KR100426835B1

KR100426835B1 - 항균제 자체의 항균성 및 항균제로 가공 처리된항균제품의 항균력 시험방법

Info

Publication number: KR100426835B1
Application number: KR10-2001-0003674A
Authority: KR
Inventors: 전동원; 최정임; 안선영; 홍주석
Original assignee: 한국생산기술연구원
Priority date: 2001-01-26
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2004-04-13
Also published as: KR20010025736A

Abstract

본 발명은 항균가공에 사용되는 항균제 자체의 항균성 및 항균제로 가공 처리된 항균제품의 항균력을 객관적이고 신뢰감 있게 평가할 수 있는 새로운 시험방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 용출형 및 비용출형 항균제의 접촉 배양시간을 시험자가 임의로 조절 가능하며 항균력을 배양된 콜로니수로 계산하여 육안측정이 가능한 한천 플레이트 도말방법(Agar Plate Smear Method) 및 항균가공제품, plastic, 의료용구 등의 항균력 측정에 광범위하게 적용될 수 있을 뿐만 아니라 가공처리된 항균제품의 항균력을 실제 사용조건과 유사한 조건에서 측정이 가능하고 용출형, 비용출형 항균제의 적용에 관계없이 일괄적으로 적용가능한 한천 플레이트 접촉방법(Agar Plate Contact Method)에 관한 것이다.

Description

항균제 자체의 항균성 및 항균제로 가공 처리된 항균제품의 항균력 시험방법{Assay methods for antimicrobial activity of antimicrobial agents or materials treated with antimicrobial agent}

본 발명은 항균가공에 사용되는 항균제 자체의 항균성 및 항균제로 가공 처리된 항균제품의 항균력을 객관적이고 신뢰감있게 평가할 수 있는 새로운 시험방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 용출형 및 비용출형 항균제의 접촉 배양시간을 시험자가 임의로 조절 가능하며 항균력을 배양된 콜로니수로 계산하여 육안측정이 가능한 한천 플레이트 도말방법(Agar Plate Smear Method) 및 용출형 및 비용출형 항균제로 가공처리된 제품에서 접종균액과의 접촉 배양시간을 시험자가 임의로 조절가능하며 가공 처리된 항균제품의 항균력을 실제 착의조건과 유사한 조건에서 측정이 가능한 한천 플레이트 접촉방법(Agar Plate Contact Method)에 관한 것이다.

최근에 이르러 항균가공제품은 공산품 전반에 걸쳐서 적용되고 있으며 항균가공산업의 규모도 급격히 팽창되고 있다. 항균가공의 대상도 확대되어 가공의 초기단계에서는 의료용품이 주류를 이루어 왔으나 근년에는 섬유제품, plastic 제품을 비롯하여 가전제품, 문구류, 가구류, 철강재 제품까지 그 가공영역이 확대되고 있는 실정이다. 그러나, 항균가공산업에서 대두되고 있는 문제점이 대략 2가지 형태로 요약되어 지적되고 있다.

첫번째는 항균제 자체의 항균력에 대한 신뢰성이다. 1990년대 초까지는 합성유기항균제 또는 Ag 이온을 중심으로 하는 무기항균제가 주로 사용되어 왔으나 1995년경 부터는 인체친화성의 강조, 친환경적 가공방법, 인체위해성의 최소화 등이 강조되면서 좀더 다양한 부류의 항균제들이 사용되게 되었다.

고전적으로 사용되어온 합성유기항균제들과 Ag 이온을 중심으로 하는 무기항균제들은 비교적 높은 항균력을 유지하고 있음이 밝혀져 있는바 항균제 자체의 항균력에 대한 큰 논란은 없으며 현재에도 빈번히 사용되고 있다.

그러나, 최근에 사용빈도가 증가되고 있는 천연항균제들은 항균제 자체의 항균성이 시험자마다 일치되지 않는 경우가 발견되고 있을 뿐만 아니라 박테리아에 대한 최소발육저지농도(MIC) 조차 정확히 결정되지 않고 있는 상태이다.

몇종류의 천연항균제들에서 MIC가 일정하게 결정되지 않고 있는 이유는 항균제 특성에 따른 고유한 항균력 측정방법이 뒷받침되지 못하고 있기 때문이다. 항균제 자체의 항균력이 의심된다면 이러한 항균제로 항균가공이 이루어진 제품의 항균력도 역시 신뢰성이 부여될 수 없음은 당연하다. 항균제 자체의 항균력 테스트에서는 각각의 항균제의 고유한 특성이 고려되어 항균력이 최대로 발현될 수 있는 항균제의 항균력 시험방법의 적용이 가장 바람직하다.

상기와 같은 바람직한 항균력 시험방법이 적용되기 위해서는 각각의 항균제마다 별도의 고유한 시험방법이 적용되어야만 하므로 불편할 수밖에 없다. 그 구체적인 예로서 액체에 불용성인 항균제와 가용성인 항균제는 동일한 시험방법이 적용될 수 없다. 액체에 가용성인 항균제에 적용되는 항균력 측정방법이 액체에 불용성인 항균제의 항균력 측정에 적용된다면 항균력은 당연히 낮아질 수밖에 없으며 그 결과 정확한 항균력의 측정은 불가능하다.

상기와 같은 불합리성을 개선하기 위해서는 항균제의 종류에 구애받지 않고 일괄적으로 적용될 수 있는 포괄적인 항균제 시험방법이 고안된다면 불합리성이 해소될 수 있을 것으로 판단된다. 본 발명에서는 항균제의 종류에 관계없이 항균제 자체의 항균력이 객관적이고 신뢰성있게 측정될 수 있는 Agar Plate Smear Method의 개발을 그 목적으로 하고 있다.

두번째는 항균제로 가공처리된 항균제품의 항균력을 정확히 평가할 수 있는 시험법이 아직까지 확립되지 않고 있다는 점이다.

상기에서 서술하였듯이 고유한 항균제 자체의 항균력을 정확히 평가할 수 있는 시험법이 아직 개발되지 않은 상태에서 특정한 항균제로 가공처리된 항균제품의 항균력을 시험하였을 때 항균력에 대하여 신뢰성이 부여될 수 없음은 자명하며 한걸음 더 나아가 항균가공에 사용되는 항균제 자체의 항균력이 명확히 밝혀져 있다 할지라도 항균제 자체의 항균력과 항균제로 가공처리된 항균제품의 항균력은 서로 일치될 수 없음도 당연하다.

상기와 같은 이유로 인하여 항균제 자체의 정확한 항균력 측정시험법의 개발과는 별도로 항균제로 가공처리된 항균가공제품의 고유한 항균력을 정확히 측정할 수 있는 별도의 항균시험법이 요구되고 있다.

일반적으로 항균가공제품에 대한 항균가공방법은 2가지로 분류될 수 있으며 구체적으로는 전처리법과 후처리법이다. 전처리 가공법은 피가공 대상물의 내부에 항균제를 혼입시키는 방법이며 후처리가공법은 피가공 대상물의 외부에 항균제를 도포하는 방법이다.

전처리가공법의 가장 대표적인 유형은 폴리에스테르 섬유를 중심으로 하는 합성섬유의 용융방사시 용융방사액에 열안정성이 뛰어난 무기항균제를 혼입하여 방사함으로써 수득되는 섬유 내부에 무기항균제가 존재토록 하는 방법이다. 또는 plastic 성형물에서 성형전 용융액에 항균제를 첨가하여 성형하는 방법이다. 후처리가공법의 가장 대표적인 적용은 섬유제품의 가공에서 이루어지고 있는데 항균제를 용매에 용해시켜서 직물표면에 도포시킨 다음 건조시켜서 항균제가 직물표면에 부착토록 하는 기본원리이다.

상기의 전처리가공법과 후처리가공법을 서로 비교할 때 항균제의 항균작용이 차이를 보일 수밖에 없기 때문에 항균가공제품의 시험방법도 차별화되어야 함은 필수불가결한 것으로 사료된다.

전처리가공에 의한 항균제품은 항균제가 피가공대상물의 내부에 깊숙히 고착되어 있기 때문에 외부로 용출되어 나올 가능성이 매우 낮다. 피항균가공 대상물이 섬유류나 plastic이 대부분이므로 용융과정에서의 고온을 고려할 때 열안정성이 낮은 유기항균제는 사용되기 어려울 뿐만 아니라 항균제의 용출이 거의 이루어지지 않으므로 비용출형 항균가공제품에서 적절한 항균력 시험방법의 적용이 적합한 것으로 판단된다.

후가공처리에 의한 항균가공제품은 항균제가 피가공 대상물의 표면에 도포되어 있는 경우가 대부분일 뿐만 아니라 항균제의 용출가능성이 크기 때문에 용출형 항균가공에서 적절한 항균력 시험방법의 적용이 바람직하다.

후처리가공에 의한 항균가공제품에서는 표면에 도포된 항균제가 용출되어 나오지 않는 경우라 할지라도 전처리가공 항균제품과 달리 항균제와 박테리아가 직접 접촉될 수 있기 때문에 항균시험방법이 차별화되어야 마땅하다.

그러나, 현시점에서 용출형 항균제품의 시험법과 비용출형 항균제품의 시험방법은 서로 혼동되어 적용되고 있을 뿐만 아니라 용출형과 비용출형에 대하여 동시에 적용될 수 있는 통일된 시험법도 개발되지 않고 있는 상황이다. 용출형 항균제와 비용출형 항균제에 대한 시험법 적용의 혼동은 항균가공 섬유제품의 항균력 시험에서 단적으로 나타나고 있음을 볼 수 있다.

항균가공된 섬유제품의 항균력 시험에서는 아래에 제시되는 바와 같은 시험방법들이 현재 사용되고 있다.

·비용출형 항균제로 처리된 경우 적용되도록 정의된 시험법

Shake Flask Method

·용출형 항균제로 처리된 경우 적용되도록 정의된 시험법

AATCC Test Method 100, (KS K 0693과 유사),

균수측정법

그러나, 현재 전처리가공방법으로 처리된 항균섬유와 후처리 가공방법으로 처리된 항균섬유에서 상기에 제시된 5가지 시험법은 특정한 구분없이 적용되고 있어 정확한 항균력 시험은 불가능한 상태이다.

또한, 상기에 제시되고 있는 5가지 시험법들은 단지 항균가공 섬유에 국한되어 적용시켰을 때에도 시험방법 자체의 불합리성으로 인하여 항균력에 대한 신뢰감이 부여될 수 없는 것으로 이미 인정되고 있을 뿐만 아니라 동일한 박테리아에 대한 MIC값도 시험방법에 따라서 서로 변화되고 있는 모순도 발견되고 있다.

상기의 5가지 항균시험법은 단지 항균가공 섬유제품의 항균력시험에 국한되고 있다는 사실도 결정적인 단점으로 지적되지 않을 수 없다.

아래의 표 1∼표 5 에 걸쳐서 Shake Flask Method, AATCC Test Method 100, 개량 Shake Flask Method, 개량 AATCC Test Method 100 의 장단점을 체계적으로 정리하여 제시하였다.

Shake Flask Method 의 장단점

	장 점	단 점
shakeflaskmethod	①섬유의 항균성 측정시험시간(접종균액과 시험포 의 진탕시간)이 1시간이기 때문에 단시간 내에 실험을 할 수 있다.②진탕배양해도 균의 증식이 없어 시험 후 희석할 필요가 없기 때문에 시험방법이 매우 간단하다.	① 접종균액에 포함된 균이 life cycle상 대수증식기에 해당되는 균인지에 대한 확신이 불분명하다.②접종균액에 포함된 균수를 1.5∼3×10⁸개/㎖로 정의하고 있으 나 위와 같이 규정할 때 정확할 수 없다. 실험자의 실험 조 정방법에 의하여 초기균수가 다분히 달라질 수 있어 초기균수 에 따라 항균력의 차이가 심각해질 수 있다.③섬유와 접종균액이 접촉되어 있는 진탕실험 상태에서 접종균 액 내에 영양이 전혀 없기 때문에 착의조건과 너무 동떨어져 있으며 영양의 절대부족으로 균의 생육이 불가능하다.④섬유와 접종균액의 접종배양 시간이 1시간이어서 부적당하다. 1시간의 접촉배양 시간에서는 균이 새로운 환경에 적응할 수 있는 유도기를 전혀 고려하지 않았을 뿐만 아니라 실제 의복 착용 시간과 비교해도 크게 동떨어져 있다.⑤시험포와 접종균액의 접종배양온도가 25±5℃는 부적합하다. 체온이 37℃라는 점을 고려할 때 25±5℃는 실제 착용환경과 도 일치하고 있지 않을 뿐만 아니라 25±5℃의 저온은 피부상 재균의 증식에 적합한 온도라고 볼 수 없다.⑥시험포가 접종균액 내에 완전히 침지된 상태에서 접종배양이 이루어지므로 물속에서 항균가공직물의 항균성을 테스트하는 형태인데 의복착용조건과는 거리가 너무 멀다.⑦감균율이 26% 이상이면 항균효과가 있다고 판정하지만 항균 효과가 유효하려면 감균율이 26% 보다 훨씬 높아야 한다고 판단한다.

AATCC Test Method 100 의 장단점

	장 점	단 점
AATCCTestMethod100	①미생물이 성장할 수 있는 조건을 부여하고 있다 (배 양온도, 배양시 간, 영양의 첨가) →의복착용시 보 다 산소는 부족함②겨드랑이 등 땀이많이 나는 부위에 서 피부상재균수 가 대략 1×10⁸개 /㎖정도 라는 것 을 감안할 때 항 균성의 테스트가 인체의 특정 부위 와 유사한 상태에 서 이루어 지고 있다는 점	①접종균액 내에 포함되어 있는 영양이 외부로부터 전이되는 영양분 또는 피부로부터 의복에 부착되는 영양분의 양과 비교할 때, 실제의복착용 환경과 동떨어져 있다.②접종균액에 포함되어 있는 균이 life cycle상 대수증식기에 해당하 는 균인지에 대한 확신이 불분명하다.③접종균액에 포함된 균수를 1∼2×10⁵개/㎖로 규정하고 있는데 이 '개'는 잘못된 표기방법으로서 정확한 수치를 알 수 없다.④접종균액에 포함된 균수가 1∼2×10⁵개/㎖로 규정하고 있으나 균 수의 정확한 계측이 불가능하며 실험자에 따라 초기균수가 달라질 수 있어 항균력의 차이가 발생할 가능성이 크다.⑤섬유와 접종균액의 배양시 욕비를 1:1로 규정하고 있으나 대부분의 경우 섬유의 양보다 접종균액의 양이 많아서 섬유가 완전히 적셔 진 후에도 균액은 남는다.⑥시험에 사용한 30ml용 시험관은 접종시 피펫끝이 닿지 않아 시험 포와 1:1로 완벽하게 접종되지 않고 액이 시험포 밖에 또는 균액이 한쪽에 치우쳐 질 수 있다.⑦접종균액 배지를 조성한 후 접종시점까지 시간이 경과하게 되므로 균의 별도 증식이 문제된다.⑧섬유와 접종균액의 접종배양을 밀폐된 용기 내에서 이루어지는데 밀폐로 인한 산소의 차단은 호기성 세균일 경우 스트레스를 준다. 또한 산소의 차단은 실제의 의복착용 환경과 큰 차이가 있다.⑨생리식염수로 시험포에 흡착되어 있는 배양세균을 완전히 추출해 낼 수 없다.⑩습열멸균으로 인해서 시험포와 균액이 들어있는 바이알 속에 물방 울 생김 현상이 우려된다.⑪용출형일 때는 유리하지만 비용출형일 때는 원칙적으로 항균테스 트 결과를 신뢰할 수 없다.⑫시험포의 발수성 여부에 따라서 접종균액과 시험포의 접촉상태가크게 달라지기 때문에 시험포를 구성하는 섬유의 종류에 따라서 항균력의 차이가 커질 수 있다.

개량 Shake Flask Method 의 장단점

	장 점	단 점
개량shakeflaskmethod	①shake flask method에 비해서 접종균 액 내에 영양원이 충분하기 때문에 균 의 생육조건에 적합하다.②물속에서 시험하기 때문에 AATCCTest Method 100으로 야기되는 접종균액과 시험포가 골고루 접촉될 수 없다 는 문제점이 해결된다.	shake flask method에서 제기되었던 단점 중 제③항, 제④항이 일부 해결된 것을 제외하면 shake flask method에서 제기했던 단점들이 그대로 잔류하고 있다.

개량 AATCC Test Method 100 의 장단점

	장 점	단 점
개량AATCCTestMethod100	AATCC Test Method 100 에서 제시한 접종균액의 영양이 의복에 부착되는 양과 비슷하게 조정되 었다.	상기 AATCC 100에서 제기되었던 단점 중제①항이 일부 해결된 것을 제외하면 AATCC Test Me-thod 100에서 제기했던 단점들이 그대로 잔류하고 있다.

균수측정법의 장단점

	장점	단점
bacterianumbermeasure-mentMethod	①용출형 타입의 시 료에 적합하다.②무가공시료(control) 의 오염유·무를 접 종 직후 평가하여 확인한다.	①실제의 착의조건과 비교할 때 산소가 부족하다.②비용출타입의 시료는 발수성으로 인하여 부적합했다.③완충생리식염수로는 시험포에 흡착하고 있는 생균을 씻 어내기가 어려웠다.④시험포와 접종균액과의 비율 1:1은 부적합했다.⑤접종균액의 조정 후 접종할 때까지 균의 증식이 염려되 었다.⑥습열멸균시 cap tube 속에 물방울이 생겨 접종에 영향 을 주었다.

상기의 표 1∼표 5에 거쳐서 제시되고 있는 바와 같이 항균시험방법상의 근본적 문제점이 대략 다음과 같이 요약, 정리될 수 있다.

1. 항균력 발현의 대상이 되는 미생물이 life cycle상 대수증식기에 해당하는 미생물인지에 대한 불확실성

2. 접종균액 내에 포함된 균수를 정확히 조절할 수 없으며 그 결과 초기균수에 따라서 항균력이 변화될 수 있는 가능성

3. 섬유와 접종균액이 접촉되어 있는 진탕실험 상태에서 영양원이 전혀 없거나 반대로 너무 과다하다는 불합리성

4. 균의 증식에 적합한 접촉배양 온도가 보장되지 못하고 있다는 점

5. 섬유에 균액을 접종하여 배양시 욕비가 적합치 않거나 (AATCC Test Method 100의 경우 1 : 1로서 섬유의 양보다 접종균액의 양이 과다히 크다) 의복착용조건과 전혀 동떨어진 상황 (Shake Flask Method의 경우 수용액에서 항균시험이 행해지고 있다는 점) 하에서 항균시험이 행해지고 있어 신뢰성이 부여되기 어렵다는 점

6. 섬유와 접종균액의 접촉배양이 이루어지고 있는 시스템에서 산소가 차단된 경우는 호기성세균의 경우 스트레스를 받을 수 있다는 점

7. 항균가공처리된 섬유의 고유한 발수성의 정도에 따라서 접종균액과의 접촉상태가 변화될 수 있으므로 항균력이 이에따라 광범위하게 변화될 수 있다는 불합리성

8. 항균제 자체에 대한 항균력시험이 별도로 이루어지지 않았기 때문에 항균가공이 이루어진 섬유에 대한 항균성이 객관적으로 인정될 수 없다는 불합리성

9. 상기의 5가지 항균성 시험방법들은 항균가공 섬유제품에 국한되어 적용될 수밖에 없다는 한계성

본 발명에서는 상기에 제시되고 있는 바와 같은 항균성 시험방법의 단점을 보완하여 용출형 및 비용출형 항균제의 접촉 배양시간을 시험자가 임의로 조절 가능하며 항균력을 배양된 콜로니수로 계산하여 육안측정이 가능한 한천 플레이트 도말방법(Agar Plate Smear Method)과 항균가공제품, plastic, 의료용구 등의 항균력 측정에 광범위하게 적용될 수 있을 뿐만 아니라 가공처리된 항균제품의 항균력을 실제 사용조건과 유사한 조건에서 측정이 가능하고 용출형, 비용출형 항균제의 적용에 관계없이 일괄적으로 적용가능한 한천 플레이트 접촉방법(Agar Plate Contact Method)을 발명하였다.

도 1은 Agar Plate Contact Method에 의한 항생용 여지를 이용한 정치 표본을 나타낸 것이다.

도 2는 Agar Plate Contact Method에 의한 직물을 이용한 정치표본을 나타낸 것이다.

도 3은 MRSA의 성장 곡선을 나타낸 것이다.

Agar Plate Smear Method와 Agar Plate Contact Method를 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.

Agar Plate Smear Method

기존의 시험법들은 모두 항균제를 처리한 섬유제품에 대한 항균성시험방법으로서 항균제 자체의 경향을 알아보기 위한 실험을 하기엔 부적합하기 때문에 항균제의 항균력을 측정할 때 대부분 항생제의 MIC 측정방법인 Optical Density Method(OD Method)를 이용했다.

그러나, OD Method는 항균제가 접종균액 속에 용해되어 작용하기 때문에 직물표면에 부착된 항균제가 항균력을 발휘할 수 있는 환경과는 다르다. 또 colony 측정이 아니고 탁도의 변화로 평가하는 비색법이기 때문에 정확한 생균 측정이 어렵다.

Agar Plate Smear Method의 경우 OD Method와는 반대로 생균 측정이 정확하고 용이하며 한천배지 위에서 영양을 공급받게 되므로 피부와 접촉되는 항균제의 환경과 매우 유사하다. 현재 항균가공약제의 사용범위가 넓어짐에 따라 가공약제의 적절한 선택이 무엇보다 중요하게 대두되는 현시점에서 가공약제 자체의 특성을 우선 파악해야 할 것이다. 그러기 위해선 미생물에의 직접적인 반응성 여부를 먼저 관찰하여야 할 것이라는 본 발명자들의 견해에 따라 간편하면서도 정확하게 파악할 수 있는 한천평판배지 도말법을 개발하였다.

이 방법은 용출 type 및 비용출 type 항균약제에 무관하게 모두 적용가능하고 또 실험의 편의상 원하는 항균약제의 양과 균액양 뿐만 아니라 접촉배양시간을 임의로 조절할 수 있다. 따라서 조절한 항균용액과 조정한 시험균액을 도말(smearing)한 후 37℃ incubator에서 배양하는 것으로 시간에 따른 변화상황 즉, 세균억제·세균감소·살균유무 등을 쉽고 정확하게 파악할 수 있는 구체적인 방법이라 할 수 있다.

1. 시험균

MRSA ATCC 33592

2. 시험균의 배양과 시험균 현탁액의 조정

1의 보존균주를 표준한천사면배지에 이식한 후 35∼37℃에서 24∼30시간동안 정치배양 하거나 또는 육즙배지에 이식한 후 35∼37℃에서 세균의 대수기에 해당하는 시간(MRSA의 경우 18∼22시간이 적당)동안 진탕배양한다. 이 배양균 1 loop를 채취하여 보통 육즙배지에 2대 계대 배양하고 마찬가지로 35∼37℃에서 세균의 대수기에 해당하는 시간동안 진탕배양한 후 0.85% 멸균 완충생리식염수를 사용하여 10배 희석계열을 만들고 최종단계의 균수를 1∼2 × 10⁴CFU/㎖로 조정했다. 이때의 생균수인 초기균을 확인하기 위하여 한천평판 3매를 작성하고 배양하여 평균했다.

3. 배양시험

온도 20℃, 습도 65%에서 3일 보관한 표준한천평판배지 위에 실험하고자 하는 농도의 항균용액 0.2㎖를 도말하고 여기에 더하여 2에서 조정한 현탁균액 0.2㎖를 도말한 것과, 별도로 2에서 조정한 현탁균액만을 0.2㎖를 접종하여 도말한 후 35∼37℃의 항온기에서 24∼72시간 동안 정치 배양한다.

이때 항균용액을 도말한 후 현탁균액을 주입하여 도말한 것 3매와 control로 현탁균액 만을 도말한 것 3매씩을 작성한다.

4. 생균수의 측정

생육한 colony수를 각각 계측하여 생균수를 산출한다. 이때 항균활성의 본질이 살균작용인지 또는 세균생육억제작용인지는 시간에 따른 콜로니의 생성여부로부터 판별 가능하다.

5. 시험결과의 평가

한천평판배지의 콜로니 수를 계측하여 다음의 식으로 균 감소율을 계산했다.

균감소율 = (A-B)/A × 100

A : 항균용액은 넣지 않고 현탁균액 만 넣어 도말한 후 배양한 균(3검체)

B : 항균용액과 접종균액을 함께 접종한 후 도말하여 배양한 균수 (3검체)

Agar Plate Contact Method

기존의 시험방법들이 액체 속에서 접촉배양이 이루어지거나 또는 용기의 부적합에서 기인하는 산소공급의 유무 등으로 인하여 미생물의 생육조건에 제약이 많았다. 이 시험법은 접종균의 영양원이 육즙배지가 아니라 고체로서 온도, 습도, 영양의 측면에서 볼 때 피부와 유사하게 고안된 한천배지 위에서 영양을 공급받기 때문에 의복착용 환경과 유사하다. 또 접종전과 접종배양 후의 생균수를 파악할 때 발생하는 문제점을 개선하고 육안으로 콜로니 수의 변화를 간단하게 측정하고 판정할 수 있다.

1. 시험균

MRSA ATCC 33592

2. 시험균의 배양과 시험균 현탁액의 조정

1의 보존균주를 표준한천사면배지에 이식한 후 35∼37℃에서 균의 종류에 따라 18∼24시간 정치배양 하거나 또는 육즙배지에 이식한 후 35∼37℃에서 세균의 대수증식기에 해당하는 시간(MRSA는 18∼22시간이 적당)동안 진탕배양한다. 이 배양균 1 loop를 채취하여 보통 육즙배지에 2대 계대 배양하고 마찬가지로 35∼37℃에서 세균의 대수기에 해당하는 시간동안 진탕배양한 후 0.85% 멸균완충생리식염수를 사용하여 10배 희석계열을 만들고 최종단계의 균수를 4∼6×10³CFU/㎖로 조정했다. 이때의 생균수인 초기균을 확인하기 위하여 한천평판 3매를 작성하여 평균했다.

3. 시료의 조정

농도를 서로 다르게 조절한 항균제가 용해된 항균용액을 사용하여 지름 11㎜의 cellulose 항생여지를 wet pick-up 100%가 되도록 고정하고 마이크로 피펫으로 coating하거나 또는 지름 26㎜인 면 표준포를 여러 가지 농도의 항균제가 용해된 항균용액으로 wet pick-up 100%가 되도록 고정하고 항균제가 용해된 항균용액을 도포시킨 후 자연건조시킨다.

고압증기멸균시 발생할 수 있는 항균제 성분의 변성을 방지하기 위하여 clean bench의 자외선등으로 10분∼1시간 멸균시키거나 또는 170∼180℃에서 5분간 고온 건열멸균시켰다. 항균제로 항균가공된 시험편 0.2g(항생여지 6개, 또는 지름 26mm의 면 표준포 3개)을 채취하여 1검체로 했다.

동일시료에 대하여 대조포 6검체, 가공포 4검체를 준비했다. 가공포는 항균가공약제와 포의 특성상 열에 민감한 것은 100℃이하의 간헐멸균 또는 자외선 살균하고 습윤열에 강한 대조포는 호일에 잘 싸서 autoclave 속에서 121℃, 15분간 습열 멸균했다.

4. 배양시험

Agar Plate Smear Method 에서 사용되었던 한천평판배지 위에 3에서 조정한 시료를 잘 포개고 떨어지지 않도록 핀셋으로 눌러주었다. 시료 위에 4.7.2에서 조정한 현탁균액을 0.16ml(욕비 1 : 0.8) 또는 현탁균액 0.12ml(욕비 1 : 0.6)로 균일하게 접종하여 37℃에서 24∼30시간 정치 배양했다(항생용 여지를 이용할 경우 또는 직물을 이용할 경우의 정치 표본을 도 1과 도 2에 표본으로 제시했다).

5. 시험의 준비

배양 후의 시료는 미리 준비한 1/20 육즙배지 16ml(욕비 1 : 0.8 인 경우) 또는 12ml(욕비 1 : 0.6 인 경우)가 담긴 삼각플라스크 속에 넣고 Voltex로 10∼20초 가량 강하게 교반 시킴으로써 시험편 속에 부착되어 있는 생균을 액체속으로 이행시켜 분산시켰다. 이 분산액을 이용하여 1/20 표준육즙배지에서 10배 계열희석을 만들었다.

6. 생균수의 측정

5에서 얻은 각 단계의 희석액 0.1∼0.2㎖을 취해 약 15㎖의 표준한천배지에 도말하여 혼합한천평판을 만들고 37℃에서 18∼24시간 동안 정치 배양했다. 생육한 colony 수를 계측하고 그 희석배율을 곱하여 시험편 속의 생균수를 산출했다. 생균수의 산출은 접종균액 0.1ml를 접종시킬 경우, colony수×10/ml, 0.2ml를 접종시킬 경우, colony수 ×5/ml로 계산했다.

7. 시험결과의 평가

한천평판배지의 colony 수를 계측하고 다음 식을 이용해서 균감소율을 계산했다.

균감소율 = (A-B)/A ×100

A : 18∼24시간 배양 후 분산 회수한 미가공포의 생균수 평균치(3검체)

B : 18∼24시간 배양 후 분산회수한 가공포의 생균수 평균치(3검체)

본 발명의 Agar Plate Smear Method 와 Agar Plate Contact Method에서 항균력측정이 가능한 적용대상 미생물은 다음과 같다.

MRSA ATCC 33592

Staphylococcus aureusATCC 6538

Klebsiella pneumoniaeATCC 4352

Escherichia ColiATCC 25922

Pseudomonas aeruginosaATCC 15442

Proteus vulgarisATCC 6059

Salmonella typhimuriumKCTC 1925

Shigella flexneri KCTC 2008

Staphylococcus mutansATCC 25175

Trichophyton mentagrophytes

Bacillus subtilisKCTC 1021

Entrobacter cloacaeATCC 27508

Actinomyces SP.

Bacillus megateriumATCC 10778

Sporocytophaga myxoccoides

Cellulomonas

Clostridium

Enterococcus. faecalis Pseudomonas aeroginosa

Pseudomonas. fluorescens

상기에 상세히 그 발명이 개시된 Agar Plate Smear Method 와 Agar Plate Contact Method 의 장,단점을 체계적으로 정리하면 다음의 표와 같다.

Agar Plate Smear Method 의 장단점

	장 점	단 점
Agar Plate Smear method	①시험균을 2대 계대배양하여 대수증식기에 해당하는 균을 사용하 기 때문에 균의 life cycle에 따른 균주의 특성차이를 최소화시 킬 수 있다.②접종균주의 접종균액 내에 존재하는 균수로 정의하지 않고 접종 전후의 colony수를 서로 비교함으로써 항균성을 판별하기 때문 에 초기균수의 차이에서 발생될 수 있는 항균력의 차이를 최소 화시켰다.③접종균액의 희석과정에서 생리식염수를 사용함으로써 영양의 공 급을 지양하여 접종할 때까지 균이 증식할 염려가 없다.④접종균액과 항균용액을 한천배지 위에 혼합·도말하므로써 미 생물의 성장에 필요로 하는 모든 조건이 피부와 유사하여 실제 의복착용 환경과 아주 가깝다.⑤용출형과 비용출형 항균제에 모두 적용할 수 있다.⑥감균율을 측정할 때 한천배지 위에 생성된 colony 수를 육안으 로 직접 계측할 수 있으므로 별도의 조작 없이 간편하게 감균율 을 계산할 수 있다.⑦항균제와 접종균액의 접종배양 시간을 자유롭게 조절할 수 있 다. 그 결과 배양시간 변화에 따른 상황을 쉽게 관찰할 수 있으 며 세균억제, 세균감소, 살세균 유무 등을 육안으로 파악할 수 있다.⑧밀폐된 용기 내에서 접종배양이 이루어지지 않고 의복착용조건 과 유사한 환경이라 할 수 있는 한천배지에서 실험을 진행하기 에 세균이 받는 스트레스가 없다.⑨접종균액과 항균성분을 함유하고 있는 용액의 농도조절이 매우 쉽고 항균제의 실험조건도 다양하게 변화시킬 수 있다.⑩항균처리 가공용 항균제의 항균성능을 피부와 유사한 조건하에 서 사전 검증함으로써 항균가공섬유의 항균성능에 대한 신뢰성 을 부여할 수 있다. Agar Plate Smear method에서 항균성이 발 현되지 않거나 항균성이 낮게 나타날 항균제는 섬유에 대하여 항균제로 사용했을 때 항균력이 낮을 것으로 예측케 한다.	①한천배지 위에 접종균액과 항균액을 도말할 때 숙련된 조작이 요구된다.

Agar Plate Contact Method 의 장단점

	장 점	단 점
AgarPlateContact Method	①용출형, 비용출형 가공약제로 처리한 모든 재질과 다양한 형태 의 섬유제품은 물론 수분흡수성이 있거나 항균제가 용출될 수 있는 섬유 이외의 제품에도 적용할 수 있다.②접종배양 후 10배 희석할 때 멸균완충생리식염수가 아닌 1/20 육즙배지를 사용하기 때문에 실험하는 동안 세균이 증식하거나 감소 할 수 있는 가능성을 배제시킨 생육조건에 필요한 영양분 이 공급된다. 또한 멸균완충생리식염수로는 시험포 속에 흡착하 고 있는 생균을 세척액 속으로 완전히 이행시킬 수 없다는 점을 해결 했다.③시험포를 표준한천배지 위에 놓고 배양하기 때문에 의류의 실제 착의조건과 유사한 환경이다.④접종균액 배지량을 기존의 1:1 욕비로 접종했을 때는 시험포에 흡수되고 남은 액량이 시험포 밖으로 흘러나오는 경우가 대부 분이나 1:0.8, 1:0.6의 욕비는 시험포를 충분히 적셔주고 남거나 부족하지가 않은 적당한 량이다.⑤접종배양시 배지 위에서 배양하기 때문에 접종균액에 미리 영양 분을 공급할 필요가 없다. 접종균액 조정시 멸균완충생리식염수 를 사용하기 때문에 접종할 때까지 균이 증식할 염려가 없다.⑥한천평판배지 위에서 접종배양하기 때문에 vial 속에서 접종배 양이 이루어질 때의 문제점인 직물에 고른 흡수가 안되는 점을 염려할 필요가 없다.⑦AATCC 100 Method에서는 수분증발 방지를 위해 vial 뚜껑을 꼭 막아 공기의 유입을 차단시키는데 호기성 균의 경우 스트레 스가 가해질 수 있다. 이 방법은 미생물의 생육에 필수요건인 온도·습도·공기·pH(배지의 pH가 7.0±0.2로 조정되어 있음) 등 제반조건을 모두 고려한 방법이다.⑧접종배양시간을 자유롭게 조절하면서 실험할 수 있다.	한천평파내지의 적당한 수분유지가 필요하다

본 발명을 하기의 실시예로 예시하며 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1. 항균제 자체의 항균성 측정

Shake Flask Method, 개량 Shake Flask Method, 균수측정법, AATCC Test Method 100, 개량 AATCC Test Method 100, OD Method에 의거하여 천연항균제인 chitosan의 MRSA에 대한 MIC를 측정하였으며 본 발명에서

항균제 자체의 항균성 측정을 위하여 고안된 Agar Plate Smear Method에 의거하여 역시 MIC를 측정하여 서로 비교하였다.

실시예 1에서 사용되고 있는 MRSA와 항균제로 사용된 chitosan의 특성 및 Shake Flask Method, 개량 Shake Flask Method, AATCC Test Method 100, 개량 AATCC Test Method 100, 균수측정법에 의한 시험방법을 상세히 제시하면 다음과 같다.

·MRSA의 특성

도 3에는 MRSA의 growth curve를 제시하였다. 도 3의 growth curve로부터 MRSA의 대수증식기는 18∼22시간 범위임이 확인된다. 18∼24시간 생육범위의 MRSA를 항균의 대상으로 삼았다.

·chitosan

Kr 190723 에 의거하여 동해안 홍게(Chionoecetes opilio)로부터 분자량의 크기 50만에 달하는 고분자량의 chitosan을 우선 수득한 다음 NaBO₃를 사용하여 분자량의 크기를 8만 정도로 조절하여 MRSA에 대한 항균제로 사용되었다.

분자량 8만에 해당하는 chitosan의 제조에서는 Kr 159972 에 의거하여 1ℓ의 탈이온수에 NaBO₃·4H₂O 32g을 첨가하여 용해시킨후 분자량 50만의 chitosan 20g을 첨가하고 50℃를 유지하면서 6시간 반응시킨후 탈이온수로 세척하고 100% ethanol 속에 24시간 동안 침지시켰다가 상온에서 건조시켜서 사용하였다.

수득된 분자량 8만의 저분자화 chitosan의 탈아세틸화도는 92.3%, Pd 1.76으로 측정되었다.

·Shake Flask Method에 의한 chitosan 자체의 MRSA에 대한 MIC 측정

Shake Flask Method에서는 0.75g의 항균가공된 시험포를 사용하므로 이에 대응하여 0.75g의 항균시험포 대신 0.75㎖에 해당하는 chitosan 산수용액을 사용하는 것 이외에는 Shake Flask Method의 시험법을 그대로 적용하였다. chitosan 산수용액을 다양한 농도로 제조하여(최소 0.002% 까지, chitosan을 용해시키는 산수용액의 산농도와 chitosan의 농도는 동일하게 조절) 0.75㎖를 1검체로 사용하고 대조구로서는 멸균인산완충용액 70㎖에 접종균액 5㎖를 넣고 chitosan 산수용액을 첨가하지 않은 상태에서 75㎖의 용액을 blank로 사용하였다.

·균수측정법에 의한 chitosan 자체의 MRSA에 대한 MIC 측정

0.2g의 항균가공된 시험포를 사용하는 대신 0.2㎖의 chitosan 산수용액을 사용하는 것을 제외하고는 균수측정법의 시험방법을 그대로 적용하였다.

·개량 Shake Flask Method에 의한 chitosan 자체의 MRSA에 대한 MIC 측정

0.75g의 항균가공된 시험포를 사용하는 대신 0.75㎖의 chitosan 산수용액을 사용하는 것을 제외하고는 개량 Shake Flask Method의 시험법을 그대로 적용하였다.

·AATCC Test Method 100에 의한 chitosan 자체의 MRSA에 대한 MIC 측정

AATCC Test Method 100에서는 0.2g의 항균가공시험포를 사용하므로 이에 대응하여 0.2g의 항균가공시험포 대신 여러 농도로 조절된 0.2㎖의 chitosan 산수용액을 습열멸균된 30㎖ 용량의 유리 vial에 넣고 AATCC Test Method 100의 규정에 따라서 조정된 접종균액 0.2㎖를 접종시키는 것 이외에는 AATCC Test Method 100의 시험법을 그대로 적용하였다.

·개량 AATCC Test Method 100에 의한 chitosan 자체의 MRSA에 대한 MIC 측정

0.2g의 항균가공된 시험포를 사용하는 대신 0.2㎖의 chitosan 산수용을 사용하는 것을 제외하고는 개량 AATCC Test Method 100의 시험법을 그대로 적용하였다.

·OD Method에 의한 chitosan 자체의 MRSA에 대한 MIC 측정

육즙배지 9.8㎖에 여러 농도로 조절한 항균용액 0.1㎖를 첨가한 일련의 시험관을 준비하고, 냉장보관 중이던 균주를 육즙배지에 이식한 후 35∼37℃에서 세균의 대수증식기에 해당하는 시간동안 진탕배양한다. 이 배양균 1 loop를 채취하여 보통 육즙배지에 2대 계대 배양하고 마찬가지로 35∼37℃에서 세균의 대수증식기에 해당하는 시간동안 진탕배양한 후 10배 희석계열로 만들어 조정한 것 0.1㎖를 접종하여 37℃에서 일정시간 배양한 다음 spectrophotometer를 사용하여 배양액의 탁도를 측정하였으며 탁도의 변화가 없는 것을 MIC로 구했다.

·Agar Plate Smear Method에 의한 chitosan 자체의 MRSA에 대한 MIC 측정

앞서 발명의 상세한 설명에서 기재되었던 Agar Plate Smear Method에 의거하여 chitosan을 초산수용액에 용해시킨 chitosan 초산수용액 0.2㎖를 한천평판배지 위에 도말하는 것을 제외하고는 Agar Plate Smear Method에 따라서 시험하였다.

표 8에서 상기 5종류의 항균시험방법에 의한 chitosan 산수용액의 MIC를 측정하여 제시하였다.

5종류의 항균시험방법에 의한 chitosan 산수용액의 MIC농도

chitosan의 분자량	Shake Flask Method	개량 Shake Flask Method	균수측정법	AATCC Test Method 100	개량 AATCC Test Method 100
8만	0.002% ^* (0.2ppm) ^**	0.25% (25ppm)	0.025% (125ppm)	0.025% (125ppm)	0.025% (125ppm)

^* % 농도는 MRSA에 대하여 첨가되는 chitosan 용액의 농도를 표시함

^** ( )는 chitosan의 MIC를 표시함

표 8에서 보듯이, 시험방법에 따라서 MRSA에 대한 MIC가 0.2ppm에서 125ppm까지 광범위하게 변화되고 있어 시험방법의 적용에 따라서 MRSA에 대한 chitosan의 MIC 값이 변화되고 있음이 확인된다. 그러나, 상기의 5가지 시험방법 전부에서 항균제 자체의 MIC 측정에서는 불합리하다고 지적되었던 표 1∼표 5에서 제시되고 있는 제반 단점들을 감안할 때 항균제인 chitosan의 항균력 측정에서는 적합하지 않는 것으로 판단된다.

표 9에 OD Method와 Agar Plate Smear Method에 의한 chitosan의 MIC 측정결과를 제시하였다.

Agar Plate Smear Method와 O. D Method에 의한 chitosan 산수용액의 MIC 농도 측정결과

chitosan의 분자량	Agar Plate Smear Method	O. D Method
chitosan의 분자량	Agar Plate Smear Method	용해후 바로 사용	용해후 1주일 경과
8만	0.05% 억제 (6.49ppm)	0.05% 억제(5ppm) 특히 분자량 8만, 4만에서는 0.025%(2.5ppm) 에서도 억제	0.05% 살균(5ppm) 특히 분자량 15만, 8만에서는 0.025%(2.5ppm) 에서도 억제

상기의 표 9에서 보았듯이 Agar Plate Smear Method에서 MRSA에 대한 chitosan의 MIC가 6.49ppm이었으며 OD Method에서는 MRSA에 대한 chitosan의 MIC가 5ppm으로 밝혀지고 있어 chitosan 자체의 항균력 테스트에 상기 2가지 시험방법이 바람직한 것으로 결론지워진다.

한가지 더 부언하자면 Agar Plate Smear Method와 OD Method에서 chitosan의 MRSA에 대한 MIC가 거의 일치하고 있기는 하지만 OD Method 보다는 Agar Plate Smear Method에 대하여 더욱 큰 신뢰성이 부여될 수 있는 것으로 사료되고 있다.

상기 OD Method에서는 접종배양액의 탁도변화만으로 MRSA의 생육을 확인하기 때문에 일부 사멸된 균에 의해서도 탁도의 변화가 있을 가능성을 완전히 배제할 수 없다.

반면 Agar Plate Smear Method에서는 접종배양 전과 접종배양 후 생성된 colony 숫자를 눈으로 직접 계측하여 확인하였기 때문에 chitosan의 항균성에 대한 오차가 거의 없는 것으로 판정할 수 있다.

OD Method에 비해서 Agar Plate Smear Method에서는 간단히 colony 숫자만을 계측함으로써 항균제의 항균성을 직접적으로 확인할 수 있다는 점에서 매우 유리하다.

OD Method가 항생제 및 항균제의 MIC 측정방법으로 이용되고 있는 방법이기 때문에 Agar Plate Smear Method와 OD Method에서 측정된 MIC값이 거의 흡사하다는 점은 Agar Plate Smear Method가 항균제 자체의 항균성 측정에 적합하다는 사실을 뒷받침하고 있다.

실시예 2. 항균가공처리된 항균가공제품의 항균성 측정

항균가공처리 제품의 항균성 측정에서는 chitosan으로 면직물을 후처리가공하여 Shake Flask Method, 개량 Shake Flask Method, 균수측정법, AATCC Test Method 100, 개량 AATCC Test Method 100, Agar Plate Contact Method로 MRSA에 대한 항균력을 측정하였다.

·chitosan을 이용한 면직물의 항균가공

앞에서 수득되었던 분자량 8만에 해당하는 chitosan을 0.5% 농도의 초산수용액으로 용해시켜서 소정농도의 chitosan 초산수용액을 제조하여 면직물에 wet pick up 100%로 도포시켜 항균제인 chitosan을 면포표면에 도입시켰다.

chitosan 초산수용액의 농도를 0.01∼0.08% 범위로 각각 제조하여 면포에 도포시킨 다음 상기에 제시된 시험방법에 따라 항균성을 측정함으로써 MRSA의 증식이 저지되는 chitosan 산수용액의 최소농도를 결정하여 항균가공제품에서 성립되는 MRSA에 대한 MIC로 결정하였다.

·Shake Flask Method

항균가공시험포로서 chitosan 산수용액을 도포시킨 면포 0.75±0.05g을 칭량하고 이 시료를 1검체로 한다. 동일시료당 무가공 시료 3검체, 가공 시료 3검체를 준비한다. 포는 가늘게(1×1㎝ 정도) 절단하여 시험에 사용하였다.

열에 의한 chitosan 성분의 변성을 방지하기 위하여 autoclave에서의 멸균 대신 clean bench에서 10분∼1시간 가량 자외선 멸균시켰다.

·균수측정법

항균가공시험포로서 chitosan 산수용액을 도포시킨 면포 0.2g을 사용하고 시험포의 멸균시 autoclave를 사용하지 않고 clean bench 속에서 10분∼1시간 동안 자외선 멸균하는 것을 제외하고는 균수측정법에 의한 시험방법을 그대로 적용하였다.

·개량 Shake Flask Method

Shake Flask Method에서 사용되는 시료를 그대로 사용하는 것을 제외하고는 개량 Shake Flask Method의 방법을 그대로 적용하였다.

·AATCC Test Method 100

균수측정법에서 사용되었던 항균가공시험포로서 면포를 그대로 사용하고 시험포의 멸균시 autoclave를 사용하지 않고 clean bench 속에서 10분∼1시간 동안 자외선 멸균하는 것을 제외하고는 AATCC Test Method 100에 의한 시험방법을 그대로 적용하였다.

·개량 AATCC Test Method 100

균수측정법에서 사용되었던 항균가공시험포로서 면포를 그대로 사용하고 시험포의 멸균시 autoclave를 사용하지 않고 clean bench 속에서 10분∼1시간 동안 자외선 멸균하는 것을 제외하고는 개량 AATCC Test Method 100에 의한 시험방법을 그대로 적용하였다.

표 10에 MRSA의 증식이 저지되는 chitosan 초산수용액의 최소농도와 직물에 부착된 chitosan이 MRSA의 증식을 저지시키는 최소농도를 제시하였다.

시험포를 chitosan 산수용액으로 처리할 때 MRSA의 증식이 저지되는 Chitosan 산수용액의 최소농도와 직물에 부착된 chitosan이 MRSA의 증식을 저지하는 최소농도

chitosan type (분자량)	Shake Flask Method	개량 Shake Flask Method	균수측정법	AATCC Test Method 100	개량 AATCC Test Method100	Agar Plate Contact Method
8만	0.05% (5ppm) ^* (면포)	0.05% (5ppm) (면포)	0.25% (2500ppm) (면포)	0.25% (2500ppm) (면포)	0.025% (250ppm) (면포)	0.05% (500ppm) (면포)

* ( ) 안의 수치는 MRSA의 증식이 저지되는 chitosan 산수용액의 최소농도로 가공포가 처리되었을 때 직물표면에 부착된 chitosan의 양으로부터 실험방법에 따라 고유하게 환산된 chitosan 자체의 MRSA 생육저지 최소농도이다

표 10으로부터 MRSA의 증식을 저지시킬수 있는 직물가공에 사용되는 chitosan 산수용액의 최소농도로부터 MRSA의 증식을 저지 가능케 하는 직물표면에 고화, 부착되어 있는 chitosan 자체의 최소농도도 계산가능하다.

표 10에서 항균실험방법에 따라서 MRSA 생육저지가 발현되는 chitosan 산수용액의 최소농도가 변화되고 있음을 볼 수 있다.

우선 Shake Flask Method에서는 chitosan 자체의 MRSA에 대한 MIC가 0.2ppm이었던 반면 직물을 chitosan 산수용액으로 가공하는 경우는 chitosan 산수용액의 농도가 0.05% 이상으로 유지되어야만 항균력이 발현되고 있다. chitosan 가공직물 표면에 부착되어 있는 chitosan 양의 계산으로 부터 부착되어 있는 chitosan이 MRSA에 대하여 항균력을 발휘할 수 있는 MIC도 다음과 같이 계산해낼 수 있다.

Shake Flask Method의 경우 wet pick up이 100%이므로 0.75g의 가공직물에 흡착되는 chitosan 산수용액의 양은 0.75㎖이고 0.05% 농도의 chitosan 산수용액 0.75㎖ 내에 함유되어 있는 chitosan의 양(결국 0.75g의 직물에 고화되어 부착되는 chitosan의 양과 일치한다)은0.75×(0.05/100)=7.5×5×10 ^-5 g이 된다.

결국 Shake Flask Method에 의한 chitosan 가공직물의 항균실험에서는 가공직물에 부착된 7.5×5×10^-5g의 chitosan이 접종균액 75㎖ 속에 침지되므로chitosan 자체의 농도는 7.5×5×10 ^-5 g/75㎖=5×10 ^-6 g/㎖=5ppm이 된다.

Shake Flask Method가 적용될 때 chitosan 자체의 MIC가 0.2ppm이었던 반면 chitosan이 가공포에 고착되는 경우는 항균력이 저하되어 MRSA에 대한 MIC가 25배상승하여 5ppm으로 나타났다.

chitosan 자체의 항균력 측정에서는 75㎖의 접종균액 내에 0.75㎖에 해당하는 chitosan 산수용액이 첨가되어 완전히 용해되므로 항균력이 클 수 밖에 없으나 chitosan이 고화, 부착된 가공직물에서는 직물표면에 chitosan이 고체상태로 고착되어 존재하므로 용해상태가 유지되고 있는 chitosan 자체에 비해서 항균력이 저하될 것은 당연한 이치이다.

더구나 Shake Flask Method가 비용출형 가공제에 대하여 적용되는 항균성 측정방법이라는 점을 감안할 때 가공직물에 고화, 부착되어 있는 chitosan 자체가 5ppm의 낮은 MIC를 보여준다는 사실은 예상 밖의 결과로 해석될 수 있다.

엄격히 해석한다면 chitosan 가공직물 표면에 고착되어 있는 chitosan 자체의 MIC가 5ppm이라는 것은 이론적 수치일 뿐 의미가 없을 수도 있다.

그 이유는 75㎖의 접종균액 내에 0.75g의 chitosan 가공직물이 가해질 때 직물표면에 고착되어 있는 chitosan 성분이 접종균액 내부로 골고루 분산되지 않기 때문이다.

chitosan 가공직물에 고화, 부착되어 있는 chitosan이 보여줄 수 있는 항균능력이 매우 낮다는 점을 고려할 때 Shake Flask Method에 의해서 측정되는 항균가공직물의 MRSA 증식저지능력은 항균제인 chitosan의 작용이라기 보다는 온도가 낮고 영양분이 없는 환경 때문에 MRSA의 증식이 억제된 것으로 볼 수 있다.

뿐만 아니라 Shake Flask Method에서의 최대 문제점은 개량 Shake Flask Method에서 나타나고 있다. 개량 Shake Flask Method에서도 MRSA의 생육저지chitosan 산수용액의 최소농도가 Shake Flask Method에서와 같이 0.05%로 나타나고 있음을 볼 수 있다.

Shake Flask Method에 비해서 접종균액 내에 영양원이 지극히 풍부할 뿐만 아니라 균의 성장온도 측면에서도 절대적으로 유리한 개량 Shake Flask Method에서 직물가공에 적용되는 chitosan 산수용액의 MRSA 최소저지농도가 Shake Flask Method와 동일하다는 사실은 납득되기 어렵다.

이는 Shake Flask Method와 개량 Shake Flask Method에 내재되어 있는 근본적인 문제점을 단적으로 보여주고 있는 것으로 해석된다.

앞서 개량 Shake Flask Method에서 chitosan 자체의 MRSA에 대한 MIC가 25ppm이었다는 점을 감안할 때 직물에 고화, 부착된 chitosan 자체의 MIC가 오히려 5ppm으로 저하되고 있다는 사실은 상식적으로 납득되기 어려운 것으로서 이는 개량 Shake Flask Method에 내재된 문제점을 객관적으로 노출되고 있다.

결론적으로 Shake Flask Method와 개량 Shake Flask Method의 시험방법에서 발현되는 항균성은 항균가공직물의 항균성이라기 보다는 항균시험방법의 부적절한 조건에 따른 결과라고 판단된다.

균수측정법에서는 chitosan 산수용액의 농도 0.25%로 직물을 가공처리 할 때 MRSA의 생육이 저지되고 있으므로다음의 계산에 의해서 0.2g의 가공직물표면에 고화, 부착되어 있는 chitosan 자체의 무게는 0.2×(0.25/100)=5×10 ^-4 g 이며 chitosan 가공처리직물 0.2g에 대해서 접종균액 0.2㎖가 가해지므로 접종균액 내에존재하는 chitosan 자체의 농도는 5×10 ^-4 g chitosan/0.2㎖, 즉 2.5×10 ^-3 g/㎖ 로 계산되며 결과적으로 고착 chitosan의 MIC는 2500ppm이 된다.

이로부터 균수측정법과 AATCC Test Method 100에서는 chitosan 가공처리 직물에 부착되어 있는 chitosan이 보여주는 항균력은 chitosan 자체의 항균력과 비교할 때 대략 1/20 이하로 저하되고 있음을 볼 수 있다.

그러나, 상기 균수측정법과 AATCC Test Method 100에 해당하는 2가지 실험방법에서는 접종균액 내에 존재하는 영양원이 너무 과다할 뿐만 아니라 0.2g의 가공포에 대하여 0.2㎖의 접종균액을 접종할 때 균액의 양이 너무 과다하다는 점을 포함하여 제기되고 있는 여러 문제점들에 비춰볼 때 항균력의 신뢰성이 매우 결여된 것으로 판단된다.

개량 AATCC Test Method 100에서는 MIC가 AATCC Test Method 100에 비해서 1/10로 저하되고 있는데 이는 접종균액 내에 포함되는 영양원이 AATCC Test Method 100에 비해서 1/15로 축소되었기 때문으로 추정된다. 개량 AATCC Test Method 100에서는 접종균액 내에 균의 증식에 필요한 최소한의 영양원이 존재하고 있는 상황으므로 균수측정법, AATCC Test Method 100 뿐만 아니라 Shake Flask Method, 개량 Shake Flask Method와 비교할 때 영양원 함량측면에서는 합리성이 충분하다고 판단된다.

그러나, 개량 AATCC Test Method 100에서는 chitosan 자체의 MIC가 125ppm이었던 반면 가공섬유 표면에 고화되어 부착된 chitosan 자체의 MIC가 250ppm으로서chitosan 자체의 MIC에 비해서 가공섬유 표면에 부착된 chitosan의 MIC가 2배 밖에 상승되지 않고 있다는 사실은 지금까지 본 연구에서 밝혀진 chitosan의 항균력에 비추어 볼 때 이해하기 어렵다.

chitosan 자체의 항균력 측정시 완전히 용해된 chitosan 산수용액의 항균성과 가공포에 고화, 부착되어 항균력의 발현이 어려운 chitosan 간에 항균력 차이가 2배 정도로 미미하다는 사실은 상식적으로 납득되기 어렵다.

chitosan 자체의 항균력 측정에서 균수측정법, AATCC Test Method 100, 개량 AATCC Test Method 100에 해당하는 3가지 시험법 전부에서 MIC가 125ppm으로 일치되고 있다(표 8).

상기 3가지 시험방법에서 영양원의 공급상태가 서로 다르지만 MIC가 서로 일치되고 있는 이유는 chitosan 자체가 최대의 항균력을 발휘할 수 있는 용해상태로 존재하고 있을 뿐만 아니라 영양원이 충분히 공급되고 있어 chitosan이 영양원 첨가량의 차이에 의하여 영향을 거의 받지 않기 때문에 항균력이 거의 동일하게 발휘될 수 있는 것으로 추정된다.

반면 chitosan으로 가공된 포에서는 직물표면에 고화, 부착된 chitosan의 항균작용이 원활치 않게 되고 이로 인하여 chitosan 자체의 항균력과 서로 비교해 볼 때 항균력이 급격히 저하될 수밖에 없으며 그 결과 MIC 값도 현저히 상승될 수 밖에 없다.

개량 AATCC Test Method 100의 경우 chitosan 자체의 MIC에 비해서 chitosan 가공포에서 MIC가 2배 밖에 상승되지 않고 있다는 사실은 균수측정법이나 AATCCTest Method 100에 준하여 볼 때 MIC 값의 상승이 너무 낮기 때문에 chitosan 가공포의 항균성 측정에서 신뢰감이 부여될 수 없음이 분명하다.

개량 AATCC Test Method 100 시험법이 균수측정법이나 AATCC Test Method 100에 비해서 물론 객관적인 신뢰성 측면에서 우수하다고 평가되고는 있지만 영양원이 1/15로 축소된 것 이외에는 AATCC Test Method 100에서 제기되었던 문제점들을 그대로 안고 있다는 사실을 감안할 때 항균성 측정방법으로서 과다한 신뢰성의 부여는 배제되어야 마땅하다.

또한, 개량 AATCC Test Method 100은 의복착용 환경과는 거리가 멀다는 점도 지적되지 않을 수 없다. Agar Plate Contact Method에서는 MRSA의 증식을 저지하는 chitosan 산수용액의 최소농도가 0.05%로서 개량 AATCC Test Method 100 보다도 다소 큰 값을 보여주고 있다.

개량 AATCC Test Method 100에서는 가공포의 항균성 측정실험에서 가공포에 접종균액을 적하, 침투시켜서 항균성을 측정하기 때문에 의복착용 환경과 매우 다른 것에 비해서 Agar Plate Contact Method에서는 피부와 대응될 수 있는 적절한 정도로 습도가 유지되고 있는 한천배지 위에 가공포를 부착시킴으로써 의복착용 환경과 유사화시켰을 뿐만 아니라 피부에 대응되는 한천배지로부터 적절한 정도로 영양을 공급받고 있기 때문에 착용의복 환경에 가장 접근되어 있다고 볼 수 있다.

chitosan 자체의 MRSA에 대한 MIC 측정결과 O. D Method에서 5ppm 이며 Agar Plate Smear Method에서 6.49ppm 으로서 서로 유사한 값을 보여주고 있다는 점을 감안할 때 Agar Plate Contact Method에 대한 신뢰성이 보장되고 있다.

chitosan 가공포에서 MRSA의 증식을 저지시키는 chitosan 산수용액의 최소농도가 0.05%라는 사실은 chitosan 가공포의 항균성 측정방법으로서 무리가 없이 합당한 것으로 판단된다.

본 발명은 항균제 자체의 항균력을 정확하고 간편하게 측정할 수 있는 Agar Plate Smear Method와 항균가공 제품의 항균성을 간편하고 객관적으로 측정할 수 있는 Agar Plate Contact Method의 발명을 목적으로 하고 있다. Agar Plate Smear Method는 용출형과 비용출형 항균제에 대하여 모두 적용이 가능하며 감균율을 측정할 때 한천배지 위에 생성된 colony 숫자를 육안으로 간단히 계측할 수 있으므로 별도의 번거로운 조작없이 감균율의 계산이 가능하며 항균제와 접종균액의 접종배양 시간의 자유로운 조절에 의하여 균억제, 균감소, 살균유무 등을 쉽게 파악할 수 있다는 장점이 제시될 수 있다. 또한 피부와 유사한 환경 하에서 항균제의 항균성 측정이 이루어진다는 장점도 아울러 제시된다.

Agar Plate Contact Method는 용출, 비용출 항균제로 가공처리된 모든 섬유제품뿐만 아니라 수분흡수성이 있거나 항균제가 용출될 수 있는 섬유제품 이외의 항균제품에 대해서도 적용이 가능하며 Agar Plate Contact Mehod는 미생물의 생육에 필수요건인 온도, 습도, 공기, pH 등의 제반요건이 모두 고려된 방법으로서 객관성과 신뢰성이 보장된 항균력 측정을 가능케 한다.

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용출형 및 비용출형 항균제의 접촉 배양시간을 시험자가 임의로 조절 가능하며 항균력을 배양된 콜로니수로 계산하여 육안측정이 가능한 다음 단계로 이루어진 한천 플레이트 도말방법(Agar Plate Smear Method).

① 시험균의 배양과 시험균 현탁액의 조정

시험균주를 표준한천사면배지에 이식한 후 정치배양 하거나 또는 육즙배지에 이식한 후 진탕배양한다. 이 배양균 1 loop를 채취하여 보통 육즙배지에 2대 계대 배양하고 10배 희석계열을 만들어 최종단계의 균수를 1∼2 ×10⁴CFU/㎖로 조정했다. 이때의 생균수인 초기균을 확인하기 위하여 한천평판 3매를 작성하고 배양하여 평균했다.

② 배양시험

온도 20℃, 습도 65%에서 3일 보관한 표준한천평판배지 위에 실험하고자 하는 농도의 항균용액 0.2㎖를 도말하고 여기에 더하여 ①에서 조정한 현탁균액 0.2㎖를 도말한 것과, 별도로 ①에서 조정한 현탁균액만을 0.2㎖를 접종하여 도말한 후 35∼37℃의 항온기에서 24∼72시간 동안 정치 배양한다.

이때, 항균용액을 도말한 후 현탁균액을 주입하여 도말한 것 3매와 control로 현탁균액 만을 도말한 것 3매씩을 작성한다.

③ 생균수의 측정

생육한 colony수를 각각 계측하여 생균수를 산출한다.

④ 시험결과의 평가

한천평판배지의 콜로니 수를 계측하여 다음의 식으로 균 감소율을 계산했다.

균감소율 = (A-B)/A ×100

A : 항균용액은 넣지 않고 현탁균액 만 넣어 도말한 후 배양한 균(3검체)

B : 항균용액과 접종균액을 함께 접종한 후 도말하여 배양한 균수(3검체)
삭제
용출형 및 비용출형 항균제로 가공처리된 제품에서 접종균액과의 접촉 배양시간을 시험자가 임의로 조절 가능하며 가공 처리된 항균제품의 항균력을 실제 사용조건과 유사한 조건에서 측정이 가능한 다음 단계로 이루어진 한천 플레이트 접촉방법(Agar Plate Contact Method).

① 시험균의 배양과 시험균 현탁액의 조정

시험균주를 표준한천사면배지에 이식한 후 35∼37℃에서 균의 종류에 따라 18∼24시간 정치배양 하거나 또는 육즙배지에 이식한 후 35∼37℃에서 세균의 대수증식기에 해당하는 시간(MRSA는 18∼22시간이 적당)동안 진탕배양한다. 이 배양균 1 loop를 채취하여 보통 육즙배지에 2대 계대 배양하고 10배 희석계열을 만들어 최종단계의 균수를 4 ∼ 6 ×10³CFU/㎖로 조정했다. 이때의 생균수인 초기균을 확인하기 위하여 한천평판 3매를 작성하여 평균했다.

② 시료의 조정

농도를 서로 다르게 조절한 항균제가 용해된 항균용액을 가공포에 도포시킨 후 자연건조 시킨다.

가공포는 항균가공약제와 포의 특성상 열에 민감한 것은 100℃이하의 간헐멸균 또는 자외선 살균하고 습윤열에 강한 대조포는 호일에 잘 싸서 autoclave 속에서 121℃, 15분간 습열 멸균했다.

③ 배양시험

Agar Plate Smear Method 에서 사용되었던 고체 한천평판배지 위에 ②에서 조정한 시료를 잘 포개고 떨어지지 않도록 핀셋으로 눌러주었다. 시료 위에 조정한 현탁균액을 0.16ml(욕비 1 : 0.8) 또는 현탁균액 0.12ml(욕비 1 : 0.6)로 균일하게 접종하여 37℃에서 24∼30시간 정치 배양했다.

④ 시험의 준비

배양 후의 시료는 미리 준비한 1/20 표준육즙배지가 담긴 삼각플라스크 속에 넣고 강하게 교반 시킴으로써 시험편 속에 부착되어 있는 생균을 액체속으로 이행시켜 분산시켰다. 이 분산액을 이용하여 1/20 표준육즙배지에서 10배 계열희석을 만들었다.

⑤ 생균수의 측정

④에서 얻은 각 단계의 희석액을 취해 표준한천배지에 도말하여 혼합한천평판을 만들고 정치 배양했다.

생육한 colony 수를 계측하고 그 희석배율을 곱하여 시험편 속의 생균수를 산출했다.

⑥ 시험결과의 평가

한천평판배지의 colony 수를 계측하고 다음 식을 이용해서 균감소율을 계산했다.

균감소율 = (A-B)/A ×100

A : 18∼24시간 배양 후 분산 회수한 미가공포의 생균수 평균치(3검체)

B : 18∼24시간 배양 후 분산회수한 가공포의 생균수 평균치(3검체)
제 4항에 있어서, 가공 처리된 제품이 섬유제품인 것을 특징으로 하는 한천 플레이트 접촉방법(Agar Plate Contact Method).