KR100419553B1 - 신규의 스트렙토마이세스 아버미틸리스 변이주 및 아버멕틴의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아버멕틴(Avermectin) 생산에 유용한 신규의 스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis) 변이주 및 이를 이용한 아버벡틴의 제조방법에 관한 것이다.

Description

신규의 스트렙토마이세스 아버미틸리스 변이주 및 아버멕틴의 제조방법{A novel Streptomyces avermitilis mutant and a culture process therewith}

본 발명은 아버멕틴(Avermectin) 생산에 유용한 신규의 스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis) 변이주 및 이를 이용한 아버벡틴의 제조방법에 관한 것이다.

아버멕틴은 가축 및 가금류에 심한 경제적 손실을 야기시키는 선충류를 포함한 내부 기생충에 광범위한 구충효과를 갖는 약물로서, 항세균, 항진균 활성은 거의 없으나 광범위한 구충효과로 살충제 및 살비제로 유용하다. 최근에는 농약으로의 사용량이 급증하고 있으며 사람을 대상으로 한 열대병 치료에도 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.

한편, 아버멕틴은 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 세포내에 존재하는 2차 대사산물로서 8종류 서브타입의 혼합물로 생합성된다. 즉, A1, A2, B1, 및 B2 4종의 주요성분이 각각 a 및 b로 구분되는 8종류의 서브타입의 혼합물 형태로 얻어진다. (화학식 1 및 표1 참조)

아버멕틴	R1	R2	X-Y
A1a	CH3	C2H5	CH=CH
A1b	CH3	CH3	CH=CH
A2a	CH3	C2H5	CH2-CH(OH)
A2b	CH3	CH3	CH2-CH(OH)
B1a	H	C2H5	CH=CH
B1b	H	CH3	CH=CH
B2a	H	C2H5	CH2-CH(OH)
B2b	H	CH3	CH2-CH(OH)

상기 8 종류의 아버멕틴 중 생물학적 효과면에서 가장 유효한 것은 아버멕틴 B1a이며, 동물용 구충제로서의 아버멕틴은 아버멕틴 B1a와 상대적으로 소량인 B1b로 구성된다.

아버멕틴은 스트렙토마이세스 아버미틸리스 ATCC31267, 31271, 31272과 이들 균주에서 유래된 변이주의 배양액에서 얻어지는 것으로 알려져 있으며, 이 균주가 생산하는 아버멕틴은 약 90% 이상이 a 성분들 즉, A1a, A2a, B1a 및 B2a이다(미국특허 제 4,310,519호 및 제 4,429,042호).

상기의 아버멕틴 생산규주 중 스트렙토마이세스 아버미틸리스 ATCC31271의 아버멕틴 생산량은 485mg/L이고 유효성분인 아버멕틴 B1은 170mg/L이며 성분비는 35%로 보고된 바 있다(R.W.Burg 등, 1979.Antimicrob. Agents Chemother. 15:361-367).

스트렙토마이세스 아버미틸리스의 변이주로는 아버멕틴 모핵만을 생성하는 균주, A2와 B2 성분을 생성하는 균주, B 성분을 생성하는 균주, a 성분(A1a, A2a,B1a, 및 B2a)을 생성하는 균주 등이 개발된 바 있다(Ikeda 등, 1995. Control of Avermectin Biosynthesis in Streptomyces avermitilis for Selective Production of a useful Component.J. Antibiot. 48: 549-562). 현재까지 보고된 전체 아버멕틴의 생산량은 2,300mg/L수준이 최고이고 이때 B1의 성분비는 48.5-50% 이다(WO 98/56939). 유효성분인 B1a의 생산성은 780 mg/L가 최고 수준으로 성분비는 39 %이다(Zhinan Xu 등. 1999.Biotechnology Letters. 21: 91-95).

그러나, 상기한 종래의 균주들은 B1의 성분비가 높을 경우에는 전체 아버멕틴의 생산량이 적고, 아버멕틴의 서브타입중 아버멕틴 B1a의 성분비가 높은 경우에는 아버멕틴 B1a 생산량이 적은 한계를 보이고 있다.

이에 본 발명자들은 배양액 중 아버멕틴의 생산량이 많고 유효성분인 아버멕틴 B1a 성분 비율이 높은 특성을 동시에 갖는 아버멕틴을 생산하는 균주를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 놀랍게도 특정의 스트렙토마이세스 아버미틸리스 변이주를 본 발명의 방법에 따라 배양하였을 때, 상기의 목적을 동시에 얻을 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 아버멕틴을 생산하는 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 변이주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 변이주를 배양하여 그 배양액으로부터 아버멕틴을 제조하는 방법을제공하는 것을 포함한다.

도1 은 모균주 및 본 발명에 따른 변이주를 배양한 후 생성된 아버멕틴을 실리카겔 박막 크로마토그래피법으로 분석한 결과이다.

열 1. 본 발명에 따른 변이주의 추출액

열 2. 모균주의 추출액,

열 3. 올리고마이신 표준액,

열 4. 아버멕틴 표준품

도2는 본 발명에 따른 변이주를 배양하여 생성된 아버멕틴을 고속 액체 크로마토그래피 법으로 분석한 결과이다.

도3은 본 발명에 따른 변이주의 배양시간에 따른 균의 생육 및 아버멕틴 B1a 의 생산성을 나타내는 도면이다.

-○- 균체의 생육

-●- 아버멕틴 B1a 생성 양

본 발명은 아버멕틴을 생산하는 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 변이주를 제공한다. 본 발명에 따른 변이주는 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) ATCC 31271로부터 돌연변이된 것으로, 이는 1999년 9월 28일자로 생명공학연구소 유전자원센터 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁번호 KCTC 0662BP로 기탁되었다. 따라서 본 발명에 따른 변이주는 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP 이다.

상기 본 발명에 따른 변이주는 배양시 그 배양액중 아버멕틴 B1a가 40중량% 이상이고 아버멕틴 B1b가 5중량% 이하인 특성을 가지고 있다.

본 발명자들은 고역가의 아버멕틴 생산 변이주를 얻기 위하여 다양한 스트렙토마이세스 아버미틸리스 균주를 모균주로 하여 UV 조사, NTG 처리, 원형질체 융합 등의 과정을 통하여 수많은 변이주를 분리한 결과, 놀랍게도 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) ATCC 31271로부터 돌연변이된 변이주가 생성되는 전체 아버멕틴 서브타입중 아버멕틴 B1a 성분 비율이 40% 이상인 고역가의 아버멕틴을 생산한다는 것을 발견하였다. 이는 선행기술에 전혀 개시되거나 암시되지 아니한 것이다.

본 발명에 따른 신규의 스트렙토마이세스 아버미틸리스 변이주 (KCTC0662BP) 및 모균주인 공지의 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (ATCC 31271)의 형태적, 배양적, 생리학적, 및 화학분류학적 특성은 다음 표2와 같다.

배지	생장정도	균체색	포자색
	ATCC31271	KCTC0662BP	ATCC31271	KCTC0662BP	ATCC31271	KCTC0662BP
ISP2	+++	++	흰색	흰색	회색	포자없음
ISP3	+++	++	흰색	흰색	회색	회색
ISP4	+++	++	흰색	흰색	포자없음	회색
ISP5	+++	++	베이지	베이지	포자없음	포자없음
ISP6	+	+	흰색	노랑	포자없음	포자없음
ISP7	+	+	흰색	흰색	회색	포자없음
베네트한천	+++	++	흰색	흰색	흰색	포자없음
자펙한천	+	+	흰색	흰색	포자없음	포자없음
영양한천	++	+++	베이지	노랑	포자없음	포자없음

형태적 특성

본 발명에 따른 변이주는 모균주(ATCC 31271)와 달리 ISP6 배지와 영양한천 배지에서 노랑색 균체를 만드는 특징을 가지고 있으며, ISP3배지에서 모균주와 같은 주름진 균체를 만들지 않는다. 본 발명의 변이주 및 모균주는 포자색에서 차이가 있다. 또한, 모균주는 ISP 2 및 7 배지에서 회색의 포자를 형성하지만, 본 발명의 변이주는 포자를 형성하지 않는다. 그리고, 모균주는 ISP4 배지에서 포자를 형성하지 못했지만, 본 발명의 변이주는 회색의 포자를 형성하는 특징이 있다.

배양적 특성

본 발명에 따른 변이주 및 모균주의 성장 온도는 동일하게 28 ℃와 37℃에서 성장하지만 50℃에서는 성장하지 못한다. 또한 본 발명의 변이주는 모균주에 비하여 다양한 한천배지에서의 생육이 늦으며, 영양한천배지에서의 생육은 모균주보다 빠른 특징을 가지고 있다.

본 발명의 변이주와 모균주는 포자색에서 차이가 있다. 모균주는 ISP 2, 3, 7 배지에서 회색의 포자를 생성하지만, 본 발명의 변이주는 흰색의 포자를 생성한다. 그리고 모균주는 ISP 4, 5, 6 배지와 자펙 한천 배지(Czapeck solution agar)에서 포자를 형성하지 못했지만, 본 발명의 변이주는 흰색의 포자를 형성하는 특징이 있다.

생리학적 특성

본 발명에 따른 변이주와 모균주는 멜라닌 유사색소의 생성면에서 차이가 있다. 모균주는 ISP 6 배지에서 검정색의 색소를 생성하지만, 본 발명의 변이주는 색소를 생성하지 않는 특징이 있다. 또한, 본 발명의 변이주와 모균주의 탄소원 이용성에 관한 특성은 다음 표3과 같다.

	ATCC 31271	KCTC 0662BP
포도당	++	++
과당	++	+/-
유당	+++	+
맥아당	+++	+
자당	+	+
전분	+++	+

탄소원에 따른 두 균주의 성장 정도에 있어서, 모균주는 최소 한천 배지에 유당, 맥아당, 전분을 탄소원으로 공급한 경우 성장이 매우 우수하고, 자당을 탄소원으로 공급하면 성장이 활발하지 못하다. 그러나, 본 발명의 변이주는 탄소원이 포도당인 경우 모균주와 유사한 정도의 성장을 하고, 특이하게 과당을 탄소원으로 공급한 경우 거의 성장을 하지 못한다.

본 발명의 변이주와 모균주의 생화학적 특성은 다음 표4와 같다.

	ATCC 31271	KCTC 0662BP
전분 가수분해	++	+++
카제인 가수분해	+	++
질산염 환원	-	-
황화철 생성	+	-

본 발명의 변이주는 전분과 카세인의 분해 능력에서 모균주보다 우수하다. 이는 아밀라제와 단백질 가수분해 효소의 차이를 나타내는 것으로 본 발명의 변이주가 모균주보다 고분자물질의 가수분해 능력이 우수함을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 변이주는 모균주와 달리 황화철 생성능력이 없다.

화학분류학적 특성

본 발명에 따른 변이주는 세포에 디아미노피메린산이 존재하며, 모균주와 동일하게 LL-형의 디아미노피메린산을 갖는다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 신규의 스트렙토마이세스 아버미틸리스 변이주 (KCTC 0662BP)는 형태적, 배양적, 생리학적, 및 화학분류학적 특성 등에서 모균주인 공지의 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (ATCC 31271)와 전혀 상이한 균주임을 알 수 있으며, 특히 아버멕틴 B1a 성분 비율이 높은 고역가의 아버멕틴을 생산할 수 있다는 측면에서 공지의 균주와 전혀 상이한 균주이다.

본 발명은 또한 상기한 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP를 배양하여 그 배양액으로부터 아버멕틴을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법에서의 배양방법은 다음과 같다.

즉, 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP를 포자생성용 한천배지에 접종하여 10-15일간 배양하고, 생성된 포자를 종균배양용 배지에서 2-3일 배양한 다음, 아버멕틴 생성용 배지에 종균배양액을 접종한다.

아버멕틴 생성용 배지는 공지의 아버멕틴 생산에 사용되는 배지를 사용할 수 있다 (미국특허 제제4,310,519호 및 제4,429,042호). 즉, 탄소원으로서 포도당, 과당, 맥아당, 설탕, 가용성 녹말, 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 질소원으로서 대두분, 면실분, 효모추출물, 펩톤화된 우유, 낙화생분, 육즙 추출물 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 이 외에 인산칼륨, 황산아연, 황산마그네슘, 황산철, 염화코발트 등의 무기산염과 대두유, 면실유, 채종유 등을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 고역가 아버멕틴의 제조에 있어서, 아버멕틴 생성용 배지는 비타민 B1 (thiamine) 을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 제조방법에 따라

제조된 아버멕틴은 목적 생성물인 아버멕틴 B1a의 생성비율이 다른 아버멕틴서브타입들보다 높지만, 이와함께 정제공정에서 쉽게 제거되기 어려운 B1b 성분의 생성량도 증가할 수 있다. 따라서, 비타민 B1 이 포함된 아버멕틴 생성용 배지를 사용할 경우, 아버멕틴 B1a 생성량에 영향을 주지 않으면서 B1b 비율을 선택적으로 감소시킬 수 있다. 배지에 포함되는 비타민 B1의 함량은 5 - 2000mg/L 가 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하지만, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1

고체배지(포도당 6%, 대두분 2 %, 효모추출물 0.3%, 대두유 0.5%, 한천 2%)에 한천 조각(지름 10mm)을 만든 후, 스트렙토마이세스 아버미틸리스 ATCC 31271와 스트렙토마이세스 아버미틸리스 KCTC 0662BP 각각을 접종하고 28℃에서 10일간 배양한 다음 한천 조각을 아세톤으로 2시간동안 교반하여 추출하였다. 아버멕틴이 추출된 아세톤 용액 10 ㎕를 실리카젤 박막에 점적하고 아세토니트릴을 전개 용매로 사용하여 크로마토그래피법으로 아버멕틴의 각 성분을 분리하였다. 아버멕틴 성분이 분리된 실리카젤 박막에 자외선(파장 254nm)을 조사하여 생산된 아버멕틴 양을 비교한 결과는 도1과 같다.

도1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 변이주로부터 얻은 추출액이 모균주로부터 얻은 추출액에 비하여 아버멕틴의 생산성이 훨씬 우수함을 알 수 있다.

실시예 2

스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP의 포자가 형성된 한천배지로부터 포자농도를 5X10⁶spores/ml 이 되도록 다음과 같은 종균배양용 배지 50 ml을 넣은 250 ml 플라스크에 접종하였다.

포도당 20 g/L

대두분 15 g/L

낙화생분 5 g/L

효모추출물 3 g/L

탄산칼슘 1 g/L

황산마그네슘 10 mg/L

황산아연 10 mg/L

대두유 3 g/L

증류수 1000 ml

pH 멸균후 7.0

상기 플라스크를 28 ℃ 회전진탕기에서 220rpm으로 48시간 배양한 후, 다음과 같은 아버멕틴 생성용 배지 60 ml이 들어있는 500 ml 플라스크에 6ml를 접종하였다.

포도당 100 g/L

대두분 20 g/L

면실분 5 g/L

효모추출물 3 g/L

인산칼륨 1 g/L

황산아연 10 mg/L

황산마그네슘 100 mg/L

황산철 10 mg/L

염화코발트 10 mg/L

대두유 5 g/L

증류수 1000 ml

pH 멸균전 7.6

상기 플라스크를 28 ℃ 회전진탕기에서 150 rpm으로 11일간 배양였다. 배양액중 5ml를 취하여 10ml의 에틸아세테이트를 혼합하고 2시간 동안 추출하였다. 에틸아세테이트 층으로 추출된 아버멕틴을 고속 액체 크로마토 그래피를 사용하여 배양액중 생성된 아버멕틴양을 측정하였다. 그 결과는 도2와 같다.

상기에서 고속 액체 크로마토 그래피 분석조건은 다음과 같다.

장치 ; 히타치(HITACHI) 모델 L-7100, 7200, 7300, 7400, D-7500

컬럼 ; 코스모실(COSMOSIL) 5C18-AR-II, 4.6 X 250 mm

이동상 ; 아세토니트릴:메탄올:증류수(850:50:100)

유속 ; 분당 1ml

주입량 ; 10 ㎕

배양액 추출물로부터 얻은 피크면적을 아버멕틴 표준품의 피크면적과 비교하여 생성량을 산출하였다. 아버멕틴의 8가지 성분들에 대하여 생성량을 구하고, 면적 백분율 방법에 의하여 아버멕틴 전체에 해당하는 비율을 계산하였다.

본 발명에 따른 변이주로부터 생성된 아버멕틴 양은 약 4,000 mg/L 이었으며, 유효성분인 아버멕틴 B1a는 1,786 mg/L의 생산성을 나타내었고, 성분비는 40 - 45 %이었다(3회 평균값). 그러나 B1b 성분은 5%미만으로 생성되었다.

상기에서 확인할 수 있는 바와 같이, 유용한 성분인 아버멕틴 B1a의 생성량에 있어서, 본 발명에 따른 변이주가 모균주보다 훨씬 우수함을 확인할 수 있다.

실시예 3

스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP를 사용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 배양된 종균배양액을 다음의 아버멕틴 생성용 배지 60 ml이 들어있는 500 ml 플라스크에 6 ml 접종하였다.

포도당 100 g/L

대두분 20 g/L

면실분 5 g/L

효모추출물 3 g/L

인산칼륨 1 g/L

황산아연 10 mg/L

황산마그네슘 100 mg/L

황산철 10 mg/L

염화코발트 10 mg/L

대두유 5 g/L

비타민 B1 0-100 mg/L

증류수 1000 ml

pH 멸균전 7.6

상기 플라스크를 28 ℃ 회전진탕기에서 150rpm으로 11일간 배양한 후, 실시예 2와 동일한 방법으로 배양액중 존재하는 아버멕틴 구성성분들의 양을 분석하였다. 상기 조작을 3회 반복하였으며, 얻어진 결과(평균값)는 다음 표5와 같다.

비타민 B1	아버멕틴
	전체역가 (ug/ml)	B1a 역가 (ug/ml)	B1b 함량비(%)
0	4026	1725	5.0
50 mg/L	4029	1678	2.8
100 mg/L	4087	1750	2.2

상기 표5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 비타민 B1 을 배지에 첨가하여 배양시켰을 때, 효과적으로 아버멕틴 B1b의 함량을 낮출 수 있다.

실시예 4

스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP를 사용하여 7L 발효조에서 실시예 3에서와 동일한 배지조성(비타민 B1 100mg/L)으로 28℃, 250rpm, 1.0VVM의 공기를 공급하며 배양하였을 때, 도3 에서와 같이 본 발명에 따른 변이주의 아버멕틴 B1a의 생산성은 2,800 mg/L로 훨씬 높은 수준이었다.

상기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 변이주를 이용하여 아버멕틴을 생산할 경우, 모균주보다 아버멕틴 B1a 의 생산성을 효과적으로 향상시킬 수 있으며, 그 구성비도 40 %이상 유지시킬 수 있다. 또한 아버멕틴 B1b 성분을 3% 미만으로 줄일 수 있는 장점이 있다.

Claims (4)

1. 아버멕틴을 생산하는 스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP.
2. 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP를 배양하여 그 배양액으로부터 아버멕틴을 제조하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 배지가 비타민 B1을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
4. 제3항에 있어서, 배지중 비타민 B1의 함량이 5 - 2000mg/L임을 특징으로 하는 제조방법.