양
상기 <1-1>로부터 제작된 적중벡터를 형질도입시키기 위한 세포주로 J1 배아간세포(embroinic liver cells)를 사용하였다. J1 배아간세포(미국, MIT 의 R. Jeanisch 로부터 분양받음)를 DMEM 배지(Gibco Co.)에 15% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, Hyclone Co.), 1x 페니실린-스트렙토마이신(phenicillin-streptomycin, Gibco Co.), 1x 비-필수 아미노산(Gibco Co.), 0.1 mM 2-머캅토에탄올이 첨가된 ES 배지에 접종한 후 37℃에서 2 내지 3일 동안 배양하였다. 상기 배양으로부터 얻은 배세포군에 0.25% 트립신이 포함된 1 mM EDTA 용액을 처리하여 단일세포들로 분리하였다.
<1-3> 적중벡터의 도입
상기 <1-2>에서 단일세포로 분리된 배아간세포에 실시예 <1-1>에서 제작한 적중벡터를 트랜스펙션(transfection)하기 위하여 일렉트로포레이션(electroporation)을 수행하였다. 구체적으로, 2x107 cells/㎖의 세포농도로 희석된 배아간세포에 <1-1>의 적중벡터 DNA 25 ㎍를 첨가하여 혼합한 후 270 V/500 μF 조건으로 전기충격을 가하였다. 상기 배아간세포를 0.3 mg/ml G418 및 2 μM의 간사이클로버가 포함된 ES 배지에서 5 내지 7일 동안 배양하여 동형재조합(homologous recombination) 방법에 의해 배아간세포 내 칼슘 이온 통로 알파1D 유전자가 적중벡터에 의해 정확하게 적중된 배아간세포 클론을 선별·유지하였다.
<1-4> 서던 블럿 분석
상기 <1-3>으로부터 선별된 배아간세포 클론 중에 칼슘 이온 통로 알파1D 유전자가 정확하게 적중된 클론을 찾기 위하여, 각 클론들의 게놈 DNA를 추출하여 서던 블럿 분석(southern blot analysis)을 실시하였다. 구체적으로, 각 클론들로부터 추출된 게놈 DNA를 제한효소 BamHI으로 절단한 후 도 1의 A의 막대기(━)로 표시된 부분을 DNA 탐침으로 이용하여 혼성화 반응을 수행하였다.
그 결과, 적중벡터가 도입되지 않은 정상세포에서는 8.6 kb 크기의 밴드만이 관찰되는데 반하여, 적중벡터가 도입되어 칼슘 이온 통로 알파1G 유전자가 결실된 클론에서는 8.6 kb 와 12.6 kb 크기의 두 개 밴드가 검출되었다(도 1의 B 참조). 따라서, 상기에서 선별된 클론이 적중벡터의 도입에 의해 칼슘 이온 통로 알파1G 유전자가 결실되었으며, 칼슘 이온 통로 알파1G +/-의 유전자형을 가지고 있음을 확인하였다. 칼슘 이온 통로 알파1G 유전자의 결실이 확인된 배아간세포 클론을 다시 ES 배지에 분주하여 18 내지 22 시간 동안 배양한 후 트립신을 처리하여 단일세포로 분리하고 생존한 세포만을 골라 미세주입에 사용하였다.
<실시예 2> 키메라(chimera) 생쥐의 제조
칼슘 이온 통로 알파1G +/-의 유전자형을 갖는 키메라 생쥐를 제조하기 위하여, 수정된 포배아 세포에 상기 <1-3>에서 선별된 배아간세포 클론을 미세주입하였다.
구체적으로, C57BL/6J 생쥐(Jackson Laboratory, USA) 암컷과 수컷을 교배시키고 교미 후 3.5일(3.5 p.c.)된 암컷을 경부탈구법으로 희생시켰다. 희생된 암컷으로부터 자궁을 적출하여 자궁 말단부를 가위로 절제한 후 1 ㎖ 주사기를 이용하여 20 mM HEPES, 10% 소 태아 혈청, 0.1 mM 2-머캅토에탄올 및 DMEM을 포함하는 주사 용액 1 ㎖을 관류시켰다. 해부 현미경하에서 미세 유리관을 사용하여 상기 자궁조직으로부터 포배아를 분리하였으며, 분리한 포배아를 35 mm 페트리디쉬 위에 미리 떨어뜨려 놓은 주사 용액 방울에 옮긴 후 후속하는 도입과정에 사용하였다.
이와 같이 분리한 포배아에 상기 <1-3>에서 선별된 배아간세포 클론을 도입하기 위하여, 미세주입기(Zeiss 사)를 이용하여 홀딩(holding) 피펫으로 포배아의 내부세포괴(inner cell mass) 방향을 음압으로 잡은 상태에서 10 내지 15개의 배아간세포 클론을 흡입한 주사 피펫을 포배아의 포배강내로 삽입한 후 양압을 주어 배아간세포 클론을 포배아의 포배강내로 주입하였다. 상기 클론이 주입된 포배아를 정관수술한 수컷과 교배시킨 후 2.5 p.c.된 가임신 대리모 생쥐의 자궁에 이식하여 배아간세포 클론(J1) 및 C57BL/6J 생쥐의 포배아로부터 형성된 이형세포 교잡종의 일종인 키메라 생쥐의 발생을 유도하였다. 이때, 자궁이식은 애버틴(avertine, 1 ㎎/㎏ 몸무게)으로 마취된 대리모의 복부를 1 ㎝ 정도 절제하고; 자궁 상부를 핀셋으로 집어 2 cm 정도 체외로 잡아당기고; 주사 바늘로 자궁에 구멍을 내어 이 구멍을 통하여 상기의 포배아를 미세유리관으로 주입하고; 내부 복강막을 봉합사로 두 바늘 꿰멘 다음 겉가죽을 내과용 클립으로 봉입하는 방법을 사용하였다. 이렇게 배아간세포가 주입된 포배아를 대리모 생쥐의 자궁으로 이식하여 약 19일 동안 배양함으로써 배아간세포 유래의 세포와 포배아 유래의 세포가 융합되어 게놈 내 칼슘 이온 통로 알파1G +/-의 유전자형을 가지는 키메라 생쥐를 확보하였다.
<실시예 3> 알파1G +/- 유전자형의 이형접합체 생쥐 제조
상기 실시예 2로부터 얻은 수컷 키메라 생쥐를 C57BL/6J 암컷 생쥐와 교배하여 얻은 자손들 중 유전적으로 안정화된 이형접합체 돌연변이 F1 형질전환 생쥐를 확보하였다. 상기 F1 형질전환 생쥐 자손들 중 칼슘 이온 통로 알파1G +/-의 유전형질을 갖는 이형접합체 생쥐를 선별하기 위하여 PCR을 수행하였다.
구체적으로, 생쥐 자손들로부터 게놈 DNA를 추출하기 위하여 생쥐 꼬리부분을 1.5 ㎝ 정도 크기로 잘라낸 후, 상기 조직을 100 mM Tris 완충용액(pH 8.0), 5 mM EDTA, 200 mM 염화나트륨 및 0.2% SDS로 구성된 용해 완충액 0.4 ㎖에 담가두었다. 상기 용액에 0.1 ㎎/㎖ 농도로 단백질 분해효소 K(proteinase K)를 첨가한 후 55℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액에 8 M 칼륨아세테이트 75 ㎕와 클로로포름 0.4 ㎖을 첨가하여 흔들어 준 후 4℃에서 10분 동안 방치하였다. 상기 반응액을 15,000 rpm에서 원심분리하여 상층액과 침점물을 분리한 후 상층액 0.4 ㎖에 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 게놈 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세척하고 건조시킨 후 증류수 50 ㎕에 용해시켜 PCR 반응에 사용하였다.
상기와 같이 추출된 생쥐 게놈 DNA 1 ㎕를 주형으로 사용하고 서열번호 1(F1), 서열번호 2(B1) 및 서열번호 3(PGK22)으로 기재되는 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이때, F1 및 B1 프라이머 세트는 대조군 알파1G 유전자의 288 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하고, PGK22 및 B1 프라이머 세트는 유전자 변이가 일어난 385 bp 크기의 DNA 단편을 증폭하도록 고안되었다. 이들의 대조구로 정상 생쥐와 이형접합체 생쥐로부터 추출한 DNA를 사용하였다.
그 결과, 적중된 알파1G 유전자가 증폭된 385 bp 크기의 밴드와 정상적인 알파1G 유전자가 증폭된 288 bp 크기의 밴드가 두 개 검출된 생쥐를 확인하고, 이를 알파1G +/-의 유전자형을 갖는 이형접합체 생쥐로서 선별하였다(도 1의 C 참조).
<실시예 4> 알파1G -/- 유전자형의 동형접합체 유전자 변이 생쥐의 제조
상기 실시예 3에서 선별된 알파1G +/-의 유전자형을 갖는 이형접합체 생쥐 암컷과 수컷을 교배하여 알파1G -/- 유전자형을 갖는 동형접합체 형질전환 생쥐를 얻었다. 상기 동형접합체 형질전환 생쥐가 게놈 내 알파1G -/- 유전자형을 갖는지를 확인하기 위하여 서던 블럿 분석 및 PCR을 수행하였으며, 형질전환 생쥐에서 알파1G 단백질이 발현되지 않음을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
<4-1> 서던 블럿 분석(southern bloy analysis)
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 형질전환 생쥐의 꼬리 조직으로부터 게놈 DNA를 분리한 후 제한효소 BamHI으로 절단하였다. 상기 생쥐 DNA에 대해 실시예 <1-4>의 파지 DNA로부터 DNA 탐침을 사용하여 혼성화 반응을 수행하였다. 이 때, 정상 생쥐로부터 추출한 게놈 DNA와 알파1G +/-의 유전자형을 갖는 이형접합체 형질전환 생쥐로부터 추출한 게놈 DNA를 대조구로 사용하였다.
도 1의 B에 나타낸 바와 같이, 대조군인 정상 생쥐(레인 1)는 정상적인 칼슘 이온 통로 알파1G 유전자 유래의 8.6 kb 크기의 밴드가 검출되었고, 이형접합체(레인 2)는 칼슘 이온 통로 알파1G +/- 유전자 유래의 8.6 kb 및 12.6 kb 크기의 두 개 밴드가 함께 검출되었다. 반면, 동형접합체(레인 3)는 알파1G -/-의 유전자 유래의 12.6 kb 크기의 밴드만이 검출됨으로써, 본 발명의 동형접합체 형질전환 생쥐가 알파1G -/- 유전자의 유전형질을 갖고 있음을 확인하였다(도 1의 B).
<4-2> PCR(polymerase chain reaction)
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 형질전환 생쥐의 꼬리 조직으로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 게놈 DNA 1 ㎕를 주형으로 사용하고 실시예 3과 동일한 프라이머를 사용하여 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다.
도 1의 C에 나타낸 바와 같이, 대조구인 정상 생쥐(레인 1)는 정상 알파1G 유전자가 증폭된 288 bp 크기의 PCR 산물이 검출되었고, 이형접합체(레인 2)는 알파1G +/- 유전자가 증폭된 288 bp 및 385 bp 크기의 PCR 산물이 검출되었다. 반면, 동형접합체(레인 3)는 알파1G -/-의 유전자가 증폭된 385 bp 크기의 PCR 산물만이 검출됨으로써, 본 발명의 동형접합체 형질전환 생쥐가 알파1G -/- 유전자의 유전형질을 갖고 있다는 상기의 서던 블럿 분석 결과와 일치함을 확인하였다.
<4-3> 항체 제조 및 웨스턴 블럿 분석(western blot ananlysis)
알파1G -/- 유전자의 유전형질을 갖고 있는 본 발명의 유전자 변이 형질전환 생쥐에서 실제적으로 알파1G 유전자가 발현되지 않음을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)을 수행하였다.
알파1G -/-에 대한 항체는 서열목록 4로 기재되는 것으로 이루어진 부분을 에피토프(epitope)로 사용하였다. 서열목록 4로 기재되는 펩타이드를 키홀 림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin)과 접합(conjugated)하여 토끼에 주사하였다. 혈청(CW53)은 독특한 시스테인 결합에 의해 항원 펩타이드를 고정시킨 설포링크(Sulfolink) 컬럼으로 친화-정제(affinity-purified) 하였다. 이 컬럼은 TBS로 씻어내고, 항체는 농도를 높이하여 추출하여 하룻밤 동안 투석시켜 사용하였다.
웨스턴 블럿을 위한 단백질을 분리하기 위해 먼저, 정상 생쥐와 동형접합체 형질전환 생쥐를 경부탈구법으로 희생시킨 후 두개골을 절개하여 대뇌(cerebrum)를 분리하였다. 분리된 대뇌 조직에 단백질 분해 억제제가 첨가되지 않은 용해액(50 mM Tris 완충용액(pH 7.4), 1 mM EGTA, 1 mM DTT 및 1 mM PMSF) 및 상기 용해액에 단백질 분해 억제제로 칼페인 억제제 I 과 II(Boehringer Mannheim)가 혼합된 용해액을 각각 첨가한 후 조직을 분쇄하였다. 상기 조직액을 1,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액과 침전물을 분리한 후 상층액만을 취하여 다시 28,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하여 대략의 세포막 단백질을 얻었다. 상기 세포막 단백질을 8 내지 16% 아크릴아미드 젤에 전기영동한 후 단백질을 젤로부터 니트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane, PROTRAN, Schleicher & Schuell 사)으로 옮겼다. 상기 니트로셀룰로오스 막에 5% 탈지유가 포함된 TTBS 완충액(10mM Tris 완충용액(pH 7.5), 150 mM 염화나트륨, 0.05% tween 20)을 처리한 후 칼슘 이온 통로 알파1G에 대한 단일항체를 처리하여 혼성화 반응을 수행하였다. 칼슘 이온 통로 알파1G 단백질에 결합한 단일항체를 검출하기 위하여 퍼옥시다제(peroxidase)가 융합된 항-생쥐 IgG 항체를 첨가한 후 ECL 키트(Amersham)를 사용하여 발색반응을 유도하였다.
그 결과, 정상 생쥐의 대뇌 조직으로부터는 알파1G 단백질이 검출된 반면, 유전자 변이 생쥐의 대뇌 조직에서는 알파1G 단백질이 검출되지 않았다. 따라서, 본 발명의 유전자 변이 생쥐에서는 알파1G 유전자가 결실되어 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질이 발현되지 않음을 확인하였다(도 1의 D).
<4-4> 알파1G -/- 생쥐의 기능적 결함 분석
본 발명의 알파1G 유전자 변이 생쥐에서 유전자의 기능적 결함을 확인하기 위해 알파1G -/-와 대조군의 TC(thalamocortical relay) 뉴런에서 LVA(low-voltage activated) T-타입 칼슘 이온 전류의 전세포 전압-집게(whole-cell voltage-clamp) 분석을 실시하였다. 정상 TC 뉴런에서는 대기 전위가 -100 mV에서 -40 mV로 단계별 전압이 변하면, 50 밀리초(millisecond) 내에서 완전히 불활성화된 LVA 칼슘 이온 전류를 일으킨다. 반면 동일한 방법으로 알파1G -/- TC 뉴런에서는 칼슘 이온 전류가 변하지 않았다(도 2의 A). 상기 결과는 알파1G가 TC 뉴런에서 T-타입 칼슘 이온 통로의 중요한 성분임을 말해준다.
또한, 본 발명자들은 -50 mV에서 10 mV의 탈분극 전압 단계를 이용하여 HVA(high-voltage activated) 칼슘 전류를 측정하였다(도 2의 B). 대조군(n=5)과 알파1G -/-(n=5)의 TC 뉴런은 느린 비활성 HVA 칼슘 이온 전류를 생산하고 여기서 대조군과 알파1G -/-에서는 양적인 차이가 거의 나타나지 않는다. 상기 결과는 알파1G -/-는 TC 뉴런에서 HVA 칼슘 전류 활성에 영향을 끼치지 않는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 알파1G -/- 생쥐는 HVA T-타입 칼슘 이온 전류의 활성은 정상적이지만, LVA T-타입 칼슘 이온 전류의 활성은 나타나지 않는 기능적 결함을 갖고 있다는 것을 알 수 있다.
또한, 알파1G -/- 생쥐 뇌의 발생은 니슬(Nissle) 스테인 연속 절단의 분석을 통해서 보면 정상적인 발생을 하는 것으로 나타났다. 시상, 피질(cortex), 소뇌(cerebellum)와 같은 대부분의 세포구축학(cytoarchitectonic) 분할에서 알파1G 유전자의 발현은 변화가 없었다. 심장, 췌장, 장, 간 및 신장과 같은 기관에서도 해부학적인 결함은 찾을 수 없었다.
<실시예 5> 알파1G -/- 생쥐의 폭발모드 및 긴장모드 패턴 분석
본 바령의 알파1G유전자 변이 생쥐가 T-타입 칼슘 이온 전류의 상실로 인하여 복측기저부 복합체 내에 위치한 TC 뉴런의 내재 발화 성질(intrinsic firing properties)에 어떠한 영향을 주는지 확인해 보았다.
바이브라톰(vibratome)을 사용하여, 복측기저부 복합체에 해당하는 350 ㎛ 두께의 관상(coronal) 조각 (보통 정수리(bregma)에서 -1.2와 -1.5 ㎜ 사이 이다)를 산소화된(oxygenated) 차가운 ACSF(artificial cerebrospinal fluid, 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM MaH2PO4, 2 mM CaCl2, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM dextrose pH 7.4)에 준비하였다. 이 조각을 따뜻하고 습기찬(30 ℃, 95 % O2/5 % CO2) 레코딩 챔버(recording chamber)에서 공기와 ACSF 접촉면에 두었다. 세포내 레코딩 전극(intracellular recording electrode, borosilicate glass, 40-80 M)을 3 M 포타슘 아세테이트(potassium acetate)로 채우고 복측기저부 복합체에 위치하도록 하였다. 복측기저부 복합체는 내측 융대(medial leminiscus)와 내부 캡슐(internal capsules)을 표시물로 사용하여 해부 현미경(World precision)하에서 확인하였다. 커페시턴스(capacitance)와 레코딩 전극(recording eletrode, AxoClamp-2B; Axon instruments)을 통한 전류 주입을 허용하는 활성 다리(active bridge)를 사용하는 고-임피던스 증폭기(high-impedance amplifier)에 의해 시그널이 증폭되었다. 데이터 분석 프로그램은 pCLAMP, Axoscope (Axon Instruments)와 SigmaPlot (SPSS)을 사용하였다.
대조군(n=35)에서 휴지막 전위(resting membrane potential)는 61±4.7 mV이고 알파1G -/-(n=33)의 휴지막 전위는 59±3.7 mV(Student t-test, P>0.05)이다. 유입 저항(input resistance)은 대조군에서 87.7±15 ㏁ 이고 알파1G -/-에서는 93.1±8 ㏁ 이었다(Student t-test, P>0.05).
정상의 TC 세포에서 음전류 유입을 -70 mV의 대기막 전위(holding membrane potetial)로 주었을 때는, 반발(rebound) LTCP가 200-500 ㎐의 진동수(frequency)로 활동 전위(action potentials)의 폭발(burst)로 촉발되었다(50개의 세포 중 47개, 94%, 도 3의 A). 또한 -80 mV의 대기막 전위의 양전류로 주었을 때도 폭발-모드 발화(burst-mode firings)를 유발하였다(Huguenard and Prince, J. Neurophysiol., 1994, 71, 2576-81). 하지만 본 발명의 알파1G -/-의 TC 뉴런에서는 활동 전위의 폭발 발화(burst firing)는 관찰되지 않았다(36개의 세포중 0개, 0%). 그러나 알파1G -/- TC 뉴런에서는 탈분극 전류 유입의 양을 증가시키면 많은 수의 활동 전위가 유발되고(도 3의 B) 이때의 진동수는 활동 전위의 긴장 발화(tonic firing)의 진동수와 같다(100-200 ㎐). 이를 테스트하기 위해 대조군과 알파1G -/-의 TC 세포에서 -60 mV에서 탈분극 양전류에 의해 촉발된 긴장-발화(tonic-firing) 패턴을 비교해 보았으나, 스파이크의 패턴이나 발생된 스파이크 수에는 별다른 차이가 없었다(도 3의 C).
폭발 모드에서 스파이크이 수는 대조군과 알파1G -/- 의 TC 뉴런에서 양적인 차이를 보이나 긴장-모드 발화(tonic-mode firings)에서는 별 차이가 없었다(도 3의 D). 상기 결과는 알파1G -/- 유전자 변이 생쥐는 TC 뉴런에서 긴장 모드 발화에는 영향을 주지 못하고, 폭발-모드 발화에만 선택적으로 영향을 준다는 것을 나타낸다. 긴장-모드 발화는 발화간격이 길어 정보를 전달하는 역할을 수행하고, 폭발-모드 발화는 발화간격이 매우 짧은 형태의 발화로서 간질현상과 연관되어 있다.
<실시예 6> 알파1G -/- 생쥐의 SWDs(spike-and-wave discharges) 생성 분석
생체 내(in vivo)에서 SWDs의 발생 과정 중에서 알파1G의 역할을 알아보기 위해 결신발작을 유도하는 (RS)-바클로펜 ((RS)-baclofen) 혹은 γ-하이드록시부틸산 (γ-hydroxybutyric acid)의 프로드럭 (prodrug)인 γ-부티로락톤 (γ-butyrolactone)을 대조군과 알파1G -/- 유전자 변이 생쥐에 주입하였다. 상기 약에 의해 유도되는 결신발작은 양측 동기(bilaterally synchronous) SWDs의 특징을 나타내고 행동 정지(behavioral arrest), 안면 간대성 근경련(facial myoclonous)과 진모 연축(vibrissal twitching)과 같은 행동을 나타낸다. γ-부티로락톤을 70 ㎎/㎏으로 주입했을 때, 대조군(n=8)의 경막외(epidural) EEG는 3-5 Hz 발작성(paroxysmal) SWDs로 나타났으면(도 4의 A), 반면 알파1G -/- (n=8)에서는 단기 지속의 3-4 ㎐ 양측 동기 진동이 산발적으로 관찰되었느나, 전형적인 SWD 패턴은 나타나지 않았다(도 4의 A). 또한, 20 ㎎/㎏의 (RS)-바클로펜을 주입했을 때 대조군은 3-4 ㎐ SWDs가 나타나는 반면, 알파1G -/- 생쥐에서는 SWDs가 생성되지 않았다(도 4의 B). 약을 투여한지 30분 동안의 대조군과 알파1G -/- 생쥐 사이의 SWDs 생성의 양적인 차이는 도 4의 C에 나타내었다(ANOVA, p<0.001).
따라서, 본 발명의 알파1G -/- 생쥐는 결신발작을 일으키는 (RS)-바클로펜 ((RS)-baclofen) 혹은 γ-부티로락톤 (γ-butyrolactone)에 의해 SWDs가 생성되지 않아서 결신발작을 나타내지 않고, 이는 알파1G 단백질의 기능이 억제되는 결신발작이 일어나지 않는다는 것을 알 수 나타낸다.
<실시예 7> 알파1G -/-의 바클로펜-매개 과분극에 대한 시상내 진동(oscillation)의 분석
상기 실시예 6의 결과를 다시 한번 확인하기 위해 자유롭게 움직이는 동물에서 깊이 전극(depth electrodes)을 이용하여 시상 핵(thalamic nuclei)의 필드 활성(field activity)을 관찰하였다. 육안 관찰로 볼 때 대조군과 알파1G -/-의 필드 활성은 큰 차이가 없었다(도 5의 A). 그러나 10-12 ㎐ 진동수의 활성에서는 대조군보다 알파1G -/-의 시상(thalamus)에서 더 약하게 나타났다(도 5의 B). 시상 SWDs를 관찰하는데 20 ㎎/㎏을 주사하였을 때는 3-4 ㎐ 발작성(paroxysmal) SWDs가 발생되는데(도 4의 B), 30 ㎎/㎏을 주사할 경우에는 경막외(epidural) EEG에서 2-3 ㎐ 진동수에서 작은 감소와 함께 SWDs의 지속이 증가된다. 대조군의 시상에서는 30 ㎎/㎏의 바클로펜 (baclofen)에 의해 선명히 2-3 ㎐ SWD가 유발되는데 알파1G -/-에서는 이런 동기 활성(synchronized activity)이 관찰되지 않는다(도 5의 A). 대조군에서는 바클로펜의 투여는 모든 시상 활성을 2-3 ㎐ SWDs로 동일시 된다(도 5의 B 왼쪽). 그러나 알파1G -/- 시상에서는 바클로펜의 투여가 진동수의 넓은 범위에서 피크의 진폭을 감소시키는데 이것은 마치 일반 비동기(general desynchronization)를 일으키는 것과 같다(도 5의 B 오른쪽). 상기 결과는 본 발명의 알파1G -/- 생쥐는 바클로펜에 의해 생성되는 결신발작을 일으키지 않는다는 것을 나타낸다.
<실시예 8> 알파1G -/- 생쥐에 GABA
A
길항제(antagonist) 투여 후 SWDs 생성 분석
GABAA의 길항제(antagonist)인 비큐큘린(bicuculline)을 피질(cortex)에 전신투여 혹은 국부 주사하면 피질 영역으로부터 주로 일어나는 SWDs를 유발하는 것으로 알려져 있다(Steriade and Contreras, J. Neurophysiol., 1998, 80:1439-55). SWDs의 피질-의존적(cortex-dependent) 기작에서 알파1G의 역할을 알아보기 위해 비큐큘린메토브로마이드(bicucullinemethobromide, 이하 "BMB"라 약칭한다)를 생쥐의 복막안(peritoneal cavity)에 10 ㎎/㎏ 주사한 후에 EEG 패턴을 관찰하였다.
그 결과, 피질(cortex)과 시상(thalamus)의 동시 EEG 레코딩은 BMB 투여 5분 내에 피질에서 발작 스파이크가 시작되고(도 6의 A), 진폭(amplitude)이 증가하고(
도 6의 B) 또한 시상과 피질 양쪽에서 매우 동시에 일어나는 SWDs를 보여준다(도 6의 C). 반면 바클로펜을 투입한 경우에 알파1G -/- 생쥐에서는 BMB에 반응하여 SW-유사 활성을 나타낸다. 그러나 비큐큘린 유도 발작의 복잡성 때문에 알파1G -/-와 대조군에서 SWDs 발생의 양적인 차이가 있는지는 결론을 내릴 수 없었다. BMB 투여시 본 발명의 알파1G -/- 생쥐는 처음에 진모 연축(vibrissal twitching)을 하지만 나중에는 갑작스런 점프를 하거나 자세를 조절하지 못하는 복잡한 행동 형태로 나타내었다. 따라서 상기에서 관찰되는 본 발명의 알파1G -/- 생쥐의 BMB-유도 SWDs는 전신성 발작(generalized seizures)의 다른 타입과 관련되어 있다는 것을 나타낸다.
<실시예 9> 알파1G -/- 생쥐의 발작 저항에 대한 특이성 분석
본 발명자들은 알파1G -/- 생쥐의 발작 저항(seizure resistance)이 결신발작에만 특이적으로 일어나는 것인지 확인해 보았다. 포타슘(patassium) 이온 통로의 길항제(antagonist)인 4-아미노피리딘(4-aminopyridine, 이하 "4-AP"라 약칭한다)을 복막안에 주사하면 경련성(convulsive) 발작을 일으킨다. 4-AP는 막전위를 탈분극함으로서 막 흥분(membrane excitability)을 일으켜, 행동 레벨(behavioral level)에서 변연발작(limbic seizures)에 의해 특징되는 간질형태 방전(epileptiform discharge)을 일으킨다(Avoli, Epilepsia, 1996, 37:1035-42). 생쥐를 10 ㎎/㎏의 4-AP로 처리했을 때 모든 생쥐는 긴장-간대성 발작(tonic-clonic seizures)을 나타냈다(C57BL/6J, n=10; 129/sv, n=10). 2 ㎎/㎏으로 처리했을 때는 25%의 생쥐에서 긴장-간대성 발작을 나타냈다(C57BL/6J, n=10; 129/sv, n=10). 4-AP를 10 ㎎/㎏으로 주사하면 대조군과 알파1G -/- 생쥐 모두에서 30-40분 후에 활발한(vigorous) 발작성 방전(ictal discharges)을 나타내었다(도 7의 A). 이러한 발작성 방전의 EEG 패턴은 바클로펜이나 비큐큘린에 의해 유도된 스파이크-웨이브 발작(spike-and-wave seizures)에서 관찰되는 것과는 매우 다르다. 행동 증상에 의해 등급화된 4-AP에 의해 유도되는 발작의 정도는 대조군과 알파1G -/- 생쥐에서 양적인 차이가 없는 것으로 나타났다(도 7의 A, student t test, p>0.05). 4-AP를 낮은 수준인 2 ㎎/㎏으로 투여했을 때 비슷한 감수성을 보여준다.
2 또는 10 ㎎/㎏의 4-아미노피리딘에 의해 유도된 전신성 발작의 발작 스코어를 도 7의 B에 나타내었고 행동 발작을 비디오 모니터링 후 하기와 같은 기준으로 측정하였다. 0; 행동의 변화가 없음, 1; 머리의 가벼운 떨림, 2; 자세 콘트롤을 잃고 몸 전체의 떨림, 3; 난폭히 뛰거나, 점프 혹은 다리의 긴장-간대성 행동, 4; 몸 전체의 긴장 신축 혹은 사망. 4-아미노피리딘에 의해 유도된 발작의 정도는 대조군과 알파1G -/-에서 양적인 차이가 없었다.
따라서, 본 발명의 알파1G -/- 생쥐는 정상적인 긴장-간대성 발작을 나타내지만, 결신발작에만 특이적으로 반응을 나타내지 않는다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질의 기능을 상실시킨 유전자 변이 생쥐는 결신발작을 일으키지 않으므로, 알파1G 단백질의 기능을 억제하며 간질을 예방하거나 치료할 수 있고, 알파1G 유전자 변이 생쥐는 간질과 관련된 기작을 연구하는 동물모델로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1의 A는 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 유전자 구조, 적중벡터의 구조 및 적중벡터로 적중된 변이형 알파1G의 유전자 구조이고
도 1의 B는 본 발명의 유전자 변이 생쥐의 알파1G -/- 유전자형을 서던블럿 분석(Southern blot analysis)으로 확인한 결과이고,
도 1의 C는 본 발명의 유전자 변이 생쥐의 알파1G -/- 유전자형을 PCR(polymerase chain reaction)로 확인한 결과이고,
도 1의 D는 본 발명의 알파1G 유전자 변이 생쥐의 뇌조직에서 T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질이 발현되지 않음을 웨스턴블럿 분석(Western blot analysis)으로 확인한 결과이고,
도 2의 A는 본 발명의 알파1G 유전자 변이 생쥐와 대조군의 TC 뉴런에서 LVA(low voltage activated) T-타입 칼슘 이온 전류의 전세포 전압 집게(whole cell voltage clamp) 분석으로 나타낸 결과 그래프이고,
도 2의 B는 HVA(high voltage activated) T-타입 칼슘 이온 전류의 전세포 전압 집게(whole cell voltage clamp) 분석으로 나타낸 결과 그래프이고,
도 3의 A는 본 발명의 알파1G 유전자 변이 생쥐와 대조군의 음전류에 의한 폭발 발화(burst firing) 패턴을 나타낸 그래프이고,
도 3의 B는 양전류에 의한 폭발 발화(burst firing) 패턴을 나타낸 그래프이고,
도 3의 C는 양전류에 의한 긴장 발화(Tonic firing) 패턴을 나타낸 그래프이고,
도 3의 D는 스파이크 수와 전류 양과의 관계를 나타낸 그래프이고,
도 4의 A는 본 발명의 알파1G 유전자 변이 생쥐와 대조군에서 γ-부틸로락톤을 투여했을 때 EEG 패턴을 나타낸 그래프이고,
도 4의 B는 (RS)-박로펜을 투여했을 때 EEG 패턴을 나타낸 그래프이고,
도 4의 C는 γ-부틸로락톤 또는 (RS)-박로펜에 의해 유도된 SWDs의 양적 변화를 나타낸 그래프이고,
도 5의 A는 본 발명의 알파1G 유전자 변이 생쥐와 대조군에서 (RS)-박로펜을 투여했을 때 필드 레코딩(field recording)을 나타낸 그래프이고,
도 5의 B는 (RS)-박로펜을 투여했을 때 필드 전위(field potentials)의 전력 스펙트럼(Power spectral) 분석을 나타낸 그래프이고,
도 6의 A는 본 발명의 알파1G 유전자 변이 생쥐와 대조군에서 비큐큘린메소브로마이드 투여 5분 후의 시상과 피질의 EEG 레코딩 결과이고,
도 6의 B는 비큐큘린메토브로마이드 투여 10분 후의 시상과 피질의 EEG 레코딩 결과이고,
도 6의 C는 비큐큘린메토브로마이드 유도 발작동안 관찰되는 SWDs의 패턴이고,
Th : 시상(Thalamus), Cx : 피질(Cortex)
도 7의 A는 4-아미노피리딘(4-AP)을 10 ㎎/㎏ 투여시 1시간 후의 발작성 방전(ictal discharge)을 나타낸 그래프이고,
↓ : 행동 발작이 일어날 때의 발작성 방전
도 7의 B는 4-아미노피리딘을 2 또는 10 ㎎/㎏ 투여시 유도된 전신성 발작의 발작 스코어를 나타낸 그래프이다.
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-alpha1G Ab epitope
<400> 4
Cys Asn Gly Lys Ser Ala Ser Gly Arg Leu Ala Arg
1 5 10
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- T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 단백질이 발현되지 않는 알파1G -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자 변이 생쥐(transgenic mouse).
- 제 7항에 있어서, 생쥐는 무스 무쿨러스(Mus Musculus)인 것을 특징으로 하는 유전자 변이 생쥐.
- 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 알파1G 유전자의 N-말단 82-118 부위가 결실된 유전자 변이 생쥐.
- (1) T-타입 칼슘 이온 통로의 알파1G 유전자에 대한 적중벡터(targeting vector)를 생쥐 배아간세포에 도입하는 단계;(2) 상기 배아간세포를 포배아의 포배강에 주입하여 키메라 생쥐(chimera mouse)를 얻는 단계;(3) 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 알파1G +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 생쥐를 얻는 단계; 및(4) 상기 이형접합체 생쥐의 암컷과 수컷을 교배시키는 단계로 구성되는 알파1G -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자 변이 생쥐의 제조방법.
- 제 10항에 있어서, 적중벡터는 PGK-neo 카셋트를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변이 생쥐의 제조방법.
- 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 적중벡터는 알파1G 유전자에 대한 상동 절편 2개, PGK-neo 카셋트 및 3' 말단에 위치하는 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자 카셋트를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변이 생쥐의 제조방법.
- 알파1G +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 유전자 변이 생쥐(transgenic mouse)의 수정란(수탁번호 : KCTC 10086 BP).
- 제 13항의 수정란을 대리모에 이식하여 알파1G +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 유전자 변이 생쥐를 얻고, 이형접합체 유전자 변이생쥐의 암컷과 수컷을 교배시켜 알파1G -/- 유전자형을 갖는 동형접합체(homozygote) 유전자 변이 생쥐의 제조방법.
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