KR100452013B1

KR100452013B1 - 전혈샘플의혈액분석에사용하기위한만능린스시약조성물

Info

Publication number: KR100452013B1
Application number: KR1019960016923A
Authority: KR
Inventors: 제이. 말린 마이클; 샤피로 필리스
Original assignee: 바이엘 코포레이션
Priority date: 1995-05-16
Filing date: 1996-05-16
Publication date: 2004-12-03
Also published as: AU724334B2; DE69624163T2; IL117922A; ATE225841T1; DE69624163D1; CA2174306A1; ES2184818T3; US5888752A; IL117922A0; EP0743356B1; AU5218896A; JP3728548B2; TW373072B; EP0743356A1; JPH08313518A; KR960042056A

Abstract

본 발명은 자동화 분석기에서의 다양한 혈액 분석법을 수행하고/하거나 개선하는 만능 린스로서 작용하는 수성 시약 조성물의, 이전에는 공지되지 않았던 용도를 제공한다. 만능 린스 시약은 린스 용액의 pH를 약 7.0 내지 약 7.6으로 유지시키는 인산염 완충액, 비용혈성 비이온성 계면활성제(예: 플루로닉), 알칼리 금속염(예: NaCl), 항균 화합물 및 황산화 화합물을 포함하고 삼투 몰 농도가 약 285 내지 305mOsmol/kg이다. 만능 린스 시약 조성물은 세정단계에서 또는 반자동화 시스템 및 전자동화 시스템에서 수행하는 모든 형태의 혈구 분식방법 공정의 사이클에서 사용하기에 매우 적합하다. 본 발명은 다수의 특정 린스 용액을 본 발명의 만능 린스로 대체하여, 수행한 혈구 분석법의 유형에 상관없이 정확하고 허용가능한 결과를 얻는다. 만능 린스는 복잡한 하드웨어와 다수의 상이할 입출력 채널을 갖는 자동화 시스템에 가장 특히 유용하다. 만능 린스 조성물은 이러한 시스템의 설계와 조작을 경제적이고 능률적이고 단순화되도록 한다.

Description

전혈 샘플의 혈액 분석에 사용하기 위한 만능 세정 시약 조성물

본 발명은 자동화 혈액분석기 시스템과, 실행되는 혈구 분석의 정확하고 정밀한 결과, 낮은 주위 노이즈(noise), 자동화 시스템의 최적 작동성과 청결성을 보증하기 위해 당해 시스템에 사용되는 시약 조성물을 사용하는 전혈액 샘플 분석에 관한 것이다.

전혈 중의 세포의 정량, 동정 및 특성 분석을 위한 반자동 분석 시스템 및 전자동 분석 시스템의 사용은 공지된 모든 형태의 혈액 분석 수행의 효율 및 경제성을 돕는다. 자동화 시스템은 모든 혈구 형태, 예를 들면, 적색 혈구(적혈구), 망상 적혈구(미숙 적혈구), 백색 혈구(백혈구), 혈소판의 다양한 정상적 및 비정상적 대응물 쌍방에 대한 분석 및 이에 관련된 많은 파라미터들의 측정에 사용된다. 예를 들면 평균 세포 용적과 헤모글로빈의 농도 및 함량은 일반적으로 측정되는 적혈구의 특성이다.

당해 기술 분야에서의 문제는 비효율적 및/또는 부적당한 방법 및 시약에 의한 세포 오염 및 특히 수백개의 샘플을 고속 방식으로 처리 및 분석할 경우 샘플 챔버(chamber) 및 시스템 하드웨어(hardware)내의 시약의 침착 누적에 기인한 최종 결과의 정확도, 정밀도 및 재현성의 부족에 의해 야기된다.

따라서 모든 유형의 혈구 분석의 어려움을 완화하기 위해, 자동화 혈액 분석 공정 및 자동화 유동 시스템이 개발되었지만, 이러한 공정과 시스템은 신뢰할 수 있고, 정확하고 효율적인 작동성 및 결과를 보장하기 위해서는 연속적으로 세정되어야 하고 최적 작업 순서를 고수해야 한다. 자동화 시스템을 사용하여 실행하는 다양한 유형의 혈액 분석, 방법 및 이의 개선에 관한 특정의 예들은 안슬리(Ansley et al.)에게 허여된 미합중국 특허 제3,741,875호, 김(Kim)에게 허여된 미합중국 특허 제4,099,917호, 크레민스(Cremins et al.)에게 허여된 미합중국 특허 제4,801,549호 및 제4,978,624호에 기술된 바와 같이 백혈구 감별계수를 포함하며, 혈구 및 망상 적혈구의 분석은 지. 콜레라(G. Colella et al.)에게 허여된 미합중국 특허 제5,350,695호, 에스. 판(S. Fan et al.)에게 허여된 미합중국 특허 제5,360,739호 및 제5,411,891호, 티코(Tycko)에게 허여된 미합중국 특허제4,735,504호{씨.브루그나라(C. Burgnara et al.), 1994, Am. J. Clin. Path., 102(5):623-632에 기술됨}에 기술된 바와 같이 이들 세포유형의 다양한 특성의 분석을 포함한다. 많은 자동화 혈액 분석기 시스템은 최종 결과를 사이토그램 또는 유용한 출력(Output)으로서 얻거나 나타내기 위해 전기 광학 측정 및 흡광도/광 산란 또는 형광/광 산란 유동 셀 혈구 계산법에 의존한다. 일반적으로, 자동화 시스템을 사용하여 실행하는 각 유형의 혈액 분석의 실행에 있어서, 시스템은 분석 동안 뚜렷한 기능을 실행하고/하거나 측정하는 개개의 세포 유형 또는 특정의 파라미터에 대한 정보를 나타내는 역할을 하는 상이한 채널(channel)을 다수 갖도록 설계된다. 일상적으로 진행하는 다양한 작동 채널 및 샘플 수의 결과로서, 모든 샘플 챔버를 포함하는 자동화 시스템과 채널, 펌프, 튜브, 밸브, 콘테이너, 조인트 등을 포함하는 시스템 하드웨어는 반응 혼합물(혈액 샘플 및 기타 시약 성분을 포함)에 의한 침착 및 오염을 방지하기 위해 고속 분석을 수행하는 샘플 및 샘플 시약 용액의 반복 흡인(aspiration) 후에 일상적으로 하나 이상의 시약 용액으로 세척하여야 한다. 특정의 예는 실행될 분석 유형에 따라서 하나 이상의 유형의 세정 시약을 사용하는, 상품명 테크니콘(TECHNICON) H●^TM, 예를 들면 H●1^TM, H●2^TM및 H●3^TM등으로 본 발명의 양수인에 의해 통용되고 있는 자동화 혈액 분석기 시스템에 의해 예시된다. 더욱 특별하게 예시할 경우, 상기한 혈액 분석기 시스템은 일반적으로 헤모글로빈(예: Hb) 및 적혈구/혈소판(예: RBC/PLT) 채널을 위한 한 유형의 세정 시약 제형 및 혈액 분석 실행에 사용하는 과산화효소와 호염구 채널을 위한 상이한유형의 세정 시약을 필요로 한다.

기술한 바와 같은, 문제점 및 방해물은 자동화 분석기의 챔버에서, 특히 챔버를 수회의 샘플 분석을 위해 반복해서 사용할 때, 하나의 반응 혼합물의 다른 반응 혼합물로의 캐리오버(carryover)로부터 발생한다. 반응 혼합물은 시약 성분을 적당한 농도 또는 양으로 포함하는 시약 조성물과 혼합된 전혈 샘플을 의미한다.

세정 용액 캐리오버는, 이것이 어떠한 방법으로 분석되는 반응 혼합물에 반응성 화학 성분, 예를 들면 용해 유발성 계면활성제를 제공할 경우(즉 이것이 어떤 식으로든 반응 혼합물에 참여하는 경우), 분석 결과에 역영향을 미쳐 잘못되고 부정확하고 정밀하지 않은 측정 및 사이트그램 판독을 하게 된다. 세정 캐리오버는 시스템에 따라 다르고 또한 문제점이 존재하며 분석방법으로부터 얻은 결과 및 정보에 역영향을 미친다. 예를 들면, 어떤 방법에 있어서 너무 적은 세정 캐리오버의 용적은 사이토그램의 초기에 과대한 노이즈를 발생시킬 수 있다. 또는, 어떤 방법에 있어서, 과대한 세정 캐리오버 용적은 캐리오버 용적 내에 존재하는 활성 용혈성 계면활성제에 의해 백혈구가 공격받게 할 수 있다. 이러한 역효과는 특히, 예를 들면 자동화 혈액 분석기로 실행하는 백혈구 감별계수에 대한 과산화효소 방법에서의 혈액 분석 결과의 정확성과 신빙성을 손상시킨다.

따라서, 혈액 샘플을 자동화 혈액 분석기 시스템을 사용하여 처리 및 분석하는 방법에 사용하기 위한 개선된 세정 시약 용액 또는 희석액이 당해 기술 분야에 명백히 필요하다. 상기 시약 용액 및 상기 시약 용액을 사용하는 방법은 챔버로부터 샘플을 흡인하여 잔류 찌거기를 제거하고 수로에의 침착 형성을 경감시킨 후에자동화 분석기의 시약 챔버, 채널 및 기타 기계적 하드웨어(즉 펌프, 튜브, 밸브 등을 포함하는 유압 장치) 모두를 완전히 세정해야할 필요가 있다. 또한, 상기 시약 및 방법은 수차례의 샘플 분석 후 생성되는 사이토그램의 최적의 보전성 유지의 필요성을 충족시킬 수 있다. 당해 기술 분야에 있어서 또한, 자동화 혈액 분석기 시스템의 설계 및 조작을 단순화시킬 수 있고, 당해 시스템에서의 실행을 위한 다수의 상이한 혈액 분석 방법 및 절차에 매우 융통성 있고 적합한 시약이 필요하다. 당해 기술분야에서의 또 하나의 요구는 혈액 샘플 분석의 경제성과 능률성을 위해서 시약, 특히 세정 시약 용액의 불필요한 반복성의 제거이다.

시약 조성물은 매우 특별한 목적을 위한 자동화 시스템에 사용하기 위해 예로부터 개발되었다. 당해 기술 분야에서 통상적인 바와 같이, 제형화하고 시험하고 사용하여 특별한 목적을 성취하고 어떤 시스템 내에서 특별한 기능을 수행하기 위해 사용되어 온 시약 조성물은 단지 그러한 시스템에서의 그러한 시스템에서의 그러한 목적 및 기능을 위한 것으로 일상적으로 사용되어 왔으며 , 그렇게 인식되어 왔다. 따라서, 일상적인 상황하에서, 특별한 목적 및 기능을 위해 최적화한 시약 조성물은 어떤 다른 목적에 대해서가 아니라 이의 공지되고 의도된 목적에 근거하여 당해 기술 분야의 숙련가들에 의해 평가되고 사용되고 가장 흔히 당연한 것으로 여겨졌다. 당해 기술 분야에서 특정 목적을 위해서 의도되고 사용된 시약 또는 물질이 완전히 상이한 방법으로 사용되고/되거나 원래의 의도된 용도와 무관한 완전히 상이하고 독특한 목적에 유용함을 발견한다는 것은 드물고 기대하기 어렵다. 이러한 시약의 신규 용도 또는 적용은 당해 기술 분야의 숙련가가 기대할 수도 없고예측할 수도 없다.

자동화 혈액 분석기 시스템에서 특별한 기능을 실행하기 위해서 일상적으로 사용하는 하나의 시약 조성물의 예는 적혈구/호염구 초("RBC/Baso 초")로서 공지되었다. RBC/Baso 초는 상기한 테크니콘(TECHNICON) H●^TM계열의 자동화 분석기에 사용하기 위해 적혈구 및 호염구 채널의 반응 혼합물 샘플 스트림중의 세포들이 분석기 유동 셀의 벽과 접하거나 접촉하지 않도록 액체의 동심원 층에 의해 샘플 스트림을 둘러싸도록 설계되었다. 따라서 초는 "수동적" 또는 상호 작용하지 않는 시약인데, 그 이유는 상당한 정도로 혈구와 물리적으로 상호 작용하지 않고 샘플에 접촉하도록 의도되거나 사용되지 않기 때문이다. 초는 샘플 스트림이 얼라이먼트로부터 탈선함으로써 검출기에 의한 왜곡된 광학 기록을 일으키게 함으로써 자동화 방법을 방해하는 기포 형성을 방지하기 위해 계면활성제를 함유한다. RBC/Baso 초 시약중의 다른 성분은 290mOsmol/kg의 삼투몰 농도 및 자동산화로부터 계면활성제를 보호하기 위한 항산화제를 갖는 인산염 완충된 실란이다. 초 시약의 삼투몰 농도는, 샘플 스트림 중의 혈구들과 샘플 스트림을 둘러싼 초 사이의 우연한 접촉이 있을 경우 적혈구의 평균 세포 용적이 변하지 않도록, 적혈구에 대해 등장성이 되도록 의도된다. 바람직한 계면활성제, 플루로닉 P105, 샘플 스트림 중의 세포들과 초 스트림 주위의 세포 사이에 예기치 않은 접촉이 일어날 경우에 적혈구에 대해 비용혈 농도로 시약 속에 존재한다.

RBC/Baso 초는 통상적으로 하기와 같은 밀폐된 시스템에서 작동한다. 초를시린지(syringe)로부터 부압(negative pressure)에 의해 RBC/Baso 유동 셀 내로 도입하고 초를 유동 셀의 상부를 통해 빼내며, 이와 동시에 큰 정압(positive pressure) 디아프람(diaphragm) 펌프가 초를 유동 셀 하부의 동심 유동 모듈을 통해 운반한다. 샘플 스트림은 상이한 지점에서 동심 유동 모듈로 들어간다. 층류(즉, 비난류) 상태가 되도록 광학적으로 투명한 초 유체 및 샘플 스트림 (동일한 굴절률을 갖는다)의 속도를 억제한다. 샘플 및 초 스트림은 유동 셀을 통해서 독립적으로 흐른다. 초 스트림의 유압은 샘플 스트림을 이의 적당한 직경까지 압축시킨다. 따라서 초는 샘플 스트림을 자동화 시스템 하드웨어의 일부와의 접촉으로부터 보호하는 기능을 수행하는 것이다.

그러나, 본 발명 이전에는, 자동화 혈액 분석기에서 특별한 기능을 수행하기 위해 사용된 RBC/Baso 초 및 다른 시약들중 어느 것도 모든 유형의 혈구 분석에 만능의 적용성을 갖는 세정 용액으로 인식되지도 않았고 사용되지도 않았다.

따라서, 장기간의 연속적이고 다양한 조작동안 시스템을 침착없이 유지시키는 세정 시약으로 사용할 수 있는 만능적으로 적용할 수 있는 시약을 제공해야할 필요가 여전히 존재한다. 이러한 광범위하게 허용될 수 있는 시약의 사용은 현행 시스템의 설계를 단순화 및 능률화하고 혈액분석 방법의 실행 동안 생성되는 불필요한 세포 찌거기에 의해 발생하는 주위 노이즈를 경감시키고 혈액 샘플 분석 분야에서 사용하는 자동화 시스템의 작동성을 일반적으로 개신시킬 수 있다.

본 발명은 신선한 혈액 샘플 및 오래된 혈액 샘플중의 세포 유형의 개체를 정량하고 식별하는 방법에서의 만능 시약 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명은 전기 광학 방법 및 유동 셀 혈구 계산 분석에서의 내부 샘플 세정으로서의 용도에 특히 적합하다.

본 발명의 목적은 원치 않는 반응 혼합물 성분이 한 단계에서 다른 단계로 캐리오버되는 문제를 피함으로써 세포 유형의 완전한 분리 및 정량을 가능하게 하고 시스템 하드웨어 내에 허용할 수 없는 수준의 샘플 침착의 생성 및 분석 방법으로부터 야기되는 사이토그램 중의 주위 노이즈의 발생을 방지하게 하는, 반자동화 및 전자동화 혈액 분석기 시스템에서의 수성 시약 조성물의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 본원에서 이의 용도와 관련하여 기술한 시약에 대한 지금까지 인식되지 않아서 공지되지 않은 용도, 즉, 자동화 혈액 분석기 시스템에서 다양한 종류의 혈액 샘플 유형, 예를 들면 오래된 혈액 샘플과 신선한 혈액 샘플, 비정상적인 혈액 샘플과 정상적인 혈액 샘플 및 냉온과 실온 둘 다에서 저장한 샘플들을 사용하여 수행되는 상이한 형태의 혈액 분석법들의 설계 및 작동을 단순화 및 능률화하는 만능 내부 샘플 세정 시약으로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전혈 샘플과 관련되고 자동화 시스템에서 수행되는 모든 혈액 분석 방법에서 상용성이 있는 만능 수성 시약 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 본 발명의 목적은 시스템 하드웨어의 세정 및 자동화 분석기중의 캐리오버의 제거를 위해 현재 요구되는 세척제 및/또는 세정제의 총수를 감소시킬 수 있는 만능 시약으로서 사용되는 시약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 자동화 혈액 분석기 시스템 및 이의 부품에 사용되는 모든 세척제와 완전히 만능적 상용성이 있는 만능 세정 시약 용액으로서의 시약 조성물의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명에 의해 수득할 수 있는 추가의 목적 및 잇점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해진다.

본 발명을 더욱 상세히 설명하고 이의 이해를 다양한 면에서 분명히 이해하는 것을 돕기 위해 제시된 첨부된 도면에서, 본 발명에 따라 서술된 바와 같이 제조된 다양한 수성 시약 또는 희석제 또는 자동화 혈액 분석기의 전자-광학 검출 시스템을 사용하는 백혈구 감별계수의 측정에 사용되는 경우 도면 1A 내지 1F는 수득된 사이토그램을 도시한다. 제1A도에서 도시된 바와 같은 수 표시는 사이토그램의 상이한 영역을 확인하기 위한 것이고 각 도면에서 동일하다. 기술한 바와 같이, 수 1은 임파구 군집 영역을 가리키고; 수 2는 단핵세포 군집 영역을 가리키고; 수 3은 친핵구 군집 영역을 가리키고; 수 4는 호산구 군집 영역을 가리키고; 수 5는 혈소판 및 적혈구 환영세포로부터 발생되는 기원 노이즈 영역을 가리키고; 수 6은 거대한 염색되지 않은 백혈구 또는 LUC 군집 영역을 가리킨다.

세정 캐리오버 용적은 하기 제1A도 내지 제1F도에 도시한다: 제1A도 및 제1B도는 세정 캐리오버 용적 7.9μL의 결과를 도시하고, 제1C도 및 제1D도는 세정 캐리오버 용적 10.1μL의 결과를 도시하며, 제1E도 및 제1F도는 세정 캐리오버 용적 13.3μL의 결과를 도시한다. 과산화효소 방법의 R1 시약 용액은 0.105g/L SDS를 함유한다.(참조: 실험 1) 도면의 탑에서 나타낸 바와 같이, 두개의 수성 세정 시약조성물을 과산화효소 방법에 사용한다. 2.0g/L SDS를 함유하는 표준 세정 용액으로부터 생성되는 사이토그램을 제1A도, 제1C도 및 제1E도에 도시한다. 2.0g/L SDS와 3.0g/L 브리예 (Brij)^R35를 함유하는 세정 용액으로부터 생성되는 사이토그램을 제1B도, 제1D도 및 제1F도에 도시한다. 제1A도 내지 제1F도의 결과는 세정 용액 중에 Brij^R의 존재가 세정 캐리오버 용적이 약 8.0μL를 초과할 경우 고질의 결과를 손상시킴을 나타낸다.

본 발명은 자동화 시스템을 사용하는 혈액 분석 기술 분야에 잇점을 제공한다. 본 발명은 모든 유형의 자동화 혈액 방법의 실행 및 효율을 향상시킬 수 있는 만능 내부샘플 세정 시약 용액으로서 시약 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 적혈구 및 백혈구와 이들의 전구체의 측정 및 차별화 및 전혈 샘플 중의 여러 군집의 혈구의 다양한 특성의 측정에 사용하는 반자동화 및 전자동화 유동 셀 혈구 계산 분석기에 관한 것이다. 만능 세정 시약의 용도는 또한, 예를 들면 다수의 상이한 세정 시약을 사용하여 여러 샘플의 분석 동안 자동화 시스템 수로에 축적되는 반응 혼합물 찌거기를 제거하는 것과 같이 당해 기술 분야에서 일상적으로 부딪히게 되는 성가신 문제들을 해결한다. 따라서 본 발명의 만능 세정 시약의 용도는 자동화 시스템의 설계를 단순화하고 상이한 유형의 여러 세정 제제에 대한 요구를 경감시킨다.

또한, 본 발명자들은 노닐계 비이온성 계면활성제로 제형화된 시약 용액을 자동화 분석기에서 실행하는 모든 유형의 혈액 방법 중에 사용할 수 있는 만능 "세정" 시약 용액으로서 우선 인지하고 사용한다. 상기 유형의 세정 조성물의 사용은 제1D도 및 제1F도에서 발생한 바와 같이, 세정 캐리오버 용적 중의 변수가 혈액학적 방법의 결과에 역으로 영향 받는 것을 예방한다. 본 발명의 만능 세정 시약 조성물의 비용혈성 계면활성제 성분은 충분한 청정성을 제공하여 축적의 형성을 예방할 수 있는 동시에 분석하는 샘플 중의 혈구를 공격 또는 파괴시키지 않을 수 있다.

아직 한정하지 않은 특정의 실시예일 때, 세정 시약은 백혈구 감별계수의 과산화효소 방법의 최초 반응상 (즉, 세포 용해 및 고정상) 중에 비이온성 폴리에톡실레이트 계면활성제(예: Brij^R35)와 이온성 계면활성제(예: SDS 또는 TDAPS) 둘다를 함유하는 신규 시약과 접촉시켜 사용할 때 최초의 노이즈를 감소시키는데 특히 효과적으로 밝혀졌다. 과산화효소 방법에 만능 세정의 사용은 이전에 자동화 시스템에서 과산화효소 분석을 반복 실행한 사람들을 괴롭혔던, 세정 캐리오버에 의한 시스템-대-시스템 변화성 문제를 해결하는 것으로 또한 밝혀졌다. 세정 캐리오버는 자동화 유동셀 혈구 계산 분석의 결과로서 발생한 사이토그램 중의 세포군의 위치에 영향을 준다. Brij^R35와 같은 비이온성 계면활성제 부재 세정 용액의 사용은 또한 24시간 동안 실온에 저장한 혈액 샘플을 사용하여 수득한 결과를 향상시킬 수 있다.

본 발명에 따라서 제형화 하고 사용한 수성 세정 시약 조성물이 자동화 분석기에서 실행하는 모든 유형의 혈구 분석에 만능 응용성 및 혼화성을 갖는다고 새롭게 측정되었다. 만능 세정 시약을 내부샘플 세정으로서 샘플사이에 사용할 수 있도록 최적으로 설계하여 이전의 샘플을 샘플 흡인 후에 분석기 반응 챔버 및 채널에 일상적으로 남는 시약과 혼합시킴을 포함하는 반응 혼합물을 제거한다. 만능 세정 용액으로서 사용한 세정 시약은 자동화 혈액 시스템에 대한 최적 실행을 위해 필요하고 세정, 초 및 세정제를 포함하는 시약의 총수를 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다. 만능 세정을 현재 수많은 유형의 혈액 분석에 대한 자동화 시스템에 사용하는 복합 세정 시약 또는 용액으로 치환할 수 있다고 추측하고, 상기 자동화 혈액 분석기의 한정되지 않은 예는 시판되는 테크니콘(TECHNICON) H●^TM계이다.

본원에서 먼저 기술한 바와 같이 효과적인 만능 세정임이 밝혀진 세정 시약의 성분을 수성 혼합물에서 제형화한다. 이의 가장 단순한 제제중, 세정 시약은 인산 완충액(예: 인산염 완충된 염수, pH 약 6.8 내지 7.8) 및 계면활성제중 플루로닉 족 또는 부류의 비이온성 및 비용혈성 계면활성제를 포함한다. 일반적으로, 플루로닉은 구조식 (EO)_X-(PO)_y-(EO)_X의 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌의 블록 공중합체이다(참조: 플루로닉 및 테트로닉(Pluronic & Tetronic) 계면활성제, BASF Corporation, Parsippany, New Jersey, 1987). 플루로닉은 프로필렌 옥사이드의 조절된 중합화에 의해 폴리프로필렌 글리콜 단위, (PO)_y를 합성함으로써 형성한다. 플루로닉은 분자량이 약 950 내지 약 4000g/mol에서 변화하고 (PO)는 약 20중량% 내지 약 90중량%를 포함하고, "y"는 약 3 내지 약 62 단위의 범위일 수 있다. 이후, EO 중합쇄는 폴리(PO) 단위의 양 측면상에 형성되어 플루로닉 공중합체를 수득한다. 당해 기술 분야의 숙련가들은 EO 중합화가 대칭적으로 조절되어 "x"가 본질적으로 플루로닉 분자의 각 측면 또는 말단상에서 동일하다는 것을 인식한다. 만능 세정 조성물에 사용하기에 적합한 플루로닉에 있어서 "x" 및 "y"값의 비제한적인 예는 하기와 같다: "x" 는 약 1 내지 36 단위이고, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 27이고, "y"는 바람직하게 약 14 내지 약 48 단위이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 플루로닉은 분자량이 약 2000 내지 약 4000g/mol 범위이고 %EO 값이 약 20중량% 내지 80중량% 범위이다. 분자량이 약 3000 내지 약 3600g/mol 범위이고 %EO 값이 약 30중량% 내지 70중량% 범위인 것이 더욱 바람직하다. 예를 들면 플루로닉 P105 및 P85는 %EO값이 약 50중량%이고, 플루로닉 P104 및 P84는 %EO값이 약 40중량%이다. 제한되지 않은 플루로닉의 예는 P84, P85, P103, P104, P105 및 P123이고 P105가 더욱 바람직하다. P105는 분자량이 약 3300이고 폴리에틸렌을 약 50중량% 포함한다. 상기 플루로닉 계면활성제의 용도는 계면활성제 미셀 중에서 반응 혼합물로부터의 소수성 물질을 포착하여 자동화 시스템의 수로를 청결하게 한다.

당해 기술 분야의 숙련가들은 또한 테트로닉스(Tetronics)(즉, 에틸렌 디아민에 프로필렌 옥사이드와 에틸렌 옥사이드의 연속 첨가에 의해 생성되는 테트라 작용성 블록 공중합체)가 분자내의 3급 질소의 존재로 인해서 양이온성 특성을 갖는다는 것을 인지해야만 한다. 따라서, 상기한 테트로닉스의 양이온성 특성은 예를 들면, 백혈구 감별계수의 과산화효소 방법의 반응 1 시약 용액 중에 존재하는 이온성 계면활성제(예: SDS)와의 혼화성 문제(예: 침전)때문에 본 발명에 적당하지 않다.

세정 시약은 또한 미생물 성장을 지연시키는 제제 또는 화합물을 함유한다. 적당한 미생물 화합물의 예는 제한적이지는 않지만 프로클린(Proclin)150(2-메틸-4-이소티아졸린-3-온)과 프로클린 300(5-클로로-2-메틸-4-이소티아졸린)(롬 및 하아스(Rohm & Hass)), 거말(Germall) 115(N,N'-메틸렌비스[N'-(1-(하이드록시메틸)-2,5-디옥소-4-이미다졸리디닐]우레아)(수톤 라보라토리즈(Sutton Laboratories)), 다우아실(Dowacil) 200(1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트리아자-1-아조니아아다만탄 클로라이드)(다우 케미칼(Dow Chemical)) 및 브로노폴 (Bronopol)(앙구스 케미칼 캄파니(Angus Chemical Company))를 포함하고, 프로클린 150이 바람직하다. 최종 용액의 pH를 중성 또는 거의 중성으로 유지하기 위해서 세정 시약에 하나 이상의 완충 화합물 또는 이들의 혼합물, 예를 들면 일염기성 인산나트륨 및 이염기성 인산나트륨도 또한 포함한다. NaCl, LiCl, KCl 등과 같은 알칼리성 금속 클로라이드염은 세정 시약을 포함할 수 있고, NaCl이 바람직하다. 수용성 항산화제도 또한 세정 용액에 존재하여 항산화에 대한 비용혈성 계면활성제를 안정화시킨다. 적당한 항산화제의 예는 제한적이지는 않지만 3,3'-티오디프로피온산; 3' ,3' -디티오아세트산; 트롤록스(Trolox)^R(즉, 수용성 비타민 E, 호프만-라로케(Hoffman-LaRoche); BHT, 부틸화 하이드록시톨루엔 또는 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀; BHA, 부틸화 하이드록시아니솔 또는 2-tert-부틸-4-메톡시페놀; MEHQ 또는 ρ-메톡시페놀 또는 이들의 혼합물들을 포함한다. 기술한 바와 같이 세정 시약 조성물은 적당한 완충액을 포함하여 시약 조성물의 pH를 약 6.8 내지 약 7.7, 더 바람직하게는 약 6.9 내지 약 7.5,가장 바람직하게는 약 7.0 내지 약 7.3으로 유지시킨다. 최종 용액의 삼투 몰 농도는 약 275mOsm/kg 내지 약 320mOsm/kg, 더 바람직하게는 약 285mOsm/kg 내지 약 305mOsm/kg이다. 또한 최종 세정 시약 용액을 여과시켜(즉, 0.2μ) 그렇지 않으면 시스템 내의 축적의 잠재적 원인일 수 있는 부유성 고형물을 제거한다.

표 1은 최종 만능 시약 용액의 적당하고 작동성 pH와 삼투몰 농도를 수득하기 위한 각각 세정 시약 성분의 양 및 이들의 범위를 포함하여 만능 세정 시약 조성물의 표본 배합을 나타낸다. 표 1에 나타낸 바와 같이 세정 시약 조성물의 성분 각각에 있어서, 리터 당 바람직한 양을 괄호에 제공하지 만 제한하지는 않는다. 각각의 기록된 세정 용액 성분의 농도 및 범위가 조성물이 역으로 영향을 주지 않고약 ±5% 내지 10% 벗어남을 당해 기술 분야의 숙련가들은 이해할 것이다.

기술한 바와 같이 무기염도 또한 시약 용액에 포함될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적당한 염은 NaCl, KCl 및 LiCl와 같은 알칼리 금속 클로라이드 염일 수 있다. 염화나트륨(NaCl)이 바람직한 염이다. 염은, 사용할 경우 바람직하게는 약 125mM 내지 약 136mM의 양으로 존재해야 한다. 염으로서 NaCl을 사용할 경우, 시약 용액 중에 약 7.4 내지 약 8.0g/L의 양으로 존재한다.

세정 시약 중에 사용하는 완충액 또는 완충액들의 혼합물은 시약 용액의 pH를 약 6.8 내지 약 7.6, 바람직하게는 약 6.9 내지 약 7.5, 더 바람직하게는 약 7.0 내지 약 7.3으로 유지하기에 적당해야 한다. 적당한 완충액은 인산나트륨 또는 인산칼륨, 디에틸말로네이트, 3-(N-몰폴리노)프로판 설폰산(MOPS), N-2-아세트아미도-2-아미노에탄 설폰산(ACES) 및 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진-에탄설폰산(HEPES)을 포함한다. Na₂HPO₄(일염기성 인산나트륨)와 NaH₂PO₄(이염기성 인산나트륨)의 혼합물이 바람직하다. 기술한 바와 같이 완충액은 용액의 pH를 거의 중성 수준으로 유지하기에 적당한 양으로 본 발명의 시약 용액 중에 존재해야 한다. 예를 들면 Na₂HPO₄와 NaH₂PO₄의 혼합물을 사용할 경우, 혼합물은 pH 범위가 약 7.0 내지 약 7.3인 일련의 용액을 제조하기 위해서Na₂HPO₄대 NaH₂PO₄의 몰비를 약 3.39:1 내지 약 6.76:1로 함유해야 한다. 본 발명의 시약 용액 중에서 상기 인산염 완충액 혼합물의 농도는 약 0.020M 내지 약 0.050M이다. 또한, 세정 시약 용액의 pH를 통상 산과 염기 적당량(예: 3.0N HCl과 4.0N NaOH)을 사용하여 생리적 범위의 pH를 성취할 수 있도록 조절할 수 있음을 이해할 것이다. 당해 기술 분야의 숙련가들은 완충액 농도가 증가함에 따라서 시약 조성물 중의 다른 성분의 농도는 수용가능한 삼투몰 농도를 유지하기 위해서 감소해야 한다.

혈액 분석의 실행 및 본 발명에 따라서 통상적으로 사용하는 세정 시약 용액은 수용액이고, 바람직하게는 탈이온수를 사용한다. 용액은 물속에서 혼합물 형태로 성분들을 결합하여 제조한다. 용액의 pH에 있어서 바람직한 범위 내에서 유지됨을 확인하기 위해서 시계를 가깝게 유지시켜야 한다. 당해 기술 분야의 숙련가들은 목적한 시약 용액 중에 기타의 첨가물도 또한 포함시킬 수 있다. 예를 들면, 에틸렌디아민 테트라 아세트산(EDTA), EGTA, 이나트륨, 삼나트륨, 또는 사나트륨 EDTA 또는 EGTA를 계면활성제 자동산화의 촉매 작용을 할 수 있는, 철 또는 구리와 같은 금속 이온을 킬레이트화하고 불활성화하는 다가 금속 이온 킬레이트제로서 포함시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 세정 시약 용액은 시스템 세척이 요구되기 전에(참조: 실시예 2) 약 500 내지 1000 이상의 혈액 샘플을 정량하기에 충분한 내부샘플 찌거기를 제거하고, 시스템의 청결성을 유지하여 수용가능한 성능의 전혈 분석 방법을 가능하게 한다.

만능 세정으로서의 용도에 대해 본원에서 기술한 바와 같이 세정 시약의 적합성은 전혈의 1035 흡인을 포함하는 작동 중에 세정 시약 조성물을 사용하여 예시한다. 상기 작동 동안 세정은 시스템의 청결성을 유지시켜 자동화 분석기 위에서 실행하는 연속적 혈액 샘플 방법을 수용가능한 방식으로 실행하고 정확하고 정밀한 결과를 제공한다. 상기 적합성은 세정 시약이 4년산 일때 세정 시약 조성물의 안정성을 시간에 따라서 예시함으로써 또한 재생된다. 만능 세정 시약을 가능한 한 많은 이의 개별적 성형을 포함하여 자동화 혈액 분석에 사용하는 시스템의 모든 수로와 접촉시켜 찌거기가 시스템의 어떤 위치에도 축적되지 않아서 이후에 침착 증강은 세척제를 사용하여 쉽게 제거할 수 없음을 확인하는 것을 권장한다.

만능 세정 시약 제제의 최적화에 있어서, 다수의 계면활성제들을 탈이온수 중에 프로클린 150을 0.5mL/L 함유하는 상황으로 시험한다. 이후에 생성되는 세정 조성물을 자동화 시스템에서 다수의 상이한 유형의 혈액 분석으로 시험한다. 이온성 계면활성제가 세정 조성에 유용하지 않음이 측정된다. 특정의 예, 음이온성 계면활성제(SDS)는 세정 시약 제제에 존재할 경우, 망상 적혈구 분석에 사용하는 시약의 성분인 양이온성 염료, 옥사진 750과 혼화되지 않는다. CTAB(양이온성 계면활성제)는 세정 시약 제제에 존재할 경우, 추측컨데 백혈구 감별계수의 과산화효소 측정방법의 제1 반응상 중에 사용한 특정의 시약 희석제 중의 음이온성 계면활성제와의 부적합성의 결과로서 백혈구 감별계수 및 서브군집의 측정 실행을 방해한다. 라우릴 디에틸아민 N-옥사이드 또는 LO(양쪽성 계면활성제)는, 세정 시약 조성에존재할 경우, 감별 백혈구 계수의 과산화효소 방법 및 서브군집의 측정 실행을 방해한다. 다른 양쪽성 계면활성제(TDAPS)는, 세정 시약 조성에 존재할 경우, 적혈구 분석 방법도 또한 방해하는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 실험성 시험 및 분석을 통해서, 세정 시약 조성 중에서 시험한 이온성 계면활성제(즉, 상이한 정전하를 갖는 모든 주요 집단으로부터의 계면활성제)가 본 발명에 유용하지 않음이 밝혀졌다. 또한, 비이온성 계면활성제(즉, Brij^R35) 및 유사한 폴리에톡시화 알콜 및 페놀(즉, TritonX^R-100)은 이들이 과산화효소 방법 중에 백혈구를 공격하여 활성적으로 반응하기 때문에 세정 시약 조성으로 유용하지 않다. 비이온성 플루로닉 계면활성제, 특히 플루로닉 P105가 자동화 분석기에서 실행하는 과산화효소 방법, 혈액학적 방법 및 본원에서 사용한 반응 혼합물과 혼화될 수 있음이 마침내 밝혀졌다. 상기 플루로닉 계면활성제는 깨끗한 샘플 작동을 제공하고 샘플 함량, 반응 혼합물 또는 최종 생성물을 방해하지 않는다.

본 발명의 한 양태에서, 만능 세정 시약 용액은 실시예 1에서 예시한 바와 같이 자동화 혈액 시스템을 사용하는 백혈구 감별계수의 과산화효소 방법에 사용한다. 동일한 만능 세정 시약은 백혈구, 혈소판, 망상 적혈구 및 이와 관련된 파라미터들(즉, 백색 세포 용적 및 헤모글로빈 분석)을 정량화 및 특성화하는 자동화 방법에도 또한 사용한다. 만능 세정 시약은 림프구, 단핵 세포, 친핵구, 호산구 등을 포함하는 백혈구, WPC(백혈구로도 공지됨)를 정량화 및 특성화하는 자동화 방법에 사용한다. 또한, 만능 세정 시약을 호염기성 채널에 사용하여 다형핵 백혈구의 호염구와 핵 소엽성의 특성화를 촉진시킬 수 있다.

만능 세정은 정상 혈구 및 비정상 혈구 둘다의 특성의 분석, 정량화 및 측정, 및 특정 세포 계통에서 세포 발육 및 분화의 모든 단계를 분석하고 측정하는 방법에 사용할 수 있다. 실제로, 숙련된 변호사들은 세정 시약이 다양한 자동화 혈액 분석에 의해 세고 확인하고/하거나 측정하는 모든 유형의 세포 분석 및 이로 인해 전개된 개선에 적용할 수 있음을 이해할 것이다.

상기한 만능 세정 시약이 당해 기술 분야의 숙련가들이 일상적으로 사용하는 모든 유형의 세척 시약 용액으로 특히 자동화 혈액 분석기 채널 및 하드웨어 성분 중의 시약 침착 증강을 제거하거나 용해시키는 데에도 또한 적합하고 유용함이 증명되었다. 적합성이란 사용하는 세정 시약 용액 또는 세척 용액 중에 어떤 침전도 발생하지 않음을 의미한다. 예를 들면, 알칼리성 하이포염소산염("표백") 및 2-(2-에톡시에톡시) 에탄올을 함유하는 알칼리성 용액을 테크니콘(TECHNICON) H●^TM계열의 자동화 분석기 중의 세척제로서 사용한다.

또 하나의 양태에서, 만능 세정 시약은 현재 자동화 혈액 분석기에 사용하는 하나 이상의 용액을 치환할 수 있다. 따라서, 만능 세정 시약은 유리하게 자동화 방법을 능률화시키고 변호사에 의해 실행되는 세정 콘테이너의 다수의 변화를 경감시킬 것이다. 자동화 시스템에 필요한 시약수의 감소는 분석방법에 있어서 보다 큰 경제성과 효율성을 제공하고 시스템의 정비 및 일반적 유지를 개선시키고 촉진시킨다.

본 발명이 또한 특별하게 제조된 혈구의 스톡 보정기, 억제 및 기타 용액을 사용하여 장치 정확도를 보정하고 유지시킬 수 있다. 본원에 사용한 기타 변형체가 없는 용어 "샘플"은 특별하게 전혈 세포 또는 혈구를 함유하는 기타 용액을 포함하고자 한다. 또한, 본 발명의 재료도 본원에 예시하고 기술한 바와 같이 반자동 또는 완전 자동 방법과 결합하여 수동 방법에 적용할 수 있다.

상기 실시예는 본 발명을 예시한다, 이들은 발명 개념의 이해를 더 촉진시키고 결코 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 이해되지 않는다.

실시예

실시예 1

이 실시예는 만능 세정 시약이 하기 기술한 자동화 분석 시스템을 사용하여 백혈구 감별계수의 과산화효소 방법의 성능을 개선시키는데 도움이 될 수 있음을 예시한다.

백혈구 감별계수의 과산화효소 방법에 기술한 만능 세정 시약의 용도는 두개의 특정집단의 계면활성제:비이온성 계면활성제 및 음이온성 계면활성제(본 발명의 위탁자에게 허여되고 1995년 5월 16일에 출원되어 공 계류중인 미합중국 특허원 제08/442,491호에 기술됨)를 함유하기 위해서 제형화하는 과산화효소 방법(즉, 적혈구 용해 및 백혈구 고정상)의 제1 반응상("R1상") 중에 사용하는 수성 시약 조성물 또는 희석제의 용도와 결합한다. 표 2는 백혈구 감별계수의 과산화효소("Px") 방법의 상기 이중 계면활성제 함유 R1 시약 조성물(본원에서 Px라고도 칭함) 중의 바람직한 성분 및 이들의 바람직한 각각의 농도 및 범위의 예이다. 당해 기술 분야의 숙련가들은 나열된 각 시약 성분의 농도 및 범위가 세정 조성물에 역으로 영향을 미치지 않고 약 ±5% 내지 10% 이탈하는 것으로 평가할 것이다. 또한, 표2에 나타낸 바와 같은 세정 시약 조성물의 각 성분에 있어서, 리터당 바람직한 양은 괄호에 제공되고 이에 제한되는 것은 아니다.

만능 세정 시약의 용도가 특별하게 예시되는 과산화효소 방법의 실행에 있어서 수성 Px 1 시약 조성물은 분석하는 혈액 샘플과 신속하게 혼합되어 R1 반응 혼합물을 형성한다. 약 5초내에 발생하는 균일한 혼합물 Px 1 시약 용액과 혈액 샘플을 서로 접촉시킨다. Px 1 반응 조성물과 샘플이 균일하지 않고 신속히 혼합되지 않을 경우, 백혈구의 완전한 용해를 예방하는 백혈구의 고정제(즉, 포름알데히드에 의해 가교결합)에 의한 방법의 실행으로부터 수득된 상이한 WBC 계수의 정확성이 크게 손상된다. 즉, 불완전한 혼합은 비용혈성 고정제 및 적혈구의 용해(즉, 이들 가공은 균일하게 실행하지 않는다)를 초래하고 방법은 부정확한 결과를 수득한다. 또한, 백혈구의 비용혈성 고정제에 의해 방법중에 정확한 결과를 수득함을 주시한다.

Px 1 시약 용액과 혈액 샘플을 혼합할 경우 실온(약 20。C 내지 약 28。C)에서 시작하여 자동화 분석기의 임계 열 프로파일(profile)을 유지함을 확인한다. 이후에 반응 혼합물을 적절한 실온에서 자동화 혈액 분석기의 적절한 챔버(들)로의 주입에 의해 약 62。C 내지 약 72。C, 이상적으로는 약 64。C 내지 약 68。C의 온도로 가열한다. 운동학적 측정은 반응 혼합물 온도가 주입후 즉시 실질적으로 약 35。C 내지 42。C로 됨을 나타낸다. 후속적인 반응 온도는 이 지점으로부터 상승한다. 반응 혼합물의 가열은 약 15초내에, 바람직하게는 약 20초내에 발생하고 가열이 신속하게 발생하지 않을 경우 적혈구는 화학적으로 가교 결합되어 이들의 용해를 예방하고 백혈구 감별계수의 정확성을 방해한다.

이후 즉시, 과산화수소 및 적합한 크로모겐(예: 4-클로로-1-나프톨)을 포함하는 염색 혼합물을 반응 혼합물과 혼합한다. 염색 혼합물의 초기 온도는 실온이고, 염색 혼합물과 반응 혼합물을 혼합한 후의 온도는 과산화효소 활성이 있는 친핵구, 단핵세포 및 호산구를 염색하기 위해 약 30초, 바람직하게 약 8 초 내지 약15초 동안 약 62℃ 내지 약 72℃, 바람직하게 약 63℃ 내지 약 69℃로 증가시킨다.

테크니콘(TECHNICON) H●^TM계열의 자동화 혈액 분석기에 있어서, 자동화된 혈액 분석기 반응 챔버 온도를 대략 72℃로 유지시킨다. 전혈 12.0μL 및 Px 1 시약 조성물 250μL를 실온에서 동시에 시스템내로 주입하고, 이를 약 30초 이하 동안 인큐베이션하여, 그 동안 혼합물의 온도를 약 62℃ 내지 약 72℃로 증가시킨다. 인큐베이션 말기에 적혈구를 계면활성제로 공격하고 용해시키고 이들의 모든 헤모글로빈 함량의 실질적인 손실을 초래하고 고정된 환영세포로 전환된다. 또한 백혈구를 고정시킨다. 이후 즉시, 크로모겐 시약(예: 옥시디에탄올 중 8.0g/L의 4-클로로-1-나프톨) 125μL를 3.0g/L 과산화수소를 포함하는 과산화수소 용액 250μL와 동시에 주입하여 R2 반응 혼합물을 형성한다. 두 시약은 초기에는 실온이나 반응 챔버의 온도로 인하여 염색 혼합물의 온도가 약 30초 이내에 약 63℃ 내지 약 69℃로 상승하고, 이 시간동안 친핵구 및 호산구의 과산화효소 염색이 완료된다. 만능 세정 시약 약 0.5 내지 1.0mL를 가하여 모든 채널을 세척한다. 약 0.6초 후에 추가의 세정 용액 0.5 내지 1.0mL를 가하여 추가로 세척한다.

특히, 테크니콘(TECHNICON) H●^TM계열의 자동화 혈액 분석기에서 실행한 과산화효소 방법의 세정 사이클은 본 발명의 발명자에 의해 분석을 위한 혈액학적 방법 중에 다소의 문제를 야기한다고 밝혀진 세정 시약 1용액 및 세정 시약 2용액을 사용하여 이전에 실행했다. 상기 문제에 대한 용액은 본원에서 교시하고 기술한 바와 같이 만능 세정 시약의 발견, 전개 및 적용을 유도한다. 특별하게, 이전에 사용한 세정 시약 1 용액 중의 이온성 계면활성제(SDS)가 망상 적혈구 및 적혈구 분석에 사용하는 시약의 성분인 양이온성 염료(옥사진 750)와 혼화되지 않음이 밝혀졌다. 이 부적합성은 망상 적혈구 채널의 선택한 위치에서 청색 침전의 존재로 설명된다.

추가로 더 중요하게, 본 발명에 의해 세정 시약 2 용액의 성분인 비이온성 계면활성제 Brij^R35가 과산화효소 방법의 R1 상에 필요한 활성 성분임이 발견되었다. 이에 대해서, Brij^R35가 적혈구의 용해를 야기하고 세정 캐리오버 용적이 약 10μL를 초과할경우 샘플내의 호산구를 공격할 수 있다(참고: 본 발명의 위탁자 엠. 말린(M. Malin et al.)에게 혀여되고 본원과 동시에 출원된 미합중국 특허원 제08/442,491호). Brij^R35는 폴리에틸렌 글리콜로 에테르화되는 직쇄 지방족 소수성인 비이온성 계면활성제 군의 일원이다.

세정 캐리오버가 시스템에서 시스템으로 변하는 경우가 발생할 경우 결과적으로 Brij^R35와 같은 계면활성제의 불필요한 침전도 또한 시스템에서 시스템으로 변한다. 세정 캐리오버의 용적이 일정할 때 조차도 상기 용적내의 시스템 대 시스템 변동은 시스템에서 시스템으로의 방법의 실행에 있어서 이탈의 원인이 됨을 이해해야 한다. 자동화 분석기에서 과산화효소 백혈구 백분율 방법의 실행에서 변화가능한 세정 캐리오버의 문제를 피하기 위해서 본 발명의 발명자에 의해 만능 세정 시약 용액에 사용한 계면활성제는 세정 캐리오버로 인해 존재할 경우 방법중에 비활성이어야 하고 방법의 실행에 참여하거나 작동해서는 안됨이 추가로 발견되었다. 본 발명에 따라서 및 하기 기술한 바와 같이 Px 1 시약 조성물에 함유되는 동일한 계면활성제를 함유하지 않는 만능 세정 시약을 발견하고 방법에 사용한다.

세정 캐리오버의 문제의 예시는 다음과 같다: 세정 용액 약 7 내지 10 μL(더욱 특별하게 8.0+/- 0.1μL를 일반적으로 내부샘플 세정 사이클의 완결 후에 반응 챔버 중에 둔다. 세정 용액이 비이온성 계면활성제, Brij^R35를 함유하도록 제형화 될 경우 상기 세정 용액의 적은 용적은 사이토그램 상에서 수용가능한 적혈구 용해 및 세포 분해 생성물을 위해 필요한 과산화효소 방법의 R1 상에 Brij^R35 양을 가하게 한다. 그러나, 세정 캐리오버 초과 용적, 즉 약 10μL 이상은 사이토그램의 열화를 야기한다. 특별하게, 호산구 군집은 사이토그램의 친핵구 군집 내에서 상부로 이동하고 단핵세포 및 림프구 둘은 사이토그램 아래로 이동한다(제1D도). 세정 캐리오버의 용적이 약 13.3μL일때, 과산화효소 방법은 비이온성 계면활성제 Brij^R35의 존재에 의해 완전히 퇴화된다. 상기 특정의 문제는 본원과 동시에 출원된 엠. 말린(M. Malin et al.)의 미합중국 특허원 제08/442,491호에서 상세화한다.

과산화효소 방법의 R1 상 동안 가하는 Px 1 시약 용액의 용적(Brij^R35와 같은 비이온성 계면 활성제를 함유)이 0.25mL이기 때문에 계산된 Brij^R35의 농도는 과산화효소 방법의 첫번째 반응 상 동안 약 8.0 내지 10.0μL인 세정 캐리오버 용적에 상응하는 약 0.093g/L 내지 0.120g/L이다. 비이온성 계면활성제 및 이온성 계면활성제 둘다를 함유하는 Px 1 시약 조성물을 본원에서 기술한 만능 시약(Brij^R35는 제거됨)과 결합하여 사용할 경우, Px R1상에 전달된 Brij^R35의 변동량을 제거하고 세정 캐리오버는 미미(즉, 1% 미만)하고, 또한 결과의 정확도 및 정밀도는 매우 수용가능하다. 비이온성 계면활성제(즉, Brij^R35)는 만능 세정 시약 용액으로 제형화되고 과산화효소 방법에 사용될 경우 본 발명의 발명자에 의해 사이토그램 중의 백혈구 군을 퇴화시키는 제제로 측정되었다.

실시예 2

복수의 연속적 샘플 분석에 사용하고 자동화 혈액 시스템 청결을 유지하기 위한 만능 세정의 효율성 및 실행 가능성은 2일 동안 전혈의 총 1035 흡인을 혼입하는 실험에서 측정한다. 표 3에 나타낸 바와 같이 WBCP(즉, 백혈구 계수), RBC, Hb, MCV, PLT 및 WBCB의 파라미터는 실온에서 약 2일 동안 숙성된 혈액 샘플의 분석 중에 500, 700 및 1035 흡인 후에 수용가능하다. TEHCHNICON H●^TM자동화 분석기(즉, 상기 특별한 예 중의 H●3^TM)의 각각의 채널로부터의 하나 이상의 파라미터를 모니터링한다: RBC/PLT 채널용으로 RBC, PLT 및 MCV; 헤모글로빈(Hb) 채널용으로 Hb; 과산화효소 채널용으로 WBCP(백혈구 계수); 호염기성 채널용으로 WBCB(호염기제 세포 계수).

최종(즉, 1035) 흡인 후에, 시스템을 검사하고 시스템이 침적 증강 부재임을 발견한다. 방법의 실행 동안 주어진 채널의 모든 수로가 만능 세정 시약 용액을 수용함을 확인하기 위해 예방함을 주의한다. 그러나, 상기 채널 침착 증강 또는 찌거기 축적이 발생할 경우 이는 시스템(약 10 사이클) 중에서 세척액, 예를 들면 알칼리성 2(2-에톡시에톡시) 에탄올 함유 계면활성제를 사용하여 제거한 후에 만능 세정 시약(약 10 사이클)을 사용하여 모든 세척액 성분을 제거할 수 있다. 이 실험은 만능 세정 시약이 약 1035 샘플 흡인 이하로 충분한 시스템 청결을 유지하여 방법의 실행을 수용할 수 있게 함을 나타낸다.

동일 수의 샘플 흡인을 포함하는 2009 샘플에서 실행한 유사한 실험은 상당한 양의 찌거기가 자동화 분석기의 수로에 부착되기 때문에 성공적이지 않다. 결과로서, 세척 전에 만능 세정 시약 사용의 적당한 간격은 약 1000 내지 1050 흡인의 순서 상에 있다.

표 3 중에, 용어 "LO", "MID" 및 "HI"는 자동화 시스템을 보정하기 위해 사용하는 합성의 시판 가능한 대조 물질을 의미하고, "sd"는 10개의 복제 혈액 샘플 분석으로부터의 표준편차를 의미한다. 또한 "WBCP"는 과산화효소 방법(과산화효소 채널)으로부터 측정되는 백혈구 계수의 파라미터이고, "RBC"는 적혈구 계수의 파라미터이고, "Hb"는 헤모글로빈 농도의 파라미터이고, "MCV"는 평균 세포 용적의 파라미터이고, "PLT"는 혈소판 계수의 파라미터이고, "WBCB"는 호염기성 채널에서 측정하는 백혈구 계수의 파라미터이다. 상기 약어는 표준이고 당해 기술 분야의 숙련가들에게 공지되었다.

실시예 3

만능 세정을 제조하고 본 발명에 따라서 전혈 샘플 중의 망상 적혈구를 분석하는 방법으로 자동화 혈액 분석기(즉, TECHNCON H●3^TM분석기, 마일스(Miles) H^*3^TM혈액 분석기를 의미하기도 함)에서 실행하는 망상 적혈구 분석에 사용한다. "H^*3^TM망상 적혈구 방법" (C. Brugnara et al. 1994, Am. J. Clin. Path., 102:623-632)은 전혈 세포 중에 망상 적혈구(미성숙 적혈구)의 존재를 검출한다. H^*3^TM방법은 통상적으로 농도 0.0318g/L의 SDS, 농도 6.60g/L의 TRIS 염기, 농도 1.00g/L의 Na₂EDTA 이무수물, 진한 HCl 3.50mL, 농도 6.20g/L의 NaCl를 포함하고 pH가 7.2±0.2인 내부 샘플 세정(세정 1)를 사용하여 실행한다. H^*3^TM망상 적혈구 시약은 망상 적혈구 중의 RNA를 염색하는 염료 옥사진 750(5mg/L)을 함유한다. 성숙한 적혈구는 RNA를 함유하지 않기 때문에 상기 차이는 방법에 있어 특정 분자 표적을 제공하고 방법내에서 망상 적혈구만의 측정을 가능하게 한다.

표준 H^*3^TM망상 적혈구 방법 실행의 성능을 상기한 표준 방법 세정이 본 발명의 만능 세정 조성물로 치환되어 변형된 H^*3^TM망상 적혈구 방법의 성능과 비교한다. 샘플 세트는 정상의 비병원용 샘플 30과 병원용 샘플 29를 포함한다. 표준 H^*3^TM방법은 H^*3^TM시스템(C. Brugnara et al. 1994에 기술됨)에서 실행한다. 변형된방법은 본 발명이 기술한, 세정 1이 만능 세정으로 치환된 H^*3^TM시스템에서 실행한다. 결과는 하기 표 4에 나타내고, "R"는 보정 계수이고 "S_y.x"는 평가의 표준오차이고 "x_bar-y_bar"는 참조 방법에서 시험 방법을 뺀 샘플 세트 바와 같이 망상 적혈구 분석의 결과는 3개의 파라미터 모두가 표준 방법 규격내에 있다. 따라서, H평균차이다.

표 4에 나타낸^*3^TM망상 적혈구 방법은 방법 중에 만능 세정을 포함하는 수용가능한 방법으로 실행한다:

본원에서 인용한 모든 특허 출원, 발행된 특허, 공표된 사항 및 참고문헌은 전적으로 참고로 인용한다.

다양한 변화가 본 발명의 범주 및 정신에서 벗어남이 없는 상기 조성물 및 방법으로 실행할 수 있을때 상기 설명에 포함되고 첨부된 도면 중에 나타나고 첨부된 특허청구의 범위에 규정된 모든 내용은 제한적인 의미가 아닌 예시로서 해석할 것이다.

제1A도 내지 제1F도는 수성 세정 시약 조성물을 사용하는 내부 샘플 세정을 포함하는 샘플 사이클을 포함하는, 백혈구 감별계수 분석에 대한 과산화효소 방법을 사용하여 백혈구 감별계수에 대한 다양한 세정 캐리오버(carryover)의 효과를 시험한 실험 결과를 도시한 사이토그램이다.

제1A도 및 제1B도는 7,9μL인 세정 캐리오버 용적의 결과를 도시한다.

제1C도 및 제1D도는 세정 캐리오버 용적 10.1μL의 결과를 도시한다.

제1E도 및 제1F도는 세정 캐리오버 용적 13.3μL의 결과를 도시한다.

Claims

에틸렌 옥사이드와 1급 하이드록실 그룹으로 말단화된 프로필렌 옥사이드 폴리올과의 블록 공중합체이고 계면활성제 분자내의 에틸렌 옥사이드의 중량%가 약 30 내지 약 60%이며 계면활성제의 분자량은 2000 내지 4000g/mol인 비이온성 비용혈성 계면활성제를 함유하는, 수성 세정 시약 조성물로 혈액 분석기 시스템 하드웨어와 이의 부품을 세정하는 단계를 포함하는, 혈액 샘플 분석에 사용되는 반자동화 및 전자동화 혈액 분석기 시스템과 이의 부품으로부터 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
제1항에 있어서, 세정 시약 조성물이 pH를 약 7.0 내지 약 7.3으로 유지시키기에 효과적인 농도의 완충액 또는 완충액 혼합물을 추가로 포함하는, 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
제2항에 있어서, 완충액이 Na₂HPO₄및 NaH₂PO₄또는 이들의 혼합물을 포함하는, 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
제1항에 있어서, 계면활성제의 일반식이 HO-(CH₂CH₂-O)_x-(CH₂CH(CH₃)O)_y-(CH₂CH₂-O)_x-H이되 여기서 x는 7 내지 21이고 y는 14 내지 48인, 혈액 샘플과 시약혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서, 계면활성제가 플루로닉 P105인, 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
제1항에 있어서, 수성 세정 시약 조성물이 알칼리 금속 클로라이드 염을 추가로 포함하는, 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
제6항에 있어서, 알칼리 금속 클로라이드염이 NaCl, KCl 또는 LiCl인, 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
제7항에 있어서, 알칼리 금속 클로라이드염이 NaCl인, 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
제8항에 있어서, 수성 세정 시약 조성물이 항균 화합물을 추가로 포함하는, 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
제9항에 있어서, 항균 화합물이 프로클린 150, 프로클린 300, 거말 115, 다우아실 200 및 브로노폴로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
제1항에 있어서, 수성 세정 시약 조성물이 항산화 화합물을 추가로 포함하는, 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
제11항에 있어서, 항산화제가 3,3'-티오디프로피온산, 3,3'-디티오아세트산, 트롤록스^TM또는 수용성 비타민 E, 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀, 2-tert-부틸- 4-메톡시페놀 및 ρ-메톡시페놀로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
제1항에 있어서, 수성 세정 시약 조성물이, 이의 삼투 몰 농도가 약 285 m Osmol/kg 내지 305 m Osmol/kg인, 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.
a) (i)샘플 중의 적혈구를 용혈시켜 헤모글로빈은 방출시키지만 백혈구 개체들은 용혈시키지 않기에 효과적인 농도의 비이온성 폴리에톡실레이트 계면활성제, (ii)샘플 중의 적혈구는 용혈시키지만 백혈구는 용혈시키지 않기에 효과적인 농도의 음이온성 또는 양쪽성이온성인 이온성 계면활성제, (iii)샘플 중의 백혈구들은 화학적으로 가교결합시키지만 용혈된 적혈구들은 가교결합시키지 않기에 효과적인 농도의 포름알데히드 또는 파라포름알데히드, (iv)샘플 중의 임파구의 검출능을 향상시키기에 효과적인 농도의 당 또는 당 알콜 및 (v)반응 혼합물의 pH를 약 6.9 내지 7.6의 거의 중성으로 유지시키는 완충액 또는 완충액 혼합물을 포함하는 수성 시약 조성물과 혈액 샘플을 혼합시켜 시약 혼합물을 형성시키는 단계;

b) 상기 단계(a)의 반응 혼합물을 약 60℃ 내지 약 75℃로 가열하여 샘플 중의 적혈구를 용혈시키고 백혈구를 고정시키는 단계;

c) 반응 혼합물 중의 백혈구의 적어도 일부를 염색하여 현탁액 중의 염색된 백혈구의 개체수와 염색되지 않은 백혈구의 개체수를 구하는 단계로, 이때, 수성 시약 혼합물에 비이온성 계면활성제와 이온성 계면활성제가 존재함으로 인해 신선한 혈액 샘플과 채혈 후에 하루 이상 실온에서 저장되었던 오래된 혈액 샘플에 대하여 단계(c)에 따른 정확하고 신뢰할 만한 백혈구 감별계수 결과를 제공하는 단계;

d) 상기 단계(c)의 염색된 백혈구와 염색되지 않은 백혈구의 현탁액을 전기 광학 검출 시스템으로 통과시켜 현탁액 중의 백혈구 감별계수(differential white blood cell count)를 구하는 단계; 및

e) (i) 전혈 샘플을 분석한 후, 에틸렌 옥사이드와 1급 하이드록실 그룹으로 말단화된 프로필렌 옥사이드 폴리올과의 블록 공중합체인 비용혈성 비이온성 계면활성제로서 이때 계면활성제 중의 에틸렌 옥사이드의 중량%는 약 30 내지 약 60%이고 계면활성제는 일반식이 HO-(CH₂CH₂-O)_x-(CH₂CH(CH₃)O)_y- (CH₂CH₂-O)_x-H (x는 약 7 내지 21이고, y는 약 14 내지 48임)이며 계면활성제의 분자량은 약 2000 내지 약4000g/mol인 비용혈성 비이온성 계면활성제와 (ii)세정 시약 조성물의 생리적 pH를 유지시키는 완충액 또는 완충액 혼합물을 혼합하여 포함하는, 수성 세정 시약 조성물로 자동화 분석기 시스템을 세척하여, 시스템 하드웨어와 이의 부품에 축적된 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하는 단계를 포함하는,

과산화효소 염색 및 자동화 혈액 분석기 시스템을 사용하여 적혈구와 백혈구를 함유하는 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단(subpopulation)을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 단계(a)의 시약 조성물 중의 비이온성 계면활성제가 폴리에틸렌 글리콜에 대해 에테르화되는 직쇄의 지방족 소수성 계면활성제인, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제15항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 브리예(Brij)^R35인, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 단계(a)의 시약 조성물 중의 음이온성 계면활성제가 탄소수 10 내지 16의 알킬 설페이트의 알칼리 금속염을 포함하는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제17항에 있어서, 음이온성 계면활성제가 알칼리 금속 도데실설페이트를 포함하는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제18항에 있어서, 음이온성 계면활성제가 나트륨 도데실 설페이트인, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 음이온성 계면활성제가 단계(a)의 시약 조성물에 약 0.09 내지 약 0.12g/L의 양으로 존재하는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 음이온성 또는 양쪽성이온성 계면활성제가 단계(a)의 시약 조성물에 약 0.050 내지 약 0.125g/L의 양으로 존재하는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 포름알데히드가 단계(a)의 시약 조성물에 약 52 내지 약 58g/L의 양으로 존재하는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 단계(a)의 시약 조성물이 NaCl, KCl 및 LiCl로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 알칼리 금속 클로라이드염을 추가로 포함하는, 전혈 샘플의백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제23항에 있어서, 염이 NaCl이고 시약에 약 6.8mM 내지 약 10.3mM의 양으로 존재하는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 완충액 또는 완충액 혼합물이 단계(a)의 시약 용액의 pH를 약 7.0 내지 약 7.5로 유지시키는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제25항에 있어서, 단계(a)의 시약 중의 완충액이 Na₂HPO₄, NaH₂PO₄또는 이들의 혼합물을 포함하는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 단계(a)의 시약 조성물이 EDTA, EGTA 및 이나트륨, 삼나트륨 또는 사나트륨 EDTA 또는 EGTA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 다가 금속 이온의 킬레이트제를 추가로 포함하는, 전혈 샘플의 백혈구 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제27항에 있어서, 금속 이온 킬레이트제가 시약 조성물에 약 1mM 내지 약 5mM의 농도로 존재하는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 염색단계

가 반응 혼합물을 과산화수소 및 크로모겐과 혼합하여 과산화효소-활성 백혈구를 과산화효소염색 하는 것을 포함하는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제29항에 있어서, 크로모겐이 4-클로로-1-나프톨인, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 단계(a)의 시약 조성물이 당 알콜로서 시약 조성물에 약 110.0g/L 내지 약 120.0g/L의 농도로 존재하는 소르비탈을 추가로 포함하는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 세정단계(e)에서의 계면활성제가 플루로닉 P105인 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 단계(e)의 세정 시약 조성물이 알칼리 금속 클로라이드염을 추가로 포함하는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제33항에 있어서, 단계(e)의 세정 시약 조성물 중의 알칼리 금속 클로라이드염이 NaCl, KCl 또는 LiCl인, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제34항에 있어서, 알칼리 금속 클로라이드염이 NaCl인, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 단계(e)의 세정 시약 조성물이 프로클린 150, 프로클린 300, 거말 115, 다우아실 200 및 브로노폴로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항균 화합물을 추가로 포함하는 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 단계(e)의 세정 시약 조성물이 3,3'-티오디프로피온산, 3,3'-디티오아세트산, 트롤록스^TM또는 수용성 비타민 E, BHT 또는 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀, BHA 또는 2-tert-부틸-4-메톡시페놀 및 MEHQ 또는 ρ-메톡시페놀로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항산화 화합물을 추가로 포함하는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제14항에 있어서, 단계(e)의 세정 시약 조성물이, 이의 삼투몰 농도가 약 285 m Osmol/kg 내지 305 m Osmol/kg이고, 완충액이 pH를 약 7.0 내지 약 7.6으로유지시키는, 전혈 샘플의 백혈구 감별계수와 아집단을 측정하는 방법.
제1항에 있어서, 세정 시약 조성물이 pH를 6.9 내지 7.6으로 유지시키기에 효과적인 농도의 완충액 또는 완충액 혼합물을 추가로 포함하는, 혈액 샘플과 시약 혼합물을 제거하거나 그 축적을 방지하는 방법.