KR100525254B1 - 포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청 배지 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청 배지에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아미노산, 비타민, 지질, 탄수화물, 무기염류, 미량원소 등으로 구성된 기존의 현탁배양용 무혈청배지 조성에 인슐린 유사인자, 상피세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 단백질 가수분해산물, 이온 킬레이터, 계면활성제, 에탄올아민 및 셀레늄을 일정함량 첨가함으로써 포유동물세포를 혈청 함유 배지에서와 유사한 세포성장로 배양할 수 있으며, 기존의 상업화된 현탁배양용 무혈청 배지보다 우수한 세포성장률로 배양할 수 있는 무혈청배지에 관한 것이다.

Description

포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청 배지{Serum-free medium for suspension culture of mammalian cells}
본 발명은 포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청 배지에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아미노산, 비타민, 지질, 탄수화물, 무기염류, 미량원소 등으로 구성된 기존의 현탁배양용 무혈청배지에 인슐린 유사인자, 상피세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 단백질 가수분해산물, 이온 킬레이터, 계면활성제, 에탄올아민 및 셀레늄을 일정함량 첨가함으로써 포유동물세포를 혈청 함유 배지에서와 유사한 세포성장률로 배양할 수 있으며, 기존의 상업화된 현탁배양용 무혈청 배지보다 우수한 세포성장률로 배양할 수 있는 무혈청 배지에 관한 것이다.
세포배양은 바이러스성 백신, 단일 항체, 면역조절인자, 폴리펩티드 성장인자, 호르몬, 효소 등과 같은 생물학적 활성을 가진 여러 유용한 물질을 생산하는 데 널리 이용된다. 이들 물질은 정상 혹은 치환되었거나 유전적으로 조작된 세포로부터 생산된다.
모든 세포주의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공하기 위해 혈청을 배양배지에 첨가하는 것이 세포배양에 필수적이다. 혈청은 호르몬, 성장인자, 캐리어단백질, 부착성 인자, 영양분, 미량원소 등이 함유되어 있다. 일반적으로 세포배양 배지는 소태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)과 같은 동물의 혈청을 10% 정도 포함한다. 혈청함유 배지가 널리 사용되고는 있으나 혈청은 많은 한계를 가지고 있다. 동물혈청은 제조단위마다 편차가 심하고 가격이 비싸며 질병 유발성 바이러스 및 마이코플라스마와 같은 잠재 오염원인이 될 수 있고, 또한 혈청에 존재하는 많은 성분들로 인해 배지 내에 분비된 정제를 원하는 재조합 단백질의 분리 및 고순도 정제가 매우 어려운 단점이 있다. 이러한 문제점 때문에 재조합 단백질의 생산을 목적으로 동물세포를 배양할 때는 배지에 혈청이 포함되지 않은 무혈청 배지를 사용하는 것이 매우 바람직하다고 할 수 있다.
동물혈청이 포함된 배지보다 무혈청 배지에서의 세포 배양이 산업적 측면에서 유리하며 또한 유전자 재조합 단백질 발현율도 유사한 현상을 관찰할 수 있는데 이는 대부분 혈청 성분의 대체 및 강화에 기인한다. 동물세포 배양용 무혈청 배지의 구성성분은 아미노산류, 유기 및 무기염류, 비타민류, 미량원소, 당류, 지질류, 핵산류 등이며, 혈청 성분의 대체 및 강화를 위하여 여러 가지 세포성장인자의 첨가 및 아미노산과 비타민의 강화를 통해 동물세포의 무혈청 배양이 가능하며 각 동물세포의 영양요구성과 형태에 따라 각 구성성분의 함량비는 달라지게 된다. 따라서 적절한 영양성분의 구성을 갖는 배지의 개발이 동물세포의 무혈청 배양에 필수적이다. 또한, 현탁배양은 고농도 세포배양과 높은 생산성, 세포 대량배양의 편리성 때문에 부착성 배양보다 유리하다고 할 수 있으므로 무혈청 현탁배양용 배지의 개발은 유전자 재조합 단백질 생산에 있어서 필수적인 요소라 할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 동물세포 중 특히 재조합 단백질 생산용 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary;CHO) 세포의 성장과 단백질의 발현에 적합한 현탁배양용 무혈청 배지를 개발하기 위해 노력한 결과, 동물세포 배양용으로 공지된 기본배지 조성에 인슐린을 대체하는 성장인자(인슐린 유사인자), 상피세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 단백질 발현 및 분비된 단백질 안정성에 기여하는 단백질 가수분해산물, 트렌스페린을 대신하는 이온 킬레이터, 계면활성제, 에탄올아민 및 셀레늄을 첨가한 동물세포 현탁배양용 무혈청 배지를 개발할 수 있었고, 이를 이용하여 동물세포인 CHO 세포를 배양한 결과, 혈청을 함유한 배지에서와 유사한 세포성장률과 생산성으로 배양할 수 있으며, 기존의 상업화된 무혈청 배양용 배지에서보다 성장률과 생산성이 우수함을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 포유동물 세포를 혈청을 함유한 배지에서와 유사한 세포 성장률로 배양할 수 있으며 기존의 상업화된 현탁배양용 무혈청 배지보다 우수한 무혈청 배지를 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명은 탄수화물, 비타민류, 아미노산류, 무기염류, 미량원소 및 기타 성분류로 구성된 포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청 배지에 있어서,
인슐린 유사인자 10 ∼ 50 ㎍/ℓ, 섬유아세포 성장인자 10 ∼ 50 ㎍/ℓ, 상피세포 성장인자 10 ∼ 50 ㎍/ℓ, 단백질 가수분해산물 1 ∼ 5 g/ℓ, 이온 킬레이터 0.5 ∼ 2 ㎎/ℓ, 계면활성제 0.5 ∼ 1.5 g/ℓ, 에탄올아민 1 ∼ 10 ㎎/ℓ 및 셀레늄 0.5 ∼ 1 ㎍/ℓ을 첨가한 포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청 배지를 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
일반적으로 포유동물 세포의 현탁배양에 사용되고 있는 배지로는 DMEM 배지, HAM 배지, IMDM 배지, RPMI 1640 배지를 세포특성에 맞게 변형하여 사용할 수 있다. 특히, 동물세포 배양용으로 상업화된 배지로서 DMEM/F12 배지가 바람직하다. DMEM/F12는 무기염류로서 무수 CaCl2, CuSO4ㆍ9H2O, Fe(NO3 )3ㆍ9H2O, FeSO4ㆍ7H2O, KCl, MgCl2, MgSO4, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4ㆍH2O, Na2HPO4 및 ZnSO4ㆍ7H 2O를 포함하고, 기타 성분으로 D-글루코즈, Na 하이포잔틴(Hypozanthine), 리놀렌산(Linoleic acid), 리폰산(Lipoic acid), 페놀 레드, 푸치레신ㆍ2HCl, 나트륨 피루베이트를 포함하고, 비타민류로는 비오틴, D-판토텐산칼슘, 염화콜린, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 염산피리독신, 리보플라빈, 염산티아민, 비타민 B12를 포함하고, 아미노산류로는 L-알라닌, L-아르기닌 HCl, L-아스파라긴, L-아스파트산, L-시스테인, L-시스테인ㆍ2HCl, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘ㆍHCl, L-이소류신, L-류신, L-리신ㆍHCl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트립토판 및 L-티로신ㆍ2Naㆍ2H2O, L-발린이 포함되어 있다.
본 발명은 상기 기본 배지에 추가성분으로 인슐린유사인자, 상피세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 단백질 발현 및 분비된 단백질 안정성에 기여하는 단백질 가수분해산물, 트렌스페린을 대체하는 이온 킬레이터, 계면 활성제, 에탄올아민 및 셀레늄를 첨가하여 CHO-SFM-SGM1로 명명된 배지를 제조할 수 있다.
상기 추가성분 각각에 대해 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서 인슐린을 대체하는 성분으로 인슐린 유사인자를 사용하며, 이는 포도당 대사와 단백질 대사를 향상시켜 세포성장을 촉진하는 역할을 하며, 특히 바람직하기로는 재조합 IGF-1(Insulin-like growth factor-1)을 사용한다. 인슐린 유사인자의 바람직한 함량은 10 ∼ 50 ㎍/ℓ이며, 이의 성분이 10 ㎍/ℓ미만일경우에는 세포예정사(Apoptosis)를 초래하며, 50 ㎍/ℓ을 초과할 경우에는 세포독성 및 비용증가의 문제점이 있다.
또한, 본 발명에서는 상피세포 성장인자(Epidermal growth factor; FGF)를 사용하며, 이는 in vivo 상태에서 다양한 형태의 세포증식을 야기할 수 있으며, 바람직하기로는 재조합 단백질을 사용한다. 상피세포 성장인자의 바람직한 함량은 10 ∼ 50 ㎍/ℓ이며, 이의 함량이 10 ㎍/ℓ 미만이면 특별한 효과가 없으며, 50 ㎍/ℓ을 초과하면 세포에 독성을 가진다.
또한, 본 발명에서는 염기성 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast growth factor; bFGF)를 사용하며, 이는 자가분비(autocrine) 성장인자로서 세포증식과 발달, 생존유지 역할을 하며, 바람직하기로는 재조합 단백질을 사용한다. 섬유아세포 성장인자의 바람직한 함량은 10 ∼ 50 ㎍/ℓ이며, 이의 함량이 10 ㎍/ℓ미만이면 큰 효과가 없으며, 50 ㎍/ℓ을 초과하면 오히려 세포에 독성을 가져 성장을 저해한다.
또한, 본 발명에서는 아미노산, 지질, 올리고펩티드 공급원 및 분비된 단백질 안정성에 기여하는 단백질 가수분해산물을 사용하며, 가장 바람직하기로는 식물 유래의 콩 가수분해산물(Soybean hydrolysate)을 사용한다. 단백질 가수분해산물의 바람직한 함량은 1 ∼ 5 g/ℓ이며, 이의 함량이 1 g/ℓ미만이면 단백질 안정성에 기여할 수 없으며, 5 g/ℓ을 초과하면 가수분해산물의 응집이 일어날 가능성이 있으며, 정제공정에도 어려움을 유발할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 트렌스페린을 대체하는 이온 킬레이터는 무혈청배지에서 불안정한 이온농도 유지를 안정화시키며 이온의 독성을 제거하는 역할을 하며, 바람직하게는 FeSO4ㆍ7H2O EDTA를 사용한다. 이온 킬레이터의 바람직한 함량은 0.5 ∼ 2 ㎎/ℓ이며, 이의 함량이 0.5 ㎎/ℓ 미만이면 성장이 저해되며, 2 ㎎/ℓ을 초과하면 세포에 독성효과를 유발한다.
또한, 본 발명에서는 부유배양시 세포들의 물리적인 충격을 완화시키며 동시에 세포성장에도 효과를 가지는 계면 활성제를 사용하며, 바람직하기로는 Pluronic F68을 사용한다. 계면활성제의 바람직한 함량은 0.5 ∼ 1.5 g/ℓ이며, 이의 함량이 0.5 g/ℓ 미만이면 부유배양이 원활하지 않으며, 1.5 g/ℓ을 초과하면 활성 증가가 더 이상 없으며 배양액내에 거품과다 발생을 초래한다.
또한, 본 발명에서는 지질의 용해도 증가 및 세포막 전구물질 역할을 하는 에탄올아민를 사용하며, 이를 1 ∼ 10 ㎎/ℓ 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 이의 함량이 1 ㎎/ℓ미만일 때, 활성이 없으며, 10 ㎎/ℓ을 초과되면 활성증가가 더 일어나지 않는다.
마지막으로 본 발명에서는 무혈청 배지에서의 필수 미량원소로서 항산화제 역할을 하는 셀레늄을 사용하며, 이를 0.5 ∼ 1 ㎍/ℓ사용하는 것이 바람직하다. 이때, 이의 함량이 0.5 ㎍/ℓ미만이면 산소독성에 민감하며, 10 ㎍/ℓ을 초과하면 심각한 세포독성을 초래한다.
상기와 같은 조성을 가지는 본 발명의 배지는 290 ∼ 350 mOsm/kg의 삼투압 범위, 특히 300 mOsm/kg 삼투압 조건 하에서 사용되는 것이 바람직하다. 삼투압 조절인자는 일반적으로 염으로서 배지에 널리 사용되는 염으로는 NaCl, KCl, KNO3이다. 또한, pH 6.5 ∼ 7.5의 범위, 특히 pH 7.0 배지를 유지하기 위해 버퍼를 사용하는 것이 일반적이다. 배지에 사용되는 버퍼는 NaHCO3와 같은 중탄산나트륨을 함유한다. 또한, CaCl2ㆍ2H2O, MgSO4ㆍ7H2O, NaH2 PO4ㆍ2H2O와 같은 염소이온, 황화이온, 인산이온 등을 50 ∼ 500 ㎎/ℓ로 포함하거나 HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane)와 같은 다른 버퍼를 1000 ∼ 10,000 ㎎/ℓ로 포함하기도 한다. 배지의 에너지원은 만노스, 프럭토스, 갈락토스, 말토스, 글루코스와 같은 단당류 1000 ∼ 10,000 ㎎/ℓ로 존재하며 D-글루코스가 가장 바람직하다. 배지에 포함되는 금속이온은 마그네슘, 주석, 아연을 포함하며, 나트륨, 칼륨, 셀레늄 역시 첨가되며, 염소, 황 이온으로 결합된 염의 형태로 배지에 주입된다. 각각의 양은 DMEM/F12 배지에 포함된 양과 유사하다. 또한, 배지에 포함되는 비타민과 조효소 비타민은 비타민B6, 비타민B12, 비타민 K(biotin)가 0.01 ∼ 0.5 ㎎/ℓ, 비타민C(ascorbic acid)가 10 ∼ 30 ㎎/ℓ, 비타민B2(riboflavin)가 0.1 ∼ 1.0 ㎎/ℓ, 비타민B1(thiamine), 니코틴아미드, 비타민B5(D-calcium pentothenate), 폴레이트산, i-이노시톨이 일반적으로 0.2 ∼ 8.0 ㎎/ℓ로 주입된다. 지질로서 배지에 포함되는 성분은 콜린클로라이드, 리폰산, 올렌산, 포스파티딜클로라인, 리놀린산 등이 0.05 ∼ 10 ㎎/ℓ범주로 포함된다. 각 성분은 계면활성제인 플루로닉 에프68(Pluronic F68), 에탄올아민에 녹게 된다. 아미노산은 세포주 및 발현단백질에 따라 각각 아미노산 별로 다양하지만, 일반적으로 10 ∼ 150 ㎎/㎖의 농도로 포함된다. 그러나, 글루타민의 경우, 에너지원으로도 사용되기 때문에 400 ∼ 600 ㎎/㎖로 주입된다.
이와 같은 본 발명의 CHO-SFM-SGM1 배지는 포유동물세포 배양을 위한 것으로 형질전환되지 않은 CHO 세포 및 재조합 단백질 생산을 위해 형질전환된 CHO 세포, 예를 들어 사람 인터페론 베타(Interferon-beta)를 발현하는 재조합 CHO 세포주 SFC-D110N의 배양에 적합하나 이에 제한되지 않으며, CHO 세포의 DHFR(dihydrofolate reductase) 돌연변이주인 CHO DUKX, CHO DG44 등의 배양배지로서 사용할 수 있다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : CHO-SFM-SGM1 배지의 제조
1 ℓ의 CHO-SFM-SGM1 배지를 제조하기 위해, 먼저 탈이온 증류수 900 ㎖에 다음 표 1 및 2에 나타낸 기본배지 성분과 추가 성분들을 다음 표에 나타낸 양만큼씩 정량하여 혼합하여 녹인 후 0.1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용하여 pH 7.2로 조정하였다. 이 혼합액에 탈이온 증류수를 첨가하여 배지 총용량이 1 ℓ가 되도록 하였다. 1ℓ배지 혼합액을 0.22 ㎛ 스테리컵(Stericup) 필터[MILLIPORE 사]를 사용하여 여과하여 2 ∼ 8 ℃에 보관하였다.
기본 배지 성분
구 분 함 량 (mg/ℓ)
무기염/미량원소 CaCl2(무수) 116.60
CuSO4ㆍ5H2O 0.0013
Fe(NO3)3ㆍ9H2O 0.05
FeSO4ㆍ7H2O 0.417
KCl 311.80
MgCl2 28.64
MgSO4 48.84
NaCl 6995.50
NaH2PO4ㆍH2O 62.50
Na2HPO4 71.02
ZnSO4ㆍ7H2O 0.432
아미노산 L-알라닌 4.45
L-아르기닌ㆍHCl 147.50
L-아스파라긴ㆍH2O 7.50
L-아스파트산 6.65
L-시스테인ㆍH2O 17.56
L-시스틴ㆍ2HCl 31.29
L-글루탐산 7.35
L-글루타민 365.00
글리신 18.75
L-히스티딘 HClㆍH2O 31.48
L-이소루이신 54.47
L-루이신 59.05
L-라이신ㆍHCl 91.25
L-메티오닌 17.24
L-페닐알라닌 35.48
L-프롤린 17.25
L-세린 26.25
L-트레오닌 53.45
L-트립토판 9.02
L-타이로신ㆍ2Naㆍ2H2O 55.79
L-발린 52.85
(계속)
구 분 함 량 (mg/ℓ)
비타민/각종성분 D-글루코즈 3151.00
HEPES 3574.500
나트륨 하이포크산틴 2.3900
리놀레산 0.0420
리포산 0.1050
페놀 레드 8.1000
나트륨 퓨트레신ㆍ2HCl 0.0810
나트륨 피루베이트 55.0000
비오틴 0.0035
D-판토텐산칼슘 2.2400
염화콜린 8.9800
폴산 2.6500
i-이노시톨 12.6000
니아신아미드 2.0200
피리독신ㆍ HCl 2.0310
리보플라빈 0.2190
티아민ㆍ HCl 2.1700
타이미딘 0.3650
비타민 B12 0.6800
추가성분
구 분 함 량 (mg/ℓ)
인슐린 유사인자 0.02
상피세포성장인자 0.01
섬유아세포성장인자 0.02
콩 가수분해산물 1000
FeSO4ㆍ7H2O EDTA 0.7
에탄올아민 5
셀레늄 0.0006
계면활성제 1200
시험예 1: CHO-SFM-SGM1 배지와 혈청함유 배지에서의 CHO 세포성장 및 단백질 발현 비교
본 발명의 CHO-SFM-SGM1 배지에서 CHO 세포의 성장성 및 단백질 발현 정도를 확인하기 위해, α-MEM에 10% 소태아 혈청을 첨가한 배지를 이용하여 두 배지에서의 세포 성장 및 단백질 발현 정도를 비교하였다. 실험을 위해서 250 ㎖ 스핀너 플라스크(spinner flask) 2개를 멸균한 후 α-MEM에 10% 소태아 혈청과 계면활성제를 1 g/ℓ농도로 첨가한 배지 100 ㎖와 상기 실시예 1의 방법으로 제조한 CHO-SFM-SGM1 배지 100 ㎖를 각각의 스핀너 플라스크에 넣고, 여기에 인터페론-베타를 발현하도록 형질전환된 SFC-D110N 세포를 초기 세포 농도가 2 ×105 cells/㎖가 되도록 접종한 후, 37 ℃ CO2 배양기 내에서 교반기 위에 올려놓고 회전수 70 rpm으로 배양을 실시하였다. 배양 시작 직후부터 매일 각각의 스핀너 플라스크에서 1 ㎖의 배양액을 취하여 Vi-CELLTM 세포생존률 측정기(Cell Viability Analyzer)[Beckman Coulter 사]에서 세포수 및 세포생존율을 측정하였으며, 배양액 중에 생성된 인터페론-베타의 함량은 인간 인터페론 베타 엘리자 킷트(Human Interferon Beta ELISA Kit)[PBL Biomedical Laboratories 사]를 사용하여 측정하였다.
도 1은 CHO-SFM-SGM1 배지와 α-MEM에 10% 소태아 혈청과 계면활성제를 1 g/ℓ농도로 첨가한 배지에서 CHO 세포를 배양하여 배양 시간에 따른 세포 성장성을 나타낸 그래프로서, 배양 시작 후 5일간 생존한 CHO 세포의 수 및 생존율에서 두 가지 배지에서 유사한 경향을 보였다.
도 2는 CHO-SFM-SGM1 배지와 α-MEM에 10% 소태아 혈청과 계면활성제를 1 g/ℓ농도로 첨가한 배지를 사용한 배양에서 생성된 인터페론-베타의 생산량을 비교한 그래프로서, 목적 단백질인 인터페론-베타가 두 배지에서 거의 유사한 수준으로 생산됨을 보여준다.
이와 같은 결과로부터 본 발명의 무혈청 현탁배양 배지에서의 세포 성장률 및 목적 단백질의 생성율이 혈청을 포함한 배지에서와 유사함을 확인할 수 있다.
시험예 2: CHO-SFM-SGM1 배지와 상업화된 무혈청 배지에서의 DG44세포의 세포 성장 비교
CHO-DG44 세포는 유전자 재조합 단백질 생산을 위해 형질전환시 사용되는 숙주세포로서 CHO-DG44 세포의 무혈청 현탁배양이 가능한 경우 CHO-DG44를 이용하여 형질전환된 유전자 재조합 CHO 세포주들의 무혈청 현탁배양을 가능하게 하는 좋은 예가 될 수 있다.
본 발명의 CHO-SFM-SGM1 배지와 현재 상업화되어 시판중인 무혈청 배지 CHO-S-SFM II[Invitrogen 사] 배지를 이용하여 상기 시험예 1과 동일한 조건 및 절차에 따라 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자 결손세포주인 CHO-DG44 세포를 배양한 후, 각 배지에서의 세포 성장 특성을 비교하였다.
도 3은 CHO-SFM-SGM1 배지와 CHO-S-SFM II 배지에서 CHO-DG44 세포를 배양하여 배양 시간에 따른 세포 성장성을 나타낸 그래프로서, 배양 시작 후 5일간 생존한 CHO-DG44 세포의 수 및 생존율에서 CHO-SFM-SGM1 배지가 무혈청 현탁배양에 적합한 결과를 보였다.
시험예 3: CHO-SFM-SGM1 배지와 상업화된 무혈청 배지에서의 CHO 세포성장 및 단백질 발현 비교
CHO-SFM-SGM1 배지와 상업화된 무혈청 배지 CHO-S-SFM II[Invitrogen 사]를 이용하여 상기 시험예 1과 유사한 조건 및 절차에 따라 배양을 실시한 후 SFC-D110N 세포의 성장성을 비교하였다.
도 4에서 나타낸 바와 같이, CHO-SFM-SGM1 배지에서 SFC-D110N 세포의 성장성이 5일간 배양시 최대 2.7 ×106 cells/㎖까지 지속된 반면, CHO-SFM II 배지에서는 최대 0.9 ×106 cells/㎖로 세포 성장이 지연되었음을 확인할 수 있었다.
또한, CHO-SFM-SGM1 배지와 상업화된 무혈청 배지 CHO-S-SFM II를 이용하여 SFC-D110N 세포를 무혈청 현탁배양에서 생성된 인터페론-베타의 생산량을 비교한 결과, 도 5에 나타내었듯이 목적 단백질인 인터페론-베타가 CHO-SFM-SGM1 배지에서 CHO-S-SFM II 배지 보다 최대 4배 이상의 생산성 향상을 보여주었다.
이러한 결과로부터, 본 발명의 무혈청 현탁배양 배지인 CHO-SFM-SGM1이 기존의 무혈청 배지보다 CHO 세포의 배양에 더욱 적합함을 알 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 동물세포 배양용으로 상업화된 기본 배지에 인슐린 유사인자, 상피세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 단백질 가수분해산물, 계면활성제, 에탄올아민 및 셀레늄을 첨가함으로써 동물 세포, 특히 CHO 세포를 혈청이 포함된 배지에서와 유사한 세포 성장률로 배양할 수 있으며, 상업화된 무혈청 현탁배양 배지보다 더욱 높은 생산성으로 CHO 세포를 배양할 수 있다.
도 1은 본 발명의 무혈청 배지와 기존의 혈청이 포함된 배지를 이용하여 CHO 세포를 현탁배양시 배양 시간에 따른 세포 성장률을 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 무혈청 배지와 기존의 혈청이 포함된 배지를 이용하여 CHO 세포를 현탁배양시 배양 시간에 따른 인터페론-베타 생산량을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 무혈청 배지와 상업화된 현탁배양용 무혈청 배지를 이용하여 DHFR 유전자 결손 세포주인 CHO-DG44 세포를 현탁배양시 배양시간에 따른 세포 성장률을 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 무혈청 배지와 상업화된 현탁배양용 무혈청 배지를 이용하여 유전자 재조합 인터페론-베타를 발현하는 CHO 세포를 현탁배양시 배양시간에 따른 세포 성장률을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 무혈청 배지와 상업화된 현탁배양용 무혈청 배지를 이용하여 CHO 세포를 현탁배양한 후 이로부터 발현 분비된 유전자 재조합 인터페론-베타의 생산량을 비교한 그래프이다.

Claims (6)

  1. 탄수화물, 비타민류, 아미노산류, 무기염류, 미량원소 및 기타 성분류로 구성된 포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청배지에 있어서,
    상기 무혈청배지에 인슐린 유사인자 10 ∼ 50 ㎍/ℓ, 섬유아세포 성장인자 10 ∼ 50 ㎍/ℓ, 상피세포 성장인자 10 ∼ 50 ㎍/ℓ, 단백질 가수분해산물 1 ∼ 5 g/ℓ, 이온 킬레이터 0.5 ∼ 2 ㎎/ℓ, 계면활성제 0.5 ∼ 1.5 g/ℓ, 에탄올아민 1 ∼ 10 ㎎/ℓ 및 셀레늄 0.5 ∼ 1 ㎍/ℓ가 첨가된 것임을 특징으로 하는 포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청배지.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 배지에 단백질로서 첨가되는 인슐린 유사인자, 섬유아세포 성장인자 또는 상피세포 성장인자가 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는 포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청배지.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 가수분해 산물이 콩 가수분해산물인 것을 특징으로 하는 포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청배지.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 이온 킬레이터가 FeSO4ㆍ7H2O EDTA인 것을 특징으로 하는 포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청배지.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 계면활성제가 플루로닉 F68(Pluronic F-68)인 것을 특징으로 하는 포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청배지.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 형질전환된 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포인 것을 특징으로 하는 포유동물 세포의 현탁배양용 무혈청배지.
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