KR100413926B1 - 애그로박테리움을 이용한 택서스 속 식물세포의 효율적인 형질전환 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애그로박테리움을 이용한 택서스 속(Taxussp.) 식물세포의 효율적인 형질전환 방법에 관한 것으로, 구체적으로 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata) 세포주와 같이 형질전환 효율이 낮은 식물세포를 형질전환시킬 때 병원성 유도체인 아세토시린곤 (acetosyringone)을 첨가하고, 배양액의 pH, 애그로박테리움 농도, 공동배양 기간 등을 최적화하며, 숙주 민감성 극복을 위한 화학적·물리학적 전처리 방법 등의 조건을 확립함으로써 높은 효율로 식물세포를 형질전환하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 방법에 따르면 일반적으로 형질전환 효율이 낮은 것으로 알려진 택서스 속 식물세포의 형질전환 효율을 2배 이상 높일 수 있으며, 도입된 유전자가 오랜 기간 동안 안정적으로 발현되므로, 이를 이용하여 패클리탁셀 등의 2차 대사 생산물의 생산 증가와 같이 각종 식물의 대사공학에 응용할 수 있다.

Description

애그로박테리움을 이용한 택서스 속 식물세포의 효율적인 형질전환 방법 {Method for transformation of Taxus species cells with agrobacteria in high efficiency}

본 발명은 애그로박테리움을 이용한 택서스 속 식물세포의 효율적인 형질전환 방법에 관한 것으로, 구체적으로 택서스 속 (Taxusspecies) 식물세포를 형질전환시킬 때 병원성 유도물질인 아세토시린곤을 첨가하고, 배양액의 pH, 애그로박테리움 농도, 공동배양 기간 등을 최적화함과 동시에, 숙주 민감성 극복을 위한 화학적·물리학적 전처리 방법 등의 조건을 확립함으로써 높은 효율로 택서스 속 식물세포를 형질전환하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 외래 유전자 (exogenous DNA)가 다른 세포에 삽입되어 하나의 독립적인 복제가능단위 (replicon)를 형성하거나 혹은 동종 재조합 (homologousrecombination)에 의해 도입된 세포의 게놈 속으로 통합 (integration)되어 계속적인 복제가 가능하고, 유전자 발현이 됨으로써 새로운 형질을 나타내도록 하는 것을 형질전환이라고 한다. 이와 같이 외래 유전자의 도입이 가능해 짐에 따라 원하는 유전자를 원하는 세포에서 대량으로 발현할 수 있게 되었으며, 이러한 재조합 DNA 기술 (recombinant DNA technology)은 현대 유전공학 발전의 핵심이라 할 수 있다. 예를 들어 원하는 단백질을 대량으로 생산하기 위하여 대장균 등의 박테리아에 원하는 유전자를 도입하거나 동물 또는 식물 세포에 도입하는 방법, 동물 또는 식물 세포가 특정 병원체에 저항성을 갖도록 하는 유전자를 도입하여 형질전환체를 제조하는 방법, 유용 물질을 생산하는 세포의 대사 조절을 통해 보다 많은 산물을 생산하도록 하기 위하여 조절 유전자를 삽입하는 방법 또는 질병의 치료를 위해 목적하는 유전자를 포함하는 벡터로 세포를 형질전환시키는 방법 등이 널리 이용되고 있다.

이 중 식물 세포의 형질전환에 이용되는 대표적인 방법은 애그로박테리움 (Agrobacterium)을 이용하는 방법이다. 애그로박테리움은 Ti 플라스미드 (tumour-

inducing plasmid)를 포함하고 있는데, 일단 이 세균이 식물 세포와 접촉하면 약 23kb 크기의 T-DNA라고 불리는 단편이 Ti 플라스미드로부터 식물 세포의 식물의 염색체 중 임의의 위치로 통합되어 들어가게 된다. T-DNA가 식물 세포 게놈으로 통합되는 데에는 상기 T-DNA의 양 쪽 끝에 위치한 약 23 bp 크기의 두 개의 경계부위 (left border, right border)가 중요한 역할을 한다. 이러한 성질을 이용하여 Ti 플라스미드에서 T-DNA의 통합에 필수적인 왼쪽 및 오른쪽 경계부위만을 남겨두고나머지 T-DNA 대신에 목적하는 외래유전자를 대체시켜 형질전환용 재조합 플라스미드를 제작하고, 이를 애그로박테리움에 도입한 후 숙주식물과 애그로박테리움을 공동배양하는 방법으로 식물의 형질전환에 이용한다. 구체적인 방법으로는 T-DNA를 포함하는 상대적으로 작은 크기의 플라스미드와 이의 통합에 필요한 유전자를 발현하는 플라스미드를 함께 이용하는 이원벡터 (binary vector system) 또는 코인테그레이션 벡터 (cointegration vector)를 이용할 수 있으며, 이 경우 식물 세포 형질전환용 균주로는 애그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 Ti 플라스미드와 유사한 Ri 플라스미드 (root inducing plasmid)를 포함하는 애그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhyzogenes) 등을 사용할 수 있다. 상기와 같이 애그로박테리움을 사용하는 경우에는 재조합 플라스미드로 형질전환된 애그로박테리움과 식물체 절편을 공동 배양함으로써 상처 부위 등을 통해 재조합 플라스미드가 식물 세포로 전이되게 된다. 이외에도 T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용할 수도 있는데, 이 경우에는 외래 유전자의 도입을 위해 전기 천공법 (electroporation), 미세입자 충격법 (microparticle bombardment) 또는 폴리에틸렌 글리콜 침전법 (polyethylene glycol-mediated uptake) 등의 방법이 식물 세포를 형질전환시키는 데 이용될 수 있다.

그러나, 이러한 방법에 의해 모든 식물 세포의 형질전환을 효율적으로 이룰 수 있는 것은 아니다. 일반적으로 식물 세포는 동물 세포에 비해 형질전환 효율이 낮으며, 이용될 수 있는 숙주세포도 제한되는 것으로 알려져 있다.

예를 들어, 형질전환 효율이 낮은 것으로 알려진 대표적인 식물 세포로는 항암제인 택솔의 생산으로 주목받고 있는 택서스 속 식물세포가 있다.

택서스 쿠스피다타 (Taxus cuspidata)는 택서스 과에 속하는 상록침엽림으로 탁월한 항암효과를 낸다고 알려진 패클리탁셀(paclitaxel: 택솔; Taxol)의 공급원으로 이용된다. 패클리탁셀은 20개 이상의 비대칭 중심을 갖는 극히 복잡한 디테르펜 (Diterpene)계 탁산 화합물로서 세포분열 (cell divsion)을 저해하여 암세포 성장을 막는다. 최초 패클리탁셀은 택서스 속 식물의 수피로부터 추출되었지만(US 774,010), 최근에는 택서스 속 식물의 잎, 뿌리(US 5,744,333) 및 씨눈 (대한민국 출원공개 1995-5081), 택서스 속 식물 이외의 다른 침엽수 (US 5,955,621), 재조합 박테리아 (US 5,916,783; 5,958,741; 5,908,759; 5,861,302) 또는 화학적 합성 (US 5767282; 5808113)에 의한 생산 등 다양한 생산 방법이 개발되어 있다. 그러나, 택서스 속 식물은 워낙 생장이 느리기 때문에 직접 자생하는 택서스 속 식물로부터 택솔을 추출하는 방법은 대량생산에 한계가 있으며, 세포배양 등을 이용한 방법도 아직 완전하게 확립되지는 못한 실정이다. 또한 화학적 합성 방법은 부산물(byproduct) 생성으로 인한 환경오염의 단점이 있다.

택서스 속 식물세포에 대한 형질전환 방법에 관한 연구는 최근에 시작되어, 한 등에 의해서 택서스 속 식물에 애그로박테리움의 T-DNA를 도입한 바 있으며 (Han K.H.et al.,Plant Science 95: 187-196, 1994), 택서스 속 식물의 접합배에서 DNA 직접 도입을 통한 GUS 유전자의 일시적 발현이 보고된 바 있다 (Lulan E.et al.,Cell Dev. Biol. Plant 32: 81-85, 1996). 그러나 택서스 속 식물에서의 애그로박테리움을 이용한 형질전환 방법은 그 효율이 매우 낮아 효과적이지 못하며, 상기 방법 이외에 미세입자 충격법 (microparticle bombardment)에 의한 유전자 직접 도입방법 (US 5,932,782)등이 보고되었으나 대량생산 및 실용화에 대해선 아직 미지수이다.

상기의 단점을 극복하고 상업적 대량생산을 위한 방법으로 세포배양 (US 5,871,979)을 통한 택솔의 생산방법이 제시되어 있지만, 아직까지 안정적인 대량생산에는 어려움이 많다. 따라서, 택서스 속 식물세포의 이차대사산물 생산 경로에 관련하는 여러 유전자에 관한 정보가 축적됨에 따라, 효율적인 택서스 속 식물세포의 형질전환 방법이 개발된다면 유전자 재조합 기술을 이용한 대사공학 기술을 통해 식물세포 배양을 통한 택솔의 대량 생산이 가능할 것으로 기대되고 있다.

이에 본 발명자들은 일반적으로 형질전환 효율이 낮은 것으로 알려진 택서스 속 식물세포를 효과적으로 형질전환시키기 위하여 연구를 거듭한 결과, 형질전환시 병원성 유도물질로 아세토시린곤을 첨가하고, 배양액의 pH, 애그로박테리움 농도, 공동배양 기간 및 숙주 민감성 극복을 위한 화학적·물리학적 전처리 방법 등을 최적화함으로서 형질전환 효율을 200% 이상 증가시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 외래유전자를 포함하는 애그로박테리움을 이용하여 고효율로 택서스 속 식물세포를 형질전환하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 택서스 속 식물세포의 형질전환 효율을 높이기 위해 병원성 유도물질의 종류와 농도, 배양액의 pH, 애그로박테리움 농도, 공동배양 기간 및 숙주 민감성 극복을 위한 화학적·물리학적 전처리 방법 등에 있어 최적의 조건을 제공하기 위한 것이다.

도 1은 병원성 유도제인 아세토시린곤 농도 변화에 따른 일시적 형질전환된 택서스 속 식물세포에서 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein; 이하 GFP라 한다)의 상대적 형광도를 나타낸 것이고,

도 2는 공동배양 배지의 pH 변화에 따른 일시적 형질전환된 택서스 속 식물세포에서의 GFP의 상대적 형광도를 나타낸 것이고,

도 3은 애그로박테리움 농도 및 공동배양 기간의 변화에 따른 일시적 형질전환된 택서스 속 식물세포에서의 GFP의 상대적 형광도를 나타낸 것이고,

□: 1일간 공동배양한 택서스 속 식물세포

○: 2일간 공동배양한 택서스 속 식물세포

△ : 3일간 공동배양한 택서스 속 식물세포

도 4는 디메틸설폭시드(DMSO)로 전처리한 후 일시적 형질전환된 택서스 속 식물세포에서 GFP의 상대적 형광도를 나타낸 것이고,

도 5는 초음파 처리시간 변화에 따른 일시적 형질전환된 택서스 속 식물세포에서 GFP의 상대적 형광도를 나타낸 것이고,

도 6은 정상 및 형질전환된 택서스 속 식물세포에 대해 웨스턴 블럿 분석한 결과를 나타낸 겔 사진이다.

1: 단백질 크기 표지 (size marker)

2: 표준 GFP

3: 택서스 속 식물세포

4: 형질전환된 택서스 속 식물세포

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 형질전환시 병원성 유도물질의 종류와 농도, 공동배양액의 pH, 애그로박테리움 농도, 공동배양기간 및 전처리 방법 등의 조건을 확립하여 종래의 형질전환 방법에 비해 높은 효율을 나타내는 애그로박테리움을 이용한 택서스 속 식물세포의 형질전환 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 택서스 속 식물세포의 고효율 형질전환 방법은,

1) 택서스 속 식물세포를 DMSO(dimethyl sulfoxide) 또는 초음파로 전처리하는 단계;

2) 외래유전자를 포함하는 0.1×10⁹∼1×10⁹세포수/㎖ 농도의 애그로박테리움과 상기 단계 1)의 택서스 속 식물세포를 50∼250μM의 아세토시린곤이 포함된 pH 5.0∼5.6의 배지에서 1∼4일간 공동배양하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 공동배양한 세포를 세척하여 애그로박테리움을 제거한 후 식물세포만을 선별 배지에서 배양하는 단계; 및

4) 활발하게 자라는 조직을 선별하여 외래유전자를 안정적으로 발현하는 세포주를 확립하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 택서스 속 식물세포의 고효율 형질전환 방법은 택서스 속에 속하는 다양한 종의 식물세포에 적용할 수 있다. 예를 들어 택서스 쿠스피다타 (Taxus cuspidata), 택서스 브레비폴리아 (Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스 (Taxus canadensis), 택서스 키넨시스 (Taxus chinensis) 등이 이용될 수 있다.

상기 형질전환 방법에서, 단계 1의 DMSO 처리는 택서스 속 식물세포를 애그로박테리움과 공동배양하기 전에 0.1∼5%의 DMSO를 혼합한 배양액에서 약 24시간 동안 배양하는 것이 바람직하다. DMSO는 식물세포의 세포막 투과성을 높여 숙주의 감수성을 높이는 역할을 한다. 첨가하는 DMSO 양은 0.1∼5%, 바람직하게는 약 3∼5 % 농도인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 약 5%가 적당하다. 너무 많은 양의 DMSO를 처리할 경우, DMSO의 세포 독성으로 인하여 식물세포의 생존율이 낮아지게 되며, 너무 낮은 농도로 처리하면 형질전환 효율의 증대 효과를 볼 수 없게 된다.

한편, 상기 단계 1의 초음파 처리는 공동배양에 앞서 택서스 속 식물세포와 애그로박테리움의 공동배양액을 25∼30 kHz, 보다 바람직하게는 약 28 kHz의 초음파로 20∼30초간 처리하는 것이 바람직하다. 초음파는 식물세포 및 조직 표면에 미세한 상처를 만들어, 식물세포가 애그로박테리움에 의해 감염되는 것을 촉진시킨다. 형질전환 효율은 약 30초간의 초음파 처리시에 가장 높은 것으로 나타났다.

또한 본 발명의 형질전환 방법에서, 단계 2의 애그로박테리움으로는 애그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 애그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhyzogenes)를 모두 사용할 수 있다. 이때 애그로박테리움을 형질전환시키는 재조합 플라스미드로는 식물 세포에서 발현시키기 원하는 목적 유전자를 클로닝한 이원 벡터 시스템이거나 코인테그레이션 벡터가 이용될 수 있는데, 대상이 되는 식물체의 종류에 따라 해당 식물체에서의 발현을 극대화할 수 있는 것으로 알려진 프로모터 등을 사용하여 작제되는 것이 바람직하다.

상기 단계 2에 있어서, 애그로박테리움은 0.1×10⁹∼1×10⁹세포수/㎖의 농도로 식물 세포와 혼합하여 공동배양시키는 것이 바람직하다. 다양한 공동 배양 조건 하에서 애그로박테리움을 이용한 식물 세포의 형질전환 방법의 효율을 조사하는과정에서 본 발명자들은 식물 세포의 현탁 배양 세포의 생존율이 애그로박테리움의 공격과 밀접한 관련이 있음을 발견하였다. 즉, 형질전환이 효율적으로 일어나는 범위 내에서 배양 세포의 생존율을 낮추지 않을 정도로 애그리박테리움의 농도 및 공동 배양 기간을 조절하는 것이 매우 중요하다. 너무 적은 수의 애그로박테리움을 적용할 경우 형질전환 효율이 감소하며, 너무 많은 수의 애그리박테리움을 사용하여도 세척 단계에서 제거되지 않은 애그로박테리움에 의해 형질전환 세포주의 생장에 영향을 미칠 수 있으므로 바람직하지 않다. 본 발명의 형질전환 방법에 있어 효율의 극대화를 위해서는 약 1∼4일간 공동배양하는 것이 바람직한데, 특히 공동배양 기간을 3일 정도로 한 경우에는 1∼2일간의 배양 기간의 경우에 비해 거의 모든 애그리박테리움 세포 농도구간에서 훨씬 높은 형질전환율을 나타내어, 3일의 공동배양 기간을 적용할 경우 애그로박테리움의 감염 농도를 낮출 수 있는 장점이 있다.

상기에서, 단계 2의 병원성 유도물질인 아세토시린곤은 애그로박테리움에 존재하는 재조합 플라스미드의 T-DNA 외부에 존재하는 병원성 관련 유전자인virA, B, C, D, E및G등의 전사를 촉진하여 상기 유전자 산물들은 T-DNA 부위의 식물 세포로의 전달 및 식물 세포 게놈으로의 통합을 촉진한다. 아세토시린곤외에도 α-하이드록시시린곤(α-hydroxysyringone) 등의 페놀계 화합물이 상기와 같은 목적으로 이용될 수 있다. 이 때, 아세토시린곤의 적용 농도는 50∼200 μM인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 식물 세포 형질전환 방법에서, 애그로박테리움과 식물 세포의 공동배양 배지의 pH 또한 식물 세포의 형질전환 효율에 큰 영향을 미치는데, pH 5.0∼5.6, 보다 바람직하게는 pH 5.2∼5.4에서 애그로박테리움의 병원성 유도와 이로 인한 식물 세포의 형질전환 효율에 있어 가장 좋은 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 고효율 형질전환 방법의 유용성을 확인하기 위하여 택솔을 생산하는 택서스 쿠스피다타 세포주 (KCTC PC 10177)를 사용하였지만, 본 발명의 형질전환 방법을 이용할 수 있는 택서스 속 식물세포로는 이에 한정되지 않는다. 또한 형질전환 유전자를 갖는 애그로박테리움은 변형된 녹색 형광 단백질 (modified green fluorescence protein, mGFP)을 코딩하는 이원 벡터인 pCAMBIA (MRC, 영국)를 포함하는 애그로박테리움 튜메파시엔스 LBA4404를 사용하였다. 형질전환 효율은 형질전환 세포의 단백질 분획이 나타내는 상대적 형광을 측정함으로써 관찰하였고, 웨스턴 블럿으로 형질전환된 택서스 속 식물세포가 안정적으로 도입된 유전자를 발현하는지 확인하였다.

애그로박테리움의 병원성 유도물질인 아세토시린곤의 농도가 애그로박테리움에 의한 택서스 속 식물세포의 일시적 형질전환 효율에 미치는 영향을 관찰하였을 때, 50μM 까지 급격하게 증가하며 그 이후로 증가율이 감소하는 것으로 나타났다. 이때 공동배양액의 pH는 5.2∼5.4일 때 높은 형질전환 효율을 보였으며, pH 5.0∼5.6 바깥 범위에서는 효율이 급격하게 떨어지는 것으로 나타났다. 공동 배양 기간이 3일인 경우에는 택서스 속 식물세포와 혼합하는 애그로박테라움 농도에 관계없이 높은 형질전환 효율을 보였으며, 따라서 애그로박테리움 사용 농도를 낮출 수 있는 장점을 가진다.

택서스 속 식물세포의 형질전환 효율을 높이기 위한 시도의 하나로 애그로박테리움과 택서스 속 식물세포를 혼합한 공동배양액에 화학적 및 물리학적 방법으로 전처리를 하였다. 애그로박테리움-매개 형질전환법에서 식물세포의 형질전환 효율은 숙주-감수성 (host sensitivity)에 의하여 제한받는 것으로 알려져 있다. 따라서 화학적 또는 물리적 처리를 통하여 식물세포의 세포막 구조를 변형시켜 식물세포의 감수성에 영향을 주기 위해, 세포막의 투과성을 높이는 것으로 알려져 있는 디메틸설폭시드 (dimethyl sulfoxide: DMSO)를 처리하였으며, 5%까지의 처리 농도에서 형질전환 효율이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 초음파 처리를 할 경우에도 형질전환 효율을 증가시킬 수 있었는데, 이는 초음파가 택서스 속 식물세포의 세포벽에 미세한 상처를 유발하기 때문이라 여겨지며, 30초간 처리를 하였을 때 약 200%이상의 형질전환 효율을 증가시킬 수 있었다.

본 발명에서 제공한 방법으로 택서스 속 식물세포를 형질전환 시켰을 때, 도입된 외래유전자가 변형 없이 안정적으로 발현되는지를 알아보기 위하여 형질전환 후 3 개월간 배양한 택서스 속 식물세포의 단백질을 수득하여 웨스턴 블럿 분석을 실시하였으며, 그 결과, 배양 3 개월 뒤에도 도입된 외래유전자가 안정적으로 발현됨을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 택서스 속 식물 세포의 현탁배양 및 형질전환

본 실험에서는 이용한 외래 유전자 도입에 의한 형질 변환에 사용하기 위한 세포주로 공지의 택솔을 생산하는 택서스 쿠스피다타 세포주 (KCTC PC 10177)를 이용하였으며, 0.5 g/l 카세인 가수분해물 (casein hydrolysate), 4 mg/l의 2,4-D 및 30 g/l의 수크로스 (sucrose)가 첨가된 변형 갬보그 B5 (modified Gamborg B5, Duchefa, 네덜란드)배지에서 암조건으로 26℃, 110 rpm에서 배양하였다. 형질전환 유전자를 갖는 애그로박테리움으로는, 변형된 GFP을 코딩하는 바이너리벡터인 pCAMBIA (MRC, 영국)를 삼친교잡법 (triparental mating)을 통하여 애그로 박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)에 도입시켰다. 이 때 모체 균주는 pCAMBIA를 가지고 있는 대장균 MM294 균주를 이용하였다. 이후 재조합 애그로 박테리움 튜마파시엔스 LBA 4404 (ClonTech, 미국)를 이용하여 상기 택서스 쿠스피다타로부터 유래된 식물세포를 형질전환시켰다.

상기 애그로박테리움을 50 mg/l 리팜피신 (rifampicin), 50 mg/l 카나마이신 (kanamycin)을 포함하는 LB 배지 (Luria Bertani medium)에서 28℃, 110rpm 조건으로 하루동안 배양한 후 원심분리하여 박테리아만을 수확하였다. 박테리아를 10 g/l 글루코스 (glucose), 100 μM 아세토시린곤 (acetosyringone; Aldrich, 미국)을 포함하는 변형 갬보그 B5 (modified Gamborg B5, pH 5.2) 유도배지 (inducing media)에 재현탁한 후, 현탁배양된 택서스 쿠스피다타 세포주와 혼합하고 25℃ 암조건에서 3일 동안 110rpm을 유지하며 공동배양하였다. 배양한 형질전환세포를 원심분리하여 얻은 후, 살균수로 세 번 세척하여 잔존한 애그로박테리움을 제거하고, 250 mg/l 쎄포탁심(cefotaxime), 10mg/l 히그로마이신(hygromycin) 및 0.8% 한천 (agar)이 포함된 변형 갬보그 B5 한천 선별 배지 (agar selection media)로 옮겨 암조건으로 26℃에서 배양하여 형질전환체를 선별하였다. 형질전환 이틀 뒤 GFP의 일시적 발현 (transient expression)을 측정하기 위하여 상기 형질전환 세포의 일부를 수집하였으며, 나머지 세포주는 선별배지에서 4주간 배양한 후 활발하게 자라는 조직을 선별하여, 250 mg/l 쎄포탁심(cefotaxime) 와 10mg/l 히그로마이신 (hygromycin)이 포함된 변형 갬보그 B5 선별 배지에서 현탁배양하고 3개월간 계속 증식시켰다.

<실시예 2> 녹색 형광 단백질 발현 분석

GFP의 발현 분석을 위해, 상기 실시예 1에서 수확한 세포 0.5g에 액체질소 (liquid nitrogen)를 가해 얼리고 미리 차갑게 식힌 조직분쇄기 (tissue grinder)를 이용해 분쇄한 후, 단백질 추출완충액 (extraction buffer; 50 mM Trs-HCl, pH8.0, 10 mM EDTA, 10 mM DTT, 20 % 글리세롤)으로 단백질을 추출하였다. 추출액을 2분간 초음파처리 (sonication)하고 15분 동안 14,000 rpm에서 원심분리한 후 상등액만을 모아 터너 디지털 형광측정기(Turner Digital Fluorometer, Dubuque, 미국)로 460 nm의 여기 조건(excitation), 515 nm의 측정 (detection)조건으로 하여 형광도를 측정하였다. 모든 일시적 형질전환 효율은 상대적 형광도로 비교하였다.

<실시예 3> 아세토시린곤의 농도 및 배양액 pH 변화에 따른 녹색 형광 단백질 발현 분석

애그로박테리움 균주의 병원성 유도물질로 사용되는 아세토시린곤의 농도가 외부 유전자 도입으로 인한 택서스 속 식물세포의 형질전환에 미치는 영향을 조사하기 위하여 공동배양배지에 다양한 농도의 아세토시린곤을 첨가하여 상대적 형광도를 측정하였다 (도 1). 상대적 형광치는 50 μM 아세토시린곤 농도까지 급격히 증가하였으며 이후 증가량은 감소하였고, 200 μM에서는 아세토시린곤 처리를 하지 않았을 때보다 약 2배 이상 증가하였다. 상기의 결과에서 천연 페놀계 화합물인 아세토시린곤이 애그로박테리움 매개 형질전환 효율을 향상시키는데 유용함을 알 수 있다.

공동배양배지의 초기 pH (배지제조시)가 택서스 속 식물세포 형질변화에 미치는 영향은 도 2에서 보듯 pH 5.2∼5.4 근방에서 가장 높은 형질변화율을 나타냄을 알 수 있었다. pH 5.0 이하나 pH 5.6 이상이 되었을 때는 형질전환율이 절반 이하로 낮아졌다.

<실시예 4> 애그로박테리움 농도 및 공동 배양일에 따른 녹색 형광 단백질 발현 분석

본 발명자들은 택서스 속 식물세포의 현탁 배양세포 생존율이 애그로박테리움의 공격과 밀접한 관련이 있음을 발견하였으며, 애그로박테리움의 농도 및 형질전환을 위한 공동배양 기간을 변화시킴으로써 택서스 속 식물세포의 사망을 억제하고 동시에 형질전환효율을 높게 유지할 수 있을 것이라고 판단하였다. 이에 따라, 택서스 속 식물세포의 형질전환율을 높이기 위한 최적의 애그로박테리움 농도 및 공동 배양 기간을 결정하기 위해 다양한 농도의 애그로박테리움 및 공동배양 기간을 적용하여 GFP의 발현에 따른 형광도를 비교하였다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 애그로박테리움과 택서스 쿠스피다타 세포주를 3일간 공동배양할 때 1-2일간 공동배양할 때보다 높은 형질변화 성공률을 보였다. 3일간 공동 배양 시켰을 경우 애그로박테리움 농도에 따른 GFP의 발현은 큰 차이가 없었으나, 너무 높은 농도의 애그로박테리움과 공동배양할 경우 택서스 쿠스피다타 세포주의 생존율이 낮아지는 경향을 나타내었다. 상기의 결과를 고려하면 애그로박테리움과 택서스 속 식물세포를 3일간 공동배양할 경우 애그로박테리움의 농도를 0.5×10⁹cell/ml 정도로 낮게 사용하여도 높은 형질전환율을 얻을 수 있으며, 이는 애그로박테리움의 농도를 낮춤으로써 택서스 속 식물세포의 생존률을 높이기 때문인 것으로 판단된다.

<실시예 5> 형질전환 효율 상승을 위한 택서스 속 식물세포의 전처리법 개발

택서스 속 식물세포의 형질전환 효율은 높이기 위한 시도로 형질전환을 위한 공동배양에 앞서 화학적 또는 물리적 전처리를 시도하였다. 화학적 전처리 수단으로는 디메틸 설폭시드 (Dimethyl sulfoxide; DMSO)를 배양액에 혼합하였으며 물리적 전처리는 택서스 속 식물세포에 초음파를 일정시간 처리하였다.

1) DMSO 농도에 따른 형질전환 효율

침적세포 부피(Packed cell volume) 60%의 택서스 쿠스피다타 세포주에 0∼5% DMSO를 처리하고 24시간 동안 배양한 후, 증류수로 DMSO를 세척한 후 애그로 박테리움과 혼합하여 공동배양하였다. 도 4에서 보듯이 5% 농도의 DMSO 처리구간까지는 투여한 DMSO 농도에 비례하여 GFP에 의한 형광이 증가하였다. 이처럼 DMSO 전처리가 일시적 형질전환 효율을 증가시키는 정확한 기작은 아직 불분명지만, DMSO가 택서스 속 식물세포의 세포막 투과성에 영향을 미쳐 발생하는 것으로 판단된다. 한편 DMSO는 독성을 가지고 있어 고농도에서 세포를 사멸시킬 수 있기 때문에 너무 높은 농도의 DMSO를 처리하면 택서스 속 식물세포 생존율에 영향을 미친다.

2) 초음파 전처리 시간에 따른 형질전환 효율

초음파 전처리 후 택서스 속 식물세포의 일시적 형질전환 효율을 측정하기 위해서, 택서스 쿠스피다타 세포주와 애그로박테리움을 혼합한 공동배양액(40 ml)을 공동배양에 앞서, 50 ml 원형 튜브 (conical tube)에 담고 초음파 발생장치 (Sonics Materials,INC)에서 처리시간을 변화시키면서 28 kHZ의 초음파 처리한 후, 3일간 공동배양하여 일시적 형질전환 효율을 측정하였다(도 5). 형질전환 효율은 30초간 초음파 처리를 할 때까지 증가하는 양상을 보였으며, 그 이상 음파처리 시간이 증가시키면 효율이 감소하였다. 상기 결과는 초음파로 인하여 택서스 속 식물세포와 식물조직에 미세한 상처가 생성되어 애그로박테리움 감염을 촉진시키기 때문인 것으로 보인다.

<실시예 6> 웨스턴 블럿 분석

상기 실시예 1을 통해 형질전환시킨 택서스 쿠스피다타 세포들이 GFP을 안정적으로 발현하는지 확인하기 위해 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다. 택서스 쿠스피다타 세포를 형질전환 시킨 후 3개월간 유지 증식시킨 식물 조직으로부터 분리한 단백질 시료를 램리 등의 방법 (U.K. Laemmli, Cleavage and structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4,Nature,227:680-685, 1970)에 따라 12%(w/v) SDS-아크릴아미드 겔상에서 SDS-PAGE를 수행하였다. 겔상에서 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 뒤 탈지우유 (skim milk)로 반응을 차단 (blocking)하고, 1차 항체로서 TBS 용액 (20mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 3%(w/v) 탈지우유)에 1/1000비율로 희석시킨 항 GFP 다클론 항체 (anti-GFP polyclonal rabbit antibody; Clontech, 미국)를 사용하여 2시간 동안 반응 시켰다. 2차 항체로는 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase)가 융합된 항 토끼 IgG 항체를 사용하여 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 세척한 후 NBT/BCIP (nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate-p-toluidine) 용액으로 발색시켰다.

도 6에 나타난 바와 같이 본 발명의 형질전환 방법으로 형질전환시킨 분액 (레인 4)에서, 표준 GFP (레인 2)과 같은 30-32 kDa 밴드가 확인돼 택서스 쿠스피다타 세포에서 GFP이 안정적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 세포외 분획 (레인 3)에서는 GFP이 발현되지 않았다.

본 발명의 형질전환 방법에 따르면 일반적으로 형질전환 효율이 낮은 것으로 알려진 택서스 속 식물세포에 2배 이상 높은 효율로 외래 유전자를 형질전환시킬 수 있으며, 상기 방법을 이용하여 유용한 유전자를 식물체에 도입함으로써 대사조절에 의한 유용 물질의 대량 생산 등에 본 발명의 형질전환 방법을 이용할 수 있다.

Claims (10)

1) 택서스 속 식물세포를 DMSO(dimethyl sulfoxide) 또는 초음파로 전처리하는 단계;

2) 외래유전자를 포함하는 0.1×10⁹∼1×10⁹세포수/㎖ 농도의 애그로박테리움과 상기 단계 1)의 택서스 속 식물세포를 50∼350μM의 아세토시린곤이 포함된 pH 5.0∼5.6의 배지에서 1∼4일간 공동배양하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 공동배양한 세포를 세척하여 애그로박테리움을 제거한 후 식물세포만을 선별 배지에서 배양하는 단계; 및

4) 활발하게 자라는 조직을 선별하여 외래유전자를 안정적으로 발현하는 세포주를 확립하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 애그로박테리움을 이용한 택서스 속 식물세포의 형질전환 방법.

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제 1항에 있어서, 상기 택서스 속 식물세포는 택서스 쿠스피다타 (Taxus cuspidata)로부터 유래된 것임을 특징으로 하는, 택서스 속 식물세포의 형질전환 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1의 DMSO 처리는 택서스 속 식물세포를 애그로박테리움과 공동배양하기 전에 0.1∼5%의 DMSO를 혼합한 배양액에서 24시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 택서스 속 식물세포의 형질전환 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1의 초음파 처리는 공동배양에 앞서 택서스 속 식물세포와 애그로박테리움의 공동배양액을 25∼30 kHz의 초음파로 20∼30초간 처리하는 것을 특징으로 하는, 택서스 속 식물세포의 형질전환 방법.

제 1항에 있어서, 단계 2의 애그로박테리움은 애그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 애그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhyzogenes) 인 것을 특징으로 하는, 택서스 속 식물세포의 형질전환 방법.

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제 1항에 있어서, 단계 2의 배지 pH는 5.2∼5.4 인 것을 특징으로 하는, 택서스 속 식물세포의 형질전환 방법.

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