KR100393908B1

KR100393908B1 - 당뇨합병증에 유효한 복분자 추출물

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Publication number: KR100393908B1
Application number: KR10-2001-0002986A
Authority: KR
Inventors: 김해리; 정금심; 이영아
Original assignee: 김해리
Priority date: 2001-01-18
Filing date: 2001-01-18
Publication date: 2003-08-02
Also published as: KR20020061902A

Abstract

본 발명은 당뇨합병증에 유효한 복분자(Rubus coranus Miquel) 추출물에 관한 것이다. 구체적으로, 복분자 추출물이나 과량의 비타민 E나 비타민 C를 당뇨병 유도된 흰쥐에게 투여 시 당뇨합병증을 억제하는 효과가 있음을 관찰하고, 이에 당뇨합병증의 억제 또는 예방에 효과적인 복분자 추출물 또는 과량의 비타민 E 또는 비타민 C를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명의 약학 조성물은 백내장 및 신증의 치료 및 예방에 효과적이다.

Description

당뇨합병증에 유효한 복분자 추출물{RUBUS CORANUS MIQUEL EXTRACT WITH DIABETIC COMBINATION-INHIBITING EFFECT}

본 발명은 당뇨합병증의 치료에 유효한 약학 조성물에 관한 것으로, 특히, 당뇨합병증의 진행을 억제하는 효과가 있는 복분자 추출물 또는 과량의 비타민 E나 비타민 C를 함유하는 약제에 관한 것이다.

당뇨병은 적절한 식이 조절과 운동, 약물로 조절할 수 있다. 주요 성인병 중 하나인 당뇨병은 일상생활에서의 주의가 요구되는 병인 것이다. 그러나 통계청의 99년 사망원인 특별조사보고서에 의하면 97년과 비교 시 당뇨병은 인구 십만명 당 18.8명에서 98년 21.1명으로 12.2%증가하였다. 남자의 경우는 12.0%이며 여자의 경우 11.9%이다. 또한 89년에서 98년 사이에는 124.5% 증가하였다. 특히 인구고령화에 따른 성인병이 많은데 60대의 경우 사망원인 5위를 차지하며 70대 이상에서 3위를 나타내었다(통계청,1999). 또 국내의 당뇨병 이환률은 1990년 서울대학교 보건대학원의 전국적인 조사결과를 보면 전체 인구의 3%에 달하는 것으로 추정되고 있다(민,1992). 당뇨병에 의한 사망원인은 합병증으로 15-20년이 지나면 체내 여러 기관이 손상을 받아 당뇨병성 백내장, 신장병, 말초신경장애, 고지혈증 등의 만성당뇨합병증이 나타난다(Vlassara,1990; Foster,1991). 당뇨병에 의한 사망률은 유병기간이 길어질수록 증가하는데 10년씩 증가할 때마다 24%씩 증가한다고 보고하고 있다(West,1978).

고혈당으로 인한 만성퇴행성 변화의 병인은 아직까지 확실히 밝혀지지 않았으나 크게 단백질 당화, 폴리올 경로의 기작 변화에 의한 삼투압 스트레스(Van Heyningen,1959)와 자유 라디칼에 의한 산화적 스트레스 등으로 설명되고 있다.

1. 단백질 당화

단백질 당화란 단백질의 N-말단의 α-아미노기 또는 리신 잔기의 ε-아미노기와 당의 알데히드가 효소 작용없이 친핵성 첨가반응을 하고, 이를 통해 알디민(aldimine) 혹은 쉬프 염기(schiff base)를 형성하고 이후 안정된 화합물인 글리코실아민을 형성하는 과정을 말한다. 기저막, 혈장알부민, 수정체 단백질, 피브린, 콜라겐 등에서 당화가 일어나며 당화 단백질로 잘 알려진 것이 HbA₁c이다. 아마도리(Amadori) 화합물은 생리적 pH에서 자동 산화하여 과산화물(superoxide) 라디칼과 히드록실 라디칼을 생성하는(Mullarkey et al.,1990) 등과 같이, 당화 단백질은 원래 기능과 다른 특성을 나타내며 노화와 당뇨 기간동안 조직과 혈액에 축적된다. 비효소적 당화 과정에 의한 아마도리 산물과 안정한 최종 당화 산물(advanced glycosylation end product, AGE)에 대한 연구가 많이 진행되어 있으며 당뇨 조직 중에서 여러 종류의 당화 단백질을 보고하고 있다(Paulraj Chellan et al.;1999). 또한, 아미노구아니딘도 당화 단백질의 축적을 감소시켜 만성 고혈당으로 인한 조직의 손상을 억제시켰다는 연구 보고가 있다.

2. 폴리올 경로

폴리올은 알도스(aldose)나 케토스(ketose)로 부터 알도스 환원효소(AR) 작용에 의해 환원되어 형성되는 알코올이다. 이 과정은 포도당의 인산화 과정 없이 일어나며 NADPH를 조효소로 사용한다. 이렇게 형성된 소르비톨이 다시 소르비톨 탈수소효소(SDH)에 의해 산화되어 과당을 생성한다. 이 두 단계를 폴리올 경로라 한다(Van Heyningen,1959; Nishimura et al.1994). 알도스 환원효소는 정상적인 상태의 포도당 농도에서는 친화력이 낮으며 당뇨병과 같은 고농도의 상태에서 활성화된다. AR에 의해 조직내 축적된 소르비톨이 당뇨 합병증의 원인이 될 수 있음을 보이는 연구 보고와 AR의 저해제가 합병증에 효과를 보이는 연구결과들이 많이 이루어져 있다. 그러나 단순히 소르비톨의 축적이 원인이라기 보다는 이 과정에서 일어나는 대사적 변화가 당뇨합병증 발달에 큰 역할을 한다는 연구 결과들이 많다. 또 사람의 경우 실험동물에서 보이는 소르비톨 농도보다 낮다는 결과도 있다(Hong-Ming Cheng et al.1986). 즉 폴리올 경로에 의해 일어나는 세포내 삼투압 변화와 이로 인한 세포내의 칼륨, 아미노산, 글루타치온, 이노시톨, ATP의 농도 감소, Na/K-ATPase의 활성감소 등의 변화를 들고 있다(Peter F. Kador et al.,1985; Kinoshita, 1974; Spector, 1995). 또, 폴리올 경로에 의한 삼투압변화 외에 산화적 스트레스와의 관계에 대한 연구보고도 있는데, 소르비톨이 대사 과정에서NADP+/NADH와 NAD+/NADH의 산화환원 상태가 변화되어 글루코스 대사에 영향을 미치며 글루타치온이나 단백질의 설프하이드릴 기의 산화를 촉진시키는 것이다(Ansari et al., 1996; Kubo et al., 1999; Patrick et al., 1985; Srivastava et al., 1989). 또한 AR과 글루타치온 환원효소(GR)는 조효소인 NADPH를 사용하기 때문에 폴리올 경로 상태에서 NADPH의 주요 급원인 6탄탕 일인산염 측로(Hexose Monophosphate Shunt)가 활성화된다. 그러나 AR과 GR의 NADPH 경쟁으로 GR의 산화물질 해독능력이 감소되고 자유 라디칼을 제거하는 능력이 감소하게 되어 산화적 손상을 받게 된다(Barnett et al.,1986; Patrick et al., 1985; Srivastavaet al.,1989).

이러한 산화적 스트레스에 대해 세포는 효소적 항산화계(GR, GPx, 카탈라제, 과산화물 디스뮤타제)와 비효소적 항산화계(GSH, α-토코페롤, 아스코르빈산)의 방어 시스템을 갖고 있다. 이중 GSH 의존성 효소계는 세포에서 지질 과산화반응에 대해 중요한 방어작용을 한다. GPX는 지질과산화수소(ROOH)를 포함한 H₂O₂를 환원하는 효소이다(Tappel, 1978). 이때 산화된 GSH는 GR에 의해 재환원된다(Cariberg and Mannervick, 1981).

당뇨 상태에서의 대사 변화 기작에 대해 연구가 많이 이뤄진 부분 중 하나가 신장과 눈이다. 당뇨인 경우는 20-30대에서도 백내장이 나타나며 정상인에 비해 실명의 위험이 약25배에 이르는 것으로 알려져 있다(고 등, 1991). 수정체 혼탁으로 빛이 망막에 이르는 것이 차단되어 시각장애가 일어나는 백내장은 전체 실명의약35%를 차지한다. 수정체는 물외에 대부분이 단백질인데 다른 기관보다 대사율이 느려 변형된 단백질의 회복이 느리다는 특징이 있다. 따라서 이미 백내장이 형성된 뒤에는 치료한다는 것이 불가능하므로 대부분 수술에 의존하고 있다. 그러나 수술후 시력이 다시 나빠지는 후발성 백내장이 생기기 쉽고 당뇨가 있으면 수술후 염증 발생이 잘되고 출혈이 되는 경향이 있다(윤 등,1986). 또 사람의 백내장 수정체에서 히드록실 라디칼에 의해 산화된 아미노산이 보고되기 시작하면서(Shanlin Fu et al.;1998, Brett Grener et al.; 1999) 현재는 히드록실 라디칼/펜톤 시스템이 백내장 형성에 큰 자리를 차지하게 되었다. 또한 폴리올 경로를 통한 백내장 형성이 자유 라디칼 형성과 관련되어 있다는 보고도 나와 있고 실제 ARI인 SND-860으로 OH 라디칼 생산을 완전히 억제하는 실례도 입증된 바 있다(Eri Kubo, Norio miyoshi et al.;1998).

당뇨 환자에게 있어서는 신장합병증이 흔하고 고혈당 기간에 의존적이다. 미세혈관 병변이 신장을 침습하여 일어나는 당뇨병성 신질환은 당뇨병의 가장 중요한 사망원인이며(Mauer,1994), 국내에서는 1980년대 이후로 혈액투석 또는 복막투석을 받게되는 3대 질환의 하나가 되고 있다(김 등, 1992). 또한 당뇨병환자는 정상인에 비해 신부전증의 위험이 약 20배(고 등, 1991)에 이르며, 최근 당뇨병진단 후 20년 이상 생존하는 환자의 비율이 증가하게 되어 당뇨병성 신질환에 의한 말기 신부전환자의 유병율 또한 증가가 예상된다(김 등, 1992).

신장을 구성하는 주요 구성기관은 신소체, 요세관, 및 혈관이며 기능적인 단위는 신소체와 요세관으로 구성된 신원(nephron)이다. 신장은 혈액의 pH 및 혈중글루코스 농도를 일정하게 유지하는데 관여하는 신체 항상성의 중요한 역할을 하는 기관이다. 과다한 AR의 활성이 당뇨합병증 발달의 요인으로 가정되고 있고 그 중에 신장병이 포함되어 있다. 그러나 실험 동물로 쥐에서 주로 연구되었는데 ARI 투여가 효과가 있다고 하는 것과 없다고 하는 결과들이 충돌하고 있다. 또 당뇨병으로 인한 알도스 환원효소 활성에 의한 폴리올 축적이 신비대증, 사구체 확대 혹은 혈관 사이 용적 증가를 설명하기에는 충분치 않다는 보고들도 있다. 그 예로 당뇨를 유도한 개에서 ARI인 소르비닐(sorbinil)을 5년 간 투여하였을 때 대조군에 비해 폴리올 축적을 효과적으로 막았으나 대조군에서도 신장병변이 나타나지 않은 연구보고가 있다(Timothy S. Kern et al.,1999). 그러나 ARI인 소르비닐을 당뇨를 유도한 쥐에게 투여했을 때 단백뇨는 감소하였으며(Beyer-Mears,1986), 미오이노시톨과 Na+/K+-ATPase 활성도는 증가시켰다(Cohen, 1986; Cohen et al.,1985). 또한 ARI를 당뇨병 환자에게 투여했을 때 가벼운 신사구체의 손상을 완화시켰다고 보고되고 있다(Vlassara,1990).

기전이 분명히 밝혀지지는 않았지만 당뇨 신장합병증에 산화적 스트레스가 중요한 역할을 한다고 제시되고 있다. 야굽(Yagoob,1993)등은 40여명의 인슐린 의존형 진성 당뇨병(IDDM) 환자들에서 내피기능, 자유산소 라디칼생성, 산화손상, 사구체 단백뇨, 세뇨관 단백뇨, 세뇨관 효소 뇨증을 측정하여 자유라디칼의 변화가 당뇨병 신증의 발생과 정도에 중요함을 보고한바 있고 당뇨병환자에서 혈장 지질과 산화물이 증가되어 있으며 이것이 당뇨병성 신증 정도와 상관관계가 있다고 하였다. 또한 당뇨에 의한 산화적 스트레스가 세포사멸을 유도할 수 있고 이것이 당뇨신장합병증의 발달에 기여할 것이라는 연구 보고가 있다(Weiping Zhang et al.,1997).

당뇨합병증 치료제로 개발된 알도스 환원효소 억제제는 동물 실험에서는 당뇨합병증에 좋은 효과를 보였으나 사람에게서는 그만큼의 효과를 보기 어렵고 또 부작용이 있어 현재 사용중지된 것이 대부분이다. 그러나 약물 개발을 위한 알도스 환원효소 억제제의 구조와 활성에 대한 연구가 계속적으로 활발히 진행되고 있다. 그리고 ARI의 효과를 보이는 약용 식물의 항당뇨, 항산화성 및 혈당강하 효능에 대한 약리 효과에 많은 관심이 모아지고 있으며 세계적으로 400여종 이상의 전통식물이 당뇨치료에 효과가 있다고 보고되고 있다(Bailey et al, 1989). 국내에서도 약물로 인슐린의존성 당뇨를 유도하거나 유전적 혹은 식이요법으로 인슐린 비의존성 당뇨를 유도한 실험동물 모델에 천연추출물의 항당뇨 효과를 본 연구자료들이 많이 나와 있다. 또 시험관내에서 천연추출물의 ARI의 효과를 조사한 자료(K.H.SHIN et al.1993)에서 AR 저해효과가 큰 천연물들 중에 장미과에 속하는 복분자(Rubus coreanus), 모과나무(Chaenomeles sinensis) 등이 있었다.

본 발명의 목적은 제한 식이 하에 당뇨합병증을 억제 또는 예방하는 효과를 갖는 복분자(Rubus coranus Miquel) 수침 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 제한 식이 하에 당뇨합병증을 억제 또는 예방하는 효과를 갖는 메가용량의 비타민 E를 함유하는 약제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 제한 식이 하에 당뇨합병증을 억제 또는 예방하는효과를 갖는 메가용량의 비타민 C를 함유하는 약제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 복분자 추출물을 포함하는 건강보조식품, 생약제재 및 음료를 제공하는 것이다.

도 1은 실험동물 사육 과정 중의 급식 시스템을 도시한 것이다.

도 2는 각 실험군의 14주 동안의 체중 변화에 미치는 실험 식이의 효과를 도시한 그래프이다.

도 3은 헤모글로빈 A₁c에 미치는 실험 식이의 효과를 도시한 그래프이다.

도 4는 쥐 신장의 과산화물 함량에 미치는 실험 식이의 효과를 도시한 막대그래프이다.

도 5는 쥐 수정체의 과산화물 함량에 미치는 실험 식이의 효과를 도시한 막대 그래프이다.

도 6은 신장의 글루타치온 환원효소 활성에 미치는 각 실험 식이의 효과를 도시한 막대 그래프이다.

도 7은 쥐 신장의 글루타치온 과산화효소 활성에 미치는 각 실험 식이의 효과를 도시한 막대 그래프이다.

도 8은 신장의 소르비톨 농도에 미치는 실험 식이의 효과를 도시한 막대그래프이다.

도 9는 수정체의 소르비톨 농도에 미치는 실험 식이의 효과를 도시한 막대그래프이다.

도 10은 쥐 수정체의 혼탁도에 미치는 실험 식이의 효과를 도시한 막대그래프이다.

도 11a, 11b 및 11c는 각 실험군에서 나타나는 쥐 수정체들의 형태학적 변화를 촬영한 사진이다.

먼저, 본 발명에서 사용하고자 하는 복분자, 비타민 E, 비타민 C에 대한 자료들을 이하에 상세하게 설명하였다.

복분자(Rubus coranus Miquel)는 한국 및 중국이 원산이며 식물학적으로 갈잎 딸기나무에 속한다. 5-6월에 분홍빛 꽃이 피고 7-8월에 붉은 열매로 익은 뒤에는 검은색으로 변한다. 주로 간(肝)과 신(腎)의 기능을 보하고, 사정을 연장시키는 삽정(澁精), 소변을 참게 하는 축뇨(縮尿), 눈을 맑게 하는 명목(明目) 등의 효능이 알려져 있고 한방에서 신기능 허약으로 인한 유정, 소변을 자주 볼 때, 심한 피로감을 회복시킬 때 쓰이고 있다.

약으로 쓰이는 종류로 우리나라에는 16종 이상이 있으며 주로 복분자 딸기, 산딸기, 멍석딸기 등이 있다. 한방에서는 복분자를 잘 익지 않은 황색일 때 따서 햇빛에 건조시킨 것을 쓴다. 단백질 결핍 식이로 스트레스를 준 쥐에게 한방에서 강장제로 쓰이는 약재의 수침 추출물 투여시 복분자가 뇌의 노르에피네프린, 도파민 양을 유지, 증가시켜 주는 것을 관찰한 연구 보고가 있다(이재현, 1985). 분리된 성분으로는 코레아노사이드(coreanoside) F1, 수아비시모사이드 (suavissimoside), 니가이시고사이드(nigaichigoside) F1, F2 등을 비롯한 트리테르페노이드, 탄닌 등이 보고되어 있다(김은,1986). 잎에서는 플라보노이드로서 켐페롤(kaemperol), 케르세틴(quercetin), 케르세틴 3-O-β-D-글루쿠로나이드의 나트륨염, 엘라긴산(ellagic acid), 산귄(sanguiin) H-5등이 분리 보고된 바 있다(방 등,1996).

특별한 백내장억제 제제가 없기 때문에 비타민 E는 그 가능성에 주목을 받고 있다. 그리고 비타민 E가 다양한 생체내 또는 시험관내 실험에서 백내장을 지연 혹은 막을 수 있다는 것을 많은 보고에서 보여주고 있다. 그러나 몇몇 보고는 백내장억제 효과를 보이지 않기도 한다(Auriccio and Libondi,1983; Ohta and Ishiguro, 1995; Trevithick, Robertson and Mitton, 1993). 요시지 오타(Yoshiji Ohta) 등의 1999년 연구자료에서는 비타민 E를 포함한 리포좀을 스트렙토조토신으로 당뇨를 유도한 쥐에게 하루 두 번씩 떨어뜨려 주었을 때 9 내지 12주 경과 시에도 유의하게 백내장형성을 효과적으로 지연시켰다. 또한, 히드록실 라디칼에 대한 직접적인 항산화제로 작용하기 때문에 폴리올 경로로 인해 증가한 히드록실 라디칼에 대한 효과를 보일 수 있다.

비타민 E의 식이 섭취량이 증가할수록 장내 흡수가 비교적 비효과적이고 대변으로 배설되는 양이 증가되나 섭취량이 10000 IU 비타민 E/kg식이 이상이 될 때까지는 섭취량에 대하여 조직 내 저장량이 증가한다. 이는 소장에서 비타민 E에 대해 선택력이 없이 양에 비례하여 흡수되기 때문이며 주로 간에 저장된다(Blackett et al., 1981; Jack Yang et al., 1977; Packer et al., 1990; Wiss et al.). 타펠(Tappel) 등(1973)과 황 등(1985)에 의하면 마우스에서 2740mg 비타민 E/kg식이의 과보충에서도 독성이 관찰되지 않았다고 한다.

비타민 C는 6탄당과 비슷하지만 분자 속에 엔디올기를 가지고 있다. 이 기 때문에 수용액은 산성을 나타내며, 염기에 의해 염을 만드는 것 외에 강한 환원작용을 나타내는 등의 특성이 있다. 분자량이 크기 때문에 막을 통해 확산되지 못하며 생리적 pH에서 일원자가 음이온으로 존재하므로 수용성이 매우 커서 막의 지용성 구성물질에 용해되기에 적당치 못하다. 그러나, 세포막의 운반체에 의해 인지되어 촉진확산 및 능동수송에 의해 이동된다(Rose,1988). 따라서 자유 라디칼로 부터의 보호가 필요한 조직에 축적될 수 있고 이동이 용이하여 체내 항산화제로서 유용하다. 다비 등(1992)은 정상인에게 3개월 동안 매일 1g씩의 비타민 C를 섭취시켰을 때 당화된 혈장 알부민의 농도가 33% 감소했고 당화된 HbA₁c의 농도가 16% 감소함을 보고했다. 또한 비타민 C의 과량보강이 스트렙토조토신(STZ)으로 당뇨를 유도한 쥐와 정상 쥐에 있어서 단백질의 손상을 막고 지질과산화물의 생성을 억제했다고 보고하고 있다(Mukhopudhyay et al.,1994; Stolba et al., 1987; Khatami et al., 1988). 또한 STZ으로 당뇨를 유도한 쥐에서 혈장과 기관중의 비타민 C 농도가 감소되는 것이 보고되어 왔는데 혈장 비타민 C가 감소된 당뇨 쥐에게 보강(40-60mg/day)하였을 때 정상 쥐에 가깝게 비타민 C의 혈장농도를 증가시켰다(Yue et al.,1989). 그러나 비타민 C가 Fe등 전이금속과 함께 존재하면 오히려 산화촉진제로 작용한다는 시험관내 실험이 보고되어 있으며(Brett Grener et al., 1999; Metaeo et al., 1978) 사람의 백내장 수정체에서 시간이 경과될 수록 증가하는 전이금속을 보고하고 있다( Lee AY,1999). 그러나 시험관내 실험으로 아스코르빈산의작용 기작을 연구한 맥가한(M.C. McGahan;1994, B. Holley;1997, M.Goralska et al.;2000)의 보고들에 따르면 아스코르빈산이 페리틴의 번역을 증가시켜 Fe에 의한 산화반응으로부터 조직을 보호한다고 한다. 또한 절반망막정맥폐쇄와 망막 중심정맥폐쇄를 임의로 만든 직후에 아스코르빈산을 복강내 주사한 실험에서도 망막내층의 조직손상을 대조군에 비해 유의하게 감소시켰다. 이를 연구자는 항산화작용으로 보았다(우경인,1996).

그러나, 비타민 C는 췌장인슐린 분비를 저해하며(Bergsten et al.,1993; Johnson et al.,1994) 산화형태인 탈수소아스코르빈산은 포도당 흡수를 저해한다고 보고되었다(Mooradian,1987). 또 STZ으로 당뇨유도한 쥐에서 여러 수준의 고농도 비타민 C를 보강하였을 때 대조군에 비해 유의적으로 혈당이 증가하였다(정연재, 1997). 또한 농도 의존적인 효과를 나타내지 않아 적정한 비타민 C의 사용 수준에 대한 연구가 필요하다고 하였다. 반면, 비타민 C가 단백질의 당화반응을 억제하여 당뇨 환자의 HbA₁c를 감소시키는데 이는 비타민 C가 아미노산에 대해 포도당과 경쟁하여 반응하고 이 반응은 케토아민을 형성하기 보다는 가역적인 쉬프 염기로 존재하기 때문이다(Shoff et al,1993; Davie et al.,1992). 이와 같이 비타민 C는 아직 연구가 많이 필요하다. 비타민 C의 권장량에 있어서도 대폭 증가시켜야 한다는 주장과 반대하는 의견들이 충돌하고 있다. 비타민 C의 성인 여성과 남성에게 안전한 권장량을 각각 75mg/일, 90mg/일로 보고 있으며 2000mg/일 이상은 섭취하지 않도록 강조하며, 고용량 또는 메가용량이 설사와 암치료를 방해한다고 보고하기도 하였다(Time,2000). 또한, 국립보건소는 비타민 C의 최적 용량을 현재 60mg에서 100-200mg으로 증가시켜야 한다고 한다(British Medical journal,1999). 또한 고농도의 비타민 C를 수년간 복용하여도 부작용이 나타나지 않으며 효과를 나타낸다고 주장하는 사람들이 늘어나고 있는 때에 잠정적으로만 지나친 것은 좋지 않다고 말하는 것이 아니라 메가용량 혹은 고용량에 대한 실제적인 연구가 많이 진행되어야 한다.

본 연구에서는 위에서 언급한 복분자, 비타민 E, 비타민 C를 STZ으로 당뇨 유도한 쥐에게 공급하여 당뇨합병증에 미치는 영향을 알아보고자 한다. 비타민의 농도는 많이 이뤄진 보충 수준이 아닌 문제가 되고 있는 고농도 수준으로 함으로써 그 효과를 확인하고자 한다. 또한 당뇨합병증의 기전으로 잘 밝혀진 폴리올 경로를 막아줄 수 있는 ARI로서의 복분자 천연 추출물의 가능성을 보며 복분자와 비타민 E를 함께 투여하여 상승효과를 보고자 한다. 이는 폴리올 경로와 이로 인한 산화적 스트레스를 ARI와 항산화제로 막아주었을 때의 상승효과라 할 수 있다. 그러나 일반 실험에서와 같이 당뇨유도쥐를 자유 급식하여 질병 진행속도를 빠르게 하는 것이 아니라 제한 급여를 통해 장기간의 실험을 하여 합병증의 진행을 얼마나 효과적으로 막아줄 수 있는지 보고자 한다.

1.실험재료 및 투여농도 산출

경동시장(2000년5월)에서 복분자를 구입하여 완전 분말화하였다. 증류수에 40에서 50시간 동안 가열 교반하여 추출, 여과, 원심분리하였다. 정제한 여액을 동결건조하여 분말화 하였으며 추출물의 수율은 약24%이었다. 복분자의 알도스 환원효소 억제(ARI) 활성을 확인하기 위해 정상쥐의 수정체에서 얻은 효소원으로 시험관내 실험을 하였다. 위의 방법으로 얻은 두릅수침추출물을 0.05mg/ml의 농도에서 AR효소활성을 저해하는 대조군에 비해 80-90% 저해시키는 것을 확인할 수 있었다.

복분자의 투여농도는 1999년 이뤄진 두릅추출물투여 농도를 기준으로 정하였다. 강경재(1999)의 연구에서 두릅의 수침추출물을 200mg/일 수준으로 실험용 쥐에게 공급하였을 때 독성작용에 대한 보고가 없었다. 두릅의 수율은 16%로 일일 공급되는 두릅의 양은 1250mg이 된다.

따라서, 본 연구에 쓰인 복분자는 수율이 24%이므로 복분자 공급 양이 1250mg/일 수준이 되도록 추출물 농도를 300mg/일로 결정하였다.

비타민 C의 농도는 신소영(1996)의 연구에서 쓰인 13g/kg식이에서 계산되었다. 이 연구에서 사용된 체중이 200g 가량되는 4주령의 실험쥐의 하루 섭취 식이량이 25g이라 할 때 325mg/일, 1625g/kg체중(B.W.)이 된다.

본 연구에서는 당뇨유도 후 2주간의 기간을 통해 정상쥐는 1일 25-30g을, 당뇨쥐는 50-60g 섭취하는 것을 확인하였다. 정상군의 비타민 C 공급 식이 농도를 13g/kg식이로 하였을 때 1일 섭취되는 양이 400mg/일, 1333mg/kg체중(10주령, 300g)으로 계산되었다.

사람의 비타민 C 섭취 한계치로 2000mg/일(Time,2000)을 제시한 자료에 기초해 성인의 체중을 70kg으로 체중당 농도를 구하면 28.5mg/kgB.W/일이 되므로 설취류의 경우 1333mg/kgB.W.의 농도는 메가용량이라고 할 수 있다.

비타민 E는 5.0, 7.5g/kg식이 수준(박영주,1999)에서 신장병변에 유의한 효과를 나타내었음을 연구 보고한 것을 기준으로 하여 정하였다. 즉 정상군의 실험식이 농도를 6g/kg식이로 하여 1일 섭취되는 비타민 E의 양이 180mg/일이 되도록 하였다.

2. 실험동물의 사육

생후 6주된 흰쥐(Sprague-Daweley) 종 숫쥐를 서울대 실험동물사육장에서 공급받아 철선 우리에 1마리씩 수용하여 일반 고형사료와 물을 주면서 환경에 적응시켰다. 10주령으로 체중이 260-360g이 되었을 때에 스트렙토조토신으로 당뇨를 유도하여 당뇨가 유도된 흰쥐들을 당뇨군으로 하여 8-10 마리씩 5그룹을 만들었고 정상군은 8 마리씩 5그룹을 만들었다. 당뇨 유도한 2주 후부터 실험 식이를 시작하였으며 정상군은 자유급식시켰고 당뇨군은 제한 급식하였다.

당뇨군과 정상군 그룹 각각에 혼합사료, 비타민 E 첨가 식이, 복분자 수침 추출물 첨가 식이, 비타민 E와 복분자 수침 추출물을 함께 첨가한 식이, 그리고 비타민 C 첨가 식이로 나누어 공급하였다. 단 정상군과 당뇨군의 식이의 첨가농도를 달리하여 하루 섭취되는 양이 두 군간에 차이가 없도록 첨가물의 농도를 조절하였다.

실험기간은 당뇨 유도기간을 포함하여 14주이며 12주간 실험식이를 공급하였다. 사육환경은 온도 20-25℃, 습도는 55±1%, 명암 주기는 일정한 간격(light 9:00-18:00)으로 유지하였다. 또한 실험기간동안 2주 간격으로 체중과 혈당을 체크하였다. 단 정상군의 혈당은 실험기간동안 처음, 중간, 끝, 공복혈당으로 4-5회 측정하였다. 실험과정을 도 1에 나타내었다.

3. 당뇨유도 및 실험식이

스트렙토조토신은 선택적으로 췌장의 베타세포를 파괴하여 인슐린결핍을 유도하여, 영구적인 당뇨(insulin-dependent diabetes mellitus; IDDM)를 유발하는 화학물질(Mordes and Rossini, 1981)로, 본 발명에서는 이를 이용하여 당뇨를 유도하였다.

실험동물이 10주가 되었을 때 0.01M 구연산염 완충액(pH 4.5)에 스트렙토조토신(Sigma Chemical CO., USA)을 65mg/kg B.W이 되도록 녹여 10분 이내에 복강에 주사하여 당뇨를 유도하였다. 당뇨유도 일주일 후에 꼬리의 정맥혈을 취하여 비공복시 혈당이 300mg/dl 이상인 경우에만 당뇨로 분류하였다(Kawnmura et al.,1987). 또한 시험 스트립으로 요당, 요단백을 체크하여 당뇨그룹의 당뇨유도상태를 확인하였으며, 각 그룹에 단백뇨가 나타난 정도를 동일하게 하였다.

당뇨유도를 시작한 후 2주간은 자유 급식시켜 평균 섭취량을 계산하였다. 정상군과 당뇨군 간에 일일 섭취량에 있어 당뇨군이 2배 가량 많이 섭취하였다. 정상군은 일반 고형사료를 25-30g 범위 내에서 섭취하였고 당뇨군은 50-60g 범위에서 섭취하는 것을 확인한 뒤 표 1과 같은 실험식이를 제조하였다. 실험식이는 일반고형사료를 분말화하여 복분자 추출 분말과 dl-α-토코페롤 아세테이트(Sigma,USA), L-아스코르빈산(Sigma,USA)를 첨가하여 균질화시켰다. 3주 분량씩 한번에 제조하여 일부는 -20℃에 보관하였고 일부는 냉장고에 보관하면서 공급하였다. 또한 제한식이의 조건은 정상군 섭취량의 15%정도를 증가시킨 양으로 하였다. 즉 정상군의 식이 양을 체크하여 30g/일의 양으로 일주일에 2-3회 나누어서 공급하였고, 잔량을 체크하므로 자유급식이 이뤄지도록 하였다. 당뇨군에는 정상군 식이 보다 15%가량증가시킨 35g/일 식이를 매일 측정하여 공급하였으며 13주와 14주에는 정상군의 식이 섭취량 증가에 따라 40g/일로 공급하여 식이를 제한하였다.

당뇨병이 섭취하는 열량에 영향을 많이 받으므로 당뇨그룹의 실험식이의 열량이 군간 차이가 없다는 것을 확인하기 위해 실험식이의 성분 및 열량을 검사하였다. 이는 국가지정 사료품질검사 인정기관인 부경대학교 양식학과 사료영양생화학 연구실에서 분석하였으며 결과는 표 2와 같다.

실험 식이 용량

실험군		㎎/일	1차 식이(g/㎏ 식이)	2차 식이(g/㎏ 식이)
정상군	CC	n=9	-	-
	CVE	n=8	180	6
	CR	n=8	300	10
	CM	n=8	비타민 E + R180+300	비타민 E + R6 + 10
	CVC	n=8	400	13.3
당뇨군	DC	n=10	-	-	-
	DVE	n=9	180	5.14	4.5
	DR	n=10	300	8.57	7.5
	DM	n=9	비타민E + R180 + 300	비타민 E+R5.14+8.57	비타민E+R4.5+7.5
	DVC	n=10	400	11.4	10
CC : 정상 대조군 DC : 당뇨군 대조군CVE : 정상군 비타민 E DVE : 당뇨군 비타민 ECR : 정상군 복분자 DR : 당뇨군 복분자CM : 정상군 혼합물(복분자 + 비타민E) DM : 당뇨군 혼합물(복분자 + 비타민E)CVC : 정상군 비타민 C DVC : 당뇨군 비타민 C

실험 식이의 조성 분석(무수물 기준)

실험군	단백질(%)	지방(%)	에너지(kcal/g)
DC	23.1	4.7	4168.5
DVE	22.6	5.1	4185.5
DR	22.6	4.94	4167.1
DM	22.5	5.4	4202.8
DVC	22.6	5.38	4173.5
DC : 당뇨 대조군 DVE : 당뇨군 비타민 EDR : 당뇨군 복분자 DM : 당뇨군 혼합물(복분자 + 비타민E)DVC : 당뇨군 비타민 C

4. 혈당측정

혈당은 글루코스 옥시다제법을 이용하여 측정하였다. 쥐 꼬리정맥에서 혈액을 취해 혈당 감지기(Blood glucose sensor, Medisense 2, Medisense, Inc., Waltham, MA, USA)와 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)에서 추출한 글루코스 옥시다제(≥0.021IU)가 함유되어 있는 시험 스트립(Medisense, Inc., Waltham, MA, USA)을 사용하여 측정하였다.

5. 시료의 수집 및 처리

실험동물은 12시간이상 금식시킨 후 비공복혈당과 체중을 체크한 뒤 에틸에테르로 마취시켜 복대동맥을 통해 혈액을 채혈하였다. 혈액 중 일부는 혈청을 얻기 위해 3000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였고 -80℃에서 냉동 보관하였다. 1ml 정도의 전혈은 EDTA 튜브에 담아 냉장 보관하였다가 일주일이내에 HbA₁c분석에 사용하였다.

신장은 적출 후 생리식염수에 세척하고 여과지로 수분 제거 후 무게를 측정하였다. 신장중 하나는 피질과 수질을 분리한 뒤 액체질소에 급냉하여 -80℃에 보관하였다가 분석에 사용하였다. 피질과 수질의 일부는 빙냉 균질화 배지(0.25M 슈크로스, 6mM EDTA, 25mM Tris-HCl, 2.4mM 데옥시콜산 나트륨, pH6.8)를 넣어 4℃에서 균질화하여 12,500 ×g에서 20분간 원심분리하였다. 상층액을 냉동 보관하였다가 알도스 환원효소 측정에 사용하였다. 나머지 신장 피질과 수질은 0.3N 과염소산으로 균질화하여 3000rpm에서 15분간 원심분리하고 상층액을 1M KOH로 중화한 후 냉동 보관하였다가 소르비톨 측정에 사용하였다.

나머지 신장은 빙냉 균질화 배지(15mM KCl, 50mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF), pH7.4)를 넣고 4℃에서 균질화하였다. 균질액 일부에 동량의 10% 설포살리실산을 첨가하여 3000rpm, 4℃, 15분간 원심분리하여 글루타치온 함량측정에 사용하였다. 남은 균질액은 1000 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 세포조각들이 들어가지 않도록 조심하여 상층액을 모아 10,000 ×g, 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 다시 상층액을 모아 100,000 ×g, 4℃에서 60분간 원심분리하여 세포질층(상층액)과 미세소체층(펠릿)으로 분리하여, 미세소체층은 10mM 인산칼륨 완충액(pH7.4)으로 분리하여 재부유시켜 액체질소로 급속냉동하여 -80℃에서 보관하였다.

안구에서 수정체의 분리는 희생시킨 후 12시간 안에 이루어졌으며 스펙터(Spector et al.,1993)의 방법을 따랐으며 급냉하여 보관한 뒤 분석에 사용하였다. 수정체는 무게를 측정한 후 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.9)을 넣고 4℃에서 균질화한 다음 균질액 일부는 10,000 ×g, 4℃에서 20분간 원심분리하여 상층액을 효소활성도 측정에 사용하였다. 나머지 균질액에는 동량의 20% TCA(트리클로로아세트산)를 첨가하여 3000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 사용하여 글루타치온과 소르비톨 함량을 측정하였다.

6. 화상분석

적출한 수정체는 분리직후 배양배지를 2ml씩 담아놓은 24웰(Felcon,USA)에 담아 37℃로 유지해 주면서 CCD 카메라를 이용하여 사진을 찍었다. 혼탁 정도는 찍은 사진을 화상 분석시스템(Image Pro Plus(version 4.0), media and cybernetics, USA)을 통해 분석하였다.

7.생화학적 분석

7.1 혈액분석

7.1.1 당화 헤모글로빈의 함량측정

EDTA처리한 전혈을 HbA₁c 전용검사기기를 이용하여 분석하였다. 이 기기는 변환기, 탈기 유니트, 완충액 저장 유니트, 본체로 구성되어 있으며 혈액은 0.1% 트리톤 X-100으로 용혈시켜 사용하였다(서울대학병원 임상병리과).

7.1.2 혈청 알부민과 크레아틴, 우레아-N 함량

알부민과 크레아틴은 건식 자동 생화학분석기(Spotchem, Kyoto Co.Ltd., Japan)로 측정하였다. 우레아-N 측정은 효소법을 이용한 키트(영동제약)를 이용하였다.

7.1.3 혈청 트리글리세라이드, HDL-콜레스테롤 함량측정

트리글리세라이드 측정은 건식 자동 생화학분석기(Spotchem, Kyoto Co.Ltd., Japan)로 측정하였다. HDL-콜레스테롤은 HDL 분리 시약을 첨가한 후 원심분리에 의해 HDL 이외의 지단백을 침전시킨 후에 총콜레스테롤을 측정하는 키트(영동제약)를이용하였다.

7.2 TBARS의 함량측정

신장의 소포체와 수정체의 균질액에서 지질과산화물 지표의 하나로 TBARS 함량을 측정하였다(Ohkawa et al., 1979). 각 시료의 단백질 농도가 2㎎/㎖ 정도가 되도록 10mM 인산칼륨 완충액(pH7.4)으로 희석한 후 스크류캡 튜브에 1㎖을 넣고 37℃ 항온수조에서 60분간 진탕 가온하였다. 여기에 10%(w/v) 트리클로로아세트산 1㎖과 0.67% 티오바르비투르산 1㎖을 가한 뒤 30초 동안 격렬하게 혼합하여 끓는 물에 마개를 닫고 15분간 중탕하였다. 중탕 후 빙수에 급히 냉각시키고 1,000 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리하여 그 상층액으로 535nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준용액으로는 테트라에톡시프로판(TEP)을 메탄올에 녹여서 사용하였다.

7.3 신장의 항산화제와 항산화효소 활성도 측정

7.3.1 신장의 글루타치온 함량 측정

신장 균질액을 엘만(Ellman, 1959)의 방법으로 측정하였다. 상층액 0.5㎖에 0.3M 인산 나트륨 완충액 4㎖, DTNB 용액 0.5ml을 가하여 혼합한 후 410nm에서 흡광도를 측정하였다. DTNB 용액은 1% 구연산 삼나트륨 용액에 녹여서 사용하였으며 표준용액으로는 글루타치온(Sigma,USA)을 사용하였다.

7.3.2 신장의 글루타치온 과산화효소 활성도 측정

신장 세포질에서 타펠(Tappel, 1978)의 방법을 이용하여 측정하였다. 기질로 쿠멘-과산화물 첨가시 글루타치온 과산화효소 작용에 의해 생성된 산화형 글루타치온이 글루타치온 환원효소와 일정량의 NADPH의 존재 하에 다시 환원되는 속도를 측정하였다. 시료 0.1ml과 모액(50mM Tris, 0.1mM EDTA, 0.25mM 글루타치온, 0.12mM NADPH, 1 유니트/ml 글루타치온 환원효소; pH 7.6) 1.55ml을 큐벳에 넣고 37℃에서 3분간 활성화시켰다. 여기에 50㎕의 쿠멘-과산화물(1mg/ml d.w.)를 첨가하여 즉시 340nm에서 2분간 흡광도 감소를 측정하였다. NADPH의 소광계수로 6.22mM^-1cm^-1을 이용하였고 단위는 1분 동안 산화된 NADPH의 nmol수로 표시하였다.

7.3.3 신장의 글루타치온 환원효소 활성도 측정

신장 세포질에서 글루타치온 환원효소의 활성도는 칼버그·매너빅(Calberg and Mannervick, 1981)의 방법으로 측정하였다. EDTA-인산칼륨(2mM/0.2M) 완충용액(pH7.0) 0.5㎖, 2mM NADPH(in 10mM Tris-HCl, pH7.0) 0.05㎖, 20 mM 산화된 글루타치온(증류수 중 용액) 0.05㎖, 3차 증류수 0.4㎖을 큐벳에 넣은 후 30℃에서 3분간 활성화시켜 340nm에서 1분간의 흡광도 감소를 관찰하였다. 글루타치온 환원효소의 활성도는 1분 동안 산화되는 NADPH의 nmol수로 표시하였다.

7.4. 소르비톨의 함량 측정

신장피질과 수정체의 균질액 중에 존재하는 소르비톨 농도는 소르비톨 탈수소효소와 포마잔(formazan) 발색 검출 시스템을 이용한 효소적 비색법을 이용하여 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)에서 구입한 키트(D-소르비톨/크실리톨 키트, 독일 만하인에 소재하는 뵈링거 만하임 제품)로 측정하였다. 100㎕의 시료에 2% 트리톤 X-100을 포함한 트리에탄올아민 인산염 완충액 170㎕, 디아포라제/NAD 용액 40㎕, 2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐테트라졸륨 클로라이드(INT) 용액40㎕을 첨가하고 증류수를 첨가하여 전체 용량이 0.6ml이 되게 하였다. 소르비톨 탈수소효소 5㎕를 첨가하여 반응을 시작하였으며, 492nm에서 종말점에 도달할 때까지 흡광도를 관찰하였다. 소르비톨 농도는 몰당 흡광계수 19.9mmol^-1cm^-1을 이용하여 계산하였다.

7.5 단백질 함량측정

각 시료의 단백질분석은 소혈청 알부민을 표준용액으로 하여 바이오래드 DC 단백질 분석법으로 측정하였다(Lowry et al.,1951).

8. 통계처리

실험결과는 SAS 일반 선형 몰 절차를 이용하여 각 실험군의 평균과 표준편차로 계산하고, P<0.05수준에서 ANOVA 시험 후 던칸 복수 범위 시험(Duncan's multiple range test)에 의하여 각 실험군 간의 유의차를 검증하였다.

결과 및 고찰

1. 체중과 신장 무게의 변화

각 군의 14주 동안 체중변화는 도 2와 같다. 정상군은 고용량의 첨가 식이였으나 14주 동안 꾸준히 체중이 증가하였다. 반면 당뇨군은 당뇨유도 이후 꾸준히 체중이 감소하고 있다. 뚜렷한 정상군과 당뇨군의 차이를 보여주고 있음을 알 수 있다. 그러나 당뇨군내에서 유의하지는 않으나 복분자군의 평균 체중값이 가장 높게 나타났고 비타민 군이 낮은 값을 보이고 있다. 그러나 다른 연구에서 당뇨를 유도한 쥐를 자유 급식하였을 때 체중이 조금씩은 증가한 결과들과는 차이를 보인다(이영미,1998; 강경재,1999). 이는 식이 섭취량을 제한한 영향으로 생각된다.

STZ 투여가 췌장의 β-세포를 파괴하여 인슐린생성에 이상을 일으켜 당이 에너지원으로 쓰이지 못하고 또 신장손상으로 단백질이 계속적으로 손실됨으로 인해 체중이 쉽게 회복되지 않을 것이다. 정상군과 대조군의 뚜렷한 체중 차이는 다른 연구에서도 공통적으로 보고하고 있다.

정상군과 당뇨군의 체중 100g당 신장무게를 비교한 결과는 당뇨군이 정상군에 비해 유의적으로 증가하였음을 보여주고 있다. 당뇨상태에서는 신장손상이 계속적으로 일어나기 때문에 신장 비대현상이 일어나며 정상군과 차이를 나타낸다. 이는 다른 연구에서도 공통적으로 보고하고 있으나(이영미,1998; 강경재,1999) 본 실험에서는 당뇨군간 유의한 차이를 보이고 있다. 즉 복분자와 비타민 투여군에서는 모두 당뇨대조군에 비해 신장비대를 감소시킨 것이다. 특별히 복분자가 가장 낮은 수치를 보여줌으로 신장에 효과가 있다는 고서의 내용을 보증해 줄 수 있는 결과라 할 수 있다. 그러나 비타민과 함께 주었을 때 더 좋은 효과가 나타나지는 않았다. 혈장 내 높은 농도의 포도당은 세포막의 비대를 가져오는 UDP-갈락토스 또는 글리코겐으로 대사되어 사구체 내의 혈관사이 세포에 추적되어 신장의 비대현상을 초래한다(Steer et al.,1985)는 보고가 있다. 실험기간동안 고혈당 수준에 차이가 없었던 것으로 미루어 이들의 신장비대를 막은 효과를 혈당이 다른 군보다 떨어져 있었기 때문으로 보기는 어렵다. 더욱이 당뇨군은 동량의 식이를 공급하였기 때문에 혈당유지정도가 비슷하였다. 또한 당뇨대조군이 유의적이지는 않았지만 다른 군에 비해 체중감소(59g/14w)가 덜하였으므로 체중 100g당 신장무게 값이 작게 나오기가더 좋다. 이러한 것들을 고려할 때 복분자와 비타민 E의 신장의 비대를 막아준 효과가 더욱 두드러진다고 할 수 있다(표 3).

신장 중량에 미치는 실험 식이의 효과

실험군	신장 중량(g/100gB.W)
정상군	CC	0.61±0.01^c
	CVE	0.6±0.01^c
	CR	0.64±0.02^c
	CM	0.63±0.02^c
	CVC	0.65±0.02^c
당뇨군	DC	1.31±0.04^a
	DVE	1.28±0.05^ab
	DR	1.18±0.02^b
	DM	1.24±0.05^ab
	DVC	1.25±0.05^ab
CC : 정상 대조군 DC : 당뇨군 대조군CVE : 정상군 비타민 E DVE : 당뇨군 비타민 ECR : 정상군 복분자 DR : 당뇨군 복분자CM : 정상군 혼합물(복분자 + 비타민E) DM : 당뇨군 혼합물(복분자 + 비타민E)CVC : 정상군 비타민 C DVC : 당뇨군 비타민 C상기 측정값들은 평균값 ±표준편차이다.첨자가 상이한 평균값은 P<0.05 수준에서 던칸 복수 범위 시험에 의해 측정시 유의적 차이를 나타낸 것이다.

2. 혈액분석

2.1. 혈당과 HbA ₁ c의 함량

정상군과 당뇨군의 비공복시 혈당, 공복시 혈당을 표 4에 나타내었다. HbA₁c는 도3에 나타내었다. 혈당은 당뇨군이 정선군 보다 높게 나타나며 당뇨를 유도 후 300mg/dl이상인 것만 당뇨군으로 하였기 때문에 실험초기에 당뇨군의 혈당은 300이상의 혈당을 유지하였다. 데이타로 나타내지는 않았으나 중반 이후 증가하였던 혈당이 감소한 쥐들이 각 군마다 나타났고 실험시작 후 10주 쯤에는 전반적으로 혈당이 떨어지는 개체들이 많이 나타났다. 정상군의 경우는 자유급식을 하였으나 당뇨군의 경우 제한 식이를 하였기 때문에 전날 식이 공급한 이후 24시간 시점부터 혈당을 체크하였는데 이 영향이 있는 것으로 보인다. 그러나 35g/일의 식이에서 40g/일로 증가시켰을 때 300-400mg/dl의 범위를 보이던 혈당이 500mg/dl수준으로 증가되었으며 실험 종료때 까지 유지되는 것을 관찰할 수 있었다. 5g의 식이가 증가된 것이지만 혈당증가에 영향을 미치는 것을 볼 수 있었다. 때문에 제한한 식이를 계속 유지한 것이 당뇨쥐의 합병증 진행에 영향을 주었을 것이라 생각할 수 있다. HbA₁c는 당뇨상태에서 보여주는 현상을 나타내어 정상군 보다 3배 가량 높게 나왔다. 그러나 당뇨군간에는 유의적인 값의 차이를 보였는데 당뇨 처리군 모두 당뇨대조군보다 낮아진 것이다. 특히 복분자와 비타민E를 함께 처리한 군이 가장 낮은 HbA₁c값을 나타내었다. 이는 혈당체크에서 다른 군에 비해 낮은 혈당이 아니었음을 고려할 주목할만한 효과라 할 수 있다. 비타민C를 고용량으로 준 것과 각각을 준 것 보다도 낮은 값을 보였으므로 복분자와 비타민E가 함께 상승작용을 나타내었다고 할 수 있다. 혈당강하효과를 보는 다른 연구의 경우 5-10일 내지는 4주 정도로 단기간 투여가 많은데 단기간에서 효과가 나타났어도 장기간의 경우 효과가 없는 것으로 나타나는 결과보고가 많다(서 등,1997; 임 등,1995;이영미 ,1998). 그러나 본 실험에서 장기간의 투여로 당화 헤모글로빈의 수치를 유의적으로 떨어뜨렸다는 것은 의의가 있다.

각 실험군에서 측정된 혈액 글루코스 농도

대조군	혈액 글루코스(㎎/dl)
정상군	CC	79.71±4.55^b	103.43±2.47^b	87.25±4.73^c
	CVE	91.88±3.18^b	91.88±3.18^b	80.88±3.75^c
	CR	98.63±3.34^b	98.63±3.34^b	98.25±3.46^c
	CM	99.75±3.16^b	99.75±3.16^b	91.25±4.14^c
	CVC	106.43±2.47^b	106.43±2.47^b	87.5±2.33^c
대조군	DC	436.5±20.78^a	359.2±15.75^a	362.1±19.84^ab
	DVE	436.11±18.33^a	403.0±19.51^a	399.39±33.2^a
	DR	443.25±20.07^a	445.0±4.16^a	336.15±35.55^ab
	DM	442.56±18.36^a	399.56±18.36^a	332.88±40.17^ab
	DVC	467.7±17.9^a	401.2±13.32^a	322.0±31.84^b
CC : 정상 대조군 DC : 당뇨군 대조군CVE : 정상군 비타민 E DVE : 당뇨군 비타민 ECR : 정상군 복분자 DR : 당뇨군 복분자CM : 정상군 혼합물(복분자 + 비타민E) DM : 당뇨군 혼합물(복분자 + 비타민E)CVC : 정상군 비타민 C DVC : 당뇨군 비타민 C
상기 측정값들은 평균값 ±표준편차이다.첨자가 상이한 평균값은 P<0.05 수준에서 던칸 복수 범위 시험에 의해 측정시 유의적 차이를 나타낸 것이다.

2.2. 혈중 알부민, 크레아티닌, 우레아-N 함량

영양상태를 나타내주는 혈청 알부민과 신장 손상의 지표가 되는 혈청 우레아 -N과 크레아티닌 함량을 조사하였으며 결과는 표 5와 같다.

알부민의 경우 정상군과 당뇨군 간에 유의한 차이를 나타내었다. 즉 정상군에 비해 당뇨군이 낮은 값을 보였으며 이는 요당, 요단백으로 인한 영양상태의 부실을 나타낸다고 할 수 있다. 알부민은 혈청 총 단백 중에서 가장 많은 성분이며 단백 대사상 수송체로서의 영양상태를 표현하기 때문이다. 그런데 정상군의 경우 혼합 식이에서 낮은 수치를 보였으며 당뇨군에서도 비타민 E군과 혼합군이 낮은 수치를 보이고 있다. 이것은 비타민 E 투여의 효과가 나타나지 않음을 말해준다고 할수 있으며 다른 연구에서도 혈중 알부민수치에 효과가 없음을 보고하고 있다(박영주 ,1999; 정수현,1999).

혈중 BUN수치는 당뇨 대조군이 가장 높은 값을 보이며 당뇨군이 정상군에 비해 2.5-3배 가량 높게 나타났다. 요소는 단백 대사의 종말 산물로서 아미노산에서 생성된 암모니아와 이산화탄소로부터 간에서 합성된다. 요소는 사구체에서 여과되어 요중에 배설되기 때문에 신기능 지표로 이용되고 있다. 그러나 예민한 지표는 아니며 사구체 여과율이 50%까지 저하하여도 정상 범위에 머물고 30%전후로 저하한 후에 비로소 경도의 상승이 있으므로 당뇨군의 현저한 상승은 정상군에 비해 당뇨군 전반적으로 신기능이 많이 손상되었음을 말해준다고 할 수 있다. 그러나 당뇨군내에서는 당뇨 대조군이 가장 높은 수치를 나타내며 나머지 치료군에서는 유의한 차가 없는 것으로 나타났다. 따라서 BUN수치에 있어서 치료군이 효과를 나타내었다고 할 수 있다. 그 중에서도 비타민 E군과 복분자군이 낮은 수치를 보여주고 있다.

크레아티닌 수치는 정상군에 비해 당뇨군이 낮은 값을 보였다. 그러나 신장손상을 준 다른 연구에서는 혈청 크레아티닌 함량이 유의한 차이를 나타내지 않았다. 크레아티닌 역시 신기능의 지표로 사용되나 BUN과 마찬가지로 예민한 지표는 아니다. 또한 사구체 여과율이 50%이상 감소하여도 정상범위에 머물기도 한다는 것을 반영할 때 각 군간의 수치의 차이는 의미를 가질 수 있다. 그러나 크레아티닌 양이 크레아틴 양에 따라 좌우되므로 근육의 총 용적에 따라 차이가 크다. 이는 당뇨군이 정상군에 비해 낮은 수치를 보인 원인이 될 수 있다. 당뇨군의 경우 단백뇨의 현상이 심하였고 또한 제한 식이를 하였기 때문에 다른 연구에서 보인 소량의체중 증가도 본 실험에서는 일어나지 않았다. 때문에 당뇨군의 경우 근육량이 급격히 감소해 있는 상태이고 이것은 혈중 크레아티닌 함량에 영향을 준 것으로 사료된다. 당뇨군내에서 크레아티닌 함량을 비교할 때 혼합군에서 가장 높은 수치를 나타내고 있다. 그러나 체중감소정도에 있어 중간정도(mean 60g/14week)이며 알부민 수치가 낮은 것을 고려할 때 혈중 크레아티닌 농도가 높다는 것은 신장기능의 손상이 다른 군에 비해 좀 더 가중되었음을 나타낼 수 있다.

종합해 볼 때 혈중 알부민, 크레아티닌은 당뇨대조군에 비해 치료군이 더 낳은 결과를 보여주지는 못하였으며 BUN수치에 있어서는 당뇨 대조군에 비해 치료군에서 좀더 낳은 효과를 볼 수 있었다. 당뇨의 비타민 E군의 경우 단백질상태가 가장 나쁘게 나타났고 크레아티닌 수치는 가장 높아 영양상태와 신기능 개선에는 효과가 없는 것으로 사료된다. 반면 복분자의 경우 알부민수치가 높은 편이고 크레아티닌 함량은 다른 군에 비해 감소시켰으며 BUN의 수치도 당뇨군중에 가장 낮은 값을 보이므로 신장기능에 효과가 있었다고 사료되며 체중 g당 신장무게에서도 가장 좋은 효과를 보인 결과가 이를 더욱 뒷받침해 준다.

혈청 알부민, 크레아틴 및 BUN에 미치는 실험 식이의 효과

대조군	알부민(g/dl)	크레아티닌(㎎/dl)	우레아-N(㎎/dl)
정상군	CC	3.4±0.11^a	0.73±0.05^ab	17.7±1.3^c
	CVE	3.3±0.09^ab	0.68±0.04^a	16.5±1.3^c
	CR	3.2±0.1^ab	0.62±0.03^ab	19.2±0.6^c
	CM	3.1±0.1^abc	0.68±0.05^a	19.9±0.9^c
	CVC	3.3±0.13^ab	0.46±0.04^b	19.5±0.6^c
대조군	DC	2.8±0.1^c	0.55±0.1^ab	43.7±5.6^a
	DVE	2.3±0.1^d	0.62±0.06^ab	34.5±4.7^b
	DR	2.9±0.09^bc	0.53±0.04^ab	32.1±2.1^b
	DM	2.8±0.05^c	0.59±0.05^ab	36.1±2.4^b
	DVC	3.0±0.09^abc	0.58±0.07^ab	36.8±1.7^b
CC : 정상 대조군 DC : 당뇨군 대조군CVE : 정상군 비타민 E DVE : 당뇨군 비타민 ECR : 정상군 복분자 DR : 당뇨군 복분자CM : 정상군 혼합물(복분자 + 비타민E) DM : 당뇨군 혼합물(복분자 + 비타민E)CVC : 정상군 비타민 C DVC : 당뇨군 비타민 C
상기 측정값들은 평균값 ±표준편차이다.첨자가 상이한 평균값은 P<0.05 수준에서 던칸 복수 범위 시험에 의해 측정시 유의적 차이를 나타낸 것이다.

2.3. 혈청중 트리글리세라이드, HDL-콜레스테롤 함량

각 실험군의 혈청 중 중성지질과 HDL-콜레스테롤 함량을 표 6에 나타내었다. 지단백대사의 동태를 파악하는데 있어서 트리글리세라이드는 콜레스테롤과 더불어 유용한 지표이며 지질대사이상 검사의 일차검사의 하나이다. 여러 연구 보고를 통해, 당뇨군에서 혈중 지질함량이 증가하며 인슐린의존형 당뇨환자에게서 고중성지방혈증이 동반됨이 잘 알려져 있다. 그러나 공복 시에도 증가할 수 있다.

본 실험에서는 정상군보다도 당뇨군이 낮은 값을 보였다. 또한 정상군은 각 개체들이 평균값에 가까운 값들을 보이고 있으나 당뇨군의 경우 편차가 심하게 나타났다(30-300g/dl). 따라서 트리글리세라이드에 대해 경향성을 분명하게 하기는 어려우나 유의성 검사에서 군간에 차이가 있음을 보이고 있다. 당뇨군의 경우 대조군에 비해 모두 낮은 값을 나타내었으며 복분자와 비타민 E 혼합군이 가장 낮은 값을 나타내었다. 정상군에서는 비타민 E군이 가장 낮은 값을 나타었다.

지질 대사이상은 신장기능의 변화를 초래하는 기전에 대한 가설중 하나이다. 신장병환자에서 신장기능이 저하된 경우에 흔히 혈청 지질함량이 증가하는 고지혈증을 동반하는 것은 일반적인 현상이라고 보고하였으며(Yoshimura et al.,1994) 진행성 신장질환을 유도한 쥐에서 혈청 중성지방과 총 콜레스테롤함량이 증가하였다. 그러나 비타민 E를 3300IU/kg식이로 보강하였을 때 더욱 증가하였다고 보고하고 있다(Drukker et al.,1997). 또한 1999년 박영주의 연구에서도 비타민E의 과량보강이 혈중 지질에 효과가 없었음을 보고하였다. 이를 볼 때 비타민의 과량보강 수준이 대조군에 비해 트리글리세라이드의 함량을 낮춘 것은 식이 제한과 체중의 과다감소로 인한 영향이 함께 작용한 것으로 사료되며 당뇨상태에서 지질수준을 낮추었다는 것은 신장의 병변진행에 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다.

혈청 트리글리세라이드 및 HDL-콜레스테롤에 미치는 실험 식이의 효과

실험군	트리글리세라이드(㎎/dl)	HDL-콜레스테롤(㎎/dl)
정상군	CC	84.57±3.83^a	60.3±0.6^NS
	CVE	74.43±4.46^ab	49.6±0.04
	CR	86±7.23^a	58.6±0.08
	CM	77.5±14.43^ab	59.0±0.04
	CVC	75.4±7.68^ab	57.0±0.02
당뇨군	DC	84.25±17.51^a	51.5±0.04
	DVE	54.7±18.09^bc	56.6±0.06
	DR	56.86±5.96^bc	59.0±0.06
	DM	45.5±4.63^c	54.0±0.08
	DVC	57.57±2.51^bc	46.7±0.03
CC : 정상 대조군 DC : 당뇨군 대조군CVE : 정상군 비타민 E DVE : 당뇨군 비타민 ECR : 정상군 복분자 DR : 당뇨군 복분자CM : 정상군 혼합물(복분자 + 비타민E) DM : 당뇨군 혼합물(복분자 + 비타민E)CVC : 정상군 비타민 C DVC : 당뇨군 비타민 C상기 측정값들은 평균값 ±표준편차이다.NS는 P<0.05 수준에서 던칸 복수 범위 시험에 의해 측정시 유의적 차이가 없는 것이다.

3. 신장과 수정체의 과산화물(TBAR)함량

티오바르비투르산(TBA)과 반응하는 지질 과산화물인 말론디알데히드(MDA)는 지질과산화 과정의 중간산물로, 신장조직의 미세소체에서 생체막 지질과산화정도를 결정하는 지표로 널리 이용된다(Ohkawa et al.,1979).

도 4와 도 5에는 신장과 수정체에서의 과산화물(TBAR) 함량을 나타내었다. 신장에서는 당뇨군이 정상군에 비해 높은 수치를 보였으며 당뇨대조군의 경우 정상 대조군에 비해 53%정도 증가한 것을 확인할 수 있었다. 당뇨 대조군에 비해 치료군이 유의적이지는 않으나 정상군에 가깝게 감소시킨 것을 확인할 수 있었다. 특히 비타민 E의 경우 평균값이 정상군 보다도 떨어질 만큼의 항산화 효과를 나타내어 다른 보고들과 일치하는 경향을 보였으며 반면 비타민 C의 경우는 다른 보고들에 비해 TBAR 함량을 많이 떨어뜨리지는 못했다. 오히려 천연추출물인 복분자군이 과량 보강된 비타민 C보다도 좋은 항산화효과를 나타내고 있다. 위에서 보았던 비타민 E의 신장기능에 대한 효과는 좋지 않았으나 항산화에 대한 효과는 다른 군에 비해 탁월함을 볼 수 있다. 그러나 복분자군과 함께 비타민 E를 투여한 경우에는 기대하였던 상승효과는 나타나지 않았다. 산화적 스트레스가 당뇨합병증의 원인으로 많은 보고가 뒷받침하는 것을 고려할 때 비타민 E의 항산화효과로 인한 합병증예방을 기대해 볼 수 있겠다. 그러나 당뇨를 유도한 이후에 투여한 비타민 E의 산화저해 효과 뿐 아니라 발병이전에 투여하여 비타민 E의 예방효과를 확인하는 과정이 필요하다 하겠다. 또한 복분자 추출물도 항산화제 비타민과 유사한 항산화 효과를 나타낸 것을 통해 복분자와 같은 식품을 꾸준히 섭취했을 때의 항산화효과에 대한 기대도 해볼 수 있다. 수정체 균질액에서 당뇨대조군의 TBAR 함량은 정상 대조군에 비해 74%정도 증가하였다. 이는 백내장을 유도한 흰쥐의 수정체에서 MDA의 양이 증가하였다는 보고(Devamanoharan et al.,1991; Huang et al.,1992; 이영미,1998; 강경재,1999)와 일치한다. 또한 당뇨병환자의 수정체 MDA함량이 정상인보다 유의적으로 높았음을 보고한 결과(Altmare et al., 1997)들도 있다. 또한 수정체의 산화적 손상에 대한 실험식이의 효과는 아주 유의적으로 나타났다. 정상군 수준으로 유사하게 떨어진 것을 볼 수 있는데 복분자와 혼합식이에서 효과가 두드러졌으며 비타민 E 및 비타민 C도 대조군에 비해 유의하게 감소시켰다. 따라서 당뇨상태에서 수정체의 산화적 손상에 대한 복분자와 비타민 C의 효과는 장기간의 조절이 필요한 당뇨질환에 좋은 항산화제가 될 수 있다.

수정체의 MDA는 수정체 세포막의 지질과산화로부터 생성된 것이거나 망막의MDA가 초자체를 통해 수정체로 이동한 것일 수 있다(Altmare et al., 1997). 따라서 수정체의 과산화물은 수정체 뿐 아니라 망막의 산화적 스트레스를 포함하고 있으며 항산화효과는 수정체뿐 아니라 눈의 산화적 스트레스에 대한 보호효과를 나타내었다고 볼 수 있다. 또한 항산화의 효과가 신장에서보다 수정체에서 더 뚜렷하게 나타났다는 보고(이영미,1998)들과도 일치한 결과를 확인할 수 있었다. 당뇨대조군의 지질과산화물의 함량이 같은 조건에서 신장보다 수정체에서 더 높은 것은 수정체가 산화적 손상에 좀더 민감하게 반응한다는 것을 말한다. 따라서 항산화제의 효과가 더욱 뚜렷이 나타나므로 항산화제에 의한 수정체의 보호효과는 크게 나타날 수 있다. 본 연구에서는 당뇨군의 식이를 제한하였다. 그리고 산화적 손상에 대한 결과에서 다른 보고들과의 차이를 발견하게된다. 이영미(1998)의 연구에서 당뇨유도하여 8주간 자유급식으로 사육하였을 때 신장에서는 당뇨 대조군이 정상군의 약 2.4배 증가한 것으로 나타났고 수정체 균질액에서는 정상군의 7배 가량 증가하였다고 보고하였다. 그러나 본 연구에서는 더 장기간 당뇨가 지속되어 당뇨상태로 인한 신체적 손상을 많이 받은 것에 비해서는 증가정도가 낮다. 즉 당뇨대조군의 정상군에 비교한 증가율이 신장은 53%, 수정체는 74%인 것이다. 이는 식이를 제한한 효과라고 볼 수 있다. 즉 식이 조절로 인해 고혈당 상태가 계속적으로 유지되지 않기 때문에 조직에 미치는 영향이 줄어든 것으로 생각된다.

4. 신장의 항산화제와 항산화효소 활성도

4.1. 신장의 glutathione함량

표 7에 신장 균질액에서의 GSH 함량을 나타내었다. 당뇨 대조군과 정상 대조군 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았다. 또한 당뇨 대조군에 비해 당뇨 치료군이 정상군 수준으로 회복을 시킨 것을 확인할 수 있었으며 이를 통해 항산화효과 혹은 GSH 보호효과라고 볼 수 있다. 또한 복분자의 경우도 비타민과 같은 효과를 나타내므로 신장에서의 효과를 다시 확인할 수 있었으며 정상군과 당뇨군 모두에서 복분자, 복분자와 비타민E의 혼합식이가 높은 수치를 나타내었다. 그러나 비타민E의 경우는 두드러지는 효과를 나타내지는 않았다.

비타민 E의 경우 당뇨쥐에서 항산화계에 농도에 비례하여 효과를 나타내지 않은 보고와 같은 경향의결과를 확인할 수 있었다(신소영,1996).

글루타치온(이하, GSH)는 체내의 비효소적 항산화 방어계의 하나이며 산화적 손상으로부터 세포를 보호하는데 있어 중요 역할을 하는 것으로 간주된다(James s.Woods,1999). 또한 일반적으로 당뇨가 발생하면 GSH의 합성이 저해되어 조직내의 GSH함량이 감소하는 것으로 알려져 있다 또한 지속적인 고혈당에 의해 산화적 스트레스가 증가함에 따라 GSH의 산화 글루타치온(이하, GSSG)으로의 산화가 촉진되고, 더불어 글루타치온 환원효소의 기능이 손상되어 GSSG의 GSH로의 환원이 원활히 이루어지지 않아 상대적으로 GSSG의 함량이 증가하는 것이다. 그러나 본 연구에서 항산화제의 충분한 공급으로 보호효과를 기대해 볼 수 있을 것으로 사료된다. 또한 항산화계 효소와의 비교를 통해 좀 더 분명한 산화적 방어시스템을 확인할 수 있을 것이다.

신장 중의 글루타치온 농도에 미치는 각 식이의 효과

실험군	글루타치온(μM/g조직)
정상군	CC	1.172±0.06^NS
	CVE	1.148±0.12
	CR	1.32±0.05
	CM	1.35±0.07
	CVC	1.309±0.07
당뇨군	DC	1.146±0.07
	DVE	1.175±0.11
	DR	1.38±0.10
	DM	1.3±0.09
	DVC	1.25±0.06
CC : 정상 대조군 DC : 당뇨군 대조군CVE : 정상군 비타민 E DVE : 당뇨군 비타민 ECR : 정상군 복분자 DR : 당뇨군 복분자CM : 정상군 혼합물(복분자 + 비타민E) DM : 당뇨군 혼합물(복분자 + 비타민E)CVC : 정상군 비타민 C DVC : 당뇨군 비타민 C상기 측정값들은 평균값 ±표준편차이다.NS는 P<0.05 수준에서 던칸 복수 범위 시험에 의해 측정시 유의적 차이가 없는 것이다.

4.2. 신장의 글루타치온 환원효소의 활성도

글루타치온 환원효소(이하 GR)는 GSSG를 GSH로 환원시켜줌으로써 세포내에서 글루타치온의 수준을 유지시키는데 중요한 역할을 한다(Sauberlich et al., 1972). 신장조직의 세포질에서의 활성도를 도 6에 나타내었다. 신장에서 GR의 활성은 유의적인 차이를 보이지 않았다. 그러나 당뇨 대조군이 정상군에 비해 감소한 것을 확인할 수 있으며 치료군이 정상군에 가깝게 상승하였다. 작은 차이이나 비타민C가 당뇨군에서 가장 높게 나타났으며 비교적 당뇨 치료군간에 차이가 크게 나타나지 않았다. 그러나 당뇨의 유도가 신장의 GR 활성도에 크게 영향을 미치지 않았다는 보고들과 같은 경향을 나타내었다.

4.3 신장의 글루타치온 과산화효소의 활성도

글루타치온 과산화효소(GPx)의 활성은 도 7에 나타내었다. 유의적이지는 않으나 당뇨대조군이 정상군에 비해 증가하였으며 치료군에 의해 감소된 것을 확인할수 있었다. 다른 연구보고(이영미,1998; Wohaieb, 1987; Asayama et al., 1991)에서도 당뇨상태에서 GPx의 활성이 증가함을 보이고 있는데 조직마다 다른 양상을 보이는 것으로 알려져 있다. 즉 신장의 경우 활성이 증가하나 수정체에서는 당뇨상태에서 감소한다. 이는 GPx의 활성이 낮은 조직에서는 산화적 스트레스에 대항하여 보충적으로 활성도가 증가하는 것으로 알려져 있다(Wohaieb et al., 1987). 1형 당뇨에서 인슐린의 부족은 지방산의 β-산화를 자극하여 H₂O₂의 형성을 야기시키며 세포는 이에 따른 보충작용이 필요하게 된다. 신장은 간 등 다른 조직에 비해 상대적으로 GPx의 활성도가 낮아 산화적 스트레스가 증가하게 될 때 보충작용이 나타나는 것으로 해석될 수 있다. 본 연구에서도 같은 경향을 보였으나 당뇨의 혼합 식이군에서는 정상군보다도 낮아진 것을 볼 수 있다. 항산화효과 작용으로 GPx가 활성화되지 않아도 산화적 스트레스를 해소시켰다고 할 수도 있으나 정상군보다도 낮아졌다는 것은 회복으로 보기 어려울 것으로 사료된다.

5. 신장의 피질 조직과 수정체의 소르비톨 함량

도 8에 신장의 피질과 수정체에서의 소르비톨 농도를 나타내었다. 정상 대조군에 비해 당뇨대조군의 소르비톨 함량이 20% 가량 증가하였으며 정상군에 비해 당뇨군의 함량이 높다. 당뇨군내에서는 대조군에 비해 치료군이 낮은 함량을 나타내므로 신장의 소르비톨 함량에 효과가 있는 것으로 사료된다. 특히 비타민 E군과 복분자군에서 효과가 컸으며 복분자가 대조군의 70% 수준으로 소르비톨 함량이 떨어진 것을 확인할 수 있었다. 그러나 비타민 E와 복분자를 함께 처리한 군에서의 상승효과는 확인할 수 없었다. 그리고 비타민 C군의 경우에도 대조군에 비해 떨어졌으나 다른 치료군에 비해서는 정도가 약한 편이다. 전반적으로 당뇨치료군이 정상군의 수준까지는 감소시키지 못하였지만 다른 보고(이영미,1998)들에 비하면 상당히 감소시킨 것으로 나타났다. 특히 복분자의 경우 신장에 미치는 효과가 여러 검사항목에서 두드러지게 나타나 신장기능과 신장의 산화적 손상, 그리고 폴리올 경로 효소저해 등의 효과가 있는 것으로 기대된다. 지금까지 보고된 바로는 당뇨상태에서 신장의 소르비톨 농도는 증가하며 특히 신장 수질에서 피질보다 높은 농도를 보고하고 있다(Wirthensohn et al., 1989; Yue et al., 1989). 또한 당뇨 유도한 흰쥐에서 신장의 수질에서 보다 피질에서 정상군에 비해 소르비톨 함량이 더 증가한다는 보고가 있다(이영미.1998; Corder et al., 1977; Yue et al., 1989). 본 연구에서는 피질과 수질을 동시에 확인하지는 않았으나 피질에서 보인 비타민 군과 복분자의 효과를 미루어 신장에서 일어나는 폴리올 경로에 대한 효과를 기대할 수 있는 것으로 사료된다.

수정체에 대한 효과는 도 9에 나타내었으며 당뇨 대조군이 정상 대조군에 비해 11배 증가한 것으로 나타났다. 이는 당뇨유도 후 8주간 자유급식으로 사육한 연구에서 보고한 30배에 비해 비교할 만한 감소라고 할 수 있다. 이는 제한급식으로 인한 고혈당상태가 조절됨으로 인해 폴리올 경로 작동기작에 필요한 기질공급이 제한되었기 때문으로 사료된다. 그러나 사람의 경우 실험쥐에서 보이는 높은 소르비톨의 증가와는 다른 경향을 나타낸다. 즉 백내장이 형성된 사람의 수정체에서는 소르비톨 함량이 5배정도 증가하는 것으로 나타나며 사람의 폴리올 경로 활성도가 실험동물과 다르므로 동물에서의 효과를 연구하는 것이 사람에게 큰 효과를 나타내기 어렵다고 보는 것이다. 그러나 ARI의 효과가 분명하게 동물에서 나타나는 만큼 사람에게서도 어느 정도 치료효과, 혹은 보호 효과를 기대할 수 있을 것이다.

또한, 당뇨 대조군에 비해 치료군에서 유의한 감소를 확인할 수 있었다. 특히 비타민 E군과 복분자군, 비타민 C군에서 소르비톨의 감소가 두드러지게 나타났다. 그러나 폴리올 경로 기작 저해와 항산화작용으로 효과가 나타나리라 예상하였던 비타민 E와 복분자 혼합군에서는 상승효과를 보지 못했다. 뿐만 아니라 사육기간동안 가장 먼저 백내장이 발생하였으며 수정체의 소르비톨 함량외에 다른 분석에서도 상승효과를 확인하지 못하였음을 볼 때 비타민과 천연추출물의 과다한 섭취로 인한 독성작용이 나타난 것으로 사료된다.

6. 수정체의 혼탁도

수정체의 혼탁한 정도를 화상분석 시스템을 이용하여 측정한 결과를 표 9에 나타내었다. 수정체의 경우 비타민 C군을 제외하고는 당뇨의 각군에서 20% 가량 백내장이 발생하였다. 백내장이 눈으로 확인될 만큼 진행되는 데에는 여러 가지 요인이 작용하기 때문에 본 실험을 통해 원인을 밝히기는 어렵다. 그러나 당뇨를 유도하였을 때 STZ약물에 대해 1-2주안에 죽거나 6주 후에 죽은 쥐들의 경우 신장이 많이 손상되어 있었고 수정체의 혼탁도 심하였다. 스트렙토조토신 자체가 발암 물질이며 각 개체의 약물에 민감도가 다름을 고려해야 할 것으로 보인다. 즉 당뇨군내에서 빠르게 백내장이 형성된 경우에 지금까지 제시된 백내장 형성기전 외에도 약물로 인한 신체의 급격한 변화와 약물에 대한 민감도가 고려되어야 하는 것으로 사료된다.

본 연구에서는 빠르게 백내장형성이 일어나는 것을 비타민 E, 복분자, 비타민 C가 막지는 못하였다. 백내장형성이 비가역적 변화인 만큼 이미 진행된 손상된 단백질을 회복시키지는 못하는 것이다. 비타민과 복분자는 진행속도를 늦추어 준다는데 의의가 있기 때문에 각군의 평균 혼탁도를 보는 것은 크게 의미가 없다. 따라서 얼마나 백내장 진행을 막아 주었는가를 보기 위해 혼탁도를 등급을 나누어 그래프화 하였다. 등급은 표 8에 나타내었으며 화상분석 시스템에서 구한 수치는 임의 유니트/픽셀로 수치가 증가할수록 혼탁정도가 심함을 나타낸다. 혼탁도 그래프는 도 10에 나타내었다.

또한 3등급 안에 들어가는 비율을 통해 당뇨 대조군과 치료군의 효과를 비교하였다. 당뇨 대조군은 32.9%, 비타민 E군은 34%, 복분자군은 49.6%, 비타민 E와 복분자 혼합군은 50%, 비타민 C군은 63%로, 비타민 C군이 수정체 혼탁도에 미치는 영향이 가장 좋았다. 14주의 사육기간동안 비타민 C군에서만 백내장이 발견되지 않은 것을 고려할 때 비타민 C가 백내장을 억제하는데 효과가 크다고 볼 수 있다. 백내장 치료제가 없으므로, 비타민 C는 이미 많이 이용되고 있는데 과보충시에도 효과가 좋음을 알 수 있다. 반면 비타민E와 혼합군의 경우는 당뇨대조군에 비해서도 백내장형성이 빨리 진행되었으며 수정체 혼탁도 결과도 좋은 편은 아니였다. 그러나 1,2,3 등급 비교에서는 대조군에 비해 백내장형성이 억제시킨 것을 확인할 수 있었다.

본 연구에서 쥐의 체중과 수정체혼탁과의 관계를 볼 때에 체중 감소정도가적은 경우 수정체가 맑은 것으로 나타났다. 이는 STZ에 의한 개체의 민감도 정도가 작아 다른 개체에 비해 신체적 손상이 덜 일어난 결과라고도 할 수 있다. 수치상으로 나타나지는 않았으나 복분자군에서 체중이 증가하는 쥐에서 수정체가 아주 맑았는데 혈당과 일일 요 배설량은 다른 개체들과 차이가 없었다. 또한 1차유도에 실패한 쥐에게 STZ투여를 2차 실시한 경우 체중 감소정도가 심하였고(약 90-100g/14주) 수정체의 혼탁도 심한 편으로 나타났다. 이를 볼 때에 인슐린의존형 당뇨에서 체중감소정도와 수정체혼탁에 관계가 있을 것으로 예상된다.

수정체 크기 변화에 있어서도 치료군이 당뇨 대조군에 비해 감소한 것을 확인할 수 있었다. 크기 변화는 삼투압과 관계가 있기 때문에 이 결과는 삼투압적 손상에 대해 비타민 E, 비타민 C와 복분자가 효과를 나타낸다고 볼 수 있다. 또한 같은 조건은 아니였으나 4주령의 흰쥐를 STZ으로 당뇨를 유도하여 4주간 혼합사료로 자유 급식시켰을 때의 수정체의 혼탁도가 평균 150 임의 유니트/픽셀 수준으로 나왔다.

쥐 수정체의 혼탁도 분류

등급	I	II	III	IV	V	VI
혼탁도(임의 유니트/픽셀)	<80	80-105	105-130	130-155	155-180	180

렌즈 혼탁도 및 직경에 미치는 실험 식이의 효과

실험군	밀도(임의 유니트/픽셀)	직경(㎜)
정상군	CC	11.58±0.76^NS	4.5±0.02^NS
	CVE	11.95±0.84	4.48±0.02
	CR	11.84±0.63	4.46±0.01
	CM	12.1±0.52	4.5±0.01
	CVC	12.1±1.03	4.46±0.02
당뇨군	DC	129.3±8.06	4.7±0.03
	DVE	121.1±11.40	4.5±0.04
	DR	113.4±9.97	4.49±0.02
	DM	118.3±9.50	4.48±0.03
	DVC	112.5±7.70	4.45±0.03
CC : 정상 대조군 DC : 당뇨군 대조군CVE : 정상군 비타민 E DVE : 당뇨군 비타민 ECR : 정상군 복분자 DR : 당뇨군 복분자CM : 정상군 혼합물(복분자 + 비타민E) DM : 당뇨군 혼합물(복분자 + 비타민E)CVC : 정상군 비타민 C DVC : 당뇨군 비타민 C상기 측정값들은 평균값 ±표준편차이다.NS는 P<0.05 수준에서 던칸 복수 범위 시험에 의해 측정시 유의적 차이가 없는 것이다.

결론

본 연구에서는 복분자, 비타민 E, 비타민 C의 과보충이 스트렙토조토신으로 당뇨를 유도한 흰쥐에서 백내장과 신증에 미치는 영향을 보았다. 특별히 합병증의 기전으로 알려져 있는 폴리올 경로와 산화적 손상에 미치는 영향을 보았으며 알도스 환원효소를 시험관내 상에서 효과적 저해한 복분자와 항산화제인 비타민 E의 혼합을 통해 상승효과를 보고자 하였다. 또한 식이섭취량을 제한하여 합병증 진행억제의 효과를 높이고자 하였다. 본 연구를 통해 나타난 결과를 요약하면 다음과 같다.

당뇨군은 당뇨유도를 통해 혈당이 300mg/dl 인 경우만을 당뇨군으로 하였고 고혈당수준이 유지되었다. 그러나 10주간 당뇨군에게 35g/day를 공급하였을 때 각 군에서 혈당이 떨어지는 쥐가 증가하였고 10주경에는 300mg/dl 아래로 떨어졌다. 그러나 마지막 2주간 40g/일의 식이를 공급하였을 때 500mg/dl수준으로 다시 상승하였다. 또한 당뇨군은 14주간 꾸준히 체중이 감소하였으며 다른 연구보고에서 보인 약간의 체중 증가도 나타나지 않은 것은 식이섭취량을 제한하였기 때문으로 사료된다. HbA₁c는 당뇨 대조군에 비해 처리군에서 유의하게 감소시켰으나 정상군에 미치지 못했다. 혈액 분석도 당뇨 대조군에 비해 당뇨치료군에서 알부민과 BUN 수치에 효과가 있었다. 혈중 크레아티닌은 당뇨군이 정상군보다도 낮았고 군간에 유의한 차이는 없었으나 비타민 E의 수치는 대조군보다 높았다. 혈중 중성지방은 복분자와 비타민 E의 혼합군이 가장 낮은 수치를 보였으며 HDL-콜레스테롤의 경우는 각 군간에 유의한 차가 없었다. 단위 체중당 신장무게는 당뇨 대조군에 비해 치료군에서 모두 효과가 있었고 복분자군이 가장 두드러졌다. 신장과 수정체의 과산화물함량에 있어서도 대조군에 비해 치료군에서 효과가 있었으며 신장의 경우 유의적이지는 않았으나 비타민 E와 복분자의 효과가 컸다.

수정체의 과산화물함량에 있어서도 당뇨 치료군이 정상군의 수준에 가깝게 떨어뜨렸다. 신장의 항산화 효소계도 당뇨 치료군에 의해 GPx활성을 정상군 수준으로 정상화시켰다. 글루타치온 환원효소 활성도의 경우 당뇨치료군 모두 대조군에 비해 증가하였으며 특히 비타민 C군에서 가장 높은 활성도를 보였다. 소르비톨 함량은 당뇨 대조군에 비해 치료군에서 감소하였으며 복분자와 비타민 E의 상승효과를 보기는 어려웠다.

수정체의 경우 과산화물 함량이 당뇨군에서 높게 나타났으며 치료군이 효과적으로 정상군에 가깝게 낮추어 주었다. 또한 수정체는 신장에 비해 당뇨군과 정상군의 차이가 크게 나타남으로 인해 수정체가 산화적 손상에 민감하게 영향 받는다고 보고한 연구(이영미,1998)와 같은 경향을 보였다. 그러나 산화적 손상에 민감한 만큼 항산화의 효과도 두드러지게 나타나므로 항산화제를 통한 당뇨시 백내장 형성저해에 대한 효과를 기대해 볼 수 있다. 수정체의 혼탁도에서 비타민 E와 혼합군의 경우 혼탁도를 개선하는 효과가 크지 않았다. 비타민 C가 혼탁도를 가장 많이 감소시켰으며 눈으로 확인할 수 있는 백내장형성이 일어나지 않았다. 반면 나머지 당뇨 치료군과 대조군에서는 전체의 20%에서 백내장이 형성되었다. 수정체의 소르비톨 함량에서 혼탁도와 같이 혼합군의 소르비톨 함량이 높았다. 당뇨대조군이 정상군에 비해 11배 증가하였으나 치료군에 의해 감소되었다. 또한 소르비톨을 통해 ARI의 저해효과를 보고자 하였는데 복분자군에서 유의하게 감소시킴으로 복분자의 ARI로서의 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 혼합군의 경우 백내장형성저해 효과가 나타나지 않은 것은 농도 설정의 문제로 생각되어 진다. 따라서 적합한 농도를 찾는 연구가 이뤄져야 상승 효과에 대한 분명한 결론을 내릴 수 있을 것이다.

따라서 신장의 경우 복분자의 항산화와 조직강화의 효과를 기대할 수 있으며 수정체에서는 비타민 C 과보충시 백내장을 효과적으로 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 제한 식이를 함으로 인해 다른 연구에서 나타난 합병증 정도와는 달리 많이 억제된 것을 확인하였다. 즉 수정체의 소르비톨 함량은 당뇨 대조군이 정상대조군의 11배로 이영미(1998)의 연구에서 보고한 30배에 비해 감소한 수치이며, 신장의 과산화물의 함량도 당뇨대조군의 수준이 정상군의 2.4배, 수정체에서 7배로 보고한 것에 비해 본 연구에서는 정상대조군에 비해 각각 53%, 73% 증가함을 보여 전체적으로 당뇨의 과산화물 수치가 떨어졌다. 또한 수정체의 혼탁도 역시 4주간 자유급식한 당뇨쥐에 비해 전반적으로 맑은 수정체를 보여 제한식이의 효과를 확인할 수 있었다(도 11).

결론적으로 제한식이와 고농도의 비타민 E, 과보충한 비타민 C, 복분자의 당뇨합병증 억제에 대한 효과를 확인할 수 있었으며 신장에서는 복분자와 비타민 E, 수정체에서는 비타민 C의 효과가 두드러졌다. 작용기전으로는 항산화 효과가 컸음을 알 수 있었다. 복분자의 폴리올 경로에 대한 억제효과도 볼 수 있었다.

Claims

당뇨합병증을 억제 또는 예방하는 효과를 갖는 복분자(Rubus coranus Miquel) 수침 추출물.
제1항에 있어서, 당뇨합병증이 백내장 또는 신증인 것을 특징으로 하는 복분자 수침 추출물.
당뇨합병증을 억제 또는 예방하는 효과를 갖는 메가용량의 비타민 E를 함유하는 약제.
당뇨합병증을 억제 또는 예방하는 효과를 갖는 메가용량의 비타민 C를 함유하는 약제.
제3항 또는 제4항에 있어서, 당뇨합병증이 백내장 또는 신증인 것을 특징으로 하는 약제.