KR100523549B1 - 식물 종자의 발아를 이용한 펩타이드 제조방법 - Google Patents
식물 종자의 발아를 이용한 펩타이드 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물 종자에 존재하는 단백질을 효소분해하여 펩타이드를 제조함에 있어 식물종자의 발아를 이용하여 펩타이드의 제조수율 및 제조공정을 개선한 식물 종자 유래 펩타이드의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 식물 종자의 발아를 이용하여 발아 전에 비해 개선된 펩타이드 제조 수율을 가지며 발아되지 않은 종자를 이용하여 제조한 펩타이드와는 상이한 조성을 가지는 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다. 이들은 식품, 조미료, 사료, 영양제, 의약품, 화장품 등의 분야에 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 식물 종자에 존재하는 단백질을 효소분해하여 펩타이드를 제조함에 있어 식물종자의 발아를 이용하여 펩타이드의 제조수율 및 제조공정을 개선한 식물 종자 유래 펩타이드의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 식물 종자의 발아를 이용하여 발아 전에 비해 개선된 펩타이드 제조 수율을 가지며 발아되지 않은 종자를 이용하여 제조한 펩타이드와는 상이한 조성을 가지는 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다. 이들은 식품, 조미료, 사료, 영양제, 의약품, 화장품 등의 분야에 이용할 수 있다.
펩타이드는 펩타이드 결합으로 이루어진 아미노산 중합체의 총칭으로 협의로는 중합도 100 이상을 단백질, 100이하를 펩타이드라고 분류한다. 이러한 펩타이드는 혈압강하작용, 항산화 작용, 지질대사 촉진작용, 면역증강작용, 혈중 콜레스테롤 저하작용, 알코올 흡수 저해작용, 철 및 칼슘흡수 촉진작용, 피부의 주름 생성 억제작용 및 각종 생체내 제어 및 정보 전달에 중요한 역할을 담당하여, 호르몬, 세포증식, 혈압조절, 신경전달, 항생작용 등을 가지며 생체내 조절 작용의 90% 정도에 조절 요인들로 작용하고 있어, 식품, 화장품 및 의약품 분야 등의 신소재로서 주목받고 있다.
종래에 천연물에서 이러한 펩타이드를 제조하는 방법은 천연물 또는 천연물에서 단백질을 추출하여, 단백질 분해효소 만을 이용하여 분해하거나, 산 또는 알칼리 분해하여 얻었다. 종래의 분해방법 중 산 또는 알칼리에 의한 방법은 암을 유발하는 염소화합물이 발생하는 것이 알려져 있으며, 단백질 분해물의 중합도를 제어하기가 곤란하다. 또한 최종적으로는 산 또는 알칼리를 중화하는 과정이 필요하여, 염이 함유되지 않은 펩타이드를 얻기 위해서는 탈염공정이 필수적이다. 또한 단백질 분해효소만을 이용하여 분해하여 펩타이드를 제조하는 경우 식물종자에 포함된 단백질을 충분히 분해하기 어려우며, 이러한 목적을 달성하기 위해서는 다량의 단백질 분해효소를 사용하여야 하는데, 단백질 분해효소는 고가인 경우가 많아 제조단가 상승의 원인이 되어 펩타이드 가격을 높이는 주요한 요인이 되었다.
식물 종자는 발아의 과정에서 다양한 생명활성을 나타내는데, 우선, 발아과정과 이후의 생명활동에 영양을 공급하기 위해 식물 종자에 포함된 단백질을 포함한 각종 영양성분의 분해가 시작되며, 각종 효소를 포함한 신규 단백질, 펩타이드, 아미노산 및 비타민 등이 다량 생성된다. 이러한 발아 식물종자를 이용한 예로는 맥아를 들 수 있는데, 맥아는 발아과정에서 아밀라아제가 다량 생성되고 비타민B1이 활성화되어 맥주의 제조 등과 한방에서는 위장과 비장을 튼튼하게 하고 소화를 잘되게 하는 약재로 이용되었다. 이외에도 발아 식물 종자에는 발아 전에 없던 성분이 다량으로 증가하는 것을 확인할 수 있는데, 현미를 싹틔운 발아현미 성분에는 감마오리자놀, 비타민, 아미노산, 지방산, 식이섬유 등이 증가하며 특히, 감마 오리자놀의 경우, 발아의 과정에서 현미 100g 당 295mg이나 생성되는 것으로 보고 되고 있다. 이외에도 주로 벼과 식물의 종자내 종피와 배아 등에 리그닌, 헤미셀룰로오즈 등의 섬유상 성분이 분포하는데, 난분해성 성분으로 효소에 의한 분해를 방해하지만, 발아 과정에서 가수분해되고, 항암활성으로 인해 학계의 주목을 받고 있는 아라비녹시란(Arabinoxylane)을 생성한다. 이와 같이 발아된 식물의 종자를 펩타이드 제조의 단백질원으로 이용할 경우에는 단백질의 분해율을 높여 펩타이드 제조수율을 높일 수 있으며, 발아과정 중에 새로운 단백질이 생성되어 발아전과는 상이한 펩타이드를 제조 가능하다는 장점과 발아과정에서 생성된 펩타이드 및 아미노산을 이용할 수 있다는 장점을 가진다. 또한 부가적으로 발아과정 중에 생성되는 생리활성 물질을 포함할 수 있어 산업적으로 매우 유익할 것이다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 펩타이드를 제조하는 방법으로 식물 종자를 발아시켜, 발아 전과는 상이한 단백질 및 아미노산 조성을 가지고, 발아 전 식물 종자에 비해 비타민 등의 생리 활성물질의 함량이 많으며, 단백질 분해효소에 의해 분해되기 쉬운 상태로 바뀐 발아 식물 종자에 단백질 분해효소를 첨가하여 분해함으로써 경제적으로 펩타이드를 제조하며, 부가적으로 발아과정 중에 생성되는 생리활성물질을 포함할 수 있는 펩타이드 제조방법을 제공하려는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 구성을 좀더 상세하게 설명하면, 미숙의 식물 종자 및 이물질을 제거하는 선별공정; 식물종자에 부착된 오염물 및 부유물을 제거하는 세척공정; 식물종자를 발아시키는 발아공정; 상기 발아된 식물종자를 마쇄하는 마쇄공정; 마쇄된 식물종자를 증류수에 현탁한 후, 70-120℃ 온도에서 교반 가열하는 공정; 상기의 현탁액에 염기성 수용액과 산성 수용액을 첨가하여 소정의 pH를 만드는 공정; 상기 현탁액을 소정의 온도로 가열하여 효소를 넣어 반응시켜 단백질을 분해 시키는 공정; 그리고, 상기 분해액을 가온하여 효소를 실활 시킨 다음 여과하여 불용성 물질을 제거한 후 분무건조 또는 동결건조하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 식물종자로는 발아가 가능한 모든 식물 종자를 포함하며, 현미, 대두, 소맥, 메밀, 수수, 조, 옥수수 등을 들 수 있다.
상기 선별공정을 통해 발아력이 왕성한 식물종자를 선별하여 미숙의 식물종자를 제거한 다음, 식물종자에 부착되어 있는 오염물이나 기타 부유물을 제거하기 위하여 세척공정을 거치게 된다.
상기 세척공정을 통해 세척된 식물종자는 발아공정을 거치게 되는데, 본 발명에 의한 발아공정은 식물종자에 건조중량의 1-5배의 물을 가하여 적절한 시간동안 방치하여 불린 후, 망상의 판에 얇게 깔고 식물종자가 소정의 발아율에 이를 때까지 일정한 간격으로 20-30℃ 수온의 물을 가하여 발아시킨다.
이와 같이 식물종자를 발아시켜 펩타이드 제조원으로 사용하게 되면, 발아되지 않은 식물종자를 직접 펩타이드 제조원으로 사용하는 것에 비해 단백질 분해효소에 의해 분해되기 쉬운 상태로 바뀌어 단백질 분해효소에 의한 분해율이 높아져, 펩타이드 제조수율이 향상되며, 발아공정을 통해 발아되지 않은 식물종자에는 존재하지 않는 다양한 단백질 및 아미노산을 포함한 영양성분이 새로이 합성되어 발아되지 않은 식물종자를 이용한 펩타이드와는 상이한 펩타이드를 얻을 수 있다.
다음에, 상기 발아된 식물종자를 마쇄한 후 중량의 5-20배의 물을 가한 후 70-120℃ 온도에서 5-30분간 교반 가열하여 단백질을 추출하고, 변성시켜 단백질 분해효소가 분해하기 용이한 상태가 되게 한다.
다음에 상기의 현탁액에 수산화나트륨 수용액, 탄산나트륨, 생석회 등을 용해한 염기성 수용액과 인산, 염산, 황산, 초산, 질산, 붕산 등의 산성 수용액을 첨가하여 단백질 분해효소에 따른 최적 pH로 만든 후 단백질 분해효소의 종류에 따른 최적 분해 온도인 20-75℃로 가온 또는 냉각한다.
다음에 상기의 최적 분해온도 및 pH를 유지하면서 단백질 분해효소를 투입하여 5-9시간 정도 효소분해를 진행한다. 분해가 완료되면, 가온하여 분해물의 온도를 90-120℃로 높여서 30분-2시간 정도 가열하여 효소의 활성을 제거한다. 이 때 가열 시간 및 온도는 효소의 종류에 따라 상이하며, 내열성 단백질 분해효소를 사용한 경우 효소활성 제거에 좀더 높은 온도 및 긴 시간이 요구된다. 효소활성이 제거되면, 실온으로 냉각한다.
본 발명에 사용되는 단백질 분해효소는 파파인, 브로멜레인, 판크레아틴, 트립신, 프로네아제(Pronase E), 서브틸리신(Subtilisin), 서브틸리신 칼스버그(Subtilisin Carlsberg), 알칼라아제(Alcalase, NOVO사), 페스칼라제(Pescalase GISTBROCADES사), 맥사자임(Maxazyme) NNP 등을 사용할 수 있다.
다음에 냉각된 분해물은 여과하거나, 원심분리하여 불용성 물질을 제거한다. 불용성물질이 제거된 분해물은 그대로 사용이 가능하며, 경우에 따라 한외여과 (Utrafiltration) 장치를 이용하여 분자량에 따른 펩타이드로 분획할 수 있으며, 사용목적에 따라 분자량을 선별하여 사용할 수 있다.
다음에 여과된 분해물은 진공농축법으로 농축하여 사용할 수 있으며, 스프레이 드라이어를 이용하여 분말상의 펩타이드을 얻거나, 동결건조법을 이용하여 건조를 하고 적당한 크기로 분쇄를 하면 펩타이드 과립 및 세립을 얻을 수 있다.
이하에서 실시예들을 들어 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하나, 실시예는 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예 1>
수세하여 불순물을 제거한 현미는 적절한 농도의 소금물에 침지하여 가라앉는 종자만을 골라 실온에서 충분한 양의 물에 48시간 침지한 후 수세하고, 바닥에 깨끗한 면포를 충분한 두께로 깐 철망 위에 고르게 깔고 위에 다시 깨끗한 면포를 덮어두고 25℃, 빛이 차단된 상태에서 약 4㎜ 발아될 때까지 6시간 간격으로 충분한 양의 물로 면포를 적셔주어 발아시켰다.
상기와 같이 발아된 현미를 충분히 마쇄한 후 마쇄된 발아 현미 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 현미 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 9.0으로 조절하였다.
상기 발아 현미 분산액에 프로네아제(Pronase E, EC 3.4.24.3, Calbiochem, 미국)를 마쇄 발아 현미 중량의 0.01% 첨가하고 40℃에서 5시간 동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.
이와 같이 용해된 것을 100℃에서 30분간 가열하여 효소활성을 실활시킨 후 실온으로 냉각하고, 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기의 분해물을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 현미 펩타이드를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 1"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<실시예 2>
실시예 1과 같이 발아시킨 현미를 충분히 마쇄한 후 마쇄된 현미 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 현미 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 6.0으로 조절하였다.
상기 발아 현미 분산액에 파파인(EC 3.4.22.2, Fluka, USA)을 마쇄 발아 현미 중량의 0.02% 첨가하고 40℃에서 5시간 동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.
이와 같이 용해된 것을 실시예 1과 같이 효소활성을 실활시킨 후 불용성 물질을 제거하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 현미 펩타이드를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 2"라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<실시예 3>
실시예 1과 같이 발아시킨 현미를 충분히 마쇄한 후 마쇄된 발아 현미 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 현미 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 6.0으로 조절하였다.
상기 발아 현미 분산액에 브로멜레인(Bromelain;EC 3.4.22.32, Fluka, USA)을 마쇄 발아 현미 중량의 0.02% 첨가하고 40℃에서 5시간동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.
이와 같이 용해된 것을 실시예 1과 같이 효소활성을 실활시킨 후 불용성 물질을 제거하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 현미 펩타이드를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 3"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<실시예 4>
수세하여 불순물을 제거한 대두는 알이 굵고 흠집이 없는 종자를 골라 실온에서 충분한 양의 물에 8시간 침지한 후 수세하고, 바닥에 깨끗한 면포를 충분한 두께로 깐 철망 위에 고르게 깔고 위에 다시 깨끗한 면포를 덮어두고 30℃, 빛이 차단된 상태에서 약 7㎜ 발아될 때까지 6시간 간격으로 충분한 양의 물로 면포를 적셔 주어 발아시켰다.
상기와 같이 발아된 대두를 충분히 마쇄한 후 마쇄된 발아 대두 중량의 5배량의 -20℃로 냉각된 아세톤을 가해 분산한 후 여과하고 마쇄된 발아 대두를 회수하여 실온에서 건조하여 잔존하는 아세톤을 제거한다. 지질성분을 제거하고 건조시킨 마쇄 발아 대두에 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 대두 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 9.0으로 조절하였다.
상기의 발아 대두 분산액에 프로네아제 E(Pronase E; EC 3.4.24.3, Calbiochem, USA)를 마쇄 대두 중량의 0.1% 첨가하고 40℃에서 5시간 동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.
이와 같이 용해된 것을 100℃에서 30분간 가열하여 효소활성을 실활시킨 후 실온으로 냉각하고, 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기의 분해물을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 대두 펩타이드를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 4"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<실시예 5>
실시예 4와 같이 발아시킨 대두를 충분히 마쇄한 후 마쇄된 발아 대두 중량의 5배량의 -20℃로 냉각된 아세톤을 가해 분산한 후 여과하고 마쇄된 발아 대두를 회수하여 실온에서 건조하여 잔존하는 아세톤을 제거한다. 지질성분을 제거하고 건조시킨 마쇄 발아 대두에 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 대두 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 6.0으로 조절하였다.
상기 발아 대두 분산액에 파파인(EC 3.4.22.2, Fluka, USA)을 마쇄 발아 대두 중량의 0.2% 첨가하고 40℃에서 5시간 동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.
이와 같이 용해된 것을 실시예 4와 같이 효소활성을 실활시킨 후 불용성 물질을 제거하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 대두 펩타이드를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 5"라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<실시예 6>
실시예 4와 같이 발아시킨 대두를 충분히 마쇄한 후 마쇄된 발아 대두 중량의 5배량의 -20℃로 냉각된 아세톤을 가해 분산한 후 여과하고 마쇄된 발아 대두를 회수하여 실온에서 건조하여 잔존하는 아세톤을 제거한다. 지질성분을 제거하고 건조시킨 마쇄 발아 대두에 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 대두 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 9.0으로 조절하였다.
상기 발아 대두 분산액에 서브틸리신(Subtilisin; EC 3.4.21.14, Fluka, USA)을 마쇄 발아 대두 중량의 0.01% 첨가하고 50℃에서 5시간동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.
이와 같이 용해된 것을 실시예 4와 같이 효소활성을 실활시킨 후 불용성 물질을 제거하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 대두 펩타이드를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 6"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<실시예 7>
수세하여 불순물을 제거한 메밀은 적절한 농도의 소금물에 침지하여 가라앉는 종자만을 골라 실온에서 충분한 양의 물에 12시간 침지한 후 수세하고, 바닥에 깨끗한 면포를 충분한 두께로 깐 철망 위에 고르게 깔고 위에 다시 깨끗한 면포를 덮어두고 20℃, 빛이 차단된 상태에서 약 4㎜ 발아될 때까지 6시간 간격으로 충분한 양의 물로 면포를 적셔 주어 발아시켰다.
상기와 같이 발아된 메밀을 충분히 마쇄한 후 마쇄된 발아 메밀 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 메밀 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 9.0으로 조절하였다.
상기의 발아 메밀 분산액에 프로네아제 E(Pronase E; EC 3.4.24.3, Calbiochem, USA)를 마쇄 발아 메밀 중량의 0.01% 첨가하고 40℃에서 5시간동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.
이와 같이 용해된 것을 100℃에서 30분간 가열하여 효소활성을 실활시킨 후 실온으로 냉각하고, 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기의 분해물을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 메밀 펩타이드를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 7"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<실시예 8>
실시예 7과 같이 발아시킨 메밀을 충분히 마쇄한 후 마쇄된 발아 메밀 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 메밀 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 6.0으로 조절하였다.
상기 발아 메밀 분산액에 파파인(Papain; EC 3.4.22.2, Fluka, USA)을 마쇄 발아 메밀 중량의 0.02% 첨가하고 40℃에서 5시간동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.
이와 같이 용해된 것을 실시예 1과 같이 효소활성을 실활시킨 후 불용성 물질을 제거하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 메밀 펩타이드를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 8"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<실시예 9>
실시예 7과 같이 발아시킨 메밀을 충분히 마쇄한 후 마쇄된 발아 메밀의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 메밀 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 6.0으로 조절하였다.
상기 발아 메밀 분산액에 알칼라제(Alcalase; Novozymes, USA)을 마쇄 발아 메밀 중량의 0.02% 첨가하고 40℃에서 5시간동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.
이와 같이 용해된 것을 실시예 7과 같이 효소활성을 실활시킨 후 불용성 물질을 제거하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 메밀 펩타이드를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 9"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<실시예 10>
실시예 1과 같이 발아시켜 마쇄한 발아 현미 분쇄물에 현미 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 현미 분산액을 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기 용해물을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 현미 단백질 용액을 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 10"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<실시예 11>
실시예 4와 같이 발아시켜 마쇄한 발아 대두 분쇄물에 마쇄된 발아 대두 중량의 5배량의 -20℃로 냉각된 아세톤을 가해 분산한 후 여과하고 마쇄된 발아 대두를 회수하여 실온에서 건조하여 잔존하는 아세톤을 제거한다. 지질성분을 제거하고 건조시킨 마쇄된 발아 대두에 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 대두 분산액을 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기 용해물을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 대두 단백질 용액을 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 11"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<실시예 12>
실시예 7과 같이 발아시켜 마쇄한 메밀 분쇄물에 발아 메밀 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 발아 메밀 분산액을 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기 용해물을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 발아 메밀 단백질 용액을 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 12"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<실시예 13>
실시예 1의 시료 1을 증류수에 1%로 용해하고 이를 분자량 5000의 멤브레인 필터를 장착한 한외여과 장치로 농축하여, 멤브레인을 통과한 여과액을 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 13"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<비교예 1>
실시예 1과 같이 선별한 현미는 수세하여 불순물을 제거하고 실온에서 충분한 양의 물에 8시간 침지한 후 수세하고, 충분히 마쇄한 후 마쇄된 현미 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 현미 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 9.0으로 조절하였다.
상기 현미 분산액에 프로네아제 E(Pronase E; EC 3.4.24.3, Calbiochem, USA)를 마쇄 현미 중량의 0.01% 첨가하고 40℃에서 5시간동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.
이와 같이 용해된 것을 100℃에서 30분간 가열하여 효소활성을 실활시킨 후 실온으로 냉각하고, 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기의 분해물을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 현미 펩타이드를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 14"라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<비교예 2>
실시예 4와 같이 선별한 대두는 수세하여 불순물을 제거하고 실온에서 충분한 양의 물에 8시간 침지한 후 수세하고, 충분히 마쇄한 후 마쇄된 대두 중량의 5배량의 -20℃로 냉각된 아세톤을 가해 분산한 후 여과하고 마쇄된 대두를 회수하여 실온에서 건조하여 잔존하는 아세톤을 제거한다. 지질성분을 제거하고 건조시킨 마쇄된 대두에 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 대두 분산액에 2N 수산화나트륨 수용액과 2N 염산 수용액을 이용하여 pH 9.0으로 조절하였다.
상기의 대두 분산액에 프로네아제 E(EC 3.4.24.3, Calbiochem, USA)를 마쇄 대두 중량의 0.1% 첨가하고 40℃에서 5시간 동안 가수분해를 수행하여 단백질을 펩타이드로 용해하였다.
이와 같이 용해된 것을 100℃에서 30분간 가열하여 효소활성을 실활시킨 후 실온으로 냉각하고, 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기의 분해물을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 대두 펩타이드를 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 15"라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<비교예 3>
실시예 1과 같이 선별한 현미는 수세하여 불순물을 제거하고 실온에서 충분한 양의 물에 8시간 침지한 후 수세하고, 충분히 마쇄한 후 마쇄된 현미 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 현미 분산액을 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기의 분산액을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 현미 단백질 용액을 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 16"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<비교예 4>
실시예 4와 같이 선별한 대두는 수세하여 불순물을 제거하고 실온에서 충분한 양의 물에 8시간 침지한 후 수세하고, 충분히 마쇄한 후 마쇄된 대두 중량의 5배량의 -20℃로 냉각된 아세톤을 가해 분산한 후 여과하고 마쇄된 대두를 회수하여 실온에서 건조하여 잔존하는 아세톤을 제거한다. 지질성분을 제거하고 건조시킨 마쇄된 대두에 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 대두 분산액을 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기의 분산액을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 대두 단백질 용액을 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 17"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
<비교예 5>
실시예 7과 같이 선별한 메밀은 수세하여 불순물을 제거하고 실온에서 충분한 양의 물에 8시간 침지한 후 수세하고, 충분히 마쇄한 후 마쇄된 메밀 중량의 10배량의 증류수를 가하여 분산하고 이를 100℃에서 30분간 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 냉각된 메밀 분산액을 500 메쉬의 체를 이용하여 불용성 물질을 제거하였다. 상기의 분산액을 10,000rpm에서 원심분리하여 수용액 상태인 상등액만을 분리하고, 0.45㎛의 필터에 여과하여 제균하여 본 발명의 메밀 단백질 용액을 수득하였다. 이와 같이 수득된 것을 동결건조하여 "시료 18"이라 하고, 하기 실험예에서 사용하였다.
[시험예 1] 아미노산 조성 분석
식물 종자의 발아에 따른 단백질 및 아미노산의 변화를 확인하기 위하여 아미노산 조성 분석을 수행하였다. 상기 실시예 10, 11, 12에서 수득한 발아 현미, 발아 대두, 발아 메밀 단백질 시료 10, 11, 12와 비교예 3, 4, 5에서 수득한 현미, 대두, 메밀 단백질 시료 16, 17, 18을 경질 시험관에 각각의 시료 5mg을 취해 6N 염산 5ml을 가하여 탈기한 후 밀봉하여 110℃에서 24시간 가수분해시켜서 2-3회 소량의 증류수로 씻은 다음 농축기로 50℃에서 건조시켜 염산을 제거하고 AccQ·Tag Reagent kit(Waters, USA)로 유도체화하여 AccQ·Tag 아미노산 분석 컬럼(Waters, USA)과 고압액체크로마토그래피(Alliance Waters 2695 system, Waters, USA)를 이용하여 분석하였다. 아미노산 조성을 분석한 결과는 하기 표 1과 같았다.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 발아된 식물종자 단백질의 아미노산 조성은 발아 전에 비해 상당히 달라진 양상을 나타내어 발아에 의해 식물 종자에 신규한 단백질 및 아미노산의 합성이 이루어지고 있음을 나타낸다. 즉, 발아된 식물 종자를 펩타이드 제조의 단백질원으로 이용할 경우, 발아되지 않은 식물 종자를 펩타이드 제조의 단백질원으로 이용하여 제조된 펩타이드와는 상이한 펩타이드를 얻을 수 있음을 나타낸다.
[시험예 2] 펩타이드 제조의 확인
본 발명에서는 단백질이 펩타이드화된 정도를 확인하기 위하여 상기 실시예 4, 11의 시료 4, 11과 비교예 2, 4의 시료 15, 17을 0.1% 소듐도데실설페이트(SodiumDodecylSulfate)를 함유한 10% 중합도의 폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel)에 전기이동(electrophoresis)하여 확인하였다(도 1참조). 도 1에서 레인 1은 표준 단백질, 레인 2는 발아되지 않은 대두 단백질 용액(시료 17), 레인 3은 발아되지 않은 대두 프로네아제 분해 펩타이드(시료 15), 레인 4는 발아된 대두 단백질 용액(시료 11), 레인 5는 발아 대두 프로네아제 분해 펩타이드(시료 4)를 나타낸다.
도 1에 나타난 바와 같이 발아 되지 않은 대두 단백질인 시료 17은 단백질 분해효소만을 이용하여 분해한 시료 15와 같이 분해됨을 확인할 수 있으나, 그 분해정도가 발아시킨 후 단백질 분해효소를 이용하여 분해한 시료 4에 비해 낮은 것을 확인하였으며, 발아시킨 후 단백질 분해효소를 이용하여 펩타이드를 제조하는 것이 동일한 단백질 분해효소 처리량으로도 좀더 효과적인 것을 확인하였다.
[시험예 3] 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation chromatography)
본 발명의 펩타이드의 펩타이드 제조효율 및 중합도에 따른 분자량 분포를 확인하기 위하여 겔 투과 크로마토그래피를 수행하였다.
OHpak KB-804 (8 X 300 mm, Shodex, 일본) 컬럼과 고압액체크로마토그래피 (Alliance Waters 2695 system, Waters, USA)를 이용하여, 이동상 pH 7.0의 100mM 염화나트륨을 포함한 50mM 인산완충액, 컬럼 온도 25℃, 분당 0.8 ㎖ 유속의 조건으로 분리하고, 251nm에서의 흡광도를 확인하여 검출하였으며, 표준물질로 알부민(Bovine serum Albumin, 분자량 66000), 카르보닉 언히드라제(Carbonic anhydrase, 분자량 29000), 씨토크롬 씨(Cytochrome C, 분자량 12400) 아프로티닌(Aprotinin, 분자량 6500), 안지오텐신 Ⅱ(Angiotensin Ⅱ Acetate 1046.2), VAL-TYR-VAL 펩타이드(분자량 379.5), GLY-TYR 펩타이드(분자량 238.2)를 사용하여 시료의 컬럼내 지연시간에 따른 펩타이드 분자량의 검량선을 작성하여, 본 발명의 펩타이드의 펩타이드 중합도를 확인하고 분자량별 펩타이드 조성비를 계산하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 발아시킨 식물 종자의 경우 발아시키기 전에 비해 중합도가 낮은 단백질 및 펩타이드의 조성이 증가하였으며, 각종 단백질 분해효소를 이용한 펩타이드 제조원으로 사용한 본 발명의 펩타이드의 경우에도 발아시키기 전의 식물종자를 단백질 분해효소를 이용하여 제조한 펩타이드에 비해 중합도가 낮은 펩타이드의 조성이 크게 증가한 것으로 나타나 본 발명이 식물 종자 단백질의 단백질 분해효소에 의한 분해율을 높여 펩타이드 제조수율이 향상되었음을 알 수 있다.
또한 한외여과막을 통하여 여과한 펩타이드 시료 13의 경우 저중합도의 펩타이드 조성이 크게 증가한 것을 확인하여 사용자의 목적에 따라 분자량 조성을 조절하여 펩타이드를 제조하는 것이 가능함을 알 수 있다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 제조방법으로 식물 종자를 발아시켜, 발아 전과는 상이한 단백질 및 아미노산 조성을 가지고, 발아 전 식물 종자에 비해 비타민 등의 생리 활성물질의 함량이 많으며, 단백질 분해효소에 의해 분해되기 쉬운 상태로 바뀐 발아 식물 종자에 단백질 분해효소를 첨가하여 분해함으로써 경제적으로 펩타이드를 제조하며, 부가적으로 발아과정 중에 생성되는 생리활성물질을 포함할 수 있는 펩타이드의 제조가 가능하다.
본 발명의 방법에 의하여 제조된 펩타이드는 식품, 화장품, 조미료, 사료, 영양제, 의약품용 소재로 사용할 수 있다.
도 1은 SDS-PAGE 전기이동(electrophoresis) 결과이다.
레인 1: 표준 단백질,
레인 2: 발아되지 않은 대두 단백질 용액(시료 17),
레인 3: 발아되지 않은 대두 프로네아제 분해 펩타이드(시료 15),
레인 4: 발아된 대두 단백질 용액(시료 11),
레인 5: 발아 대두 프로네아제 분해 펩타이드(시료 4).
Claims (4)
- 식물 종자를 단백질 분해효소로 분해하여 펩타이드를 제조하는 방법에 있어서, 효소 분해 이전에 식물종자를 발아시키는 것을 특징으로 하는, 발아시킨 식물 종자를 단백질 분해효소로 분해하여 펩타이드를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 미숙의 식물 종자 및 이물질을 제거하는 선별공정; 식물종자에 부착된 오염물 및 부유물을 제거하는 세척공정; 식물종자를 발아시키는 발아공정; 상기 발아된 식물종자를 마쇄하는 마쇄공정; 마쇄된 식물종자를 증류수에 현탁한 후 교반 가열하는 공정; 상기의 현탁액을 적정 pH로 조절하는 공정; 상기 현탁액에 효소반응시켜 단백질을 분해시키는 공정; 그리고, 상기 분해액의 효소를 실활시킨 다음 불용성 물질을 제거한 후 여과하는 공정;을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 발아시킨 식물 종자를 단백질 분해효소로 분해하여 펩타이드를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 파파인, 브로멜레인, 프로네아제, 서브틸리신 또는 알칼라제인 것을 특징으로 하는, 발아시킨 식물 종자를 단백질 분해효소로 분해하여 펩타이드를 제조하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 여과공정은 분자량 3000-10000의 여과막으로 한외여과 (Ultrafiltration)하여 고분자 펩타이드와 저분자 펩타이드를 분리하는 것을 특징으로 하는, 발아시킨 식물 종자를 단백질 분해효소로 분해하여 펩타이드를 제조하는 방법.
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