KR100423072B1 - 거봉포도의 레스버라트롤 생합성 유전자를 이용하여 형질전환된 담배 독성 물질의 억제 기능이 있는 신품종 담배 - Google Patents

Abstract

본 발명은 거봉 포도의 레스버라트롤 (resveratrol) 생합성 유전자를 이용한담배 독성 성분의 작용을 감소시키는 형질 전환된 담배 신품종에 관한 것으로, 거봉 포도에서 추출한 RNA로부터 first strand cDNA를 제조하여 RT-PCR로 증폭시킨stsycDNA를 pBI 121 벡터에 삽입시킨 재조합 벡터 (pBIstsyv1)의 제조, 이 재조합 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium)-LBA4404 에 도입시켜 형질 전환 균주 pBIstsyv1/LBA4404를 생산하고 이를 담배 엽절편체에 도입함으로써 담배의 유해 독성 물질인 니코틴 (nicotine), 니트로사민 (nitrosamine)등의 독성 효과를 억제할 수 있는 형질 전환된 담배 신품종을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

거봉포도의 레스버라트롤 생합성 유전자를 이용하여 형질전환된 담배 독성 물질의 억제 기능이 있는 신품종 담배 { Novel tabacco restraining harmful materials of tabacco which is transformed by using resveratrol synthesis gene of Vitis vinifera X Vitis labrusca L. cv. Kyoho }

본 발명은 거봉 포도의 레스버라트롤 생합성 유전자를 이용하여 담배 유해 독성 성분의 작용을 억제시키는 형질 전환된 신품종 담배에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 항 스트레스 기능 및 항암 기능이 있는 것으로 알려진 거봉 포도(Vitis viniferaXVitis labruscaL. cv. Kyoho)의 레스버라트롤 생합성 유전자를 pBI 121 벡터에 삽입시켜 재조합 벡터 (pBIstsyv1)를 구축한 후 이 벡터를 다시 아그로박테리움(Agrobacterium)-LBA4404 균주에 도입하여 형질 전환시키고, 상기 변형 균주 (pBIstsyv1/LBA4404)를 담배의 엽절편체에 접종하여 담배 독성 성분의 작용을 중화시키는 기능의 형질 전환된 신품종 담배의 제조에 관한 것이다.

레스버라트롤 (resveratrol) 및 그 중합체인 비니페린 (viniferin)은 식물체에서 외부로부터 침입한 곰팡이의 성장을 억제하는 방어 물질인 피토알렉신 (phytoalexin)으로 알려져 왔다. 레스버라트롤 [혹은 유사 스틸벤 (stilbene)]은 극히 일부 식물에서만 생성되는데 지금까지 알려진 바로는 폴리고넘 커스피다툼 (Polygonun cuspidatum), 유칼립투스, 가문비나무 (spruce), 스코틀랜드 전나무 (Scottish pine), 포도, 땅콩 (Arachis hypogaea), 백합 (lilly) 등이 있다. 이들 식물에서 레스버라트롤은 스틸벤 합성에 의해 malony-CoA 와 p-coumaroyl-CoA 로부터 합성되며, 곰팡이, UV, 오존과 같은 외부 환경 스트레스로부터 그 합성이 유도된다고 보고되었다 (Schoeppner and Kindl H, 1979; Fliegmann et al., 1992; Fritzemeier et al., 1983; Vornam et al., 1988). 근래에는 이 물질의 생합성 기작 및 조절에 대해 분자 및 유전자 수준에서 다각적인 연구가 이루어졌다. 그 결과 소나무, 포도, 땅콩 등에서 이 물질의 생합성에 관여하는 유전자가 분리되었으며(Sparvoli et al., 1994; Preisig-Muller et al., 1999; Schubert et al., 1997), 유전자의 발현, 조절에 대한 많은 정보가 축적되어 유전자를 이용하기 위한 발판이 마련되었다.

한편 포도에서의 레스버라트롤에 관한 연구는 오래 전부터 시작되었으며, 이 화합물의 항 스트레스 작용은 잘 알려져 왔다 (Langcake et al., 1979). 기존에는 레스버라트롤의 항 스트레스 작용 및 스트레스 저항성을 이용한 합성 유전자를 특정 작물에 도입함으로써 항균, 항 세균, 항 바이러스, 항충 등 내병성 형질 전환체 작물을 개발하여 왔다 (Kindle et al., 1999; Hain et al., 1998; Schroder et al., 2000). 그러나 최근 포도주에서 전이 레스버라트롤 (trans-resveratrol)이 발견되고, 적절한 포도주 섭취가 관상동맥 심장병 [coronary heart disease (CHD)]에 의한 사망율을 낮춘다는 역학적인 보고가 나온 이후, 레스버라트롤의 약리 효과에 대해 많은 실험 결과가 발표되기 시작하였다 (Siemann and Creasy, 1992). 특히 적포도주 섭취로 혈액 내 항산화 활성이 증가하고 이로 인해 산화성 LDL의 생성이 억제된다는 보고들이 주목을 받았다 (Maxwell et al., 1994; Fuhrman et al., 1995). 가장 최근에는 이 물질의 항 돌연변이 및 항암 작용에 대한 연구 결과가 많이 보고되었다 (Carbo et al., 1999; Clement et al., 1998; Huang et al., 1999).

담배에는 폐암을 비롯하여 동맥경화, 심근 경색, 협심증, 뇌경색, 폐기종, 만성 기관지염, 천식, 위궤양, 시력 장해 등 많은 질병을 일으키거나 악화시키는 수천 가지 화학 물질이 포함되어 있으며 적어도 200 여 가지 이상의 물질이 인체에 유해 작용이 있다고 한다. 이 중 담배의 해로운 작용은 담배 연기 중에 함유된 니코틴 (nicotine), 나이트로사민 (nitrosamine), 벤조프렌 (benzypyrene) 등과 같은 발암물질을 비롯한 독성 물질 때문이다. 니코틴은 자율 신경계를 통해서 지방질 대사에 영향을 미치며, 혈중 HDL을 저하시켜 동맥벽에 콜레스테롤의 침착을 촉진시키므로 동맥경화의 원인이 된다. 또한 니코틴은 혈액 응고시 혈소판 응집 능력을 증대시켜 혈액이 응고되기 쉽게 한다. 따라서 흡연자들은 혈관 내 혈전이 생기기 쉬우며, 심근 경색을 일으키기 쉽다. 담배 내 유해 물질에 의한 발암 기작에 대해서는 확실히 밝혀져 있지는 않으나, 일반적으로 흡연시 몸 속의 비타민 C 및 β-카로틴이 부족하게 되고, 이로 인해 몸 속에 산소의 프리 라디칼 (free-radical, 유리기) 등 유독 성분이 축적되기 때문이라는 가설이 유력하다. 산소 유리기는 인체 내에서 지방질이 산화될 때 생성되고, 특히 세포막을 구성하고 있는 불포화 지방산을 계속 산화시키면서 생성된다. 이 유리기는 세포 내 DNA에 손상을 입히고 그 결과 암세포가 발생한다. 최근 비타민 A, C, E, β-카로틴 등이 암 발생율을 감소시키는데 효과적이라는 보고가 나왔는데, 이는 이들 물질이 항산화 작용을 하기 때문으로 알려졌다. 실제로 항산화 효과가 있는 녹차 추출액에 의해 니코틴에 의한 폐암 발생율이 감소하는 실험 보고가 있었다. 또한 이외에도 물리, 화학적인 방법을 통해 담배의 유독 물질을 제거하려는 시도가 있었다. 국내 최초로 개발된 유전자 변환을 통한 형질 전환 담배는 한국인삼연초연구원에 의해 개발된 TMV, PVY 저항성 담배이다. 그러나 담배의 유해 독성 성분을 유전자 변환을 통해 억제 및 감소시킨 담배 신품종은 개발된 적이 없는 실정이다.

본 발명은 상기 사실들을 토대로 항 돌연변이 및 항암 기능의 거봉 포도 레스버라트롤 생합성 유전자를 추출한 후 담배에 도입시킴으로써 담배의 유해 독성 물질을 중화시키고 그 효과를 현저히 감소시키는 형질 전환된 신품종 담배를 생산하기 위해 실시되었다.

본 발명은 지난 5년간의 연구 기간 동안 개발된 유전자 클로닝 (cloning) 기술, 식물 형질 전환 기술 등을 바탕으로 제조가 완료된 항암 및 항산화 효과가 뛰어난 형질 전환 담배 신품종이라는 점에서 그 효과가 뛰어나다. 또한 본 발명은 품종 개량에 사용한 유전자가 원래 항균, 항 바이러스 기능을 가지고 있어서, 실제로 담배 재배시 당면하는 여러 가지 병해충에 의한 피해를 감소시키는 효과가 있으므로 보다 양질의 담배를 대량으로 수확하는 데 적용 가능한 뛰어난 효과가 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기의 사실들을 감안하여 거봉 포도의 레스버라트롤 (resveratrol) 생합성 유전자를 벡터에 삽입시킴으로써 제조된 재조합 벡터(pBIstsyv1)을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움(Agrbacterium)-LBA4404 균주에 도입해 형질 전환시킨 아그로박테리움 변형 균주 (pBIstsyv1/LBA4404)를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 담배에 접종함으로써 담배 독성 성분의 작용을 중화시키는 형질 전환된 신품종 담배를 생산하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 거봉 포도(Vitis viniferaXVitis labruscaL. cv. Kyoho)의 각 성장 단계의 기관 및 조직 (잎, 과피, 과육, 꽃)으로부터 추출한total RNA로부터 first strand cDNA를 합성하고 이를 프라이머를 이용해 PCR 증폭하여stsycDNA를 구축한 후 제한 효소로 open reading frame 및 일부 untranslated region 을 잘라내어 GUS 유전자가 제거된 pBI 121 벡터의 CaMV 프로모터 뒤에 삽입시켜 재조합 백터 (pBIstsyv1)를 제조하고, 배양한 아그로박테리움(Agrobacterium)-LBA4404 에 상기 재조합 벡터를 도입시켜 형질 전환 균주를 제조한 뒤, 담배(Nicotiana tabacumL. Wisconsin 38 혹은Nicotiana tabacumL. Xanthi)의 엽절편체를 상기 아그로박테리움 변형 균주의 현탁액에 접종하여 형질전환시킨 후 항생제가 들어 있는 배지에 치상하고, 그로부터 생장한 신초를 증식, 발근, 활착시켜 담배의 유해 독성 물질의 작용을 감소시키는 형질전환된 신품종 담배를 생산함으로써 달성되었다.

도 1은 거봉 포도(Vitis viniferaXVitis labruscaL. cv. Kyoho)의 스틸벤 합성 효소 (stilbene synthase) cDNA 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

도 2는 본 발명의 해독 물질 합성 유전자 및 형질 전환용 유전자를 운반하는 재조합 벡터 (pBIstsyv1)의 모식도이다.

도 3은 담배 야생종 및 도 1의 유전자가 도입된 본 발명 신품종 담배 형질전환체이다.

도 4는 본 발명 형질 전환 신품종 담배의 해독 물질 유전자 발현 과정을 확인한 RT-PCR 결과이다.

도 5는 본 발명 형질 전환 신품종 담배의 해독 물질 성분의 생성량을 HPLC으로 분석한 결과이다.

본 발명은 거봉포도(Vitis viniferaXVitis labruscaL.cv.Kyoho)의 레스버라트롤 생합성 유전자를 PCR 증폭하여 pBI 121 벡터에 삽입시켜 재조합 벡터 를 제조하는 단계 ; 배지에서 배양시킨 아그로박테리움(Agrobacterium)-LBA4404을 형질전환용 균주로 선택하여 레스버라트롤 생합성 유전자가 삽입된 상기 재조합 벡터를 도입시키는 단계 ; 공시 재료인 담배(Nicotiana tabacumL. Wisconsin 38 혹은Nicotiana tabacumL. Xanthi)의 엽절편체를 상기 아그로박테리움 변형 균주에 접종하여 형질 전환시키는 단계 ; 형질 전환된 엽절편체를 항생제가 첨가된 배지 위에 치상하여 신초를 증식시키고 발근, 활착시켜 담배의 독성 성분 작용을 감소시키는 형질 전환된 신품종 담배를 생산하는 단계 ; 신품종 담배의 genomic DNA를 추출한 후 genomic PCR을 수행하고, 형질전환된 신품종 담배의 잎으로부터 total RNA를 추출한 후 RT-PCR을 수행하여 레스버라트롤 유전자 도입 및 발현 여부를 확인하는 단계 ; 형질 전환된 담배의 레스버라트롤을 추출한 후 HPLC 분석하여 상기 형질 전환된 담배의 레스버라트롤 함량을 분석하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리 범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 거봉 포도 ( Vitis vinifera X Vitis labrusca L. cv. Kyoho)의 레스버라트롤 유전자가 삽입된 재조합 벡터 및 상기 벡터를 도입시킨 형질 전환된 아그로박테리움 (Agrobacterium) 균주의 제조

제 1단계 : 형질전환된 신품종 담배 생산을 위한 거봉포도 ( Vitis vinifera X Vitis labrusca L. cv. Kyoho) 각 기관 및 조직의 RNA 및 genomic DNA 추출

거봉포도 (Vitis viniferaXVitis labruscaL. cv. Kyoho) 과실을 개화 후 일주일 간격으로 15주간 수확한 후 과실 발달 단계를 규명하기 위해 매주 수확된 포도 알 중 5 개를 무작위로 선정해서 길이, 너비, 및 무게를 측정하였다. 수확한 포도 과실의 과피와 과육을 분리하여 각각 액체 질소로 급냉시킨 뒤 -80℃에서 보관하였다.

다양한 발달 단계에 있는 상기 거봉 포도의 각 기관 및 조직 (과피, 과육,잎, 꽃)으로부터 RNA를 추출하였다. 개화 후 각각 2, 3, 8, 10, 13, 15 주되는 포도 과실 및 각 기관으로부터 조직의 일부를 떼어 얼려서 커피 분쇄기 (coffee grinder)로 마쇄한 후, 가루를 RNA 추출 용액 (0.3 M Tris-HCl, pH 8.3, 2% PEG 4000, 5M sodium perchlorate, 1% SDS, 8.5% insoluble PVPP, 1% β-mercaptoethanol)과 섞은 다음 유리 섬유 (glass wool)로 채워진 (packing) 주사기 속에 넣고 200 ×g에서 15 분간 원심분리시켰다. 추출액은 모아 2.5 volume 에탄올로 침전시키고 펠렛 (pellet)은 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 1 mM EDTA, 0.2% β-mercaptoethanol에 녹여 페놀-클로로포름 추출 (Phenol/chloroform extraction)을 한 다음 상층액을 회수하여 0.1 volume의 3 M sodium acetate와 2.5 volume의 에탄올을 넣어 RNA를 침전시키고 다시 원심분리하여, 펠렛은 DEPC (diethylpyrocarbonate) 처리 증류수에 녹였다. 필요한 경우 PolyA-Tract mRNA Isolation System III (Promega)를 사용하여 mRNA를 추출하였고, total RNA 등 RNA 시료는 UV 분광광도계 (Spectrophotometer)와 RNA 겔 (gel)을 사용하여 그 질을 측정하였다.

다음으로 genomic DNA의 추출을 위하여 어린 잎 조직 2 g을 액체 질소를 이용해 마쇄한 뒤 25 ㎖의 버퍼 A [0.25 M NaCl; 0.2 M Tris, pH 8.0; 2.5% PVP (MW 40,000); 50 mM EDTA; 0.1% β-mercaptoethanol, pH 7.6]를 넣고 혼탁시켜 5,000 rpm에서 10 분간 원심분리를 한 뒤, 펠렛에 5 ㎖의 추출용 버퍼 (extraction buffer B [0.5 M NaCl; 0.2 M Tris, pH 8.0; 2.5% PVP; 50 mM EDTA; 3% sarkosyl; 20% ethanol; 1% β-mercaptoethanol])를 넣고 37℃에서 30 분 동안 흔들어 주었다. 동량의 chloroform:isoamylalcohol (24:1, v/v)를 넣고 잘 섞은 뒤, 12,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리를 하고, 상층액을 다시 0.54 volume 이소프로판올 (isopropanol)로 침전시켰다. 펠렛을 증류수에 녹인 후 RNase (0.1 ㎎/㎖)를 넣어 37℃에서 30 분간 정치시키고, RNase를 포함한 단백질은 0.5 volume의 7.5 M 암모늄 아세테이트 (ammonium acetate)를 넣고 침전시킴으로써 제거하였다. 상층액을 0.54 volume의 이소프로판올로 처리하여 DNA를 회수하였다.

제 2단계 : 프라이머를 이용한 cDNA의 RT-PCR 증폭

각 기관 및 조직에서 분리한 total RNA로부터, First-strand cDNA synthesis kit (Pharmacia)를 사용하여 first strand cDNA를 합성하고, 이를 PCR의 주형 (template)으로 사용하였다. 이미 보고된 Shiraz 포도의 스틸벤 합성 (stilbene synthase) cDNA (Sparvoli et al., 1994; Melchior and Kindl, 1990)의 염기서열을 분석하여 open reading frame 의 시작 및 끝 부위로부터 PCR 프라이머 (primer)를 구상하여 제조하고 그 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다.

first strand cDNA의 PCR증폭을 위한 프라이머

HPPN : 5'ATGGCTTCAGTCGAGGAAATT 3' (21mer)

HPPC : 5'TTAATTTGTCACCATAGGAATG 3' (22mer)

일반적인 PCR 방법 (Sambrook et al., 1989)으로, 94℃에서 30 초, 55℃에서 1 분, 그리고 72℃에서 1 분간, 30 주기 (cycle)을 반복하였다. PCR 생성물 (product)을 겔 (gel)에서 확인하였다.

제 3단계 : 상기 cDNA의 염기 서열 작성 및 분석

RT-PCR 증폭하여 얻어진 상기 cDNA 염기서열은 삭제 목록 (deletion series)을 확보하거나 상기 cDNA를 pCR2.1-TOPO cloning vector (invitrogen)로 여러 번 서브클로닝 (subcloning)한 후 Sequenase Kit (Version2.0; USB)를 사용하여 디데옥시 종결 (dideoxy termination) 방법으로 (Sanger et al., 1977) 결정한 후 아미노산으로 해독하고, 이전에 밝혀진 스틸벤 합성 (stilbene synthase) 유전자와의 유사성을 분석하였다 (도 1). 그 결과 Shiraz 포도의 스틸벤 합성 cDNA의 염기서열과 99% 이상 동일함을 알 수 있었다. 또한 이 cDNA를 genomic Soutern 혼성화반응을 위한 프로브 (probe)로 사용하였다. 이때 분석용 프로그램으로는 DNASIS/PROSI-

S, PCGENE, Clustal V, Blast search 등을 사용하였다.

제 4단계 : 형질전환용 균주 아그로박테리움 ( Agrobacterium) 의 배양

형질전환용 균주로 아그로박테리움 (Agrobacterium)-LBA4404를 선택하여, rifampicin 100mg/L, kanamycin(Km) 100mg/L, agar 15g/L가 첨가된 YEP(An, 1987) 고형배지 페트리디쉬에 아그로박테리움을 스트리킹 (streaking)하여 28℃에서 2-3일 배양하였다. 왕성하게 생장하고 있는 아그로박테리움 콜로니 (colony)를 취하여 Km 100mg/L가 첨가된 YEP 액체배지 3mL에 접종하여 28℃에서 8시간동안 200-250rpm으로 진탕 배양하였다. 진탕 배양한 아그로박테리움 현탁액 1mL를 Km 100 mg/L가 첨가된 50mL YEP 액체배지에 접종하여 상기한 조건으로 16시간 동안 배양하였다. 배양을 마친 아그로박테리움 현탁액은 OD (optimum density) 값이 0.8-1.0 되도록 조절한 후 담배의 형질 전환에 이용하였다.

제 5단계 : 형질 전환을 위한 stsy cDNA를 삽입시킨 재조합 벡터 pBIstsyv1 의 제조

RT-PCR에 의해 얻은stsycDNA 클론의 open reading frame 부위 및 일부 untranslated region 을 제한효소를 사용하여 잘라 내고 이를 다시 GUS 유전자가 제거된 pBI 121 벡터의 CaMV 35S 프로모터 (promoter) 뒤에 삽입시켜 재조합 벡터 pBIstsyv1을 제조하였다. (도 2). 이 재조합 벡터를 상기 4단계의 아그로박테리움에 도입시켜 형질전환 균주 pBIstsyv1/LBA4404를 제조하였다.

상기 형질전환 균주 아그로박테리움 튜머페시언스 pBIstsyv1/LBA4404 국제 미생물 기탁기관인 한국종균협회에 2001년 6월 18일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM 10284).

실시예 2 : 형질전환된 아그로박테리움 (Agrobacteri um)의 접종 및 담배의 조직배양에 의한 식물체 재분화

제 1단계 : 형질전환된 아그로박테리움 변형 균주의 접종

기내에서 육성한 담배(Nicotiana tabacumL. Wisconsin 38 혹은Nicotiana tabacumL. Xanthi)를 재료로 선택하여 그 잎을 절단한 뒤 절단면의 산화 및 건조를 막기 위하여 MS배지에 BA 2.0mg/L, IBA 0.01mg/L, sucrose 30g/L, agar 8g/L 첨가하고 pH를 5.8로 조정한 액체 배지가 20mL 들어 있는 페트리디쉬에 보관하여 아그로박테리움 현탁액과의 접종을 준비한 후 페트리디쉬에 YEP배지에서 배양된 아그로박테리움 현탁액을 20mL 넣고 준비된 자엽 절편체를 넣어 현탁액에 충분히 잠기도록 하여 25±2℃에서 5분 동안 조심스럽게 흔들어 주었다.

접종이 끝난 후 절편체를 건열 소독된 여과지 (Whatman No. 2)에 올려놓아 여분의 아그로박테리움을 닦아 준 다음, 절편체가 마르지 않게 조금씩 꺼내어 항생제 (Km 300mg/L, Carbenicillin 500 mg/L)가 들어있는 캘러스 유도배지에 치상하였다. 25±2℃, 연속조명하에 2주마다 계대배양하면서 캘러스로부터 신초 (shoot)가 유도될 때까지 배양하였다. 항생제가 첨가된 캘러스 유도배지에 치상한 날로부터 2주 후부터 아그로박테리움 변형 균주와 접종한 엽절편체에서 캘러스가 형성되기 시작하였고 약 3주 후에는 캘러스가 비대해지면서 신초가 재생되었다.

제 2단계 : 재생된 형질전환 신초의 발근 및 활착

재생된 신초 가운데 2.0cm 이상 신장한 것을 절취하여 신초 유도배지에서 계대 배양하여 신장과 증식 과정을 거친 후 발근을 유도하였다. MS배지에 Kanamycin 50 - 100 mg/L, carbenicillin 150 - 300 mg/L, α-naphthaleneacetic acid 0.5 g/L, sucrose 30g/L, agar 8g/L 첨가한 발근 유도배지에 2-4주간 배양하였다. 발근된 소식물체는 배양 용기에서 꺼내어 아가 (agar)를 흐르는 물로 수세한 후 살균제 (Iminoctadine Tris : Dimethomorph = 10 : 23% 혼합살균제, 동방아그로) 700배희석액에 순간 침지하였다가 건조시킨 후 고압 살균된 인공 토양 (vermiculite)이 들어 있는 분에 식재하였다. 배양시 Hyponex 1000배 희석액으로 저면관수 상태에서 6주간 용기를 밀봉하여 습도를 유지해 주고 용기의 밀봉을 서서히 열어 순화시켜 활착을 유도하였으며, 활착된 식물체는 온실로 옮겼다.

실시예 3 : 형질 전환 담배로부터 추출한 total RNA 및 genomic DNA의 RT-PCR 및 genomic PCR과 레스버라트롤 (resveratrol) 합성물질의 reverse phase HPLC

형질전환된 신품종 담배의 잎으로부터 상기 실시예 2의 방법을 이용하여 genomic DNA를 추출하고 이를 주형으로 사용하여 genomic PCR을 수행하였다. 거봉 포도의stsy유전자가 담배 형질전환체 내에 도입되었는지의 여부를 genomic PCR로 확인한 결과, 형질전환된 신품종 담배는 거봉 포도의 레스버라트롤 합성 유전자를 가지고 있었다. 또한 담배 야생 타입 및 형질전환 신품종 담배의 잎으로부터 total RNA를 추출하고 상기 실시예 2의 방법으로 RT-PCR을 수행함으로써 조직별 유전자 발현 양상을 분석한 결과, 이 담배 형질전환체들은 성공적으로 상기 거봉 포도 유전자를 발현시켰으며, 개체별 발현양은 서로 달랐다 (도 4).

Siemann과 Creasy 방법 (Siemann and Creasy, 1992)으로 레스버라트롤을 추출하였다. 약 1-5 g의 담배 잎을 3㎖ 에틸 아세테이트 (ethyl acetate)가 들어있는 시험관 (test tube)에 넣고 15초간 보텍스 (vortex)한 다음, 4℃에 몇 분간 넣었다가 다시 -20℃에 두었다. 유기 용매층을 파스퇴르 피펫 (Pasteur pipette)으로 분리하고 수용액층은 2㎖ 씩 두 번 에틸 아세테이트 (ethyl acetate)로 재추출하여유기용매층을 분리하였다. 무수황산나트륨 (Anhydrous sodium sulphate)을 넣어 완전히 탈수시킨 다음 유기용매상을 Rotavapor를 이용하여 저압 상태에서 농축시켰다. 추출물은 메탄올 (methanol)로 다시 녹여 Celotti 등의 방법 (Celotti et al., 1996)을 이용하여 HPLC로 분석하였다. 컬럼은 Partisphere C18, 5㎛ (125 ×4.6× mm I.D.) (Whatman)을 사용하고, mobile phase는 water/acetic acid/acetonitrile (75:5:20)로 하였다. 그리고 fow rate는 실험적으로 조절한다. Standard로는 trans-resveratrol (Sigma R5010), catechin (Sigma C1251), epicatechin (Sigma E1753), rutin (Sigma R5143), quercetin (Sigma Q0125)를 사용하였다.

담배 야생 타입 및 형질전환체의 잎으로부터 에틸 아세테이트에 용해되는 물질을 추출하고 이를 박막크로마토그라피 상에서 분획한 후 활성부위를 메탄올로 재추출하고 C18컬럼을 사용하여 HPLC로 레스버라트롤 함량을 분석한 결과, 0.5㎍/g 중량의 항암 물질이 생산됨을 확인할 수 있었다 (도 5).

이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이 본 발명은 강력한 항 돌연변이, 항산화, 항암 기능의 상기 거봉 포도 레스버라트롤 (resveratrol) 유전자를 담배에 도입하여 형질전환시킴으로써 담배 독성 물질 작용을 억제시키는 기능이 있는 형질전환된 신품종 담배를 제공하는 효과가 있다. 또한, 품종 개발에 사용한 유전자가 원래 항균, 항 바이러스 기능을 가지고 있어서, 담배 재배시 병해충에 의한 피해를 감소시켜 양질의 담배를 대량으로 생산할 수 있고, 담배의 유해 독성 성분의 작용을 완화시켜 흡연에 따른 폐암 발생을 억제 할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 국민 건강 증진과 종자 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (4)

1. 거봉 포도 (Vitis viniferaXVitis labruscaL. cv. Kyoho)로부터 분리된 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 항암 기능성 레스버라트롤 (resveratrol) 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pBIstsyv1에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페시언스 LBA4404/pBIstsyv1(KCCM-10284)를 담배 자엽절편체에 접종하여 형질전환시킴으로서, 항암성 재조합 레스버라트롤을 합성하여 담배의 유해 독성물질의 작용을 억제시킴을 특징으로 하고 조직배양을 통해 재분화되는 형질전환체 담배.
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