JP2015188442A - セサミン生産用植物培養細胞およびそれを用いるセサミン製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】セサミンを安定的に大量合成するための新規なセサミン生産用植物培養細胞、当該細胞を用いるセサミンの製造方法および当該細胞の保存方法を提供すること。
【解決手段】内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素および内在性ピノレジノール配糖化酵素を発現する植物由来の培養細胞であって、内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素および内在性ピノレジノール配糖化酵素の発現を抑制し、外来性のセサミン合成酵素を発現するように改変された植物培養細胞。
【選択図】なし

Description

本発明は、セサミン生産用植物培養細胞、当該植物培養細胞を用いるセサミン製造方法、および当該植物培養細胞の凍結保存方法に関するものである。

ゴマ（Sesamum indicum）種子中に含まれているセサミンは、多様な生理活性を有することが明らかにされており、コレステロール代謝、肝機能、免疫機能等の改善に有効であることが知られている。セサミンをゴマ種子あるいはゴマ種子の絞り粕から分離精製する方法はすでに実用化されており（特許文献１、２参照）、セサミンを主成分とする、アルコール分解促進作用などを有する肝機能活性増強剤が市販されている。しかし、セサミンの原料素材として供給可能であるのは、ゴマ油製品類の精製工程での副産物であり、ゴマ油製品類の需要の変動により供給が困難となることが危惧される。さらに、通常ゴマ種子は１年に１回しか収穫されない。しかも日本では、使用するゴマ種子のほとんどを輸入に依存している。それゆえ、今後のセサミンの需要増加を考慮すれば、安定的な原材料供給源の確保が課題となる。

上記課題の解決策として、本発明者らは、セサミン合成能を持たないレンギョウ（Forsythia koreana）の葉から調製した培養細胞に、ゴマ由来のセサミン合成酵素をコードする遺伝子と内因性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素（ＰＬＲ：pinoresinol/lariciresinol reductase）の発現を抑制するためのＲＮＡ分子をコードする遺伝子を共導入し、セサミンの合成に成功したことを報告している（非特許文献１参照）。しかしながら、その合成効率はセサミンを安定的に大量合成するためには十分といえず、セサミンをより安定的に大量合成可能な植物培養細胞を樹立すると共に、合成効率を向上させるための培養環境および培養細胞の維持管理に関して、更なる検討が必要とされている。

特開平１０−７６７６号公報 特開２００１−１３９５７９公報

Kim, H. J., E. Ono, K. Morimoto, T. Yamagaki, A. Okazawa, A. Kobayashi & H. Satake （2009） Metabolic engineering of lignan biosynthesis in Forsythia cell culture. Plant and Cell Physiology, 50, 2200-2209.

本発明は、セサミンを安定的に大量合成するための新規なセサミン生産用植物培養細胞、当該細胞を用いるセサミンの製造方法および当該細胞の保存方法を提供することを課題とする。

本発明は、上記の課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素および内在性ピノレジノール配糖化酵素を発現する植物由来の培養細胞であって、内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素および内在性ピノレジノール配糖化酵素の発現を抑制し、外来性のセサミン合成酵素を発現するように改変された植物培養細胞。
［２］内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素の発現を特異的に抑制するＲＮＡを発現するよう構築されたＲＮＡｉ発現ベクター、内在性ピノレジノール配糖化酵素の発現を特異的に抑制するＲＮＡを発現するよう構築されたＲＮＡｉ発現ベクターおよびセサミン合成酵素遺伝子発現ベクターが導入されていることを特徴とする前記［１］に記載の植物培養細胞。
［３］セサミン合成酵素が、ゴマ由来のセサミン合成酵素である前記［１］または［２］に記載の植物培養細胞。
［４］ゴマ由来のセサミン合成酵素が、配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなることを特徴とする前記［３］に記載の植物培養細胞。
［５］ゴマ、レンギョウまたはアマ由来の植物培養細胞であることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の植物培養細胞。
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の植物培養細胞を培養する培養工程と、植物培養細胞からセサミンを抽出および精製する抽出精製工程とを含むことを特徴とするセサミンの製造方法。
［７］培養工程において、赤色光を含む光照射条件下で培養することを特徴とする前記［６］に記載の製造方法。
［８］培養工程において、赤色光照射条件下で培養することを特徴とする前記［６］に記載の製造方法。
［９］さらに、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の植物培養細胞の凍結保存細胞を再培養する再培養工程を含む前記［６］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］凍結保存細胞が、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の植物培養細胞をアルギン酸ナトリウムビーズに封入して凍結保存した細胞である前記［９］に記載の製造方法。
［１１］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の植物培養細胞を、セサミン合成能を維持したまま凍結保存する方法であって、前記植物培養細胞をアルギン酸ナトリウムビーズに封入して凍結することを特徴とする凍結保存方法。
［１２］液体窒素中で凍結保存することを特徴とする前記［１１］に記載の凍結保存方法。

本発明により、セサミンを安定的に大量合成するための新規なセサミン生産用植物培養細胞、当該細胞を用いてセサミンを安定的に製造する方法、および当該細胞のセサミン合成能を維持したまま長期間凍結保存する方法を提供することができる。

バイナリ―ベクターｐＳＰＢ３１０４の構造を示す図である。 バイナリ―ベクターｐＡＮＤＡ３５ＨＫ−ＵＧＴ７１Ａ１８の構造を示す図である。 形質転換チョウセンレンギョウ培養細胞ＣＰｉ−ＦｋおよびＵ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋ、ならびに野生型チョウセンレンギョウ培養細胞におけるＣＹＰ８１Ｑ１、ＰＬＲおよびＵＧＴ７１Ａ１８の発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した結果を示す図である。 形質転換チョウセンレンギョウ培養細胞ＣＰｉ−ＦｋおよびＵ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋのリグナン量をＨＰＬＣで定量した結果を示す図である。 形質転換チョウセンレンギョウ培養細胞Ｕ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋおよび野生型チョウセンレンギョウ培養細胞に対する赤色光照射がリグナン合成に及ぼす効果を検討した結果を示す図であり、（Ａ）はＵ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋの結果、（Ｂ）は野生型（ＷＴ）の結果である。 形質転換チョウセンレンギョウ培養細胞Ｕ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋ対する各色の光照射がリグナン合成に及ぼす効果を検討した結果を示す図であり、（Ａ）がセサミン合成の結果、（Ｂ）がピノレジノ―ルアグリコン合成の結果である。 形質転換チョウセンレンギョウ培養細胞Ｕ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋを液体窒素中で凍結保存した後に再培養し、再培養後のリグナン合成量を凍結保存前のリグナン合成量と比較した結果を示す図であり、（Ａ）１０日間保存した後に再培養した結果、（Ｂ）は６か月間保存した後に再培養した結果である。

〔植物培養細胞〕
本発明は、セサミン生産用の植物培養細胞を提供する。本発明の植物培養細胞は、内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素および内在性ピノレジノール配糖化酵素を発現する植物細胞由来の培養細胞であって、内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素および内在性ピノレジノール配糖化酵素の発現を抑制し、外来性のセサミン合成酵素を発現するように改変された植物培養細胞であることが好ましい。

内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素および内在性ピノレジノール配糖化酵素を発現する植物としては、例えば、ゴマ等のゴマ科植物、レンギョウ、オリーブ等のモクセイ科植物、アマ等のアマ科植物、キャベツ、ケール、ブロッコリー等のアブラナ科植物、アンズ、モモ、イチゴ等のバラ科植物などが挙げられる。なかでもピノレジノール含量が高いゴマ、レンギョウ、アマが好ましい。内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素および内在性ピノレジノール配糖化酵素を発現する植物は、内在性のセサミン合成酵素を有する植物でもよく、内在性のセサミン合成酵素を有しない植物でもよい。

セサミン合成酵素は、ピノレジノールからセサミンへの反応を触媒する酵素であればよい。このような酵素としては、ゴマ由来のセサミン合成酵素を好適に用いることができる。ゴマ由来のセサミン合成酵素としては、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍから単離されたチトクロームＰ−４５０であるＣＹＰ８１Ｑ１およびＳｅｓａｍｕｍ ｒａｄｉａｔｕｍから単離されたチトクロームＰ−４５０であるＣＹＰ８１Ｑ２が知られている（Ono, E. et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 10116-10121.）。ただし、セサミン合成酵素はこれらに限定されず、他の公知のセサミン合成酵素および今後見出されるセサミン合成酵素は、いずれも本発明に好適に用いることができる。

ゴマ由来のセサミン合成酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。配列番号１に示されるアミノ酸配列はＳｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ ＣＹＰ８１Ｑ１のアミノ酸配列であり、アクセッション番号ＢＡＥ４８２３４としてＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに登録されている。また、ゴマ由来のセサミン合成酵素は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。配列番号３に示されるアミノ酸配列はＳｅｓａｍｕｍ ｒａｄｉａｔｕｍ ＣＹＰ８１Ｑ２のアミノ酸配列であり、アクセッション番号ＢＡＥ４８２３５としてＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに登録されている。

配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。「１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。また、実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列も同じである。

ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素およびピノレジノール配糖化酵素は、用いる植物細胞に応じて決定される。例えば、レンギョウ細胞を用いる場合、ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素（ＰＬＲ）はアクセッション番号ＡＡＣ４９６０８としてＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに登録されているものが該当し、ピノレジノール配糖化酵素（ＵＧＴ７１Ａ１８）はアクセッション番号ＢＡＩ６５９１２としてＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに登録されているものが該当する。

例えば、アマ細胞を用いる場合、ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素（ＰＬＲ）としては、以下のアクセッション番号のＰＬＲを挙げることができる。Ｑ４Ｒ０Ｉ０、ＣＡＨ６０８５７（以上、Ｌｉｎｕｍ ａｌｂｕｍ）、Ｑ４Ｒ０Ｈ９、Ｅ６Ｙ２Ｘ０、ＣＡＨ６０８５８、ＡＢＷ２４５０１、Ｐ０ＤＫＣ８、ＣＡＣ５１２５０（以上、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、Ａ３Ｒ０５２、ＡＢＭ６８６３０（以上、Ｌｉｎｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ）、Ｂ５ＫＲＨ５（Ｌｉｎｕｍ ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ）など。また、ピノレジノール配糖化酵素としては、以下のアクセッション番号のピノレジノール配糖化酵素を挙げることができる。ＡＦＪ５２９０９、ＡＦＪ５２９１０、ＡＦＪ５２９１１、ＡＦＪ５２９１２、ＡＦＪ５２９１３、ＡＦＪ５２９１４（以上、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）など。
他の植物細胞を用いる場合、用いる植物細胞のピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素およびピノレジノール配糖化酵素は、公知のデータベースを検索することにより、容易に見出すことができる。

植物細胞の内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素および内在性ピノレジノール配糖化酵素の発現を抑制する方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。例えば、標的遺伝子を改変する方法（例えば、遺伝子ノックアウト法等）、転写後に抑制する方法（例えば、ＲＮＡｉによるノックダウン法等）などが挙げられる。その他、標的遺伝子の転写を選択的に阻害・抑制する方法であってもよいし、スプライシング、翻訳、翻訳後修飾のいずれかのプロセスを選択的に阻害することにより、標的遺伝子産物の発現を特異的に抑制する方法であってもよい。

遺伝子ノックアウト法を用いる場合には、Ｔ−ＤＮＡ、トランスポゾン等を利用して遺伝子破壊株の集団を作製し、この中から標的遺伝子が破壊された株を選抜することにより、標的遺伝子が破壊された植物細胞を取得することができる。

ＲＮＡｉによるノックダウン法を用いる場合には、標的遺伝子のＲＮＡｉを生じさせるｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）等のＲＮＡ分子を人工的に作製し、これを植物細胞内に導入することにより標的遺伝子の発現が抑制された植物細胞を得ることができる。植物細胞において持続的かつ安定的に標的遺伝子の発現を抑制するために、ＲＮＡｉ発現ベクター構築し、これを植物細胞に導入することが好ましい。ＲＮＡｉ発現ベクターは、（１）１本のＲＮＡで適当な長さのヘアピン構造をもつｄｓＲＮＡを対象細胞内で発現させるように設計されたもの、（２）センス鎖、アンチセンス鎖それぞれを対象細胞内で発現させ、会合させるように設計されたもの、のいずれであってもよい。

標的遺伝子のＲＮＡｉを生じさせるＲＮＡ分子は、標的遺伝子の塩基配列に基づいて公知の方法で設計することができる。標的遺伝子の塩基配列は、公知のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等）から容易に取得することができる。例えば、本発明においてレンギョウ細胞を用いる場合、レンギョウのピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素（ＰＬＲ）をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号５）は、アクセッション番号Ｕ８１１５８としてＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている。また、レンギョウのピノレジノール配糖化酵素（ＵＧＴ７１Ａ１８）をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号６）は、アクセッション番号ＡＢ５２４７１８としてＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている。また、本発明においてアマ細胞を用いる場合、上記例示した各アクセッション番号のピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素（ＰＬＲ）をコードする遺伝子の延期配列、および、上記例示した各アクセッション番号のピノレジノール配糖化酵素をコードする遺伝子の延期配列に基づいてＲＮＡｉを生じさせるＲＮＡ分子を設計することができる。

レンギョウのピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素（ＰＬＲ）の発現を抑制するためのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、レンギョウのＰＬＲ遺伝子のＲＮＡｉを生じさせるＲＮＡ分子をコードするＤＮＡであればどのような塩基配列からなるものでもよい。本願発明者らは配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡを用いているが、これに限定されるものではない。また、レンギョウのピノレジノール配糖化酵素（ＵＧＴ７１Ａ１８）の発現を抑制するためのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、レンギョウのＵＧＴ７１Ａ１８遺伝子のＲＮＡｉを生じさせるＲＮＡ分子をコードするＤＮＡであればどのような塩基配列からなるものでもよい。本願発明者らは配列番号８で示される塩基配列からなるＤＮＡを用いているが、これに限定されるものではない。

外来性のセサミン合成酵素を発現させる方法としては、セサミン合成酵素遺伝子発現ベクターを植物細胞内に導入する方法が挙げられる。セサミン合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、公知のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等）から容易に取得することができる。例えば、本発明においてゴマ由来のセサミン合成酵素を用いる場合、ＣＹＰ８１Ｑ１をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２）はアクセッション番号ＡＢ１９４７１４として、ＣＹＰ８１Ｑ２をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号４）はアクセッション番号ＡＢ１９４７１５としてＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている。

内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素の発現を特異的に抑制するＲＮＡを発現するよう構築されたＲＮＡｉ発現ベクター、内在性ピノレジノール配糖化酵素の発現を特異的に抑制するＲＮＡを発現するよう構築されたＲＮＡｉ発現ベクターおよびセサミン合成酵素遺伝子発現ベクターは、１つのベクターに１つの発現カセットを含むベクターとして構築してもよく、１つのベクターに複数の発現カセットを含むベクターとして構築してもよい。１つのベクターに複数の発現カセットを含むベクターとしては、１つのベクターに２つの発現カセットを含むベクターとすることが好ましい。

発現ベクターは、植物細胞内で発現を可能とするプロモーターと、植物細胞内で発現させる遺伝子を含むように構築する。発現ベクターの母体となるベクターには、公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、コスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物細胞へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１等を挙げることができる。

プロモーターは、植物細胞内で導入した遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、各種アクチン遺伝子プロモーター、各種ユビキチン遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター、オレオシン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、アクチン遺伝子プロモーターまたはユビキチン遺伝子プロモーターを好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。

発現ベクターは、プロモーターおよび植物細胞内で発現させる遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、例えば、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて発現ベクターを植物細胞に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。

転写ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものを好適に用いることができる。例えば、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。なかでもＮｏｓターミネーターがより好ましい。発現ベクターに転写ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成されることを防止することができる。

形質転換体選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。具体的には、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。発現ベクターが薬剤耐性遺伝子を含むことにより、選択薬剤を含む培地中で生育する植物細胞を選択すれば、目的の形質転換植物細胞を容易に取得することができる。

翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えば、タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５‘ＵＴＲ）に配置させることによって、目的遺伝子の翻訳効率を高めることができる。

発現ベクターは、一般的な形質転換方法によって植物細胞に導入することができる。発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、公知の形質転換方法のなかから用いる植物細胞に応じた適切な方法を選択して用いればよい。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。目的の遺伝子を保持しているアグロバクテリウムを植物へ感染させる手法は、植物の種類などに応じて適切に選択することができる。例えば、リーフディスク法（Horsch, R.＆B.、 et al.: A simple and general method for trams-ferring cloned genes into plants. Science,227、 1229〜1231, 1985）、プロトプラスト共存培養法（Marton, L., et al.: In vitro transformation of cultured cell from Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens. Nature,277, 129〜131, 1981）、カルス再生法（Plant Cell Reports, 12,7-11,1992）、または、減圧浸潤法（The Plant Journal, 19(3), 249-257, 1999）等を採用することができるがこれらに限定されない。

アグロバクテリウムを植物細胞へ感染させた後、選択マーカー遺伝子の種類に応じた選択条件下で培養し、目的の形質転換細胞を選択することができる。選択した細胞が、内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素および内在性ピノレジノール配糖化酵素の発現が抑制され、外来性のセサミン合成酵素が発現していることは、宿主細胞におけるこれらの酵素の発現と比較することにより確認することができる。発現の確認には、ＰＣＲ、ウエスタンブロッティング等の公知の方法を用いることができる。

本発明の植物培養細胞は、植物培養細胞に上記の各発現ベクターを導入して作製してもよく、植物体または植物の一部（例えば、葉、茎など）に上記の各発現ベクターを導入した後に、植物培養細胞を調製してもよい。本発明の植物培養細胞は、カルスで継代された状態の細胞、懸濁培養細胞として継代された状態の細胞およびプロトプラストのいずれであってもよい。

植物体またはその一部に上記の各発現ベクターを導入した後に、植物培養細胞を調製する場合、植物培養細胞方法は特に限定されず、植物に応じて公知の方法から適宜選択して用いることができる。カルスを誘導する場合、植物体の一部の組織（例えば、根、茎、葉の切片、種子、生長点、胚、花粉等）の表面を、必要に応じて７０％アルコール、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液等を用いて滅菌した後、メス等を用いて適当な大きさの組織片（を切り出し、予め滅菌したカルス誘導培地に組織片を置床し適当な条件下で無菌培養する。カルス誘導培地としては、植物組織培養に通常用いられるムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、リンズマイヤー・スクーグ（ＬＳ）培地、ホワイト培地、ガンボーグＢ５培地、ニッチェ培地、ヘラー培地、モーレル培地等の基本培地（必要に応じて、カゼイン分解酵素、コーンスティープリカー、ビタミン類等をさらに補充することができる）に、オーキシン類および必要に応じてサイトカイニン類等の植物生長調節物質（植物ホルモン）を適当な濃度で添加した培地が挙げられる。オーキシン類としては、例えば、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）等が挙げられるが、それらに限定されない。オーキシン類は、例えば、約０．１〜約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。サイトカイニン類としては、例えば、カイネチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）、ゼアチン等が挙げられるが、それらに限定されない。サイトカイニン類は、例えば、約０．１〜約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。

カルス誘導培地は、液体培地であっても固形培地であってもよい。固形培地の場合、例えば、寒天、アガロース、ゲランガム等を約０．５〜約２％（ｗ／ｗ）となるように添加すればよい。培養容器としては、ガラス製の培養チューブ、三角フラスコ、ビーカーや、プラスチック製のアグリポット等を用いることができる。培養は、使用する植物種についてそれぞれ公知の好適な条件下で行うことができるが、例えば、固形培地を用いる場合、約２０〜約３０℃で約７〜約２８日間、静置培養する方法などが挙げられる。照明条件は培養に供される植物体に応じて適宜設定することができ、例えば２４時間明期、１６時間明期／８時間暗期、２４時間暗期等が選択され得る。誘導されたカルスは、すぐに大量増殖のために液体培養に供してよく、継代用培地で継代培養することにより種株として維持してもよい。

〔セサミン製造方法〕
本発明は、上記本発明の植物培養細胞を用いてセサミンを製造する方法を提供する。本発明の製造方法は、上記本発明の植物培養細胞を培養する培養工程と、植物培養細胞からセサミンを抽出および精製する抽出精製工程とを含む方法であればよい。本発明の製造方法は、セサミンを製造できる限りこれらの工程以外の工程を含んでもよく、その内容は特に限定されない。

培養工程における植物培養細胞の培養方法は特に限定されず、公知の植物培養細胞の培養方法を適宜選択して用いることができる。好ましくは液体培地を用いる懸濁培養である。用いる液体培地としては、上記カルス誘導培地の説明で例示した各種の基本培地またはその修正培地に、必要に応じて、カゼイン分解酵素、コーンスティープリカー、ビタミン類、植物ホルモンなどを添加した培地を用いることができる。植物ホルモンとしては、上記カルス誘導培地の説明で例示したオーキシン類および／またはサイトカイニン類を、上記と同様の濃度で添加することができる。

使用する培養槽は特に限定されないが、１Ｌ〜２５ｋＬ規模の大量培養槽を用いることが好ましい。例えば、通気型培養槽、気泡塔型培養槽、エアリフト型培養槽、回転ドラム型培養槽、通気攪拌型培養槽、スピンフィルター型培養槽などが挙げられる。培養槽の材質はガラス製またはステンレス製が一般的であるが特に限定されない。ただし、光照射条件で培養を行う場合は、光を透過する材質の培養槽を用いることが必要である。例えば、ガラス製、プラスチック製などが挙げられる。これらの培養槽は市販のものを好適に使用することができる。

培養は、滅菌した培養槽に液体培地を添加し、そこに本発明の植物培養細胞を接種することにより開始される。培養は回分培養、流加培養、連続培養のいずれを用いてもよい。培養開始時に接種する植物培養細胞の量は、培地量の約２％（ｖ/ｖ）〜約２０％（ｖ/ｖ）であることが好ましく、約５％（ｖ/ｖ）〜約１５％（ｖ/ｖ）であることがより好ましい。細胞の増殖速度、培養様式（回分培養、流加培養、連続培養等）、培養期間などに応じて適宜選択することができる。本発明の植物培養細胞は、通常２週間で約１０倍に増殖することが確認されている。

培養温度は、通常１０〜４０℃、好ましくは１０〜３０℃、より好ましくは２０〜３０℃の範囲である。培養期間は、植物培養細胞の種類、培養様式、初期細胞密度などによって変動するが、例えば回分培養の場合、７〜７０日間、好ましくは１４〜６０日間、より好ましくは２０〜４０日間である。

本発明の製造方法は、本発明の植物培養細胞を、赤色光照射条件下で培養することが好ましい。赤色光照射条件で培養することにより、暗条件または青色光照射条件で培養する場合に比べて、ピノレジノールアグリコン合成量およびセサミン合成量が顕著に増加することが確認されている。赤色光は、可視光領域（波長３８０〜８００ｎｍ）において、波長５５０〜８００ｎｍ領域の光成分が優勢である光であればよい。好ましくは波長６００〜７００ｎｍにピークを有する赤色光であり、より好ましくは６３０〜６７０ｎｍにピーク波長を有する赤色光である。本発明の製造方法における赤色光照射には、赤色光単独の照射のみでなく、赤色光を含む光の照射も含まれる。赤色光を含む光としては、自然白色光（例えば、日光など）、白色蛍光灯からの白色光などが挙げられる。光源は、赤色光を含む光を発生するものであれば特に限定されず、例えば、赤色ＬＥＤ、白色蛍光灯などを好ましく用いることができる。

本発明者らは、非特許文献１に記載のレンギョウ細胞（ゴマ由来のセサミン合成酵素を発現し、内因性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素の発現を抑制した形質転換細胞）を青色光照射条件下で培養した場合、暗条件で培養した場合と比較して増殖が抑制されずセサミン合成量が増加すること、赤色光照射条件下で培養した場合、暗条件で培養した場合と比較して増殖が抑制され、セサミン合成量は増加するが青色光照射の場合より合成量が低いことを報告している（Morimoto, K., Kim H.-J., Ono, E., Kobayashi, A., Okazawa, A., Satake, H. (2011) Effects of light on production of endogenous and exogenous lignans by Forsythia koreana wildtype and transgenic cells. Plant Biotechnol. 28(3), 331-337.）。しかし、本発明の植物培養細胞は、赤色光照射条件下で培養しても増殖が抑制されず、セサミン合成量は顕著に増加した。一方、本発明の植物培養細胞を青色光照射条件下で培養すると、セサミン合成量は増加せず、暗条件下で培養した場合とほぼ同等であった。

抽出精製工程において、植物培養細胞からセサミンを抽出および精製する方法は特に限定されず、公知の植物細胞抽出物の調製方法およびセサミン精製方法から適宜選択して用いることができる。例えば、本発明者らが実施例２で行った方法等が挙げられる。具体的には、懸濁培養した本発明の植物培養細胞を遠心分離、ろ過等の手段で採取し、これを凍結乾燥した後に破砕して８０％エタノールを加えて間超音波処理を行う。得られたサンプルを遠心分離して上清を回収して濃縮し、βグルコシダーゼ処理し、これにアセトニトリルを加えてＨＰＬＣで精製する方法が挙げられる（実施例２参照）。実施例２において、本発明者らは植物培養細胞を凍結乾燥した後に破砕しているが、これに限定されず、植物培養細胞からそのまま抽出することも可能である。抽出溶媒には、５０〜１００％メタノール、５０〜１００％エタノールを用いることができる、また、酢酸エチルなどの低極性溶媒を用いてもよい。

本発明の製造方法は、さらに本発明の植物培養細胞の凍結保存細胞を再培養する再培養工程を含むことが好ましい。植物培養細胞は、継代培養で維持する場合、通常約２年で死滅するが、凍結保存細胞を用いることにより同一クローンの植物培養細胞を長期間保存することが可能になる。したがって、同一クローンの植物培養細胞を用いてセサミンを長期間安定に製造することが可能となる。

本発明の植物培養細胞を凍結保存する方法は、セサミン合成能を維持したまま凍結保存できる方法であればよい。このような凍結保存方法としては本発明の植物培養細胞をアルギン酸ナトリウムビーズに封入して凍結保存する方法を好ましく用いることができる。植物培養細胞を封入したアルギン酸ナトリウムビーズは、例えば以下の方法で作製することができるが、これに限定されない。

最初にアルギン酸ナトリウム溶液を調製する。アルギン酸ナトリウム溶液は、通常、植物培養細胞の培養に使用している液体培地にアルギン酸ナトリウムを溶解させることで調製できるが、その他の生理的塩類溶液（例えば、カルシウムを含まないＰＢＳなど）アルギン酸ナトリウムを溶解させてもよい。アルギン酸ナトリウムの濃度は通常０．５％（ｗ／ｖ）〜５．０％（ｗ／ｖ）の範囲から選択され、より好ましくは１．０％（ｗ／ｖ）〜４．０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは１．５％（ｗ／ｖ）〜３．０％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは２．０％（ｗ／ｖ）〜２．５％（ｗ／ｖ）の範囲から選択される。アルギン酸ナトリウム溶液には、浸透圧調節用の添加物を添加することが好ましい。浸透圧調節用添加物としては、例えば、スクロース、マルトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等が挙げられる。浸透圧調節用添加物の含有量は、通常０．１〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲から選択され、より好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは２．５〜１０％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは２．５〜５％（ｗ／ｖ）の範囲から選択される。

次に、本発明の植物培養細胞とアルギン酸ナトリウム溶液を混合して細胞懸濁液を調製する。そのため、一定期間懸濁培養した懸濁培養液を遠心分離、ろ過等して培地を除去し、細胞を集める。集めた細胞と上記のアルギン酸ナトリウム溶液を混合することにより、アルギン酸ナトリウムを含む細胞懸濁液を調製することができる。細胞とアルギン酸ナトリウム溶液の混合比は、細胞の体積１に対してアルギン酸ナトリウム溶液の体積（容積）が０．５〜２であることが好ましく、１〜１．５であることがより好ましい。

次に、カルシウム溶液を調製する。カルシウム溶液の調製に用いるカルシウム塩は特に限定されないが、塩化カルシウムを好適に用いることができる。カルシウム溶液は、アルギン酸ナトリウム溶液と同様に、植物培養細胞の培養に使用している液体培地やその他の生理的塩類溶液を用いて調製することができる。本発明においては、アルギン酸ナトリウム溶液とカルシウム溶液のベースとなる溶液は、同じものを用いることが好ましい。塩化カルシウムを用いる場合、塩化カルシウム濃度は通常０．０２〜０．５Ｍの範囲から選択され、より好ましくは０．０４〜０．４Ｍ、さらに好ましくは０．０６〜０．２Ｍ、特に好ましくは０．０８〜０．１５Ｍの範囲から選択される。カルシウム溶液には、浸透圧調節用の添加物を添加することが好ましい。浸透圧調節用添加物としては、例えば、スクロース、マルトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等が挙げられる。浸透圧調節用添加物の含有量は、通常０．１〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲から選択され、より好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは２．５〜１０％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは２．５〜５％（ｗ／ｖ）の範囲から選択される。

アルギン酸ナトリウムを含む細胞懸濁液をカルシウム溶液の中に１滴ずつ滴下することにより、植物培養細胞を封入したアルギン酸ナトリウムビーズを作製することができる。形成されるビーズ（ビーズ状ゲル）のサイズは、アルギン酸ナトリウムを含む細胞懸濁液を滴下する際に用いる器具先端の形状により決定される。すなわち小径のビーズを形成するには、細胞とアルギン酸混液をシリンジに吸引し、２５Ｇ〜１９Ｇ程度の注射針を介して滴下すればよい。または、マイクロピペットを用いて滴下してもよい。より大きなビーズを形成するには、注射針を付けていないシリンジ先端から直接滴下すればよい。またはピペットを用いて滴下してもよい。本発明の植物培養細胞を凍結保存するためのアルギニン酸ナトリウムビーズのサイズは、直径１ｍｍ〜１０ｍｍであることが好ましく、直径２ｍｍ〜７ｍｍであることがより好ましく、直径３ｍｍ〜５ｍｍであることがさらに好ましい。直径３ｍｍ〜５ｍｍのビーズを形成させる場合、例えば市販の１０ｍＬプラスチックピペットを好適に用いることができる。

続いて、形成された植物培養細胞封入アルギン酸ナトリウムビーズ（以下、単に「ビーズ」と称する場合がある。）をカルシウム溶液から分離し、カルシウム塩を除去するためにビーズの洗浄を行う。洗浄は、ビーズに残存するカルシウム塩による細胞毒性が発現しない程度にカルシウム塩を除去できる方法であれば、どのような方法で行ってもよい。本発明者らは、植物細胞培養用の培地を添加して、１０〜２０分間、攪拌または振とうすることにより洗浄しているが、これに限定されない。

ビーズを浸漬して凍結するための凍結保存液は特に限定されず、例えば、植物細胞培養用の培地に公知の凍結保護物質を添加したものを保存液として好適に用いることができる。例えば、本発明者らは、２Ｍグリセロール、０．４Ｍスクロース、１％プロリンを凍結保護剤として含むガンボーグ５Ｂ培地を用いているが、これに限定されない。グリセロールの添加量は１．０〜５．０Ｍ、スクロースの添加量は０．１〜２．０Ｍ、プロリンの添加量は０．５〜１０．０％（ｗ／ｖ）の範囲からそれぞれ選択することが好ましい。また、スクロースに代えて、凍結保護剤として通常使用される単糖（グルコース等）、二糖（ラクトース、トレハロース等）、糖アルコール（ソルビトール、マンニトール等）を用いることも可能である。

上記洗浄後のビーズは、凍結する前に凍結保存液に一定時間浸漬し、馴化させることが好ましい。ビーズを凍結保存液に一定時間浸漬することにより、ある程度細胞が脱水し、同時に脱水に対する耐性を誘導することができる。浸漬時間は特に限定されないが、１０分〜３時間が好ましく、２０分〜２時間がより好ましく、３０分〜１．５時間がさらに好ましい。浸漬中は、緩やかに攪拌または振とうすることが好ましい。

凍結保存には、培養細胞の凍結保存に使用可能な公知の容器を用いることができる。具体的には、例えば市販のポリプロピレン製クライオバイアル（クライオチューブ、セラムチューブとも称される）などを好適に用いることができる。凍結保存液の液量は、ビーズが浸る最少量であることが好ましい。ビーズが浸る最少量は、凍結保存の形状および収容するビーズの個数に応じて適宜選択することができる。本発明者らは、１ｍｌ容量のポリプロピレン製クライオバイアルに２５０μｌの凍結保存液と５個のビーズを入れて凍結保存しているが、これに限定されない。
ビーズおよび凍結保存液を収容した凍結保存容器は、予備凍結を行ってから液体窒素中で凍結保存することが好ましい。予備凍結には、公知の緩速予備凍結法や簡易予備凍結法を用いることができる。

再培養工程において、本発明の植物培養細胞の凍結保存細胞を再培養する方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。すなわち、液体窒素から取り出した凍結保存容器を直ちに約３７℃〜約４０℃の温水に投入し、急速に融解させる。融解させたビーズを通常の液体培地と接触させる前に、浸透圧の急激な変化による細胞の障害を防止するために、通常の液体培地より浸透圧を高めた培地に浸漬することが好ましい。好ましくは、浸透圧の異なる培地を複数準備し、高い方から低い方へ順次浸漬させた後に、通常の液体培地を用いて培養を開始する。浸透圧調節剤としては、例えば、スクロース、マルトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセリン等が挙げられる。浸透圧調節剤は、凍結保存液に用いたものと同じものを用いることが好ましい。浸透圧調節用培地の量は、ビーズの体積に対して過剰量を用いることが好ましく、大過剰量を用いることがより好ましい。浸漬時間は特に限定されないが、通常約５分〜約１時間である。浸漬中は、緩やかに攪拌または振とうすることが好ましい。本発明者らは、融解した凍結保存ビーズ（５個）を最初に１．２Ｍスクロース入り培地（３０ｍｌ）に投入し１５分間緩やかに振とうし、次に０．５Ｍスクロース入り培地（３０ｍｌ）に投入し１５分間緩やかに振とうした後、通常の液体培地に移行しているが、これに限定されない。

次に、浸透圧調節処理を経たビーズを通常の液体培地を用いた培養に移行させる。最初はビーズのままで培養することが好ましい。培養は通常の植物細胞の培養条件（例えば、２５℃、暗条件、１１０ｒｐｍ）を採用すればよい。ビーズのままで培養する期間は特に限定されず、封入された植物細胞がビーズのままで増殖できる適当な培養期間を適宜設定すればよい。ビーズのままで封入された植物細胞をある程度増殖させた後、ビーズを破壊して内部の細胞を培地中に回収し、培養を続ける。細胞密度が低すぎると細胞が増殖し難くなるため、培養容器とビーズの個数で細胞密度を適切に調節することが好ましい。本発明者らは、１２ウェルプレートの１ウェルに約３ｍｌの培地を入れ、その中に５個のビーズを入れて３日間培養した後、ビーズを破壊して培養を続けているが、これに限定されない。細胞の増殖を確認しながら培養を続け、適宜スケールアップして通常スケールの懸濁培養に移行することが好ましい。通常スケールの懸濁培養に移行した植物培養細胞を培養槽に液体培地に接種することにより、培養工程が開始される。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔実施例１：セサミン高生産レンギョウ細胞の作製〕
チョウセンレンギョウ（Forsythia koreana）の葉から調製した懸濁培養細胞（以下、「レンギョウ細胞」という。）に、ゴマ由来セサミン合成酵素遺伝子、内在性ＰＬＲ遺伝子発現抑制用遺伝子、内在性ピノレジノール配糖化酵素遺伝子発現抑制用伝子を導入したセサミン高生産レンギョウ細胞を、以下の手順で作製した。

チョウセンレンギョウ植物は、京都大学生存圏研究所・梅澤俊明博士から入手した。表面を無菌処理したチョウセンレンギョウの葉片を、０．２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを加えたガンボーグ５Ｂ固形培地（ショ糖３％、寒天０．９％）に置床し、暗条件下２７℃で６週間、カルスを誘導した。カルス組織は、４週間ごとに同じ培地を用いて継代、維持した。カルスをガンボーグ５Ｂ液体培地（５０ｍｌ／２００ｍｌフラスコ）に移して細胞懸濁培養を開始した。懸濁培養細胞は、暗条件、１１０ｒｐｍにて振とう培養し、２週間ごとに培養細胞５ｍｌを新しい液体培地５０ｍｌに加えて継代した（非特許文献１参照）。

ゴマ由来セサミン合成酵素遺伝子ＣＹＰ８１Ｑ１（accession No. AB194714）および内在性ＰＬＲ遺伝子（accession No.U81158）発現抑制用遺伝子を導入するためのバイナリ―ベクターｐＳＰＢ３１０４は、非特許文献１の記載に従って作製した。図１にｐＳＰＢ３１０４の構造を示した。図１中ＮＰＴIIはネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子）、ｐ３５Ｓはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＷ）３５Ｓプロモーター、ｔＮＳはノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターをそれぞれ表す。

次いで、内在性ピノレジノール配糖化酵素遺伝子ＵＧＴ７１Ａ１８（accession No.AB524718）発現抑制用遺伝子を導入するためのベクターを作製した。チョウセンレンギョウの懸濁培養細胞から抽出したトータルＲＮＡから、プライマーにオリゴｄＴ、逆転写酵素にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを用いて定法に従ってｃＤＮＡ合成し、これを鋳型にしてＰＣＲによりＵＧＴ７１Ａ１８の部分ＯＲＦをＰＣＲで増幅した。プライマーセットには、フォワード：RNAi-cacc-Reng14-Fw（5’-cacccaggaataggtcacttgatatcaa-3’、配列番号９）およびリバース：RNAi-Reng14-Rv（5’-gaatggagccaaactatcctt-3’、配列番号１０）得られたＰＣＲ産物をＲＮＡｉベクターｐＡＮＤＡ３５ＨＫ（非特許Miki and Shimamoto Plant Cell Physiol. (2004)およびhttp://bsw3.naist.jp/simamoto/pANDA/real/pANDA35HK_map.htmを参照）にＬＲｃｌｏｎａｓｅ（ライフテクノロジーズ社）を用いて製造元が推奨する方法で挿入し、ｐＡＮＤＡ３５ＨＫ−ＵＧＴ７１Ａ１８を作製した。図２にｐＡＮＤＡ３５ＨＫ−ＵＧＴ７１Ａ１８の構造を示した。図２中ＮＰＴIIはネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子）、ＨＰＴはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子）、ｐ３５Ｓはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＷ）３５Ｓプロモーター、ｇｕｓ ｌｉｎｋｅｒはベータグルクロニダーゼ遺伝子部分配列（塩基配列は、http://bsw3.naist.jp/simamoto/pANDA/real/gus_linker.htmを参照）、ｔはターミネーターをそれぞれ表す。

レンギョウ細胞の形質転換は、定法に従いアグロバクテリウムを用いて行った。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０５株をｐＳＰＢ３１０４にて定法に従って形質転換した。得られた形質転換アグロバクテリウムを、カナマイシン５０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で２８℃、１８０ｒｐｍで振とう培養し、ＯＤ６００が１となるように４〜５時間培養した。９ｃｍのシャーレに４日間培養したチョウセンレンギョウ懸濁培養細胞１０ｍｌを入れ、０．１ｍｌの形質転換アグロバクテリウムを加えて２日間、２７℃、暗条件で共存培養した。共存培養後、細胞懸濁液を４回新しい培地と交換し、アグロバクテリウムを除いた。この培養細胞をカナマイシン５０ｍｇ／ｍｌ、セフォタキシム１００ｍｇ／ｌを含むガンボーグ５Ｂ固形培地に置床し、形質転換培養細胞の選抜を行い、形質転換カルスを得た。これらをガンボーグ５Ｂ液体培地へ移し、培養細胞系統ＣＰｉ−Ｆｋ（ＣＹＰ８１Ｑ１過剰発現およびＰＬＲ ＲＮＡｉ）を得た。

次に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０５株をｐＡＮＤＡ３５ＨＫ−ＵＧＴ７１Ａ１８にて定法に従って形質転換した。得られた形質転換アグロバクテリウムを、カナマイシン５０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で２８℃、１８０ｒｐｍで振とう培養し、ＯＤ６００が１となるように４〜５時間培養した。９ｃｍのシャーレに４日間培養したＣＰｉ−Ｆｋ１０ｍｌを入れ、０．１ｍｌの形質転換アグロバクテリウムを加えて２日間、２７℃、暗条件で共存培養した。共存培養後、細胞懸濁液を４回新しい培地と交換し、アグロバクテリウムを除いた。この培養細胞をハイグロマイシン５０ｍｇ／ｍｌ、セフォタキシム１００ｍｇ／ｌを含むガンボーグ５Ｂ固形培地に置床し、形質転換培養細胞の選抜を行い、形質転換カルスを得た。これらをガンボーグ５Ｂ液体培地へ移し、培養細胞系統Ｕ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋ（ＣＹＰ８１Ｑ１過剰発現、ＰＬＲ ＲＮＡｉおよびＵＧＴ７１Ａ１８ ＲＮＡｉ）を得た。得られた２系統の形質転換チョウセンレンギョウ培養細胞は、２００ｍｌフラスコを用いて暗条件、２５℃、１２０ｒｐｍにて振とう培養し、２週間ごとに増殖した培養細胞５ｍｌを新しい液体培地５０ｍｌに加えて継代した。

ＣＰｉ−ＦｋおよびＵ１８ｉＣＰｉ−ＦｋにおけるＣＹＰ８１Ｑ１、ＰＬＲおよびＵＧＴ７１Ａ１８の発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した。ＣＰｉ−Ｆｋ、Ｕ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋおよび野生型チョウセンレンギョウ培養細胞よりトータルＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴプライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩを用いて定法に従ってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型に用い、以下の各プライマーを用いてＰＣＲを行った。
ＣＹＰ８１Ｑ１増幅用プライマー
CYP81Q1-Fw：5’-atggaagctgaaatgctatattcagct-3’、配列番号１１
CYP81Q1-Rv：5’-aacgttggaaacctgacgaagaactttttc-3’、配列番号１２
ＰＬＲ増幅用プライマー
PLR-Fw：5’-atgggaaaaagcaaagttttgatcattgg-3’、配列番号１３
PLR-Rv：5’-cacgtaacgcttgaggtactcttccac-3’、配列番号１４
ＵＧＴ７１Ａ１８増幅用プライマー
UGT71A18-Fw：5’-tagcagatcaacccagtaaat-3’、配列番号１５
UGT71A18-Rv：5’-tcttgccatactgacgaatgg-3’、配列番号１６
ＰＣＲ酵素としてＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Takara Bio, Otsu Japan）を使用し、９４℃３０秒、５７℃３０秒、７２℃１分を１サイクルとして最大３５サイクル増幅した。ＰＣＲ産物の解析は定法に従いアガロースゲル電気泳動にて行った。

結果を図３に示した。図中「Ｃｙｃｌｅｓ」はＰＣＲサイクル数を示す。Ｕ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋでは、野生型（ＷＴ）と比較して、外来遺伝子であるＣＹＰ８１Ｑ１の発現、内在性遺伝子ＰＬＲの発現抑制および内在性遺伝子ＵＧＴ７１Ａ１８の発現抑制が認められ、目的の細胞が得られたことを確認した。ＵＧＴ７１Ａ１８発現抑制用ベクターが導入されていないＣＰｉ−Ｆｋでは、野生型（ＷＴ）と比較して、外来遺伝子であるＣＹＰ８１Ｑ１の発現および内在性遺伝子ＰＬＲの発現抑制が認められた。なお、「ＮＰＴ２」はｐＳＰＢ３１０４の導入を確認するため、「ＨＰＴ」はｐＡＮＤＡ３５ＨＫ−ＵＧＴ７１Ａ１８の導入を確認するためのバンドである。

〔実施例２：セサミン高生産レンギョウ細胞を用いたセサミンの生産〕
ＣＰｉ−ＦｋおよびＵ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋから、以下の方法でリグナンを抽出し、ＨＰＬＣにより定量した。すなわち、暗条件で培養した各レンギョウ細胞５ｍｌを５０ｍｌの培地に植え継ぎ、２５℃、１１０ｒｐｍ、暗条件で２週間培養した。次いで細胞をろ紙で濾し取り、液体窒素で凍結させた後、４８時間凍結乾燥させた。凍結乾燥した細胞１００ｍｇを液体窒素で冷やしながら乳鉢、乳棒ですり潰した。８０％エタノールを１ｍｌ加え、４℃で１５秒間超音波処理した。得られたサンプルを４℃、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を回収した。上清を１００μｌに濃縮した後、１００μｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）、６Ｕ/ｍｌのアーモンドβグルコシダーゼ（Sigma-Ardrich, USA）を加えて４０℃、１６時間酵素処理した。５０％アセトニトリルとなるようにアセトニトリルを添加して混合し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をＭｉｌｌｅｘ−ＬＨフィルター（0.45μm 4mm^-1 ;Millipore, Bedford, MA, USA）でろ過し、この水層部分をＨＰＬＣで分析した。

ＨＰＬＣ分析のカラムには、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ５カラム（4.6×150mm, Nomura Chemical, Japan）を用いた。ＨＰＬＣは、溶液Ａ［０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ_２Ｏ］と溶液Ｂ［９０％アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）］を溶出液として、３５−９０％溶液Ｂ／２０分間の直線濃度勾配、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎ、７分間９０％溶液Ｂでの洗浄という条件で実施し、２８０ｎｍにおける吸収によりリグナン類を検出した。

結果を図４に示した。図４のグラフの縦軸はリグナン量（ｍｇ／ｇＤＷ）を示す。図４中「ｐｉｎｏｒｅｓｉｎｏｌ」はピノレジノールアグリコンを、「ｐｉｎｏｒｅｓｉｎｏｌ−ｔｏｔａｌ」はピノレジノール配糖体およびアグリコンの総和を意味する。図４から明らかなように、内在性ピノレジノール配糖化酵素遺伝子の発現を抑制したＵ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋは、当該遺伝子を発現しているＣＰｉ−Ｆｋと比較して、ピノレジノール量が約３倍増加し、セサミン生産量が約１．４倍増加した。

〔実施例３：セサミン高生産レンギョウ細胞に対する光照射の効果〕
暗条件下で培養したＵ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋまたは野生型レンギョウ細胞を継代した直後から、白色蛍光灯、赤色ＬＥＤ（600-700 nm、630 nm peak）青色ＬＥＤ（450-550 nm、470 nm peak）をそれぞれ光量 １００μｍｏｌ ｍ^−２ｓ^−１ ＰＰＦＤ（photosynthetic photon flux density）にて照射しながら２週間培養し、光照射を行わず暗条件で培養を続けた各レンギョウ細胞のリグナン量と比較した。リグナンの抽出および定量は、実施例２と同じ方法で行った。

結果を図５（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）はＵ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋの結果、（Ｂ）は野生型（ＷＴ）の結果である。グラフの縦軸はリグナン量［10μg/gDW］を示し、「Ｄａｒｋ」は暗条件で培養した細胞、「Ｒｅｄ」は赤色光を照射した細胞を示す。図５（Ａ）および（Ｂ）から明らかなように、Ｕ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋでは、赤色光照射により暗条件と比較してセサミン合成量が約１．５倍増加した。またピノレジノールアグリコンおよびマタイレジノールは、赤色光照射により暗条件と比較して約５倍増加した。一方、野生型レンギョウ細胞（ＷＴ）では、赤色光照射によりピノレジノールアグリコン、マタイレジノールともに量が減少した。

また、Ｕ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋに対する赤色光照射がセサミンおよびピノレジノ―ルアグリコンの合成量に与える効果を白色光および青色光と比較した結果を図６（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）はセサミン合成量の結果、（Ｂ）はピノレジノ―ルアグリコン合成量の結果である。グラフの縦軸はリグナン量［10μg/gDW］を示し、「Ｄａｒｋ」は暗条件で培養した細胞、「Ｗｈｉｔｅ」は白色光を照射した細胞、「Ｂｌｕｅ」は青色光を照射した細胞、「Ｒｅｄ」は赤色光を照射した細胞を示す。図６（Ａ）から明らかなように、暗条件、白色光照射、青色光照射と比較して赤色光照射はセサミン合成量を約２〜３倍増加させることが示された。一方、図６（Ｂ）から明らかなように、赤色光照射によるピノレジノールアグリコンの合成量増加の割合は白色光照射による増加と同程度で、青色光照射と比べて約３倍高かった。

〔実施例４：セサミン高生産レンギョウ細胞の保存および再培養〕
継代後１週間経過したＵ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋ５ｍｌを１５ｍｌチューブに入れ、１００×ｇ、５分間、室温にて遠心分離し、細胞を沈降させた。ピペットで上清を除き、細胞体積を目算した。細胞体積の１〜１．５倍体積量のビーズ液（２％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウム、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．２ｍｇ/ｌ ２，４−Ｄを含むガンボーグ５Ｂ培地）を加え、数回ピペッティングして細胞を懸濁した。次いで２５０ｍｌフラスコに９０ｍｌのゲル化液（０．１Ｍ塩化カルシウム、３％（ｗ／ｖ）スクロース、０．２ｍｇ/ｌ ２，４−Ｄを含むガンボーグ５Ｂ培地）を分注した。ピペットを用いて細胞懸濁液をゲル化液の中に１滴ずつ滴下し、ビーズを作製した。

ピペットを用いてゲル化液を除いた後、レンギョウ細胞培養用の通常培地（以下、単に「培地」という。）１０ｍｌを加え、よく撹拌した後に培地を除いた。約３０ｍｌの培地を加えて１０〜２０分間振とうした。培地を除き、約１０ｍｌのＬＳＰ液（２Ｍグリセロール、０．４Ｍスクロース、１％（ｗ／ｖ）プロリンを含む培地）でビーズを洗浄し、ＬＳＰ液を除去した後、これにあらためて約５０ｍｌのＬＳＰ液を加えて１時間振とうした。１ｍｌ容量のポリプロピレン製クライオバイアルに２５０μｌのＬＳＰ液を分注し、その中にピンセットを用いてビーズ５個を移した。バイアルを入れたラックを発泡スチロールの箱に入れて−３０℃フリーザー中に４〜５時間静置し、予備凍結を行った。次いでバイアルを液体窒素中に移し、保存した。

液体窒素中で凍結保存したＵ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋを以下の方法で再培養した。すなわち、５０ｍｌチューブに約３０ｍｌの希釈液（１．２Ｍスクロース入り培地）を分注した。クライオバイアルを４０℃のお湯に投入し加温した後、試料を速やかに希釈液に移し、１５分間ゆるやかに振とうした（約７０ｒｐｍ）。次いでピペットを用いて希釈液を除き、約３０ｍｌの希釈液（０．５Ｍスクロース入り培地）を加え、１５分間ゆるやかに振とうした。希釈液を約３０ｍｌの培地と交換し、１５分間ゆるやかに振とうした後、約３ｍｌの培地を入れた１２ウェルプレートにビーズを５個移し、３日間、通常条件で振とう培養を行った。その後スパーテルを用いてビーズを破壊し、内部の細胞を培地中に回収した。約２週間、通常の条件（２５℃、暗条件、１１０ｒｐｍ）で振とう培養を行い、細胞の増殖を確認したら６ウェルプレートに移し、さらに約２週間、通常条件で振とう培養した。細胞が増殖したことを確認し、通常スケール（５０ｍｌ培地／２００ｍｌフラスコ）の培養に移行した。

Ｕ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋを１０日間保存した後に再培養し、５５日目にリグナン量を定量した。また、Ｕ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋを６か月間保存した後に再培養し、６５日目にリグナン量を定量した。同じ細胞の保存前におけるリグナン量と比較した。リグナンの抽出および定量は、実施例２と同じ方法で行った。

結果を図７（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）１０日間保存した後に再培養した結果、（Ｂ）は６か月間保存した後に再培養した結果である。グラフの縦軸はリグナン量［μg/gDW］を示す。図７（Ａ）に示したように、１０日間極低温で保存したＵ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋは、再培養開始後５５日の時点で保存前と同程度のセサミンを合成することが明らかとなった。図４（Ｂ）に示したように、６か月間極低温で保存したＵ１８ｉＣＰｉ−Ｆｋは再培養開始後６５日で保存前と同程度のセサミンを合成することが明らかとなった。

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (12)

1. 内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素および内在性ピノレジノール配糖化酵素を発現する植物由来の培養細胞であって、内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素および内在性ピノレジノール配糖化酵素の発現を抑制し、外来性のセサミン合成酵素を発現するように改変された植物培養細胞。
2. 内在性ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素の発現を特異的に抑制するＲＮＡを発現するよう構築されたＲＮＡｉ発現ベクター、内在性ピノレジノール配糖化酵素の発現を特異的に抑制するＲＮＡを発現するよう構築されたＲＮＡｉ発現ベクターおよびセサミン合成酵素遺伝子発現ベクターが導入されていることを特徴とする請求項１に記載の植物培養細胞。
3. セサミン合成酵素が、ゴマ由来のセサミン合成酵素である請求項１または２に記載の植物培養細胞。
4. ゴマ由来のセサミン合成酵素が、配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項３に記載の植物培養細胞。
5. ゴマ、レンギョウまたはアマ由来の植物培養細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の植物培養細胞。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の植物培養細胞を培養する培養工程と、植物培養細胞からセサミンを抽出および精製する抽出精製工程とを含むことを特徴とするセサミンの製造方法。
7. 培養工程において、赤色光を含む光照射条件下で培養することを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
8. 培養工程において、赤色光照射条件下で培養することを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
9. さらに、請求項１〜５のいずれかに記載の植物培養細胞の凍結保存細胞を再培養する再培養工程を含む請求項６〜８のいずれかに記載の製造方法。
10. 凍結保存細胞が、請求項１〜５のいずれかに記載の植物培養細胞をアルギン酸ナトリウムビーズに封入して凍結保存した細胞である請求項９に記載の製造方法。
11. 請求項１〜５のいずれかに記載の植物培養細胞を、セサミン合成能を維持したまま凍結保存する方法であって、前記植物培養細胞をアルギン酸ナトリウムビーズに封入して凍結することを特徴とする凍結保存方法。
12. 液体窒素中で凍結保存することを特徴とする請求項１１に記載の凍結保存方法。