KR100220090B1

KR100220090B1 - 포유동물세포 배양용 무혈청 배지

Info

Publication number: KR100220090B1
Application number: KR1019970007188A
Authority: KR
Inventors: 윤성관; 안용호
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1997-03-05
Filing date: 1997-03-05
Publication date: 1999-10-01
Also published as: KR19980072385A

Abstract

본 발명은 포유동물 세포의 배양을 위한 무혈청 배지에 관한 것으로, 아미노산, 비타민, 탄수화물, 무기염류, 미량원소 및 보조인자로 구성된 기본 배지에 인슐린, 페튜인, 펩톤, 시트르산 제 2 철 및 계면활성제를 추가한 본 발명의 무혈청 배지는 포유동물세포를 혈청 함유 배지에서와 유사한 세포 성장율로 배양할 수 있으며, 제조 비용이 훨씬 저렴하여 경제적이다.

Description

포유동물세포 배양용 무혈청 배지

본 발명은 포유동물 세포의 배양을 위한 무혈청 배지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전통적으로 생체외 동물세포 배양에 사용되어 온 기본 배지들에 인슐린, 페튜인(fetuin), 펩톤(meat peptone), 시트르산 제 2 철(ferric citrate) 및 계면활성제를 첨가하여 동물세포, 특히 재조합 단백질 생산을 위해 형질전환된 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary(CHO) cell)를 종래의 혈청 함유 배지에서와 유사한 세포 성장율로 배양할 수 있는 동물세포 배양용 무혈청 배지에 관한 것이다.

의약용으로 사용되는 재조합 단백질은 대부분 당 단백질로서, 이러한 당 단백질은 원핵세포로부터 생산할 경우 그 기능적 활성을 상실하기 때문에 주로 동물세포와 같은 복잡한 진핵세포를 이용하여 생산된다. 현재, 많은 종류의 동물세포 배양용 무혈청 기본 배지가 공지되고 상업화되어 있으며, 이러한 기본 배지에 열에 의해 비활성화된 동물 유래의 혈청을 5 내지 10 % 첨가한 배지를 사용하여 동물세포 배양이 이루어져왔다 (Biotechnology and Bioengineering, 32, 993-1000(1988); BIO/TECHNOLOGY, 9, 64-68(1991)).

그러나, 재조합 단백질 생산용 세포배양 배지에 동물 유래 혈청을 사용할 경우, 혈청에 존재하는 많은 성분들로 인해 배지내에 분비된 원하는 재조합 단백질의 분리 및 고순도 정제가 매우 어렵다. 또한 혈청 자체의 값도 비싸고, 공급원의 나이, 성별, 종 등에 따라 그 구성 성분이 매우 불균일할 뿐 아니라, 조성 및 기능이 밝혀지지 않은 성분을 포함하고 있기 때문에 배양하고자 하는 세포의 성장을 일관성 있게 통제할 수가 없다는 단점이 있다. 이러한 문제점 때문에 재조합 단백질 생산을 목적으로 동물세포를 배양할 경우 배양배지에 혈청이 포함되지 않은 무혈청 배지를 사용하는 것이 매우 바람직하다.

현재까지 알려진 무혈청 배지는 아미노산, 비타민, 탄수화물, 무기염류 및 미량원소들에 세포 성장에 필요한 성장 인자와 호르몬을 첨가하여 개발된 것들이다(Anal. Biochem., 102, 255-270(1980); Cytotechnology, 17, 153-163(1995)). 한편, 동물 세포는 그 종류 및 유래된 기관(organ)에 따라 대사 과정과 필요로 하는 영양 성분 등이 달라진다 (BIO/TECHNOLOGY, 6, 1041-1050(1988)). 따라서, 단일클론 항체 생산용 하이브리도마 세포 배양을 위해 개발된 무혈청 배지를 다른 동물세포, 예를 들어 CHO 세포나 다른 기관 유래 세포의 배양에도 사용할 수 있는 것은 아니다.

이에 본 발명자들은 동물세포 중 특히 재조합 단백질 생산용 CHO 세포의 성장과 단백질의 발현에 적합한 무혈청 배지를 개발하기 위해 계속 연구한 결과, 동물세포 배양용으로 공지된 기본 배지들에 세포성장 호르몬인 인슐린과 당단백질인 페튜인, 아미노산이 풍부한 펩톤, 트랜스페린을 대신하여 시트르산 제 2 철, 그리고 계면활성제인 플루로닉 (Pluronic F68)을 첨가한 배지에서 동물세포인 CHO 세포를 배양한 결과 혈청을 함유한 배지에서 배양한 경우와 유사한 세포 성장 및 단백질 발현량을 보임을 밝혀 내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 포유동물 세포를 혈청 함유 배지에서와 유사한 세포 성장율로 배양할 수 있는, 동물세포 배양용의 저렴한 무혈청 배지를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 아미노산, 탄수화물, 비타민, 무기염류, 미량원소 및 보조인자로 이루어진 기본 배지에 인슐린, 페튜인, 펩톤, 시트르산 제 2 철 및 계면활성제를 포함하는 포유동물세포 배양용 무혈청 배지를 제공한다.

도 1 은 본 발명의 무혈청 배지와 기존의 혈청이 포함된 배지를 이용하여 CHO 세포를 배양시 배양 시간에 따른 세포 성장을 비교한 그래프이고,

도 2 는 본 발명의 무혈청 배지와 기존의 혈청이 포함된 배지를 이용하여 CHO 세포를 배양한 후 이로부터 발현 분비된 유전자 재조합 에리트로포이에틴의 생성량을 비교한 그래프이고,

도 3 은 본 발명의 무혈청 배지와 기존의 시판 무혈청 배지를 이용하여 CHO 세포를 배양시 배양 시간에 따른 세포 성장을 비교한 그래프이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 무혈청 배지는 동물세포 배양용으로 공지된 기본 배지들에 세포성장 호르몬인 인슐린과 당단백질인 페튜인, 아미노산이 풍부한 펩톤, 트랜스페린을 대신하여 시트르산 제 2 철, 그리고 계면활성제인 플루로닉(Pluronic F68)을 추가한 배지로서, LSF 배지로 명명하였다.

본 발명의 LSF 배지에서 기본 배지로는 포유동물세포 배양용으로 공지되어 상업화된 여러 배지, 예를 들어, DMEM 배지, 함(HAM)의 배지, IMDM 배지, RPMI 1640 배지 등을 그대로 사용할 수 있다. LSF 의 기본 배지로 특히 바람직한 배지는 무기염 및 미량원소로서 무수 CaCl₂, 무수 CuSO₄, NaCl, NaH₂PO₄·H₂O, Na₂SeO₃·5H₂O, MgSO₄, KCl, KNO₃및 무수 ZnSO₄를 포함하고, 아미노산 성분으로 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아르기닌·HCl, L-아스파트산, L-시스틴·2HCl, L-시스테인, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘·HCl·H₂O, L-이소루이신, L-루이신, L-라이신·HCl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-타이로신·2Na₂2H₂O, L-발린을 포함하며, 비타민 및 기타 성분으로 D-글루코즈, 페놀 레드, HEPES, 나트륨 피루베이트, 푸트레신·2HCl, 비오틴, D-판토텐산칼슘, 염화콜린, 폴산, i-이노시톨, 니코틴아미드, 피리독살·HCl, 리보플라빈, 티아민·HCl 및 비타민 B₁₂를 포함하는 배지이다.

이러한 기본 배지에 추가 성분으로 인슐린 5 내지 50 ㎎/ℓ, 페튜인 50 내지 500 ㎎/ℓ, 펩톤 1 내지 10 g/ℓ, 시트르산 제 2 철 0.5 내지 5 ㎎/ℓ 및 계면활성제 0.5 내지 1.5 g/ℓ을 첨가하여 본 발명의 LSF 배지를 제조할 수 있다.

본 발명의 LSF 배지에 사용되는 인슐린 및 페튜인은 소 유래 인슐린 및 소 유래 페튜인이 바람직하며, 계면활성제로는 플루로닉 F-68 (Pluronic F-68)이 바람직하다.

이와 같은 본 발명의 LSF 배지는 포유동물세포 배양을 위한 것으로, 특히 재조합 단백질 생산을 위해 형질전환된 CHO 세포, 예를 들어 에리트로포이에틴(eythropoietion)을 발현하는 재조합 CHO 세포주 CHO BiP10-9-27 (수탁번호 KCTC 0220BP, 특허출원 제 96-38615호 참조)의 배양에 적합하나 이에 제한되지 않으며, CHO 세포의 DHFR^-돌연변이주인 세포, 예를 들어 세포주 CHO DUKX B1, CHO DG44 등의 배양배지로서 LSF 배지를 사용할 수 있다.

본 발명의 LSF 무혈청 배지 제조에 소요되는 비용은 기존에 상업화되어 시판되고 있는 CHO 세포 배양용 무혈청 배지 (예를 들어, GIBCO 사의 CHO-S-SFMⅡ, JRH Bioscience 사의 EX-CELL^TM301)를 구입하는 비용의 약 1/2 정도로, 매우 저렴하다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> LSF 배지의 제조

10 ℓ의 LSF 배지를 제조하기 위해, 먼저 탈이온 증류수 9 ℓ에 하기 표 1 및 2 에 나타낸 기본배지 성분과 추가 성분들의 분말을 표에 나타낸 양만큼씩 정량하여 혼합·용해시킨 후 1 N NaOH 를 사용하여 pH를 7.2로 조정하였다. 생성된 혼합액에 탈이온 증류수를 첨가하여 배지 용량이 10 ℓ가 되도록 하였다. 제조된 배지를 0.22㎛ MILLIPAK^TM-40 필터(MILLPORE 사)를 사용하여 여과 멸균하여 4 ℃에 보관하였다.

[표 1a]

기본 배지 성분

성 분	함 량 (㎎/ℓ)
무기염/미량원소
CaCl₂(무수)	50
CuSO₄(무수)	0.003
NaCl	4500
NaH₂PO₄·H₂O	150
Na₂SeO₃·5H₂O	0.017
MgSO₄(무수)	100
KCl	330
KNO₃	0.1
ZnSO₄(무수)	1000

[표 1b]

성 분	함 량 (㎎/ℓ)
아미노산
L-알라닌	30
L-아스파라긴	30
L-아르기닌·HCl	100
L-아스파트산	30
L-시스틴·2HCl	100
L-시스테인	80
L-글루타민 1168	1200
L-글루탐산	100
글리신	30
L-히스티딘·HCl·H₂O	50
L-이소루이신	100
L-루이신	100
L-라이신·HCl	150
L-메티오닌	100
L-페닐알라닌	70
L-프롤린	100
L-세린	40
L-트레오닌	150
L-트립토판	15
L-타이로신·2Na₂H₂O	150
L-발린	100

[표 1c]

성 분	함 량 (㎎/ℓ)
비타민/각종 성분
D-글루코즈	4500
페놀 레드	15
HEPES	5960
나트륨 피루베이트	110
푸트레신·2HCl	0.20
비오틴	0.013
D-판토텐산칼슘	8.0
염화콜린	8.0
폴산	8.0
i-이노시톨	14.4
니코틴아미드	8.0
피리독살·HCl	8.0
리보플라빈	0.8
티아민·HCl	8.0
비타민 B₁₂	0.026

[표 2]

추가 성분

성 분	함 량 (㎎/ℓ)
소 인슐린(SIGMA)	10
페릭시트레이트(GIBCO)	2
미트 펩톤(SIGMA)	5000
플루로닉(Pluronic F-68, SIGMA)	1000
소 페튜인(SIGMA)	100

<실험예 1> LSF 배지와 혈청함유 배지에서의 CHO 세포성장 및 단백질 발현 비교

본 발명의 LSF 무혈청 배지에서 CHO 세포의 세포 성장 및 단백질 발현 정도를 알아 보기 위해, IMDM 배지에 10 % 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 첨가한 배지를 이용하여 두 배지에서의 세포 성장 및 단백질 발현 정도를 비교하였다. 먼저, 스피너 플라스크(Spinner flask) 2 개를 멸균한 후 IMDM 배지에 10 %의 FBS를 첨가한 배지 100 ㎖와 실시예 1 의 방법으로 제조한 LSF 배지 100 ㎖를 각각의 스피너 플라스크에 넣고, 여기에 에리트로포이에틴을 발현하도록 형질전환된 CHO BiP10-9-27 (수탁번호 : KCTC 0220BP) 세포를 초기 세포 농도가 2x10⁵/㎖가 되도록 접종한 후, 5 % CO₂가 공급되고 37 ℃로 유지되는 인큐베이터 내에서 교반기를 사용하여 회전수 50 rpm으로 배양을 하였다. 배양 시작 다음날부터 매일 각각의 스피너 플라스크에서 배양액을 취하여 헤마사이토미터 (Hemacytometer)를 사용하여 트립판 블루 염료 배척(dye exclusion)방법으로 살아 있는 세포의 수를 측정하였으며, 배양액 중에 생성된 에리트로포이에틴의 양은 효소면역측정법(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)으로 측정하였다.

도 1은 LSF 무혈청 배지와 10 % FBS 함유 IMDM에서 CHO 세포를 배양하여 배양 시간에 따른 세포 성장을 나타낸 그래프로서,여기에서 보듯이, 배양 시작 후 3 일간은 LSF 배지에서의 생존 CHO 세포수가 혈청을 포함한 배지에서의 생존 CHO 세포수 보다 많고 이후 5 일째까지도 두 배지에서의 생존세포수가 거의 유사하였다.

도 2는 LSF 무혈청 배지와 10 % FBS 함유 IMDM에서 CHO 세포를 배양하여 각 배양액중에 생성된 에리트로포이에틴의 양을 나타낸 그래프로서, 목적 단백질인 에리트로포이에틴이 두 배지에서 거의 같은 수준으로 생성되었음을 보여준다.

이와 같은 결과로부터 본 발명의 무혈청 배지에서의 세포 성장율 및 목적 단백질의 생성효율이 혈청 함유 배지에서와 동일함을 확인할 수 있다.

<실험예 2> LSF 배지와 상업용 무혈청 배지에서의 CHO 세포 성장 비교

본 발명의 LSF 배지와 현재 상업화되어 시판중인 무혈청 배지 CHO-S-SFM Ⅱ(GIBCO 사)를 이용하여 실험예 1과 동일한 조건 및 절차에 따라 CHO BiP10-927(KCTC 0220BP) 세포를 배양한 후, 각 배지에서의 세포 성장 특성을 비교하였다.

도 3은 LSF 배지와 시판하는 CHO-S-SFM Ⅱ 배지를 이용하여 CHO 세포를 배양하여 배양 시간에 따른 세포 성장을 나타낸 그래프로서, 여기에서 보듯이 배양 시작 후 다음날에는 생존세포수가 CHO-S-SFM Ⅱ 배지에서 4.1x10⁵/㎖인데 비해 LSF 배지에서는 2.2x10⁵/㎖로 낮았지만, 배양 후 2 일째부터 LSF 배지에서는 세포 성장이 지속되어 5 일째 생존세포수가 최대 1.8x10⁶/㎖에 도달한 반면, CHO-S-SFM Ⅱ 배지에서는 생존세포수가 최대 6.1x10⁵/㎖로 LSF 배지에서보다 세포 성장이 지연되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 무혈청 배지인 LSF 배지가 기존의 무혈청 배지보다 CHO 세포의 배양에 더욱 적합함을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 동물세포 배양용으로 공지된 기본 배지에 인슐린, 페튜인, 펩톤, 시트르산 제 2 철, 그리고 계면활성제를 첨가한 본 발명의 LSF 무혈청 배지는 포유동물 세포, 특히 CHO 세포를 혈청 함유 배지에서와 유사한 세포 성장율로 배양할 수 있으며, 제조 비용이 훨씬 저렴하여 경제적이다.

Claims

아미노산, 비타민, 탄수화물, 무기염류, 미량원소 및 보조인자로 구성된 기본 배지에 인슐린, 페튜인, 펩톤, 시트르산 제 2 철 및 계면활성제를 포함하는 포유동물세포 배양용 무혈청 배지.
제 1 항에 있어서, 재조합 단백질 생산을 위해 형질전환된 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포의 배양을 위한 무혈청 배지.
제 1 항에 있어서, 인슐린 함유량이 5 내지 50 ㎎/ℓ인 것을 특징으로 하는 무혈청 배지.
제 3 항에 있어서, 인슐린이 소 유래 인슐린임을 특징으로 하는 무혈청 배지.
제 1 항에 있어서, 펩톤 함유량이 1 내지 10 g/ℓ인 것을 특징으로 하는 무혈청 배지.
제 1 항에 있어서, 시트르산 제 2 철 함유량이 0.5 내지 5 ㎎/ℓ인 것을 특징으로 하는 무혈청 배지.
제 1 항에 있어서, 계면활성제 함유량이 0.5 내지 1.5 g/ℓ인 것을 특징으로 하는 무혈청 배지.
제 7 항에 있어서, 상기 계면활성제가 플루로닉 F68(Pluronic F68)인 것을 특징으로 하는 무혈청 배지.
제 1 항에 있어서, 페튜인 함유량이 50 내지 500 ㎎/ℓ인 것을 특징으로 하는 무혈청 배지.
제 9 항에 있어서, 페튜인이 소 유래 페튜인인 것을 특징으로 하는 무혈청 배지.