KR100423073B1 - 거봉포도의 레스버라트롤 합성유전자를 이용하여 형질전환된 항암기능성 신품종 토마토 및 그에 의해 생산된 항암기능성 재조합 레스버라트롤 합성물질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 거봉 포도의 레스버라트롤 (resveratrol) 생합성 유전자를 이용한 항암 물질을 생산하는 형질전환된 토마토에 관한 것으로, 거봉 포도의 RNA 및 DNA를 추출하여 제조한stsycDNA를 PCR로 증폭하고 pBI 121 벡터에 삽입시킨 재조합 벡터의 제조 (pBIstsyv1), 이 재조합 벡터를 아그로박테리움 (Agrobacterium)-LBA4404 균주에 도입시켜 형질 전환 균주 pBIstsy1/LBA4404를 생산하고 이를 토마토에 접종함으로써 항암 물질을 대량으로 생산할 수 있는 신품종 토마토를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

거봉포도의 레스버라트롤 합성유전자를 이용하여 형질전환된 항암기능성 신품종 토마토 및 그에 의해 생산된 항암기능성 재조합 레스버라트롤 합성물질{A novel anti-tumoral tomato transformed by using resveratrol synthesis gene of Vitis vinifera X Vitis labrusca L. cv. Kyoho and an anti-tumoral recombinant resveratrol synthetic material produced by said tomato}

본 발명은 거봉 포도의 레스버라트롤 (resveratrol) 생합성 유전자를 이용하여 항암 기능이 증진된 토마토 (Lycopersicon esculentumMill) 신품종에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 약리 실험을 통해 항암 기능이 확인된 거봉포도 (Vitis viniferaXVitis labruscaL. cv. Kyoho)의 레스버라트롤 합성 유전자를 클로닝하여 재조합 벡터를 만든 후 그 벡터를 아그로박테리움 (Agrobacterium)-LBA4404 균주에 도입하여 형질 전환시키고, 상기 균주를 토마토에 접종하여 항암 기능이 있는 레스버라트롤 합성 물질을 생산하는 형질 전환된 토마토 신품종 생산에 관한 것이다.

레스버라트롤 (Resveratrol) 및 그 중합체인 비니페린 (viniferin)은 원래 식물체에서 외부로부터 침입한 곰팡이의 성장을 억제하는 방어 물질인 피토알렉신 (phytoalexin)으로 알려져 왔다. 레스버라트롤 (혹은 유사 스틸벤, stilbene)은 극히 일부 식물에서만 생성되는데 지금까지 알려진 바로는 폴리고넘 커스피다툼 (Polygonum cuspidatum), 유칼립투스, 스코틀랜드 전나무 (Scottish pine), 가문비 나무 (spruce), 포도, 땅콩 (Arachis hypogaea), 백합 (lilly) 등이 있다. 이들 식물에서 레스버라트롤은 스틸벤 합성 효소 (stilbene synthase)에 의해 malony-CoA와 p-coumaroyl-CoA로부터 합성되며, 곰팡이, UV, 오존과 같은 외부 환경 스트레스로부터 그 합성이 유도된다고 보고되었다 (Schoeppner and Kindl H, 1979; Fliegmann et al., 1992; Fritzemeier et al., 1983; Vornam et al., 1988). 근래에는 이 물질의 생합성 기작 및 조절에 대해 분자 및 유전자 수준에서 다각적인 연구가 이루어지고 있다. 그 결과 소나무, 포도, 땅콩 등에서 이 물질의 생합성에 관여하는 유전자가 분리되었으며 (Sparvoli et al., 1994; Preisig-Muller et al., 1999; Schubert et al., 1997), 유전자의 발현, 조절에 대한 많은 정보가 축적되어 유전자를 이용하기 위한 발판이 마련되었다.

한편 포도에서의 레스버라트롤에 관한 연구는 오래 전부터 시작되었으며, 이 화합물의 항 스트레스 작용은 잘 알려져 왔다 (Langcake et al., 1979). 기존에는 이러한 레스버라트롤의 항 스트레스 작용 및 스트레스 저항성을 이용한 합성 유전자를 특정 작물에 도입함으로써 항균, 항 세균, 항 바이러스, 항충 등 내병성 형질 전환체 작물을 개발하여 왔다 (Kindle et al., 1999; Hain et al., 1998; Schroder et al., 2000). 그러나 최근 포도주에서 트랜스-레스버라트롤 (trans-resveratrol)이 발견되고, 적절한 포도주 섭취가 관상동맥 심장병 [coronary heart disease (CHD)]에 의한 사망율을 낮춘다는 역학적인 보고가 나온 이후, 레스버라트롤의 약리 효과에 대해 많은 실험 결과가 발표되기 시작하였다 (Siemann and Creasy, 1992). 특히 적포도주 섭취로 혈액 내 항 산화 활성이 증가하고 이로 인해 산화성 LDL의 생성이 억제된다는 보고들이 주목을 받았다 (Maxwell et al., 1994; Fuhrman et al., 1995). 가장 최근에는 이 물질의 항 돌연변이 및 항암작용에 대한 연구 결과가 많이 보고되었다 (Carbo et al., 1999; Clement et al., 1998; Huang et al., 1999).

그러나 이 레스버라트롤 화합 물질은 포도를 비롯한 극히 일부 식물에서만 생성되며, 특히 포도에서는 과피에서만 합성되기 때문에 식용 포도의 경우 거의 섭취되지 못하고 버려지는 실정이었다. 따라서 이 물질이 전혀 없는 토마토에 포도유전자를 도입하여 항암 성분을 다량 함유하도록 제조한 본 토마토 신품종은 토마토의 영양 성분은 그대로 둔 채 포도의 항암 물질만 특이적으로 섭취하도록 하는 효과가 있다. 그러므로 본 발명은 거봉 포도의 레스버라트롤 합성 유전자를 삽입한 재조합 벡터를 도입하여 형질 전환시킨 아그로박테리움 변형 균주를 레스버라트롤 유전자가 전혀 없는 토마토에 접종하여 형질 전환시켜 항암 성분을 다량으로 합성하는 항암 기능성 토마토 신품종을 생산하기 위해 실시되었다.

근래 유전자 변형 기술을 이용하여 다양한 토마토 형질 전환 품종의 개량이 시도되고 있으나, 기능성 토마토는 아직 개발된 적이 없다. 특히 국내의 경우 펩타이드를 이용한 혈압 상승 억제 토마토 생산 기술이 개발된 적은 있으나 아직 생산 체제에 이르지는 못하고 있는 실정이다.

본 발명은 지난 5년간의 연구 기간 동안 개발된 유전자 클로닝 기술, 식물 형질 전환 기술 등을 바탕으로 제조가 완료된 항암 기능이 증진된 토마토 신품종으로서 국내에서 유전 공학 기법을 활용하여 육종된 첫 번째 토마토 신품종이라는 점에서 그 효과가 매우 크다. 또한 본 발명은 지금까지의 연구 결과를 토대로 상기 레스버라트롤 유전자의 항암 기능에 착안하여 기능성 유전자인 레스버라트롤 합성 유전자의 발현을 분자 수준에서 조절하여 항암 기능을 가진 것으로 밝혀진 레스버라트롤 합성물을 대량 생산하는 항암 기능성 형질 전환된 토마토 신품종을 제조하는 기술로서 그 식품적 효과가 크다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기의 사실들을 감안하여 거봉 포도의 레스버라트롤 유전자를 추출하여 벡터에 삽입함으로써 제조된 재조합 벡터 (pBIstsyv1)를제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움 균주에 도입해 형질 전환시킨 아그로박테리움 변형 균주 (pBIstsyv1/LBA4404)를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 토마토에 접종하여 레스버라트롤 합성물을 생산하는 항암 기능성 형질 전환체 토마토를 제조하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 거봉포도 (Vitis viniferaXVitis labruscaL. cv. Kyoho)의 각 성장 단계의 기관 및 조직 (잎, 과피, 과육, 꽃)으로부터 추출한 total RNA를 이용하여 first-stand cDNA를 합성하고 이를stsycDNA로부터 제조한 프라이머를 이용해 PCR 증폭한 후 제한 효소로 open reading frame 및 일부 untranslated region을 잘라 내어 GUS 유전자가 제거된 pBI 121벡터의 CaMV 프로모터 뒤에 삽입시켜 재조합 벡터 (pBIstsyv1)를 제조하고, 배양한 아그로박테리움 (Agrobacterium)-LBA4404에 상기 재조합 벡터를 도입시켜 형질전환 균주 (pBIstsyv1/LBA4404)를 제조한 뒤, 공시 토마토 (Lycopersicon esculentumMill) '영수'의 자엽 절편체를 상기 형질전환 아그로박테리움 균주의 현탁액에 접종하여 형질전환시킨 후 항생제가 들어 있는 배지에 치상하고, 그 신초를 증식, 발근, 활착시켜 레스버라트롤 유전자로부터 합성되는 항암 물질을 생산하는 항암 기능의 신품종 토마토를 제조함으로써 달성되었다.

도 1은 거봉 포도 (Vitis viniferaXVitis labruscaL. cv. Kyoho)의 스틸벤 합성 효소 (stilbene synthase) cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

도 2는 본 발명에 따른 도 1 기재의 항암 성분인 레스버라트롤 (resveratrol)의 합성 유전자 및 형질 전환용 재조합 벡터 (pBIstsy1)의 개략적 지도이다.

도 3은 도 2의 재조합 벡터를 도입시켜 본 발명의 토마토 (Lycopersicon esculentumMill) 형질 전환체를 선발하는 일련의 과정이다

도 4는 본 발명의 항암 기능성 형질 전환된 토마토에 도입된 레스버라트롤 (resveratrol) 합성 유전자의 발현 과정을 확인한 RT-PCR 결과이다.

도 5는 항암 기능성 토마토 신품종의 항암 성분인 레스버라트롤의 함량을 HPLC을 통해 분석한 결과이다.

본 발명은 거봉포도 (Vitis viniferaXVitis labruscaL. cv. Kyoho)의 레스버라트롤 합성 유전자를 PCR 증폭하여 pBI 121 벡터에 삽입시켜 재조합 벡터 pBIstsyv1을 만드는 단계 ; 배양시킨 아그로박테리움-LBA4404을 형질 전환용 균주로 선택하여 레스버라트롤 합성 유전자가 삽입된 상기 재조합 벡터 pBIstsyv1을 도입시키는 단계 ; 공시 재료인 토마토 (Lycopersicon esculentumMill) '영수'의 자엽 절편체를 상기 아그로박테리움 변형 균주에 접종하여 형질 전환시키는 단계 ; 형질 전환된 자엽 절편체를 항생제가 첨가된 배지 위에 치상하여 신초를 증식시키고 발근, 활착시켜 항암 기능의 신품종 토마토를 제조하는 단계 ; 형질전환된 신품종 토마토로부터 genomic DNA를 추출한 후 genomic PCR 및 RT-PCR 분석하여 형질 전환체 토마토의 레스버라트롤 유전자 도입 및 발현 여부를 확인하는 단계 ; 형질 전환된 토마토의 레스버라트롤을 추출한 후 HPLC 분석하여 상기 형질 전환된 토마토의 레스버라트롤 함량을 분석하는 단계로 구성된다.

상기 단계에서 항암 기능의 형질전환체 토마토는 자엽 절편체를 항생제가 첨가된 배지 위에 치상하여 신초를 증식시키고 발근, 활착시키는 조직배양법에 의하여 증식하거나 꺽꽂이(삽목)에 의하여 증식할 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리 범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 거봉 포도 ( Vitis vinifera X Vitis labrusca L. cv. Kyoho)의 레스버라트롤 유전자가 삽입된 재조합 벡터 및 상기 벡터를 도입시킨 형질 전환된 아그로박테리움 ( Agrobacterium ) 균주의 제조

제 1단계 : 형질 전환된 토마토 생산을 위한 거봉포도 ( Vitis vinifera X Vitis labrusca L. cv. Kyoho)의 각 기관 및 조직의 RNA 및 genomic DNA 추출

거봉포도 (Vitis viniferaXVitis labruscaL. cv. Kyoho) 과실을 개화 후 일주일 간격으로 15주간 수확하여 매주 5알을 무작위로 선정해서 길이, 너비, 그리고 무게를 측정하였다. 이것을 과피와 과육을 분리하여 각각 액체 질소로 급냉시킨 뒤 -80℃에서 보관하였다.

상기 다양한 발달 단계에 있는 거봉포도의 각 기관 및 조직(과피, 과육, 잎, 꽃)으로부터 total RNA를 추출하였다. 개화 후 각각 2, 3, 8, 10, 13, 15 주 되는 포도 과실 및 각 기관으로부터, 조직의 일부를 떼어 얼려서 커피 분쇄기 (coffee grinder)로 마쇄한 후, 가루를 RNA 추출 용액 (0.3 M Tris-HCl, pH 8.3, 2% PEG 4000, 5M sodium perchlorate, 1% SDS, 8.5% insoluble PVPP, 1% β-mercaptoethanol)과 섞은 다음 유리 섬유 (glass wool)로 채워진 주사기 속에 넣고 200 ×g에서 15 분간 원심분리시켰다. 추출액은 2.5 volume 에탄올 (ethanol)로 침전시키고, 펠렛 (pellet)은 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 1 mM EDTA, 0.2% β-mercaptoethanol에 녹여 Phenol/chloroform 추출 (extraction)을 한 다음 상층액을 회수하여 0.1 volume의 3 M sodium acetate 와 2.5 volume의 에탄올을 넣어 RNA를 침전시키고 다시 원심분리를 한 후, 펠렛은 DEPC (diethylpyrocarbonate) 처리 증류수에 녹였다. 필요한 경우 PolyA-Tract mRNA Isolation System III (Promega)를 사용하여 mRNA를 추출하였고, total RNA 등 RNA 시료는 UV 분광광도계(Spectrophotometer)와 RNA 겔을 사용하여 그 질을 측정하였다.

다음으로 genomic DNA의 추출을 위해 어린 잎 조직 2 g을 액체 질소를 이용하여 마쇄한 뒤 25 ㎖의 버퍼 (buffer A [0.25 M NaCl; 0.2 M Tris, pH 8.0; 2.5% PVP (MW 40,000); 50 mM EDTA; 0.1% β-mercaptoethanol, pH 7.6])를 넣고 혼탁시켜 5,000 rpm에서 10 분간 원심분리를 한 뒤, 펠렛에 5 ㎖의 추출용 버퍼 (extraction buffer B [0.5 M NaCl; 0.2 M Tris, pH 8.0; 2.5% PVP; 50 mM EDTA; 3% sarkosyl; 20% ethanol; 1% β-mercaptoethanol])를 넣고 37℃에서 30분 동안 흔들어 주었다. 동량의 chloroform:isoamylalcohol (24:1, v/v)를 넣고 잘 섞은 뒤, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 하고, 상층액을 다시 0.54 volume 이소프로판올 (isopropanol)로 침전시켰다. 펠렛을 증류수에 녹인 후 RNase (0.1 ㎎/㎖)를 넣어 37℃에서 30분간 정치시키고, RNase를 포함한 단백질은 0.5 volume의 7.5 M 암모늄 아세테이트 (ammonium acetate)를 넣고 침전시킴으로써 제거하였다. 상층액을 0.54 volume의 이소프로판올로 처리하여 DNA를 회수하였다.

제 2단계 : 프라이머를 이용한 cDNA의 RT-PCR 증폭

각 기관 및 조직에서 분리한 total RNA로부터, First-strand cDNA synthesis kit (Pharmacia)를 사용하여 first strand cDNA를 합성하고, 이를 PCR의 주형 (template)으로 사용하였다. 이미 보고된 Shiraz 포도의 stilbene synthase cDNA (Sparvoli et al., 1994; Melchior and Kindl, 1990)의 염기서열을 분석하여 open reading frame의 시작 및 끝 부위로부터 PCR을 위한 프라이머를 구상하여 제조하고그 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다.

first strand cDNA의 PCR 증폭을 위한 프라이머

HPPN : 5' ATGGCTTCAGTCGAGGAAATT 3'(21mer)

HPPC : 5' TTAATTTGTCACCATAGGAATG 3'(22mer)

일반적인 PCR 방법 (Sambrook et al., 1989)으로 94℃에서 30 초, 55℃에서 1 분, 그리고 72℃에서 1 분간, 30 주기 (cycle)를 반복한 후 PCR 생성물 (product)을 겔 (gel)에서 확인하였다.

제 3단계 : 상기 cDNA의 염기서열 작성 및 분석

RT-PCR 증폭하여 얻어진 상기 cDNA의 염기 서열은 삭제 목록 (deletion series)을 확보하거나 상기 cDNA를 pCR2.1-TOPO cloning vector로 여러 번 서브클로닝 (subcloning)한 후 Sequenase Kit (Version2.0; USB)을 사용하여 디데옥시 종결 (dideoxy termination) 방법으로 (Sanger et al., 1977) 결정한 후 아미노산으로 해독하고, 이전에 밝혀진 Shiraz 포도의 스틸벤 합성 효소 (stilbene synthase) cDNA와의 유사성을 분석하였다 (도 1). 그 결과 Shiraz 포도의 스틸벤합성 cDNA의 염기서열과 99% 이상 동일함을 알 수 있고, 따라서 이 클론은 상기 cDNA(stsy)의 혼성체 (homologe)임을 알 수 있었다. 또한 이 cDNA를 genomic Southern 혼성화반응을 위한 프로브 (probe)로 사용하였다. 이 때 분석용 프로그램으로는DNASIS/PROSIS, PCGENE, Clustal V, Blast search 등을 사용하였다.

제 4단계 : 형질전환용 균주 아그로박테리움 ( Agrobacterium )의 배양

형질전환용 균주로 아그로박테리움 (Agrobacterium)-LBA4404를 선택하여, rifampicin 100mg/L,kanamycin (Km) 100mg/L, agar 15g/L가 첨가된 YEP(An, 1987) 고형배지 페트리디쉬에 아그로박테리움을 스트리킹 (streaking)하여 28℃에서 2~3일 배양하였다. 왕성하게 생장하고 있는 아그로박테리움 콜로니를 취하여 Km 100mg/L가 첨가된 YEP 액체배지 3mL에 접종하고 28℃에서 8시간 동안 200-250rpm으로 진탕 배양하였다. 진탕 배양한 아그로박테리움 현탁액 1mL를 Km 100 mg/L가 첨가된 50mL YEP 액체 배지에 접종하여 상기한 조건으로 16시간 동안 배양하였다. 배양을 마친 아그로박테리움 현탁액은 OD (optimum density) 값이 0.8-1.0 되도록 조절하여 토마토의 형질전환에 이용하였다.

제 5단계 : 형질전환을 위한 stsy cDNA 재조합 벡터 pBIstsyv1의 제조

상기 2단계에서 RT-PCR에 의해 얻은stsycDNA 클론의 open reading frame 부위 및 일부 untranslated region을 제한 효소를 사용하여 잘라 내고 이를 다시 GUS 유전자가 제거된 pBI 121 벡터의 CaMV 35S 프로모터 뒤에 삽입시켜 재조합 벡터 pBIstsyv1을 제조하였다 (도 2). 이 재조합 벡터를 상기 4단계의 아그로박테리움에 도입하여 형질전환 균주 pBIstsyv1/LBA4404를 제조하였다.

상기 형질전환 균주 아그로박테리움 튜머페시언스 pBIstsyv1/LBA4404 국제미생물 기탁기관인 한국종균협회에 2001년 6월 18일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM 10284).

실시예 2:형질 전환된 아그로박테리움 pBIstsyv1/LBA4404 의 접종 및 토마토의 조직배양에 의한 식물체의 재분화

제 1단계 : 형질전환용 식물재료 및 종자발아

본 단계에서는 토마토 (Lycopersicon esculentumMill) '영수'를 공시 재료로 하여 종자를 발아시킨 후 자엽을 채취하여 이를 형질 전환시켰다.

종자 발아는 종자를 70% 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하고 다시 소독액 (30% 락스+Tween20)으로 20분 소독한 후 멸균수로 3회 수세하여 염농도를 1/2로 줄인 MS배지 (Murashige and Skoog, 1962)에 agar 8g/L, sucrose 30g/L를 첨가하여 파종하였다. 파종한 종자는 25℃, 습도 70% 의 생장상에서 7일간 암실 배양하며 발아를 유도하였다.

제 2단계 : 형질 전환된 아그로로박테리움 (pBIstsyv1/LBA4404)의 접종

완전히 전개되지 않고 종피가 붙어 있는 발아된 종자(배양 7일)의 자엽을 절단하고, 각 자엽의 위와 아래의 2면을 절단면의 산화 및 건조를 막기 위하여 BA 2.0mg/L, IBA 0.01mg/L, sucrose 30g/L, agar 8g/L 첨가하고 pH를 5.8로 조정한 액체 재생 배지가 20mL 들어 있는 MS배지 페트리디쉬에 보관하여 아그로박테리움 현탁액과의 접종을 준비하였다.

소독된 50mL 비이커에 YEP배지에서 배양된 아그로박테리움 현탁액

20mL와 준비된 자엽 절편체를 넣고 25±2℃에서 5분 동안 조심스럽게 흔들어 주었다. 이 때 절편체가 현탁액에 충분히 잠기도록 핀셋으로 한번씩 밀어 주었다. 접종이 끝난 후 자엽 절편체를 건열 소독된 여과지 (Whatman No. 2)에 살짝 올려놓아 여분의 아그로박테리움을 닦아주고 절편체가 마르지 않게 조금씩 꺼내어 항생제가 들어 있는 신초 재생용 배지에 치상하였다.

제 3단계 : 아그로박테리움 변형균주 (pBIstsyv1/LBA4404)가 접종된 형질전환 토마토 자엽 절편체의 공조 배양

상기 자엽 절편체 약 30여 개를 신초 재생용 배지가 들어 있는 100mL 삼각 플라스크에 넣어 25℃, 70%, 암상태에서 48시간 공조 배양하였다. 48시간 배양 후 자엽 절편체 주위에 과다 생장한 아그로박테리움을 제거하기 위하여 cefotaxime(Cx) 500mg/L이 포함된 신초 재생 액체 배지로 자엽 절편체를 5분 동안 2회 세척 한 후 다시 액체 배지로 1회 세척하였다. 건열 소독된 여과지로 수분을 제거한 후 항생제 (Km 100mg/L, Cx 200mg/L)가 첨가된 신초 재생 배지에 배축면이 배지에 닿도록 치상하여 25±2℃, 연속 조명 하에 배양하였다.

아그로박테리움에 접종하지 않은 자엽 절편체는 항생제가 첨가된 배지와 첨가하지 않은 배지에 넣어 형질 전환체 대조구로 사용하였다. 아그로박테리움에 접종하지 않고 항생제가 첨가되지 않은 배지의 자엽 절편체 절단면에서는 노랗고 딱딱한 캘러스와 하얗고 푸석한 캘러스가 형성되었으며, 노랗고 딱딱한 캘러스로부터 신초가 재생되어 배양 2주일 후에는 100% 재생되었다. 아그로박테리움에 접종하지않고 항생제가 첨가된 배지의 자엽 절편체는 절편체의 크기가 약간 커졌지만 하얗게 탈색되면서 고사되었다. 아그로박테리움과 접종한 자엽 절편체는 항생제가 첨가된 신초 재생 배지에서 1주일 후 절편체가 처음 크기에 비해 3배 이상 커지는 것을 관찰할 수 있었고, 2주 후에는 약간의 캘러스가 형성되었다. 약 3주 후에는 캘러스가 비대해지면서 신초가 재생되는 것을 관찰할 수 있었다. 신초가 재생되는 부위는 주로 절단면에서 이루어지는데 그 중에서도 엽병이 잘려진 부위가 높은 재생률을 나타냈다. 또한 절편체 치상에서 본 실험에서는 배축면이 배지에 닿도록 치상하는 것이 향축면이 배지에 닿는 것 보다 높은 재생률을 나타냈다. 이것으로 보아 향축면이 배지에 닿도록 치상하는 것보다는 배축면이 배지에 닿도록 치상하는 것이 좋을 것으로 보인다. 절편체의 배양 4주 후 형질 전환 효율은 31.7%, 절편체당 신초수 1.7개를 형성하였다. 토마토 형질 전환은 주로 24시간 전처리를 한 후 이용하는데 (Davis, 1991; Feary, 1995; Sedov 등, 1988) 본 실험에서는 전처리 과정 없이 대조구의 재생률이 100%에 이르렀으며, 30% 이상의 형질전환 효율을 얻을 수 있었다.

제 4단계 : 신초의 증식과 발근 및 활착

상기 재생된 신초 가운데 1.0cm 이상 신장한 정상적인 신초를 절취하여 BA 1mg/L, Km 100mg/L가 첨가된 신초 증식용 MS 배지에 넣어 4주마다 계대 배양하였다.

증식된 신초 가운데 1.0cm 이상 신장한 정상적인 신초를 절취하여 발근을 유도하였다. IBA 0.1mg/L, sucrose 30g/L, agar 8g/L를 첨가한 발근 유도용 MS 배지에서 2주간 배양하였다. 재생 신초의 발근은 100%의 발근율과 신초당 많은 뿌리를 얻을 수 있었다. 토마토는 내생 옥신을 많이 가지고 있어 발근 배지에 옥신을 첨가하지 않아도 쉽게 뿌리를 내린다고 하지만 (Cassells, 1979), 본 실험에서는 원활한 발근을 유도하기 위하여 발근 배지에 옥신을 첨가하여 보다 빠른 활착을 유도할 수 있었다.

발근된 소식물체는 배양 용기에서 꺼내어 아가(agar)를 흐르는 물로 수세한 후 살균제 (Iminoctadine Tris : Dimethomorph = 10 : 23% 혼합살균제, 동방아그로)의 700배 희석액에 순간 침지하였다가 건조시킨 후 고압살균된 인공토양 (vermiculite 1: perlite 1)이 들어 있는 분에 식재하였다. 그 후 배양시 Hyponex 1000배 희석액으로 저면관수 상태에서 용기를 밀봉하여 습도를 유지해 주었다. 6주 동안 용기의 밀봉을 서서히 열어 순화시켜 활착을 유도한 후, 활착된 식물체는 온실로 옮겨 꽃눈을 유도, 열매를 맺을 수 있었다.

실시예 3 : 형질전환된 토마토 DNA의 Genomic PCR 및 RT-PCR 분석과 형질전환된 토마토의 레스버라트롤 (Resveratrol) 추출 및 reverse phase-HPLC

상기 형질 전환된 토마토의 잎으로부터 실시예 2의 방법으로 genomic DNA를 추출하고 이를 주형으로 genomic PCR을 수행하였다. Genomic PCR을 통해 확인한 결과, 형질 전환된 신품종 토마토는 거봉 포도의 레스버라트롤 합성 유전자를 가지고 있었다. 또한, 형질 전환된 토마토의 각 조직 (잎, 과실)으로부터 total RNA를추출하고 상기 실시예 2의 방법으로 RT-PCR을 수행함으로써 조직별 유전자 발현 양상을 분석하였다. RT-PCR 확인 결과, 이 개체들은 성공적으로 거봉 포도의 상기 유전자를 발현시켰으며 개체별 발현양은 서로 달랐다 (도 4).

그리고 Siemann과 Creasy의 방법 (Siemann and Creasy, 1992)으로 레스버라트롤을 추출하였다. 약 1-5 g의 토마토 조직 (잎, 과실)을 3㎖ 에틸 아세테이트 (ethyl acetate)가 들어 있는 시험관에 넣고 15초간 보텍스 (vortex)한 다음, 4℃에 몇 분간 넣었다가 다시 -20℃에 두었다. 유기용매층을 파스퇴르 피펫 (Pasteur pipette)으로 분리하고 수용액층은 2㎖ 씩 두번 에틸 아세테이트로 재추출하여 유기용매층을 분리하였다. 무수황산나트륨 (Anhydrous sodium sulphate)을 넣어 완전히 탈수시킨 다음, 유기용매상을 Rotavapor를 이용하여 저압상태에서 농축시켰다. 추출물은 메탄올로 다시 녹인 다음 Celotti 등의 방법 (Celotti et al., 1996)을 이용하여 HPLC로 분석하였다. 컬럼 (Column)은 Partisphere C18, 5㎛ (125 ×4.6 mm I.D.)(Whatman)을 사용하고, mobile phase는 water/acetic acid/acetonitr-

ile(75:5:20)로 하였으며 fow 비율은 실험적으로 조절하였다. Standard로는 trans-resveratrol (Sigma R5010), catechin (SigmaC1251), epicatechin (Sigma E1753), rutin (Sigma R5143), quercetin (SigmaQ0125)를 사용하였다. 부위별 레스버라트롤 (resveratrol)함량을 분석한 결과, 잎과 과실에서 각각 0.1㎍/g , 0.15㎍/g 의 항암 물질이 생산됨을 확인할 수 있었다 (도 5).

이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이 본 발명은 상기 거봉 포도의 레스버라트롤 (resveratrol)유전자를 토마토에 도입하여 형질 전환시킴으로써 레스버라트롤 유전자 합성의 항암 물질을 대량으로 생산하는 항암 기능성 형질 전환 토마토의 제조에 뛰어난 효과가 있다. 또한 제조된 항암 기능 신품종 토마토는 토마토의 영양 성분은 그대로 둔 채 포도의 항암 물질만 특이적으로 섭취하게 하는 효과가 있고, 전 과실 발달 단계에 걸쳐 항암 성분을 안전하게 생산하므로 그 신품종 묘종이나 종자를 농가 또는 종묘 회사에 판매할 수 있고 식용, 토마토 쥬스, 케찹 또는 암환자를 위한 특수 건강 음료의 개발에 이용할 수 있으며 기능성 화장품을 개발할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 건강 음료, 식품, 화장품, 및 종자산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 거봉포도로부터 분리된 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 항암 기능성 레스버라트롤(resveratrol) 합성유전자를 포함하는 재조합 벡터 pBIstsyv1에 의해 형질전된 아그로박테리움 튜머페시언스 LBA4404/pBIstsyv1(KCCM-10284)를 토마토의 자엽절편체에 접종하여 형질전환시킴으로서 항암성 재조합 레스버라트롤을 합성함을 특징으로 하고 조직배양을 통해 재분화되거나 꺾꽂이에 의하여 무성번식되는 형질전환체 토마토.
5. 제 4항 기재의 항암 기능성 형질전환된 토마토에서 합성되는 항암기능성 재조합 레스버라트롤 합성물질.