KR100529692B1

KR100529692B1 - 인터루킨-5 억제효과를 갖는 신규사이클로헥실아이소플라본논계 유도체

Info

Publication number: KR100529692B1
Application number: KR10-2003-0027849A
Authority: KR
Inventors: 정상헌; 김영수; 이승호; 김미경; 류재천
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2003-04-30
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2005-11-17
Also published as: KR20040093961A

Abstract

본 발명은 만성 알레르기성 염증 치료효과를 갖는 IL-5 저해제로서 저분자이면서 비펩타이드 계열 물질인 신규 사이클로헥실아이소플라본논계 유도체 및 그의 제조방법, 인터루킨-5 (IL-5) 저해제로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 의한 신규 사이클로헥실아이소플라본논계 유도체는 저분자의 비펩타이드 계열 물질이기 때문에 종래 알려진 알르레기성 염증 치료제와는 달리 단백질에 대한 비특이적 반응이 없기 때문에 알르레기 억제제로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

인터루킨-5 억제효과를 갖는 신규 사이클로헥실아이소플라본논계 유도체{Novel Cyclohexylisoflavonone Derivatives which Inhibit the IL-5 Activity}

본 발명은 만성 알레르기성 염증 치료효과를 갖는 신규 사이클로헥실아이소플라본논계 유도체 및 그의 제조방법, 상기 화합물을 인터루킨-5 (IL-5) 저해제로서의 용도로 이용하는 것에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 만성 알레르기성 염증 치료효과를 갖는 IL-5 저해제로서 저분자이면서 비펩타이드 계열 물질인 신규 아이소플라본논계 유도체를 설계, 제조하는 방법에 관한 것이다.

알레르기 질환으로는 기관지 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 아토피성 피부염, 두드러기 등이 잘 알려져 있다. 매우 높은 발병율의 알레르기질환은 적절한 치료법이 없어 대부분이 만성적인 경과를 취하므로 고통, 경제적 손실 등 문제가 커서 미국 NIH에서는 21 세기에 극복해야할 5대 질환의 하나로 지목되고 있다.

알레르기는 조기반응에 의해 가려움과 같은 증상을 나타내고 후기 반응을 통해 표적장기의 상피세포가 박탈되어 과민성 국소 염증이 일어난다. 기존에 임상에 사용되고 있는 약물은 비만세포의 막 안정화 제제로 개발된 cromoglycate, 항히스타민제, 스테로이드 등을 주로 사용하고 있으며, 천식의 경우 기관지 확장 약물인 adrenergic 2 agonist (salmetrol 등), anticholinergic 약물 (ipratropium 등), xanthine 유도체 (theophylline 등)을 사용하고 있으나 증상을 완화시킬 뿐 근본적인 치료를 기대할 수는 없다.

알레르기는 과민성 질환으로 염증반응이 동반되는데 항원에 반복적으로 노출된 후 일어나는 염증반응은 비만세포(mast cell), 호산구, Th2 세포 등의 염증관련 세포와 혈관내피세포, 섬유아세포, 상피세포와 같은 구조성 세포간의 복합적인 상호작용에 의해 일어난다.

항원은 marcrophage등의 항원제시세포에 포획되어 processing을 거친 뒤 APC(Antigen-presenting cells)표면으로 나온다. APC로부터 항원을 제시받은 T-cell은 IL-4등의 cytokine을 분비해 B cell을 활성화시키고 이에 B cell은 항체로서 Ig E를 생산하게 된다. 이 Ig E가 표면에 Ig E 수용체를 갖는 비만세포에 혼합된다. 항원과 결합하게 되면 비만세포가 활성화되어 histamine, prostaglandin(PG), leukotriene(LT) 등의 화학물질을 방출하여 병적 증상을 일으키게 된다. 이에 급성 알레르기성 염증이 나타나게 된다.

한편 항원에 노출된 Th2세포는 IL-5, IL-3, GM-CSF 등의 cytokine을 방출한다. 특히 IL-5는 골수 세포가 호산구로 분화되는 것을 증가시키고 호산구 대 혈관 내피세포간의 부착을 증가시켜 호산구가 표적장기로 이동하는 것을 증가시키고, 호산구의 세포사멸을 억제하며 또한 호산구를 활성화시키는 특성으로 인하여 알레르기 반응에 중요한 역할을 한다. 활성화된 호산구에서는 major basic protein(MBP), eosinophil cationic protein(ECP)의 독성 단백질이 방출된다. 이 독성 단백질들은 lipid mediator, cytokines, chemokines을 유도함으로써 과민성 원인에 의해 알레르기 표적장기의 상피세포를 박탈하게 된다. 이에 병적 증상인 기관지 천식등의 만성 알레르기성 염증이 나타나게 된다. 일반 염증은 호중구(neutrophils)가 주도하는 반면 알레르기의 과민성 염증은 호산구(eosinophils)가 주도한다. 따라서 IL-5를 억제함으로서 만성 알레르기성 염증을 치료할 수 있을 것으로 잘알려져 있다.

호산구와 IL-5의 억제를 목표로 한 약물의 개발은 Schering-Plough사에서는 사람 IL-5의 단일 항체를 알레르기 치료제로 개발하기 위한 임상을 실시하고 있고, Roche사에서는 IL-5를 저해하는 isothiazolone 유도체 (Devos et. al., Europ. J. Biochem., 1994, 225, 635)를 합성하였으나 다른 단백질에 대한 비특이적 반응을 일으켜 의약품 개발하기에는 한계점에 부딪치고 있다.

따라서 IL-5의 생리활성을 조절할 수 있는 알레르기 치료제의 개발에는 저분자이면서 선택성이 있고 비펩타이드인 저해활성을 갖는 물질로 경구 투여 가능한 물질이 필요하다. 이에 본 발명의 목적은 회화나무에서 분리한 천연물, 저분자이면서 비펩타이드 계열 물질 소포리코사이드가 선택적 IL-5 저해제로서 효과가 있다는 사실에 착안하여 신규 사이클로헥실아이소플라본논계 유도체 및 그 제조방법, IL-5 저해제로서의 용도를 제공하는 것이다.

전술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 만성 알레르기성 염증 치료효과를 갖는 하기 일반식 1의 신규 사이클로헥실아이소플라본논계 유도체에 관한 것이다.

[여기서, R1 = 사이클로헥실메톡시, 임으로 치환된 사이클로헥실메톡시, 수소, 또는 하이드록시, R2 = 사이클로헥실메톡시, 임으로 치환된 사이클로헥실메톡시, 수소, 또는 하이드록시, R3 = 하이드록시, -OCH2COOCH3, 또는 -OCH2COOH]

본 발명은 또한 일반식 1의 화합물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 일반식 1의 화합물은 하기 일반식 2로부터 도식 1에 표시한 합성 경로에 따라서 제조될 수 있다. 도식1에 따라 제조된 화합물은 표 1과 같다. 제조방법을 개략적으로 설명하면 다음과 같다.

일반식 2를 C1∼4의 저급 알콜류 용매에 용해시키고, 여기에 탈륨 나이트레이트 트리하이드레이트를 넣고 실온에서 24-48 시간 동안 교반한다. 이 반응혼합물을 가온없이 감압하여 용매에 고체가 석출되기 전까지 제거한 후 적량의 산(염산, 황산, 하이드로브롬산, 파라톨루엔설폰산 등)을 첨가한다. 50℃로 가열하여 5시간 동안 교반한 후 박층 크로마토그래피로 반응종료를 확인하고 교반을 중지한다. 반응 혼합물을 여과 후 용매를 가온없이 감압 농축하여 제거한다. 이를 클로로포름에 용해시킨 후 증류수로 세척한다. 클로로포름층을 분리하여 건조시키고 감압하에서 농축시켜 조생성물을 수득한다. 이 조생성물을 컬럼크로마토그래피로 분리하여 정제하여 순수한 일반식 1-1로 표시된 화합물을 얻는다. 일반식 1-1로 표기된 화합물은 일반식 1의 일부이다.

상기 일반식 1-1의 화합물을 무수 유기용매에 녹인 후 포타슘 카보네이트와 메틸 클로로아세테이트를 가하고 65℃에서 1∼3 시간 동안 반응시켜 일반식 1-2의 화합물을 제조한다.

상기 일반식 1-2의 화합물을 유수 유기용매에 용해한 후 포타슘 하이드록시를 넣고 실온에서 12 시간 동안 반응시킨 후 감압 농축하여 용매를 제거한다. 농축물을 알칼리 수용액에 용해 시킨 후 클로로포름으로 씻어주어 출발물질을 제거한다. 수층을 산성화시키고 클로로포름에 용해시킨다. 클로로포름층을 분리하여 건조시키고 감압하에서 농축시켜 조생성물을 수득한다. 이 조생성물을 컬럼크로마토그래피로 분리하여 노란색의 순수한 일반식 1-3의 화합물을 제조한다.

전술한 방법에 따라 얻어진 본 발명에 의한 신규 사이클로헥실아이소플라본논계 유도체는, 쥐의 Y16 세포와 IL-5를 사용하여 분석한 결과, mIL-5에 대해 우수한 억제효과가 있음을 확인하였다.

이하 실시예를 참고로하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 제조방법을 명확히 설명하기 위한 예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 합리적인 범위 내에서 하기 실시예의 각종 조건을 변경하여 적용하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식인에게는 용이할 것이며, 이러한 변형 역시 본 발명의 기술적 사상 범위에 포함될 것이다.

<실시예>

실시예 1 : 5-사이클로헥실메톡시-3-(4-하이드록시페닐)크로멘-4-온의 제조

1-(2-사이클로헥실메톡시-6-하이드록시페닐)-3-(4-메톡시메톡시페닐)프로페논 1.015 g (2.56밀리몰)을 메탄올 800㎖에 용해하였다. 여기에 탈륨 나이트레이트 트리하이드레이트 1.2 당량 1.37g을 넣고 실온에서 36 시간 교반하였다. 그 후 2N 염산을 메탄올의 10% 해당되는 80㎖를 첨가하였다. 50℃로 가열하여 6시간 동안 교반한 후 박층크로마토그라피로 반응종료를 확인하고 교반을 중지하였다. 반응 혼합물을 여과한 후 용매를 실온으로 감압 농축하여 제거한 후 클로로포름에 용해시킨 후 증류수로 2회 세척하였다. 클로로포름층을 분리하여 무수 황산 나트륨으로 건조시키고 감압하에서 농축시켜 조생성물을 수득하였다. 이 조생성물을 컬럼크로마토그래피로 분리하여 정제하여 순수한 노란색의 5-사이클로헥실메톡시-3-(4-하이드록시페닐)크로멘-4-온(표1, 화합물 번호 1) 447㎎을 수득하였다.

실시예 2 : 7-사이클로헥실메톡시-3-(4-하이드록시페닐)크로멘-4-온의 제조

출발물질로 1-(2-사이클로헥실메톡시-6-하이드록시페닐)-3-(4-메톡시메톡시페닐)프로페논 대신 1-(4-사이클로헥실메톡시-6-하이드록시페닐)-3-(4-메톡시메톡시페닐)프로페논을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 순수한 노란색의 7-사이클로헥실메톡시-3-(4-하이드록시페닐)크로멘-4-온(표1, 화합물 번호 2)를 제조하였다.

실시예 3 : [4-(5-사이클로헥실메톡시-4-옥소-4 H -크로멘-3-일)페녹시]아세트 산 유도체 제조

(1) 5-사이클로헥실메톡시-3-(4-하이드록시페닐)크로멘-4-온 (호합물 번호 1) 300mg(0.86밀리몰)을 무수 아세트나이트릴 35㎖에 녹인 후 1.2 당량의 포타슘 카보네이트 142mg(1.027밀리몰)을 가하였다. 60℃에서 1 시간 동안 교반한 후 메틸 클로로아세테이트 1.2 당량(112mg, 1.03밀리몰)을 넣고 2 시간동안 65℃에서 교반하였다. 반응이 끝난 후 감압 농축하여 용매를 제거하였다. 클로로포름에 용해시키고 5% 수산화 나트륨 수용액으로 세척하였다. 클로로포름층을 분리하여 무수 황산 나트륨으로 건조시키고 감압하에서 농축시켜 조생성물을 수득하였다. 이 조생성물을 컬럼크로마토그래피로 분리하여 노란색의 순수한 메틸 [4-(5-사이클로헥실메톡시-4-옥소-4H-크로멘-3-일)페녹시]아세테이트 (화합물 번호 3) 322 mg(0.76밀리몰)을 수득하였다.

(2) 이렇게 얻은 메틸 [4-(5-사이클로헥실메톡시-4-옥소-4에이치-크로멘-3-일)페녹시]아세테이트 228 mg (0.56밀리몰)을 메탄올 30㎖에 세척하였다. 여기에 3당량의 수산화 칼륨 94mg(1.77밀리몰)과 소량의 증류수(3 방울)를 넣고 실온에서 교반하였다. 12 시간 동안 반응한 후 감압 농축하여 용매를 제거하였다. 5% 수산화 나트륨 수용액에 용해시킨 후 클로로포름으로 씻어주어 출발물질을 제거하였다. 수층에 2N 염산으로 산성화하고 클로로포름에 용해시켰다. 클로로포름층을 분리하여 무수 황산 나트륨으로 건조시키고 감압하에서 농축시켜 조생성물을 수득하였다. 이 조생성물을 컬럼크로마토그래피로 분리하여 흰색의 순수한 [4-(5-사이클로헥실메톡시-4-옥소-4에이치-크로멘-3-일)페녹시]아세트산 (화합물 번호 4) 111.7mg (0.27밀리몰)을 수득하였다.

실시예 4 : [4-(7-사이클로헥실메톡시-4-옥소-4 H -크로멘-3-일)페녹시]아세트 산 유도체 제조

실시예 2에서 얻은 7-사이클로헥실메톡시-3-(4-하이드록시페닐)크로멘-4-온을 출발물질로 하여 실시예 3과 동일한 방법으로 메틸 [4-(7-사이클로헥실메톡시-4-옥소-4H-크로멘-3-일)페녹시]아세테이트 (화합물 번호 5)를 얻고, 이를 실시예 3의 가수분해 조건에서 처리하여 [4-(7-사이클로헥실메톡시-4-옥소-4에이치-크로멘-3-일)페녹시]아세트산 (화합물 번호 6)을 수득하였다.

얻어진 유도체들의 수율 및 물성을 표 1에, 물리적 특성, 핵자기 공명 스펙트럼 데이터 및 적외선 분광스펙트럼 데이타를 표 2에 기재하였다.

실시예 5 : IL-5의 저해효과의 측정

1) 시료용해 및 희석

사용된 시료는 100% DMSO에 녹여 100mg/㎖가 되도록 용해하여 사용하였다.

2) 세포주 Y16의 계대배양

실험에 사용된 Y16 cell은 배지에 부유하여 증식하는 floating cell로 RPMI-8% FBS배지로 1×10⁵ cells/㎖ 이 되도록 희석한 후 petri dish에 1 ㎖씩 분주하고 9 ㎖의 RPMI-8% FBS 배지와 최종농도 5 U/㎖의 mIL-5를 첨가한 후 5% CO2, 37 ℃에서 48 시간 배양했다. 세포를 1500 rpm, 4℃에서 원심분리하여 침전시키고 배지 1 ㎖에 현탁하여 trypan blue로 염색하여 세포수를 산정하였다.

3) mIL-5에 의존한 Y16 cell 의 증식도 측정

Y16 세포 1×10⁵ cells/㎖을 96 well microplate의 well 당 100 ㎕씩 분주하고 mIL-5를 100 unit에서 0.003 unit 까지 1/3씩 계열 희석하여 well당 100 ㎕씩 가한 후 5% CO2, 37 ℃에서 48 시간 배양하였다. 48시간 후 위의 plate에 WST-1용액을 well당 20 ㎕씩 가하고 5% CO2, 37℃에서 3-4시간 방치 후 microplate reader로 파장 690 nm를 대조로 하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4) 시료에 의한 mIL-5 bioassay 억제도 측정

mIL-5에 의존한 Y16의 증식을 지표로 하여 시료의 mIL-5의 억제효과를 평가하였다.

Y16세포 1×10⁵ cells/㎖을 well당 100 ㎕씩 분주하고, mIL-5 50 ㎕, 시료 50 ㎕ 씩 가했다. 이때 mIL-5와 시료용액은 RPMI-8% FBS배지로 희석해서 사용하였으며 대조군은 시료대신 배지를, 대조군은 IL-5와 시료대신 배지를 가하였다. 이렇게 하여 위의 3)과 같은 조건에서 배양 후 흡광도를 측정하였다.

시료에 대한 억제율 계산은 다음식에 의해 산출하였다.

본 발명에 의한 신규 사이클로헥실아이소플라본논계 유도체(예를들면, 화합물 1)는 천식 반응의 주된 염증세포인 호산구의 기도 내 유입을 억제하며 기도과민성을 향상시켜 천식 증상을 완하하는 천식 증상 조절제 및 염증 반응 억제제로써의 효과가 있다.

Claims

다음 일반식 1의 사이클로헥실아이소플라본논 유도체.

(일반식 1)

[여기서 R₁=사이클로헥실메톡시 또는 수소, R₂=사이클로헥실메톡시 또는 수소이고 R₁≠R₂이며, R₃=하이드록시, -OCH₂COOCH₃, 또는 -OCH₂COOH]
제 1 항에 있어서,

R₁=사이클로헥실메톡시 또는 수소, R₂=사이클로헥실메톡시 또는 수소이고 R₁≠R₂이며, R₃=하이드록시인 것을 특징으로 하는 사이클로헥실아이소플라본논 유도체.
하기 화학식 2의 화합물과 탈륨 나이트레이트 트리하이드레이트를 알콜 용매하에서 폐환시키는 폐환반응에 의해 R₃=OH인 일반식 1의 신규한 아이소플라본논 유도체를 제조하는 방법.

(화학식 2)
삭제
제 3 항에 의해 제조된 화합물을 메틸 클로로아세테이트와 포타슘 카보네이트 존재하에서 무수 유기용매에서 반응하여 R₃=-OCH₂COOCH₃인 일반식 1의 신규한 아이소플라본논 유도체를 제조하는 방법.