KR100392244B1 - 신경사단백질유전자발현및알쯔하이머병의검출 - Google Patents

신경사단백질유전자발현및알쯔하이머병의검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알쯔하이머병, 신경 외배엽성 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아종과 관련된 신규의 단백질을 발현시키는 재조합 숙주에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 신경사 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 숙주 및 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 거의 순수한 신경사 단백질, 이 단백질의 존재를 검출하는 면역 진단학적 및 분자 진단학적 방법, 및 신경사 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 유전자 치료에 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

신경사 단백질 유전자 발현 및 알쯔하이머병의 검출
연방정부-지원 연구 및 개발하에 이루어진 발명에 대한 권리에 관한 언급
본 발명은 미국 정부 지원하에 이루어진 것이다. 그러므로, 미국 정부는 본 발명에 대한 특정의 권리를 가진다.
관련 출원에 관한 상호 관계
본원은 1993년 4월 20일에 출원된 미국 출원 일련 번호 제08/050,559호의 일부 계속 출원이며, 그 내용을 본원에 참고로 인용하였다.
알쯔하이머병
알쯔하이머병(AD)은 미국에서 매년 200만명 이상이 앓는 치매의 가장 흔한원인이다. 이 병은 기억상실, 착란 및 점진적 신체 쇄약을 임상적 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환이다. 이 병은 사망의 가장 흔한 원인중 네 번째이다. 이 병의 병인은 실제로 알려지지 않고 있으나, 유전자 결함 뿐만 아니라, 다양한 비루스, 독소, 중금속이 원인인 것으로 여겨저 왔다. 이 병은 현재로서는 불치병이다.
극히 최근까지, AD는 노인성 치매로 일반적으로 분류되는 비교적 소수의 환자들의 병인으로 생각되었다. 기타 요인들이 그러한 상태를 일으키는 데, 그 예로는 반복성의 약한 발작, 갑상선 질환, 알코올 중독 및 특정 비타민 결핍증이 있으며, 이중 다수는 치료 가능성이 있다. 그래서, AD에 특이적인 진단 시험이 상기 모든 상태에 공통적인 징후를 나타내는 환자의 임상적 진단 및 적절한 임상적 치료에 매우 유용할 것으로 생각된다.
AD환자의 뇌는 신경 세포체내 신경원섬유 엉킴 및 신경염(또는 노인성) 플라크로서 발생하는 콩고-레드 친화성 섬유 물질의 병리학적 축적 특성을 나타낸다. 신경원섬유 엉킴은 또한 특정 대뇌 혈관벽에서도 발견할 수 있다. 신경원섬유 엉킴의 주요 조직화된 구조 성분은 쌍을 이룬 나선형 필라멘트이다. 질적으로 구별할 수 없는 아밀로이드 침착물 역시 정상 연령의 뇌에서는 나타나나, 제한된 조직학적 분포를 가지고 훨씬 더 적은 수로 나타난다.
AD의 신경염 플라크 및 신경원섬유 엉킴, 및 기타 신경학적 질병에서 발견되는 단백질의 특성 분석과 관련하여 상당한 연구 활동이 최근에 이루어졌다. Glenner 등에 의해 최초로 언급된 아밀로이드 단백질중의 하나가 클로닝되었고, 서열이 분석되었다(Glenner등,Biochem. Biophys. Res. Commum. 120:1131-1135(1984): 미국 특허 제4,666,829호). 신경염 플라크 및 혈관에서 발견되는 A4 아밀로이드 단백질은 695개의 아미노산의 전구체 성분인 것으로 측정되었으며; 당부가된 세포 표면 수용체로서 기능하는 것으로 가정되었다(Masters 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4245-4249(1985), Kang등,Nature325:733-736(1987)). 또한, 아밀로이드 단백질은 세포 부착 분자로서 그리고 칼슘 이온 채널 단백질로서 기능하는 것으로 가정되어 왔다(Hooper,J. NIH Res. 4: 48-54(1992); Rensberger,Wayward Protein Molecule May Be Elusive Killer of Brain Cells, The Washington Post, January 25.1993. §1, A3(1993)). A4를 암호화하는 유전자는 염색체21상에 존재하나(Kang등, 동일 문헌; Goldgaber등,Science 235:877-880 (1987); Tanzi 등, Science 235:880-885(1987): St. George-Hyslop등,Science 235:885-889(1987)), 명백히 상기 질병의 가족 형태와는 관계가 없다(Van Broekhoven등,Nature329:153-155(1985)). 아밀로이드 A4와 β단백질, 그들의 고분자량 전구체, 및 췌장 신경사 단백질(PTP) 사이에 서열 상동성은 있다 하더라도 거의 없다(Gross등,J. Clin. Invest. 76:2115-2126(1985)).
상기 질병과 관련된 것으로 생각되는 다수의 기타 단백질이 개시되었는 데, 그 예로는 유비퀴논, ALZ-50, 미소관-연합 단백질τ 및 MAP2, 신경필라멘트 단백질이 있다(참조예:Manetto등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4502-4505(1988): Wolozin등Science 232:648-651(1986); Selkoe,Neurobiol. Aging 7:425-432 (1986); Perry등,Alteraions of the Neuronal Cytoskeleton in Alzheimer'sDisease, 플레넘, 뉴욕, 137-149면 (1987). 보다 최근에는, α1-항-키모트립신으로 불리는 세린 프로테아제 저해제가 AD 아밀로이드 침착물에서 발견되었다(Abraham등,Cell 52:487-501(1988)).
AD의 유용한 진단 시험으로 현재 임상적으로 사용되고 있는 것은 없다. 이 질환을 특성화하는 특징적 플라크, 엉킴, 쌍을 이룬 나선형 필라멘트 및 기타 대뇌 혈관 침착물의 존재를 나타내기 위한 명확한 진단은 사후에만 또는 생존중 생검을 통해 가능하다. 그러한 침해성 수술 방법은 본질적으로 위험하며, 따라서 이용 빈도는 매우 적다. 결국 AD의 임상적 오진은 약 20 내지 30%에 이른다.
사 단백질
원형(protype) 사 단백질은 췌장 사 단백질(PTP)인 데, 이것은 중성 pH에서는 불용성 근원섬유를 형성하는 특이한 물리적 성질을 가지나, 산성 또는 알칼리 pH에서는 가용성이 매우 크다(Gross등, 상기 참조). PTP는 매우 풍부하며, 췌장 소엽 세포에서 합성되며, 1 mg/ml를 넘는 농도로 췌장액내로 분비된다(상기 문헌 참조). 증가된 사 단백질 면역 반응성은 PTP에 대한 단일 클론 항체를 사용하여 AD 병변을 가진 뇌에서 측정하여 왔다(Ozturk등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 419-423)). 또한, 고감도 전방 샌드위치 면역방사계측법을 사용하여 3종 이상의 상이한 항원성 에피토프가 PTP와 뇌의 관련 단백질 시이에 공통점이 있음을 입증하였다(상기 문헌 참조). 상기 사 단백질의 췌장형 및 신경형은 유사성에도 불구하고, 거의 확실히 구별되는 데, 그 이유는 mRNA 분자 및 단백질이 크기가 상이하고, 췌장 사 단백질에 존재하는 항원성 에피토프중 다수가 뇌 조직에서는 검출할 수 없기 때문이다(de la Monte등,J. Clin Invest. 86: 1004-1013(1990); de la Monte등,J.Neurol. Sci. 113:152-164(1992);de la Monte등,Ann. Neurol, 32: 733-741(1992)).
상기 사 단백질의 중추 신경계형은 이하 "신경사 단백질"(NTP)로 지칭하며, AD 및 다운 증후군 뇌 조직에서 확인되었다(Wands등, 국제 출원 공개 제WO 90/06993호). 상기 질병의 특징적 신경 병리학적 변화가 존재하는 경우에 연구된 모든 AD 뇌에서 NTP가 발견되었다(상기 문헌 참조). 가용성 면역 반응성이 공통된 염수-추출물은 약 17 내지 20kD의 분자량을 가졌다(상기 문헌 참조).
AD 뇌의 다양한 지역에서의 NTP 면역 반응성의 정량적 측정은 대조군 뇌의 상응하는 지역에서의 1 내지 11 ng/gm조직(평균=5 ng/gm조직)에 비해 12 내지 295 ng/gm조직(평균=116 ng/gm조직)의 범위를 나타내었다(상기 문헌 참조).
PTP의 췌장형에 대한 단일 클론 항체를 사용하여 실시한 면역세포화학 분석은 NTP가 세포내에, 신경망내 미세 돌기내에 위치하거나, 또는 AD 및 다운증후군의 뇌에서는 세포외에 존재한다는 것을 입증하였다(상기 문헌 참조). 두 유형의 세포는 NTP: 뉴런 및 성상체를 함유한다(상기 문헌 참조). 발병된 뉴런은 AD뇌에서는 널리 알려진 신경원섬유 엉킴을 통상 포함하는 대형의 피라미드형이다(상기 문헌 참조).
뉴런내 NTP 축적이 본질적으로 중요하다거나 또는 AD 병변의 발생과 필수적인 관계가 있다는 것은 다운증후군의 뇌에서는 NTP에 대한 면역 표지의 동일한 유형의 존재에 의해 확증되나, 대조군 뇌에서는 확증되지 않는다(상기 문헌 참조). AD의 동일한 구조적 이상이 다운증후군을 가진 모든 중년의 환자(치매성이든 아니든)의 뇌에서 나타난다는 것에 주목하는 것은 중요하다. 또한 다운증후군 환자의 가족 구성원중에 AD의 발병률은 보다 높다. 게다가, NTP 함유 뉴런의 밀도에 있어 지역적 차이는 AD 및 다운증후군 모두에서 신경원섬유 엉킴의 밀도 분포와 유사하다. 이것은 NTP가 AD의 병리생리학과 밀접한 관계가 있다는 증거를 추가로 제시한다. 세포의 이상 대사 또는 수송의 결과로서 NTP가 신경핵 부위 세포체내에 축적되는 지는 아직 알려지지 않았다.
발명의 요약
AD가 있거나 또는 그 발병 위험이 있는 것으로 의심되는 사람에게서 실시할 수 있는 명확한 진단 시험이 필요하다. 본 발명은 그러한 필요성을 충족시키고 추가의 장점을 제공한다.
상기 목적 및 기타 목적을 본 발명에 의해 실현하는 방법은 하기에 제시하는 발명의 요약 및 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.
달리 정의하지 않으면, 본원에 사용된 다양한 용어는 본 발명이 속하는 분야에서는 널리 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 모든 인용 문헌들은 본원에 참고로 인용한다.
본 발명은 알쯔하이머병, 신경 외배엽성 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아종과 관련된 신규의 단백질을 발현시키는 재조합 숙주에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 약 8 kDa, 14 kDa, 17 kDa, 21 kDa, 26 kDa 또는 42 kDa의 분자량을 갖는 신경사 단백질(NTP)을 암호화하는 유전자를 포함한 재조합 숙주 및 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 거의 순수한 신경사 단백질, 이 단백질의 존재를 검출하는 면역진단학적 및 분자 진단학적 방법, 및 신경사 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 유전자 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 인간 시험 대상에서 NTP를 검출하고 정량분석하는 방법을 제공하는 데, 이 방법은 (a) NTP의 검출가능한 레벨을 함유하는 것으로 의심되는 인간 시험 대상의 생물학적 샘플을 NTP에 결합할 수 있는 분자와 접촉시키는 단계; 및 (b) NTP에 결합된 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로 상기에 제시한 방법으로서, 결합 분자가 (a) 천연 불순물이 거의 없는 항체; (b) 단일 클론 항체; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 단편으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 특징인 방법을 포함한다.
본 발명은 추가로 상기 방법으로서, 상기 검출 분자가 검출가능하게 표지하고, 상기 결합 분자의 배합을 사용하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 재조합 인간 NTP에서 유래한 폴리뉴클레오티드프로브를 사용하여 생물학적 샘플내에서 NTP를 암호화하는 유전자 서열의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 인간 시험 대상에서의 질병 상태의 존재를 측정하는 방법을 제공하는 데, 여기서 상기 상태는 알쯔하이머병, 신경 외배엽성 종양, 악성 성상 세포종 및 교아종으로 구성된 군에서 선택되나, 이들에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 AD를 가진 것으로 의심되는 인간 시험 대상에서 AD의 존재를진단하는 방법을 포함하는 데, 이 때, 이 방법은 (a) NTP를 함유하는 것으로 의심되는 상기 대상의 생물학적 샘플을 NTP를 동정할 수 있는 분자와 함께 항온처리하는 단계; 및 (b) 샘플내 결합된 분자를 검출하는 단계를 포함하며, 여기서, 이 검출은 그 대상이 AD를 가진다는 것을 나타낸다.
본 발명은 또한 신경 외배엽성 종양을 가진 것으로 의심되는 시험 대상에서 신경 외배엽성 종양의 존재를 진단하는 방법으로서, (a) NTP를 함유하는 것으로 의심되는 상기 대상의 생물학적 샘플을 NTP를 동정할 수 있는 분자와 함께 항온처리하는 단계, 및 샘플내 결합된 분자를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는데, 여기서, 상기 검출은 상기 대상이 신경 외배엽성 종양을 가짐을 나타낸다.
본 발명은 추가로 악성 성상세포종을 가진 것으로 의심되는 인간 시험 대상에서 악성 성상세포종의 존재를 진단하는 방법으로서, (a) NTP를 함유하는 것으로 의심되는 상기 시험 대상의 생물학적 샘플을 NTP를 동정할 수 있는 결합 분자의 존재하에 항온처리하는 단계; 및 (b) 상기 샘플내 결합된 분자를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 데, 여기서, 상기 검출은 상기 시험 대상이 악성 성상세포종을 가짐을 나타낸다.
또한 본 발명은 신경교아종을 가진 것으로 의심되는 인간 시험 대상에서 신경교아종의 존재를 진단하는 방법으로서, (a) NTP를 함유하는 것으로 의심되는 상기 시험 대상의 생물학적 샘플을 NTP를 동정할 수 있는 결합 분자의 존재하에 항온처리하는 단계; 및 (b) 상기 샘플내 결합된 분자를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 데, 상기 검출은 상기 시험 대상이 신경교아종을 가짐을 나타낸다.
본 발명은 또한 상기에 제시한 방법으로서, 생물학적 샘플을 샘플과 상기 분자의 접촉 전에 상기 시험 대상으로부터 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 상기에 제시한 방법으로서, 상기 단백질에 결합된 임의의 분자의 검출을 동일계 결상법으로 실시하는 방법을 포함한다.
본 발명은 추가로 상기에 제시한 방법으로서, 상기 단백질에 결합된 임의의 분자의 검출을 생체내 결상법으로 실시하는 방법을 포함한다.
본 발명은 추가로 상기에 제시한 방법으로서, 생물학적 샘플을 상기 단백질의 분포 및 존재를 측정하기에 충분한 방법 및 조건하에 결합 분자와 반응시키는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 상기에 제시한 방법으로서, NTP의 검출가능하게 표지한 결합 분자를 인간 시험 대상에 투여하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 상기에 제시한 방법으로서, 결합 분자가 생체내에서 단백질에 결합되는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하며, 약 42 kDa의 분자량을 가진 NTP를 포함한다.
본 발명은 추가로 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하며, 약 26 kDa의 분자량을 가진 NTP를 포함한다.
본 발명은 추가로 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하며, 약 21 kDa의 분자량을 가진 NTP를 포함한다.
본 발명은 추가로 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하며, 약 17 kDa의분자량을 가진 NTP를 포함한다.
본 발명은 추가로 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하며, 약 14 kDa의 분자량을 가진 NTP를 포함한다.
본 발명은 추가로 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하며, 약 8 kDa의 분자량을 가진 NTP를 포함한다.
본 발명은 또한 상기에 언급한 진단 방법으로서, 면역분석법이 용액내 검출가능하게 표지한 제3의 상이한 항체와 결합된 고체상 지지체에 결합된 두 개의 상이한 항체를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 NTP를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 (a) 상기 NTP를 암호화하는 인간 유전자를 함유하는 재조합 숙주를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 숙주로부터 상기 NTP를 분리하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 얻은 거의 순수한 NTP에 관한 것이다.
본 발명은 또한 NTP 핵산 서열에 상보적이고, PTP 핵산 서열에는 비상동성인 15량체 내지 30량체 안티센스 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라, 이 올리고뉴클레오티드 및 약학적 허용 담체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 NTP 핵산 서열에 상보적이고, PTP 핵산 서열에는 비상동성인 표적 서열을 포함하는 리보자임 뿐만 아니라, 이 리보자임 및 약학적 허용 담체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 허용성 담체 또는 발현 벡터를 통해 NTP 분자를 뇌로 약리학적으로 전달하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 다양한 NTP 유전자(핵산 서열)와 3중 가닥을 형성하며 PTP 핵산 서열에 비상동성인 올리고데옥시뉴클레오티드 뿐만 아니라, 이 올리고데옥시뉴클레오티드 및 약학적 허용 담체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 신경 퇴화의 알쯔하이머형의 치매를 변형시키거나 또는 개선하는 데에 사용하는 NTP-유래 분자 또는 그 단편의 치료학적 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 산발적이고 가족 특이적인 알쯔하이머병의 차등 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명은 유전공학 및 분자생물학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 알쯔하이머병, 신경외배엽 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아종과 관련된 신규의 단백질을 발현시키는 재조합 숙주에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 신경사 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 숙주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 거의 순수한 신경사 단백질, 신경사 단백질의 존재를 검출하는 면역진단 및 분자진단적 방법, 및 신경사 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 유전자 치료에 사용하는 방법에 관한 것이다.
제1A도-제1J도는 CNS-유래 종양에서의 신경사 단백질 면역 반응성을 나타낸 것이다.
제2도는 전방 샌드위치 단일클론 항체계 면역방사계측법(M-IRMA)으로 측정한 PNET1, PNET2, A172, C6 및 Huh7 간세포암 세포에서의 신경사 단백질 레벨을 도시한 그래프이다.
제3도는 Th9 단일클론 항체를 사용하여 면역침전법 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된, SH-Sy5y, A172 및 C6 세포에서의 신경사 단백질의 분자 크기를 나타낸 것이다.
제4도는35S-메티오닌을 사용한 펄스-추적 대사적 표지법 및 Th9 단일클론 항체(제4A도)를 사용한 면역침전법으로 측정한 PNET1 세포(a) 및 C6 신경교아종 세포(b)에서의 신경사 단백질의 분자 크기를 도시한 것이다. 분자량은 8, 14, 17,21, 26 및 42 kDa이다(화살표).
제5A도-제5E도는 SH-Sy5y, PNET1, A172 및 C6 세포에서의 21 kDa 및 17 kDa의 신경사 단백질의 존재와, Huh7 세포에서의 이 단백질의 부재를 SDS-PAGE/M-IRMA로 나타낸 5개 그래프의 시리즈이다.
제6도는 C6 신경교아종 세포의 21 kDa 신경사 단백질이 인산화된 것을 보여주는 겔을 도시한 것이다.
제7도는 증식 단계의 PNET1 세포에서의 변화된 신경사 단백질을 나타내는 막대 그래프를 도시한 것이다.
제8A도-제8F도는 세포 증식이 중지되고 하루밤 동안 혈청을 고갈시킨 PNET1 세포의 변화된 표현형을 나타낸 것이다.
제9도는 1-9a의 부분적 서열을 도시한 것이며, 제9A도는 1-9a의 cDNA의 5'영역(WP5'서열)에 상응하는 제2의 5'고정 PCR 생성물의 부분 서열을 도시한 것이다.
제10도는 1-9a와 인간 PTP 및 Reg 유전자(인간 PTP의 게놈 클론에 상응하는 핵산 서열)사이의 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제10A도는 인간 Reg 유전자의 1-9a와 엑손 2 사이, 및 1-9a(WP03-417)의 제1의 5'고정 PCR 생성물과 엑손2 및 Reg 사이의 배열을 도시한 것이다.
제10B도는 1-9a와 그 제2의 5'고정 PCR 생성물(WP5') 사이 및 AD3-4와 AD2-2 cDNA 사이의 배열을 도시한 것이다.
제11A도는 HB4 cDNA의 부분 핵산 및 추론 아미노산 서열을 도시한 것이다.
제11B도 및 제11C도는 단백질 친수성 윈도우 플로트를 도시한 것이다(친수성윈도우 크기=7: 규모=카이트-둘리톨).
제11D도는 HB4와 인간 PTP 사이의 배열을 도시한 것이다.
제11E도는 HB4와 인간 Reg 유전자 사이의 배열을 도시한 것이다.
제12A-12C도는 신경 외배엽성 종양 세포주 및 쥐의 췌장에서의 1-9a CNS 신경사 단백질 cDNA 서열에 상응하는 mRNA 분자의 발현을 도시한 것이다.
제13A도 및 제13B도는 인간 뇌에서의 1-9a CNS 신경사 단백질 cDNA 서열에 상응하는 mRNA 전사체를 도시한 것이다. 본도는 또한 연령별 대조군(제13A도)과 비교한 AD 뇌에서의 1-9a CNS 신경사 단백질-관련 mRNA의 보다 고레벨을 입증한다. 제13B도는 연령 대조군과 비교한 AD에서의 다량의 보다 저분자의 크기인 mRNA를 가진 4개의 상이한 전사체를 입증한다.
제14A도-제14C도는 신경 외배엽성 세포주에서의 RT/PCS 유래 cDNA의 1-9a 서던 블롯 분석을 도시한 것이다. 신마우스(NB)의 뇌, AD의 뇌, 및 연령별 대조군의 뇌에서 유래한 mRNA를 사용한 신경 외배엽성 세포주에서의 1-9a mRNA 서열의 A-PCR 및 B-PCR 증폭. 제14A도는 제14B도의 장시간 노출의 결과이다. 제14C도는 O18쥐의 PTP 프로브를 사용한 동일 블롯의 하이브리드화를 나타낸다.
제15A도 및 제15B도(SE-RT/PCR)는 mRNA를 역전사시키고 1-9a 부분 cDNA의 기지 서열에 상응하는 프라이머로써 증폭시키므로써, SH-Sy5y 세포에서 분리한 몇개의 클론과 1-9a 및 O18 프로브의 하이브리드화를 도시한 것이다.
제16A도, 제16D도 및 제16E도는 AD뇌 라이브러리에서 분리한 AD 2-2 cDNA의 부분 핵산 서열을 도시한 것이다. 제16B도 및 제16C도는 또한 AD2-2 T7의 친수성윈도우 플로트를 나타낸다(친수성 윈도우 크기=7: 규모=카이트-둘리틀).
제16F도, 제16I도, 제16J도 및 제16K도는 AD뇌 라이브러리에서 분리한 AD 3-4 cDNA의 부분 핵산 서열을 도시한 것이다. 제16C도 및 제16H도는 또한 AD3-4의 친수성 윈도우 플로트를 나타낸다(친수성 윈도우 크기=7, 규모=카아트-둘리틀).
제16L도, 제16M도 및 제16N도는 AD뇌 라이브러리에서 분리한 AD 4-4 cDNA의 부분 핵산 서열을 도시한 것이다.
제16O도는 AD뇌 라이브러리에서 분리한 AD 16c(AD 10-7로도 불림) cDNA의 부분 핵산 서열을 도시한 것이다. 제16P도 및 제16Q도는 또한 AD16c-T7의 친수성 윈도우 플로트를 나타낸다(친수성 윈도우 크기=7; 규모-카이트-둘리틀).
제16R도는 AD뇌 라이브러리에서 분리한 AD10-7 cDNA 클론의 완전한 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
제16S도는 AD뇌 라이브러리에서 분리한 AD16c cDNA 클론의 완전한 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
제17도는 AD 2-2와 인간 Reg 유전자 사이의 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제17A도는 AD 2-2와 Reg의 엑손1 및 쥐의 PTP 사이의 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제17B도는 AD 2-2와 1-9a 사이의 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제17C도는 AD 2-2 및 AD 16c 사이의 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제18도는 AD 3-4(AD 5-3으로도 불림)와 Reg 유전자 사이의 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제18A도는 AD 3-4와, 1-9a mRNA의 5'고정 PCR 생성물(WPO3-5 및 18-4) 사이의 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제18B도는 AD 3-4와 G2a-aEcoR1/PstI 게놈 클론 사이의 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제19도는 AD 4-4와 AD2-2 및 1-9a(1-9a와 동일한 PCR 클론에 상응하는 SE-4로도 불림)사이의 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제20도는 AD 16c와 Reg 유전자 사이의 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제20A도는 AD 16c와 인간 PTP 사이의 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제20B도는 AD 16c와 AD 2-2사이의 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제21A-21D도는 프로브로서 AD 3-4를 사용한 게놈 서던 분석을 도시한 것이며; 제21B도는 프로브로서 AD 2-2를 사용한 게놈 서던 분석에서의 유사한 하이브리드화 패턴을 도시한 것이다. 제21A-21D도는 프로브로서 AD 3-4를 사용한 신경 외배엽성 종양 세포주의 노던 블롯 분석을 도시한 것이다. AD 3-4 전사체를 나타내는 4개의 세포주는 표현형이 신경성이었고; C6 신경교종 세포 mRNA는 AD 3-4 프로브와 하이브리드되지 않았다. 제21D도는 AD 3-4 프로브를 사용한 인간 AD 및 연령별 대조군 측두엽 조직의 노던 분석을 도시한 것이며, 본도는 연령별 대조군 뇌(C로 표지한 레인)과 비교한 AD(A로 표지한 레인)에서의 상응하는 유전자의 과다-발현을 입증한다.
제22도, 제22A도, 제22B도, 제22C도, 제22D도, 제22E도, 제22F도, 제22G도및 제22H도는 4개의 게놈 클론(프로브로서 1-9a cDNA 및 쥐의 PTP O-18 cDNA를 사용하여 분리한 것)의 부분 서열을 도시한 것이다.
제23도 및 제23A도는 Reg 유전자를 가진 G2a-2PstI 부분 서열의 배열을 도시한 것이다.
제23B도는 G2a-2PstI-EcoRI 서열 및 Reg 유전자 및 쥐의 PTP의 배열을 도시한 것이다.
제23C도 및 제23D도는 G5d-1PstI 서열 및 Reg 유전자의 배열을 도시한 것이다.
제24A도-제24D도는 1-9a cDNA(제24A도) 및 G2a-2PstI 게놈 클론(제24B도)에 의한 신경사 단백질 발현을 도시한 것이다. 제24C도 및 제24D도는 각각 클로닝된 삽입체가 없는 G5d-1EcoRI/PstI 게놈 클론 및 p블루스크립트에 의한 음성 발현을 나타낸다.
제25A도 및 제25B도는 AD 및 연령별 대조군에서의 AD16c mRNA의 노던 블롯 분석을 도시한 것이다. 데이타는 1 내지 6명의 연령별 대조군과 비교한 9명의 AD중 6명에서 AD16c mRNA 발현 레벨의 증가를 나타낸다.
제26도는 발현된 표지 단백질에 대한 단일클론 항체(T7-표지 마우스 단일클론 항체)를 사용한 AD10-7 융합 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다.
제27A도 및 제27B도는 초기 AD의 인간 뇌조직 절편에 대한 센스 및 안티센스 cRNA 프로브의 동일계 하이브리드화의 명시야 및 암시야 현미경 분석을 도시한 것이다.
하기 설명에서는 재조합 DNA 기술에 사용된 많은 용어들을 널리 사용했다. 그러한 용어들의 취지를 비롯하여 본 명세서 및 특허 청구의 범위를 분명하고 일관되게 이해할 수 있도록, 하기 정의를 제공한다.
클로닝 벡터.숙주 세포내에서 자가 복제할 수 있고, 하나 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 특징으로 하는 플라스미드 또는 파지 DNA 또는 다른 DNA 서열을 의미하며, 상기 인식 부위에서 그러한 DNA 서열은 벡터의 본질적인 생물학적 기능을 손상시킴이 없이 측정가능한 방식으로 절단될 수 있으며, 상기 인식 부위내로 DNA 단편을 스플라이싱하여 이 단편의 복제 및 클로닝을 일으킬 수 있다. 클로닝 벡터는 또한 이 벡터로 형질전환된 세포의 동정에 사용하기에 적합한 마커를 포함할 수 있다. 마커는 예컨대 테트라시클린 내성 및 암피실린 내성을 제공할 수 있다.
형질 발현 벡터.클로닝 벡터와 유사하나, 숙주내로 형질전환 후 벡터내로 클로닝된 유전자의 형질발현을 향상시킬 수 있는 벡터. 클로닝된 유전자는 보통 프로모터 서열과 같은 임의의 조절 서열의 조절(즉, 조절 서열에 작동가능하게 결합된)하에 배치된다. 프로모터 서열은 구성형 이거나 유도형일 수 있다.
실질적으로 순수한.본원에서는 목적하는 정제된 단백질이 세포 성분의 오염이 거의 없는 것을 의미하며, 이 세포 성분은 본래 목적하는 단백질과 결합되어 있기 때문에 폴리아크릴아미드-도데실 황산 나트륨 겔 전기영동으로 단일 밴드로 확인된다. 세포 오염 성분은 단백질성 불순물, 탄수화물, 또는 지질의 불순물을 포함하며, 이것에만 국한되는 것은 아니다.
"실질적으로 순수한" 이란 용어는 또한 당업자들에 의해 사용되는 순도 또는 균질도 특성중 하나 이상이 균질한 분자를 의미한다. 예를 들면, 실질적으로 순수한 NTP는 다음과 같은 매개변수들에 대한 표준 실험 편차내에서 일정하게 재현가능한 특성을 나타낼 것이다: 분자량, 크로마토그래피 이동, 아미노산 조성, 아미노산 서열, 차단되거나 차단되지 않은 N-말단, HPLC 용출 프로파일, 생물학적 활성 및 기타 다른 변수들. 그러나, 이 용어들은 다른 화합물과 상기 NTP의 인위적이거나 합성적인 혼합물을 배제시키는 것을 의미하지는 않는다. 또한, 이 용어는 재조합 숙주로부터 분리된 NTP 융합 단백질을 제외하는 것을 의미하지는 않는다.
재조합 숙주.본 발명에 따르면, 재조합 숙주는 형질발현 벡터 또는 클로닝 벡터상에 목적하는 클로닝된 유전자를 포함하는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 이 용어는 또한 유기체의 염색체 또는 게놈내에 목적하는 유전자 (들)를 함유하도록 유전자 조작된 원핵 또는 진핵세포 유기체를 포함하는 것을 의미한다.
제조합 벡터.목적하는 클로닝된 유전자(들)를 함유하는 임의의 클로닝 벡터 또는 형질발현 벡터.
숙주.복제가능한 형질발현 벡터 또는 클로닝 벡터의 수용체인 임의의 원핵 또는 진핵 세포. "숙주"는 본원에서 염색체 또는 게놈상에 목적하는 유전자(들)를 포함하도록 공지된 기법으로 유전자 조작될 수 있는 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 그 예는 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, 콜드 스프링 하버 레보러토리, 뉴욕 콜드 스프링 하버 소재(1989)]을 참조하라.
프로모터.개시 코돈에 인접하게 위치하고 있는 유전자의 5' 영역을 일반적으로 의미하는 DNA 서열. 이 프로모터 영역에서 인접한 유전자(들)의 전사가 개시된다. 프로모터가 유도형 프로모터인 경우, 전사 속도는 유도제에 따라 증가한다. 이와 반대로 프로모터가 구성형 프로모터인 경우에는 전사 속도는 유도제에 의해 조절되지 않는다.
유전자.폴리펩티드 또는 단백질을 형질발현하는데 필요한 정보를 포함하는 DNA 서열.
구조 유전자.전달 RNA(mRNA)로 전사된 후 특정 폴리펩티드 고유의 아미노산 서열로 해독되는 DNA 서열.
안티센스 RNA 유전자/안티센스 RNA.진핵세포에서 mRNA는 RNA 폴리머라제 II에 의해 전사된다. 그러나, 특정 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 지니나, 보통은 해독되지 않는 서열을 갖는 RNA 서열이 전사되는 RNA 폴리머라제 II 주형을 함유하는 유전자를 작제할 수 있다는 것은 공지의 사실이다. 이러한 유전자 작제물은 본원에서 "안티센스 RNA 유전자"라 명명되며, RNA 전사체는 "안티센스 RNA"라 명명한다. 안테센스 RNA는 이 서열내의 해독 중지 코돈의 존재로 인해 보통은 해독가능하지 않다.
안티센스 올리고뉴클레오티드.특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 또는 RNA 분자. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 해독을 저해한다.
안티센스 치료법.환자에게 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하여 상응하는 단백질의 형질발현을 저해하는 치료 방법.
상보적인 DNA(cDNA)."상보적인 DNA" 또는 "cDNA" 유전자는 mRNA의 역전사에 의해 합성되어 중재 서열(인트론)이 제거된 재조합 유전자를 함유한다.
형질발현.형질발현은 폴리펩티드가 구조 유전자로부터 제조되는 과정이다. 이 과정은 구조 유전자의 mRNA로의 전사 및 이 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 해독 과정을 포함한다.
상동성/비상동성.HASH-암호 알고리듬(월버, 더블유 제이., 및 립만, 디. 제이.,Proc. Natl. Acad. Sci. 80:726-730(1983))으로 측정했을때, 2개의 핵산 분자가 이들의 뉴클레오티드 서열에 있어서 50% 이상의 유사성을 갖고 있다면 "상동성"인 것으로 간주한다. 이들의 뉴클레오티드 서열이 50% 미만의 유사성을 갖고 있다면 2개의 핵산 분자는 "비상동성"인 것으로 간주한다.
리보자임.리보자임은 촉매 중심을 포함하는 RNA 분자이다. 이 용어는 RNA 효소, 자가-스플라이싱성 RNA, 및 자가-절단성 RNA를 포함한다.
리보자임 치료법.환자에게 리보자임을 투여하여 표적 mRNA의 해독을 저해하는 치료 방법.
단편.NTP와 같은 분자의 "단편"은 그 분자의 임의의 폴리펩티드 아군을 의미하는 것이다.
작용성 유도체."작용성 유도체"란 용어는 분자의 "변이체", "유사체", 또는 "화학적 유도체"를 포함하는 것을 의미한다. NTP와 같은 분자의 "변이체"는 분자 전체 또는 이의 단편과 거의 유사한 자연 발생적인 분자를 의미한다. NTP와 같은 분자의 "유사체"는 분자 전체 또는 이의 단편과 거의 유사한 비-자연적인 분자를의미한다.
두 분자내의 아미노산 서열이 거의 동일하고 두 분자가 유사한 생물학적 활성을 갖고 있다면 한 분자는 또 다른 분자와 "실질적으로 유사한"이라고 할 수 있다. 따라서, 두 분자가 유사한 활성을 갖고 있다면, 분자들중의 하나가 다른 분자중에서는 발견되지 않는 추가의 아미노산 잔기를 포함하거나, 아미노산 잔기의 서열이 동일하지 않더라도, 두 분자는 본원에 사용된 용어인 변이체로서 간주된다.
본원에 사용된 바에 따르면, 한 분자가 일반적으로는 다른 분자의 일부분이 아닌 부가적인 화학적 부분을 포함하는 경우 그 분자를 다른 분자의 "화학적 유도체" 라고 할 수 있다. 이러한 부분은 분자의 용해도, 흡수성, 생물학적 반감기 등을 증진시킬 수 있다. 이 부분은 또한 분자의 독성을 감소시키거나, 분자의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 약화시킬 수 있다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 부분의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)]에 개시되어 있고 당업자라면 명백히 알 수 있는 것이다.
NTP."NTP"란 용어는 신경사 단백질의 군을 의미한다. NTP군은 본원에 사용된 바와 같이, 분자량이 약 8 kDa, 14 kDa, 17 kDa, 21 kDa, 26 kDa, 및 42 kDa인 단백질을 포함한다.
면역-폴리머라제 연쇄 반응.특이 항체-DNA 접합체를 사용하여 항원을 검출하는 방법. 이 방법에 따르면, DNA 및 항체에 대해 이중특이 결합친화성을 갖는 링커 분자를 사용하여 DNA 분자를 특이적으로 항원-항체 복합체에 부착시킨다. 결과적으로, 특이적인 항원-항체-DNA 접합체가 형성된다. 부착된 DNA는 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭될 수 있다. 특이적인 PCR 생성물의 존재는 DNA 분자가 항원-항체 복합체에 특이적으로 부착되어 있음을 증명하며, 따라서 항원의 존재를 나타낸다(Sano 등,Science 258: 120-122(1992)).
예를 들면, 사노 등(상기 문헌 참조)은 비오틴과 면역글로불린 G에 대해 특이적인 결합 친화성을 갖고 있는 스트렙트아비딘-단백질 A 키메라를 작제했다. 이 키메라(즉, "링커 분자")는 미량역가 평판 웰상에 고정되어 있는 항원-단일클론 항체 복합체에 비오틴화된 DNA를 특이적으로 부착시키는데 사용되었다. 부착된 DNA의 분절은 이어서 PCR로 증폭시킬 수 있다.
본 발명은 신경사 단백질(NTP), NTP mRNA 또는 안티센스 mRNA를 암호화하는 유전자 서열, 이 유전자 서열을 포함하는 형질발현 벡터, 이 벡터로 형질전환된 재조합 숙주, 및 이러한 형질전환된 재조합 숙주 형질발현에 의해 생산된 NTP 및 안티센스 RNA에 관한 것이다. 본 발명은 또한 NTP 리보자임, 이 NTP 리보자임을 암호화하는 재조합 DNA 분자 및 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 NTP에 대하여 유발되는 항체, 뿐만아니라 생물학적 샘플내에 존재하는 NTP의 검출에 사용하는 NTP 항체 및 NTP 핵산 서열의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전자 치료법에 NTP 암호 서열을 사용하는 용도에 관한 것이다.
I. 신경사 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 분리
NTP를 암호화하는 DNA 서열은 다양한 공급원에서 유래하는 것을 사용할 수있다. 그 공급원으로는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA, 및 이의 복합체를 포함한다.
인간 NTP 게놈 DNA는 당업자에게 공지된 방법으로 임의의 인간 세포 또는 조직으로부터 추출 및 정제할 수 있다(예컨대, 문헌[Sambrook 등,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, 콜드 스프링 하버 레보러토리 프레스, 1989] 참조). 본 발명의 NTP 게놈 DNA는 자연 발생적인 인트론을 포함하거나 포함하지 않을 수도 있다. 더욱이, 이러한 게놈 DNA는 NTP 유전자 서열의 5' 프로모터 영역 및/또는 3' 해독 종결 영역과 결합된 상태로 얻을 수 있다. 또한 이러한 게놈 DNA는 NTP mRNA의 5' 비해독 영역을 암호화하는 DNA 서열 및 또는 3' 비해독 영역을 암호화하는 유전자 서열과 결합된 상태로 얻을 수 있다. 숙주 세포가 mRNA 및 단백질의 형질발현과 관련된 전사 및/또는 해독 조절 신호를 인식할 수 있을 정도로, 천연 유전자의 5' 및/또는 3' 비전사 영역, 및/또는 mRNA의 5' 및/또는 3' 비해독 영역을 보유하여 전사 및 해독 조절에 이용할 수 있다.
대안적으로, NTP mRNA는 NTP를 형질발현하는 임의의 세포로부터 분리하여 당업자에게 공지된 방법으로 cDNA를 생산하는데 사용할 수 있다(예컨대, 샘브룩 등, 상기 문헌 참조). 사용된 mRNA 제법은 천연적으로 다량의 NTP를 생산하는 세포로부터 분리하거나, 또는 시험관내에서 슈크로스 구배 원심분리와 같은 특정 서열의 mRNA 제조물을 집적시키는데 일반적으로 사용되는 기법에 의해, 또는 두 방법을 모두 사용하여 NTP를 암호화하는 mRNA를 집적시킬 수 있는 것이 바람직하다. NTP mRNA는 포유류 신경 조직이나 이로부터 유래된 세포주로부터 얻을 수 있다. 인간 cDNA 라이브러리는 17 내지 18 주령의 태아 뇌, 2 년령의 측두엽 신피질, 말기 AD대뇌 피질, 또는 인간 신경 조직 유래의 세포주를 사용하여 작제하는 것이 바람직하다. 이러한 세포주로는 중추신경계 원시 신경외배엽 종양 세포(본원에 기술된 바와 같은 PNET1 또는 PNET2), 신경아세포종 세포(본원에 기술된 바와 같은 SH-Sy5y), 또는 신경교종 세포(A172; ATCC CRL 1620)를 포함하며, 이것에 국한되지는 않는다. 대안적으로, 쥐의 cDNA 라이브러리는 쥐의 신경교종 세포, 예컨대, C6 쥐 신경교종 세포(ATCC CCL 107)로부터 분리된 mRNA로부터 제조할 수 있다.
벡터내로 클로닝하기 위해, 적합한 DNA 제조물(게놈 또는 cDNA)은 각각 무작위적으로 전단되거나, 또는 효소적으로 절단된 다음 적합한 벡터내에 연결시켜 제조합 유전자(게놈 또는 cDNA) 라이브러리를 형성한다. NTP를 암호화하는 DNA 서열은 통상적인 기법에 따라 벡터내로 삽입할 수 있으며, 이 기법은 연결용 평활 말단화 또는 점착 말단화, 적합한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 필요한 경우 점착 말단의 충전, 목적하지 않는 결합을 피하기 위한 알칼리 포스파타제 처리, 및 적절한 리가제에 의한 연결을 포함한다. 이러한 조작의 기법은 샘브룩 등의 문헌에 개시되어 있고 당업자에게 공지된 것이다.
NTP 클론을 함유하는 라이브러리는 선별하여 NTP DNA를 특이적으로 선택하는 임의의 방법에 의해 NTP 클론을 확인했다: 그러한 방법의 예로는 1) NTP의 DNA에 특이적인 서열을 포함하는 적절한 핵산 프로브(들)에 의한 하이브리드화 ; 또는 2) 천연 mRNA가 목적하는 클론에 하이브리드화하고, 시험관내에서 해독되며, 해독 생성물이 추가로 특성규명되는 하이브리드화에 의해 선택되는 해독 분석법; 또는 3) 클로닝된 DNA 서열이 스스로 mRNA를 형질발현할 수 있는 경우 클론을 함유하는 숙주에 의해 생성되는 해독된 NTP 생성물의 면역침전법을 포함한다.
NTP에 대한 클론을 동정하는데 사용할 수 있는 NTP에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브는 상응하는 NTP의 아미노산 서열 또는 PTP의 상동성 영역으로부터 고안될 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드 프로브는 PTP의 뉴클레오티드 서열로부터 고안될 수 있다(드 라 몬테 등,J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990)).
NTP 유전자의 단편을 암호화할 수 있는 적합한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 군(또는 이러한 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고뉴클레오티드군에 상보적인 적합한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 군)은 당업계에 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다(예를 들면, 샘브룩 등의 상기 문헌 참조). 핵산 하이브리드화 및 클론 동정의 기법은 샘브룩 등의 상기 문헌에 개시되어 있다. 그 다음 이와 같이 하이브리드화할 수 있는 것으로 밝혀진 전술한 유전자 라이브러리의 군들을 분석하여 이 군들이 함유하고 있는 NTP 암호 서열의 정도 및 본성을 측정한다.
목적하는 NTP 암호 서열의 검출을 용이하게 하기 위해, 전술한 DNA 프로브를 검출가능한 기로 표지할 수 있다. 이러한 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 성질을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 이러한 물질들은 핵산 하이브리드화 분야에 잘 개발되어 있고, 일반적으로 이러한 방법에 유용한 임의의 표지는 대부분 본 발명에 사용할 수 있다.32P,3H,14C,125I 등과 같은 방사능 활성 표지가 특히 유용하다. 적절한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 갖는 임의의 방사능 활성표지가 사용될 수 있다. DNA 프로브는 당업계에 공지된 많은 방법들중에서 예컨대, 틈-해독, T4 DNA 폴리머라제 치환 합성, 또는 무작위 프라이밍에 의해 표지될 수 있다(샘브룩등의 상기 문헌 참조).
대안적으로, DNA 프로브는 비오틴, 효소, 또는 형광기와 같은 비-방사능활성 표지인자들에 의해 표지될 수 있다.
NTP DNA 서열을 클로닝하는 대안적인 방법에 있어서, NTP cDNA는 본원에 사용된 바와 같은 3'- 및 5'-RACE 법을 사용하여 세포주 및 뇌 조직으로부터 직접적인 클로닝에 의해 수득할 수 있다. 인간 신경외배엽 종양 세포주 또는 AD 뇌조직을 mRNA의 공급원으로서 사용하는 것이 바람직하다.
II. NTP를 암호화하는 유전자의 형질발현
전술한 방법은 NTP 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA 서열을 동정할 수 있다. 이러한 DNA 서열을 추가로 특성규명하고 재조합 단백질을 생산하기 위해, DNA 서열이 암호화하는 단백질을 형질발현시키는 것이 바람직하다.
NTP를 형질발현시키는데 필요한 것은 적절한 숙주가 인식할 수 있는 전사 및 해독 신호이다. 전술한 방법을 통해 얻은, 바람직하게는 2본쇄 형태의 클로닝된 NTP DNA 서열은 형질발현 벡터내에 전사 발현을 제어하는 서열에 "작동가능하게 연결"되고 원핵이나 진핵의 숙주 세포내로 도입되어 재조합 NTP를 생산할 수 있다. NTP 암호 서열의 어떤 가닥이 전사 발현을 제어하는 서열에 작동가능하게 연결되는지에 따라, NTP 안티센스 RNA를 형질발현할 수도 있다.
여러 숙주내에서 NTP의 형질발현은 상이한 해독후 변형을 초래하여 NTP의 성질을 개질시킬 수 있다. 본 발명은 진핵 세포, 특히 포유류, 곤충 및 효모 세포내에서의 NTP의 형질발현을 포함하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 진핵 숙주는 포유류 세포이다. 포유류 세포는 폴딩 및/또는 인산화를 비롯한 재조합 NTP에 대한 해독후 변형을 제공한다. 포유류 숙주 세포로는 인간 CNS 원시 신경외배엽 종양 세포, 인간 신경아세포종 세포, 인간 신경교종 세포, 또는 쥐 신경교종 세포가 가장 바람직하다. 특히 바람직한 원시 신경외배엽 종양 세포로는 PNET1 및 PNET2가 있으며, 특히 바람직한 인간 신경교아세포종 세포로는 Hg16 및 Hg17이 있으며, 특히 바람직한 인간 신경교종 세포로는 A172가, 특히 바람직한 쥐 신경교종 세포로는 C6이 있다(실시예 1 참조).
대안적으로, NTP는 원핵 숙주 세포에 의해 형질발현될 수 있다. 이러한 세포에 의해 재조합 NTP가 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질로서 형질발현되는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 원핵 숙주는 이.콜리(E.coli)이다. 바람직한 이.콜리 균주로는 Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 및 ER1647을 들 수 있다(예컨대,Molecular Biology LabFax, Brown, T.A. 편집, 아카데믹 프레스, 뉴욕(1991) 참조), 대안적인 바람직한 숙주로는 BR151, YB1886, MI119, MI120, 및 B170과 같은 균주를 비롯한 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilus)이다(예컨대, Hardy의 문헌["Bacillus Cloning Methods," inDNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press, 워싱톤 디. 씨. 소재(1985)] 참조).
DNA와 같은 핵산 분자는 이것이 결국 전사 조절 정보를 포함하는 형질발현제어 서열을 갖고 있고 이 서열들이 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 "작동가능하게 연결"되어 있다면, 폴리펩티드를 "형질발현할 수 있는" 이라고 언급된다.
핵산 분자의 2개의 서열은 양 서열이 동일한 RNA 전사체로 전사되거나, 한 서열에서 개시된 RNA 전사체가 제2의 서열로 신장될 수 있도록 하는 방식으로 서로 연결되어 있을때 작동가능하게 연결되어 있다고 언급된다. 따라서, 프로모터 서열에서 개시하는 전사가 작동가능하게 연결된 제2 서열의 RNA 전사체를 생산한다면, 프로모터 서열 및 DNA 또는 RNA의 임의의 다른 "제2" 서열과 같은 2개의 서열은 작동가능하게 연결된 것이다. 작동가능하게 연결되도록 하기 위해 양 서열을 서로에 바로 인접하게 위치시키는 것이 필수적인 것은 아니다.
본 발명의 프로모터 서열은 원핵, 진핵 또는 바이러스성일 수 있다. 프로모터는 억제형(repressible), 구성형, 또는 유도형인 것이 적합하다. 적합한 원핵 프로모터의 예로는 T4 폴리머라제(말리크등,J. Biol. Chem. 263:1174-1181(1984); 로젠버그 등,Gene 59:191-200(1987); 샤인들링 등,J. Molec. Biol.195:471-480(1987); 후 등,Gene 42:21-30(1986)), T3, Sp6, 및 T7(챔버린 등, Gene 228:227-231(1970); 베일리 등,Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A) 80:2814-2818(1983); 다반루 등,Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)81:2035-2039(1984))을 인식할 수 있는 프로모터; 박테리오파지 람다의 PR및 PL프로모터(The Bacteriophage Lmbda, 허쉬.에이.디. 편집, 콜드 스프링 하버 프레스, 뉴욕 콜드 스프링 하버 소재(1980)); 이.콜리의 trp. recA, 열충격, 및 lacZ 프로모터; 비.서브틸러스의α-아밀라제(울마넨 등,J. Bacteriol. 162:176-182(1985)) 및 델타-28-특이적인 프로모터(길만 등,Gene 32:11-20 (1984)); 바실러스의 박테리오파지 프로모터(그릭잔, In:The Molecular Biology of the Bacilli,아카데믹 프레스, 인코오포레이티드, 뉴욕 소재(1982)); 스트렙토마이세스 프로모터(워드 등,Mol. Gen. Genet. 203:468-478(1986)); 박테리오파지 람다의int프로모터; pBR322의β-락탐아제 유전자의bla프로모터, 및 pBR325의 클로람페니콜 아세틸 트란스퍼라제 유전자의 CAT 프로모터 등을 포함한다. 원핵 프로모터는 문헌 [글릭,J.Ind.Microbiol.1:277-282(1987);세나티엠포,Biochimie 68:505-516(1986); 왓슨등, In:Molecular Biology of the Gene, 제4판, 벤자민 쿰민스, 캘리포니아 멘로 파크 소재(1987); 고테스만,Ann.Rev. Genet. 18:415-442(1984); 및 샘브룩 등(상기 문헌 참조)]에 검토되어 있다.
바람직한 진핵 프로모터로는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자(하머등,J. Mol. Appl. Gen.1:273-288(1982)); 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터(맥나이트,Cell 31:355-365(1982)); SV40 초기 프로모터(베노이스트 등,Nature(London)290:304-310 (1981)); 및 효모gal4유전자 프로모터(존스톤 등,Proc.Natl.Acad. Sci.(USA) 79:6971-6975(1982); 실버등,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 81:5951-5955 (1984))를 들 수 있다. 이 참고문헌들은 모두 본원에 참고로 인용된 것이다.
강력한 프로모터가 본 발명의 가장 바람직한 프로모터이다. 이러한 바람직한 프로모터의 예로는 T3, SP6 및 T7 폴리머라제 프로모터; 박테리오파지 람다의 PL프로모터;recA 프로모터 및 마우스 메탈로티오네인 I 유전자의 프로모터를 인식하는것들이다. 원핵세포내에서 형질발현하기에 가장 바람직한 프로모터는 T7 폴리머라제 프로모터를 인식할 수 있는 것이다. 이러한 폴리머라제 인식 서열의 배열은 왓슨 등(In:Molecular Biology of the Gene, 제4판, 벤자민 쿰민스, 캘리포니아 멘로 파크 소재 (1987))에 의해 개시되어 있다. 포유류 세포중에서 형질발현하기에 가장 바람직한 프로모터는 SV 40 이다 (고만, "High Efficiency Gene Transfer into Mammalian cells",DNA Cloning: A Practical Approach, 제2권, IRL Press, 워싱톤 디.씨. 소재, pp. 143-190(1985)).
III. NPT 검출 방법
본 발명은 NPT 유전자 또는 전사체, 또는 NPT에 특이적인 항체에 하이브리드될 수 있는 핵산 프로브를 이용하여 인간 시험 대상의 신경학적 질병을 검출하는 방법에 관한 것이다. "신경학적 질병"은 알쯔하이머병(AD), 또는 알쯔하이머 유형의 병원성 변화와 관련이 있는 기타 신경 퇴행성 질환(예를들면, AD형 신경 퇴행성을 가진 파킨슨병) 뿐만 아니라, 신경 외배엽성 종양, 악성 성상세포종, 및 신경교아종을 뜻한다. "인간 시험 대상"은 임의의 인간 또는 이의 임의의 발육형, 예컨대, 태어나기전 상태의 태아 또는 배를 의미한다. 본 발명의 진단학적 방법은 신경조직의 침해성 제거를 필요로 하지 않는다.
그외에도, 본 발명은 광 또는 전자현미경 조직학, 결상, 방사성 또는 효소계 분석법등을 사용하여 인간 시험 대상물의 생물학적 유체 또는 세포에서 NTP의 존재를 검출하기 위한 핵산 하이브리드화 분석법 및 면역분석법에 관한 것이다.
a. 핵산 하이브리드화 분석법
핵산 하이브리드화 분석법을 사용하여 NPT에 대한 조직 시료를 시험함에 있어서, RNA는 동결 절편기에서 분할하고 SDS같은 계면 활성제 및 EDTA 같은 킬레이트제로 절편을 용해시키고, 선택적으로 프로티나제 K(50 ㎍/ml)에 밤새 침지시킴으로써 조직으로부터 분리할 수 있다. 상기 조직은 부검 또는 생검으로 얻을 수 있다. 조직의 바람직한 양의 범위는 1 내지 10 mg이다. 단백질은 페놀 및 클로로포름 추출에 의해 제거하고, 핵산은 에탄올로 침전시킨다. RNA는 올리고 dT 컬럼상에서 크로마토그래피로 분리한 다음, 그들로부터 용출시킨다. 당 분야에서 통상의 기술로 공지된 방법에 따라 추가의 분별을 수행할 수도 있다.
분자 하이브리드화에 관한 많은 기법을 사용하여 조직에서 DNA 또는 RNA 서열을 검출하였다; 이들은 특정 장점 및 단점을 가진다. 많은 양의 조직이 입수 가능한 경우에, 하이브리드화 역학의 분석법은 존재하는 DNA 또는 RNA의 양을 정확하게 정량할 수 있는 기회를 제공할 뿐아니라, 밀접하게 관련은 있으나 프로브와는 동일하지 않은 서열을 구별하여 상동성 비율을 측정하는 기회를 제공한다.
프로브의 재회합율이 최적인 하이브리드화 조건(Tm-25℃)하에서 반응을 수행하였다 (워트머외 다수,J. Mol. Biol.31:349-370(1968)). 반응 역학은 조직내의 서열이 프로브의 것과 동일한 경우에 2차 이지만; 상기 반응은 프로브 서열이 조직내의 것과 부분적으로 상동성이 있는 경우에 복잡한 역학을 나타낸다 (샤프 외 다수,J. Mol. Biol. 86:709-726 (1974)).
프로브:세포 RNA의 비율은 바람직한 감도로써 측정된다. 세포당 1개의 전사체를 검출하기 위해서는 총세포 DNA 또는 RNA 1 ㎍ 당 프로브 약 100 pg이 필요하다. 핵산을 혼합하고, 변성시키고, 적당한 염농도 및 온도가 되게 하고, 다양한 시간 간격동안 하이브리드화한다. 재회합율은 히드록시 인회석 크로마토그래피(브리튼외 다수,Science 161:529-540(1968)) 또는 S1 뉴클레아제 처리(수튼,Biochim. Biophys, Acta 240:522-531(1971))에 의해 하이브리드된 프로브의 양을 정량분석함으로써 측정할 수 있다.
융통성이 큰 하이브리드화 방법은 노던 블롯 기법이다. 상기 기법은 하이브리드화 반응의 엄격성에 다양성을 제공하고, 분석중의 시료에서 레트로바이러스 서열의 상태를 측정할 수 있다. 노던 분석법은 본원에서 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.
DNA 또는 RNA 서열의 하이브리드화 분석과 관련하여 고려해야 할 중요한 사항은 연구하는 시료에 존재하는 서열과 프로브간의 연관도이다. 이것은 시료내의 프로브와 서열이 비상동성 유전자를 나타내더라도 하이브리드화의 비엄격성 조건하에서 서열 상동성의 적정도가 강한 신호를 산출할 수 있기 때문에 블로팅 기법에 중요하다. 본 발명에 있어서 특정 하이브리드화 기법이 필수적 사항은 아니며, 당 분야에서 널리 사용되는 어떠한 기법도 본 발명의 범위내에 있다. 통상의 프로브 기법이 본원에서 참고로 인용한 미국 특허 제4,358,535호(폴코우외 다수)에 기술되어 있다. 예를들면, 하이브리드화는 6xSSC(10xSSC:1.5M 염화나트륨, 0.15M 시트르산나트륨, pH 7.0), 5x덴하르트(1x 덴하르트:0.2% 소의 혈청 알부민, 0.2% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 피클 400), 10mM EDTA, 0.5% SDS 및 약 107cpm의 틈 해독 DNA를함유한 용액에서 65℃에서 16 시간 동안 수행할 수 있다.
상술한 바와 같은 표지된 프로브는 조직내의 NTP 검출용의 일반 진단 방법을 제공한다. 상기 방법은 상당히 빠르고, 단순한 프로토콜을 가지며, 시판용 키트같이 제공되고 표준화될 수 있는 시약을 가지며, 많은 양의 시료를 빠르게 검색할 수 있다.
상기 방법을 수행하기 위한 한 방법으로서, RNA 전사체를 함유한 임상 분리물은 지지체에 고정시킨다. 고정된 핵산을 NTP 유전자의 암호 가닥에 대한 염기 서열 상보성 또는 상동성을 갖는 표지된 폴리누클레오티드와 접촉시킨다.
본 발명의 하이브리드화 분석법은 키트의 제조 및 상품화에 특히 적합한 데, 상기 키트는 하나 이상의 용기 수단(바이알, 테스트 튜브등)을 완전 밀폐 상태로 수용하기 위한 구획된 캐리어 수단을 포함한다. 상기 용기 수단 각각은 하이브리드화 분석법에 사용하고자 하는 분리된 부재중 하나를 포함한다.
예를 들면, 용기 수단은 "틈 해독"(표준 방법론에 대해서는 샘브룩외 다수의 상기 문헌 참조)에 의해 표지화하기에 적합한 NTP cDNA 분자, 또는 표지된 NTP cDNA 또는 RNA 분자들을 포함할 수 있다. 추가의 용기 수단은 DNA 폴리머라제 I/ DNase I 및 비표지된 데옥시리보뉴클레오티드(즉, dCTP, dTTP, dGTP, 및 dATP)를 함유한 NTP cDNA의 틈 해독용 표준 용액을 함유할 수 있다.
NTP RNA의 존재는 테스트 조직내에서 프로브-연관 RNA의 외관 및 또는 양을 변화시킴으로써 측정된다.
본 발명의 DNA 프로브는 또한 유전성 또는 가족 특이성의 AD, 및 비-유전성또는 산발성 AD의 차별 진단용으로 사용될 수 있다. AD의 가족특이 형은 어린 나이에 종종 발견되고, 가계의 다운 증후군과 관련이 있다. 따라서, 가족특이성 AD 용 유전자 테스트는 가족들의 유전자 카운셀링을 가능케 한다. 가족특이성 AD용 유전자 마커를 특징화하는 많은 노력이 있어 왔으나(구셀라,FASEB J3: 2036-2041 (1989); 후퍼,J NIH Res.4:48-54(1992)), 유전적 연관 분석은 게놈 서열의 작용을 알지 못하면 단지 유전자 마커 서열만을 식별한다. 이와는 달리, 본원에서 기술하고 산발성 AD를 지닌 개체에서 얻은 cDNA 프로브는 AD에 걸린 환자의 뇌조직에서 과도하게 발현된 공지 기능의 공지 단백질을 암호화한다.
대부분의 AD 환자는 이들이 증명된 가족성 환자이더라도 산발적 형태로 나타난다(구셀라, 상기 문헌; 해리슨의Principle of internal Medicine, 브라운왈드외 다수., Eds. 11판, McGraw-Hill Book Company, 뉴욕, pp. 2012-2013(1987)). 산발성 AD에 걸린 환자와는 달리, 가족성 AD에 걸린 환자는 배세포를 통해 소인이 있는 돌연변이를 유전시킨다. 가족성 환자 중 일부는 상염색체 우성 패턴의 유전에 따르는 것을 볼 수 있었다(상기 문헌 참조). 따라서, 가족성 AD에 걸린 환자의 DNA는 산발성 AD에 걸린 환자의 DNA가 없는 유전된 유전자 변형을 포함할 것이다.
인간 시험 대상에서 산발성 AD와 및 가족성 AD를 분별하는 방법은 알쯔하이머병을 가진 것으로 의심되는 인간 시험 대상에서 생리학적 샘플을 얻은 것을 포함한다. 이어서, DNA를 생리학적 샘플로부터 정제한다. 끝으로, DNA는 하이브리드화 조건하에서 NTP DNA 프로브와 접촉시킨다. 가족성 AD는 프로브와 DNA의 하이브리드를 검출함으로써 알 수 있는 반면, 산발성 AD는 하이브리드 검출의 부재에 의해 식별된다.
예를 들면, 생물학적 샘플은 채혈한지 3일내에 백혈구 농도를 증가시키기 위하여 차별 원심 분리한 혈액 샘플일 수 있다(파크, "PCR in the Diagnosis of Retinoblastoma,"PCR Protocols, 이니스외 다수 편집, 아카데믹 프레스, 인코오포레이티드, 뉴욕, pp. 407-415(1990)). DNA 샘플은 나트륨 N-라우로일사코신- 프로티나제 K, 페놀, 및 RNase 방법을 사용하여 제조할 수 있다(샘브룩외 다수의 상기 문헌). DNA 분석법은 DNA 샘플, 바람직하게는 5 ㎍을 제한 엔도누클레아제(예:HindIII)로 처리함으로써 수행될 수 있다. 처리된 DNA는 아가로스 겔 전기 영동법, 바람직하게는 1% 수평 아가로스 겔을 사용하여 완충액, 바람직하게는 89mM 트리스-HCl(pH 8), 89mM 나트륨 보레이트 및 2mM EDTA를 함유한 완충액에서 18시간 동안 분별 처리하였다(구셀라외 다수,Nature 306:234-238(1983)). 서던 분석법은 통용되는 기법들(샘브룩외 다수, 상기 문헌)을 사용하여 수행할 수 있고, 표지된 AD cDNA 프로브는 상술한 조건하에서 하이브리드화될 수 있다. 상기 차별 진단 방법용으로 바람직한 DNA 프로브로는 1-9a, AD3-4, AD4-4 및 G2-2 PstI을 들 수 있다.
b. 면역 분석법
NTP에 대한 항체를 본 발명의 교시에 따라 AD 검출 및 진단법에 사용할 수 있다. 면역 조직 화학적 염색 방법을 비롯한 각종 조직학적 염색 방법들 또한 본 발명의 교시에 따라 효과적으로 사용될 수 있다. 은 염색이 NTP를 가시화하는 유일한 방법은 아니다. 과도한 실험을 수행할 필요 없는 본 발명에 유용한 다른 염색방법은 당업자에게는 자명할 것이다(예컨대 문헌[A Testbook of Histology, 블룸 및 파우셋 편집, W.B. 손더스 컴패니, 필라델피아(1964)] 참고).
주어진 화합물이 NTP 작용성 유도체인지 여부를 결정하기 위한 한 검색 방법은 NTP에 대한 특이항체(단일클론 또는 다클론)의 생성을 기준으로 한 예컨대, 방사선 면역 분석법(RIA) 또는 효소-결합된 면역 흡착 분석법(ELISA)을 사용하는 면역 분석법을 포함한다. 이들 분석법에 있어서, 생물학적 샘플은 정맥 천자(혈액), 척추 탭(대뇌 척수액(CSF)), 뇨, 및 기타 체액(예: 땀 및 눈물)으로부터 수득하였다. 예를 들면, RIA의 한 유형에서는, 시험중의 물질을 방사성 표지된 항원의 존재하에서 희석된 항혈청과 혼합시켰다. 이 방법에서, 테스트 물질의 농도는 특이항체에 결합된 표지된 항원의 양에 반비례하고, 표지된 유리 항원의 양과 직접 관련이 있다. 기타 적절한 검색 방법은 당 분야의 숙련자가 쉽게 발견할 것이다.
본 발명은 샘플 또는 시험 대상에서 작용성 유도체 또는 NTP를 검출하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, NTP에 대한 특이 항체, 또는 작용성 유도체는 임의의 적절한 마커, 예컨대, 방사성 동위 원소, 효소, 형광 표지, 상자성 표지, 또는 유리 라디칼로 검출 가능하게 표지할 수 있다.
대안으로, NTP에 대한 특이 항체, 또는 작용성 유도체는 면역-폴리머라제 연쇄 반응 기법(사노외 다수,Science 258:120-122(1992))에 의해 DNA를 검출가능하게 표지화할 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 절차는 변성, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 어닐링, 및 DNA 폴리머라제를 사용한 프라이머의 연장을 비롯한 일련의 조작법을 통해 특이성 핵산 서열을 증폭시킨다(뮬리즈외 다수, 미국특허제4,683,202 ; 뮬리즈외 다수, 미국 특허 제4,683,195호 : 로외 등 다수,Science 243:217 (1988)). 상기 단계들은 수회 반복하여, 최초 특이 서열의 사본수를 크게 증폭시킬 수 있다. DNA 서열의 단일 사본은 증폭되어 수백 나노그램의 생성물을 만들 수 있다(라이외 다수,Nature 335:414(1988)). 기타 공지된 핵산 증폭 방법으로는 전사에 기초한 증폭 시스템(노어외 다수,Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:1173(1989) ; 전저라스외 다수, WO88/10315), 및 "리가아제 연쇄 반응"이 있는데, 이 반응에서 두 개(또는 2 이상)의 올리고뉴클레오티드는 "디-올리고뉴클레오티드" 서열을 갖는 핵산 표적물의 존재하에서 연결됨으로써 디-올리고누클레오티드를 증폭시킨다(우외 다수,Genomics 4:560(1989) ; 배크맨외 다수, EP 320,308 ; 월러스, EP 336,731 ; 오르겔, WO89/09835). 예를 들면, 면역-PCR 분석법은 미량역가 웰의 표면에 각종 양의 테스트 물질을 고정함으로써 수행할 수 있다(산조외 다수, 상기 문헌, 페이지 122, 각주 7). 상기 웰은 NTP 단일클론 항체와 함께 항온 처리하고, 수세한 다음, 비오티닐화 NTP DNA 분자와 항온 처리하였고, 상기 분자는 스트렙트아비딘-단백질 키메라에 접합되었다(상기 문헌 참조). 상기 키메라는 비오틴과(스트렙트아비딘 부분을 통해) 면역 글로블린 G분자의 Fc 부(단백질 A 부분을 통해)에 결합된다(상기 문헌 참조 120 ; 산조외 다수,Bio/Technology 9:1378(1991)). 이어서, 상기 웰을 수세하여 비결합된 접합체를 제거하였다. 테스트 물질내에 존재하는 임의의 NTP는 NTP 단일 클론 항체에 의해 결합될 것이고, 비오티닐화된 NTP DNA-스트렙트아비딘- 단백질 A 접합체의 단백질 A 부분에 의해 결합된다. 이어서, NTP DNA 서열은 PCR을 사용하여 증폭시킨다. 간단히 언급하면, 상기 미량역가 웰은 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트, NTP 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 Taq DNA 폴리머라제와 항온처리하였다(산조외 다수, 상기 문헌 페이지 122, 각주 11 참조). 자동 열 순환기(예; PTC-100-96 Thermal Cycler, MJ 리서치, 인코오포레이티드)를 사용하여 표준 조건하에서 PCR을 수행할 수 있다(상기 문헌 참조). 이어서, PCR 생성물을 에티듐 브롬화물로 염색한 후 아가로스 겔 전기영동법에 의해 분석하였다.
상기 검출 가능하게 표지된 항체 또는 이들의 작용성 유도체를 제조 및 검출하는 방법은 당 분야의 통상의 자에게는 공지된 사항이며, 이들은 하기에서 보다 상세히 기술하였다. 면역학의 일반 원리를 제시한 표준 참조 문헌으로는 다음과 같은 것이 있다 : 클레인(Immunology :The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, 뉴욕 (1982)) ; 케네트외 다수(Monoclonal Antibodies and Hybridomas : A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, 뉴욕 (1980)) ; 캠프벨("Monoclonal Antibody Technology," In :Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, 제13권(버든, R. 외 다수 편집), 엘시비어, 암스테르담(1984)) ; 및 아이젠(In :Microbiology, 3 판(대비스외 다수, Harper & Row, 필라델피아(1980)).
"항체"는 거의 균질성 군집인 단일 클론 항체 및 이질성 군집인 다클론 항체 둘다를 지칭한다. 다클론 항체는 항원으로 면역된 동물의 혈청에서 유도된다. 특이 항원에 대한 단일클론 항체(mAbs)는 당 분야의 숙련자에게 공지인 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 콜러 및 밀스테인의 문헌[Nature 256: 495-497(1975)] 및미국 특허 제4,376,110호를 참조할 수 있다. 이들 항체들은 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함하는 임의의 면역 글로불린 부류 및 이들의 아부류일 수 있다.
본 발명에 사용된 단일클론 항체, 특히 mAb Th7, Th9 및 Th10은 전술한 대로 제조할 수 있다(Gross 등,J. Clin. Invest.76 2115-2126 (1985); Ozturk 등,Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 86:419-423(1989); de la Monte 등,J. Clin. Invest. 86: 1004-1013(1990); de la Monte 등,J. Neurol Sci. 113: 152-164(1992); de la Monte 등,Ann. Neurol 32:733-742(1992)). Th 단일클론 항체는 사단백질의 정제된 췌장형에 대해 생성되었다(상기 문헌 참조). NTP-특이 다클론 및 단일클론 항체들은 재조합 숙주에서 분리된 거의 순수한 NTP에서 생성될 수 있다(예를 들면, 캐롤외 다수의 문헌[DNA Cloning : A Practical Approach,"Production and Purification of Polyclonal Antibodies to the Foreign Segment of β-Galactosidase Fusion Proteins," 제III권, IRL Press, 워싱턴 D.C., pp.89-111(1987)] ; 몰외 다수의 문헌[DNA Cloning : A Practical Approach, "Production of Monoclonal Antibodies Against Fusion Proteins Produced inEscherichia coli, 제3권, IRL Press, 워싱턴 D.C., pp.133-133P(1987)]. 대안으로, NTP-특이 다클론 및 단일클론 항체는 뇌조직 및 세포주 같은 생물학적 물질로부터 공지 기술을 사용하여 분리된 거의 순수한 NTP에 대하여 생성될 수 있다.
예를 들면, 약 8, 14, 17, 21, 26 kDa 및 42 KDa 분자량의 각종 NTP 분자에 대하여 특이적인 단일클론 항체는 재조합-유도 단백질로부터 제조될 수 있고, 형질 발현되고, 분리된 후, cDNA(즉, 1-9a), 게놈성 클론(G2-2Pstl) 및 AD-NTP 3-4cDNA 클론으로 정제될 수 있다. 이들 NTP 분자는 상기 cDNA들 및 게놈 클론들로부터 유도되고, 삽입된 후 적당한 형질 발현 벡터에서 생산된다(제2A도 및 제2B도 참조). 이들은 1-9a NTP cDNA와 PTP의 5' 말단에서 60-70% 상동성 영역이 있기 때문에, 통상의 차별 검색을 수행함으로써 NTP 재조합 단백질에 특이적으로 결합되고 췌장형에는 결합되지 않은 단일클론 항체를 얻을 수 있다(예를 들면, de la Monte 등,J. Clin, Invest. 86: 1004-1013(1990) 참조). NTP 및 PTP 둘다에 결합되는 단일클론 항체가 있을 지라도, 각종 유형의 NTP 분자들(예; 8,14,17,21,26 및 42 KDa)간의 실질적인 서열 이탈이 있고 에피토프가 6-8 처럼 적은 아미노산으로 한정될 수 있기 때문에 NTP-특이 단일클론항체를 발생시킬 것이다.
"항체"는 천연 분자 뿐만 아니라 이들의 단편들(예; Fab 및 F(ab')2)도 포함하는 용어이다. 상기 단편들은 항원과 결합할 수 있다. Fab 및 F(ab')2단편들은 천연 항체의 Fc 단편이 부재하고, 순환계로부터 보다 급속히 제거되고, 천연항체보다 더 적은 비-특이 조직 결합을 가질 수 있다(Wahl 등,J. Nucl. Med. 24: 316-325(1983)).
본 발명에 유용한 항체의 Fab 및 F(ab')2및 다른 단편들은 AD를 검출 및 진단하기 위하여 본원에 기술된 방법에 따라 천연 항체와 같은 방식으로 NTP의 정량 분석 및 검출에 사용될 수 있다. 이러한 단편들은 통상, 파파인(Fab 단편을 생성함) 또는 펩신(F(ab')2단편을 생성) 같은 효소를 사용하는 단백질 분해에 의해 제조된다.
항체는 이들이 분자와 특이적으로 반응하여 항체에 분자를 결합시킬 수 있는 경우에 분자에 "결합 가능한"이라고 한다. "에피토프"는 인식될 수 있는 항체가 결합될 수 있는 분자의 임의의 부분을 뜻한다. 에피토프 결정인자는 통상 아미노산, 당 측쇄 같은 분자의 화학적 활성 표면 군으로 구성되고, 특이적 3 차원 구조와 특이 하전 특성을 찾는다.
"항원"은 동물이 항원의 에피토프에 결합될 수 있는 항체를 생성하도록 유도할 수 있는 물질로서 항체에 결합될 수 있는 분자이다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 상술한 특이 반응은 항원이 선택성이 높은 방법으로 그들의 상응하는 항체와 반응하고, 다른 항원에 의해 야기될 수 있는 다수의 다른 항체와는 반응하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에 유용한 항체, 또는 항체들의 단편은 NTP 항원을 포함한 세포의 존재를 정량 또는 정성 분석에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 유용한 항체(또는 이들의 단편들)는 NTP의 존재를 조직학적으로 검출 또는 가시화 하는데 사용할 수 있다.
NTP의 상기 분석법은 NTP를 식별할 수 있는 검출 가능하게 표지된 결합분자(예, 항체)의 존재하에서 그러한 상태를 갖는지 의심스러운 상기 시험 대상의 생물학적 샘플을 항온처리하고, 샘플내에 결합된 상기 결합 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명의 상기 관점에서 생물학적 샘플은 니트로셀룰로스로 처리할 수 있거나, 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정화할 수 있는 기타 고형물지지체로 처리할 수 있다. 이어서, 상기 지지체는 적당한 완충액으로 세척한 다음 검출 가능하게 표지된 NTP-특이 항체로 처리할 수 있다. 고형상 지지체를 완충액으로 2회 세척하여 비결합된 항체를 제거할 수 있다. 다음, 상기 고형 지지체상의 결합 표지의 함량은 통용되는 수단에 의해 검출할 수 있다.
"고형상 지지체"는 항원 또는 항체가 결합될 수 있는 임의의 지지체이다. 공지의 지지체 또는 담체로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 개질 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로스, 및 마그네타이트를 들 수 있다. 담체의 성질은 본 발명의 목적에 따라 어느 정도 가용성이거나 불용성일 수 있다. 지지체 재료는 커플링된 분자가 항원 또는 항체에 결합될 수 있는한 임의의 가능한 구조 형태를 가질 수 있다. 따라서, 지지체 형태는 구형(예, 비드), 또는 원통형(예; 테스트 튜브의 내면 또는 막대의 외면)일 수 있다. 대안으로, 상기 표면은 시트, 테스트 스트립 등과 같은 편평한 형태일 수 있다. 바람직한 지지체는 폴리스티렌 비드이다. 당분야의 숙련자는 단일클론 항체 또는 항원을 결합하기 위한 많은 다른 적당한 담체를 알고 있으며, 통상의 실험법을 사용하여 동일하게 확인할 수 있을 것이다.
NTP를 함유한 생물학적 샘플에 대하여 본 발명의 진단 분석법을 수행하기 위한 한 구체예는 하기 a) 내지 e) 단계를 포함한다 :
(a) 검출 가능하게 표지된 NTP-특이 항체와 고형 지지체를 접촉시켜 상기 NTP-특이 항체 또는 이들의 단편을 고정화시키는 단계 ;
(b) NTP 함유 여부가 의심스러운 샘플을 상기 고형 지지체에 접촉시키는 단계 ;
(c) 상기 지지체와 함께 상기 검출 가능하게 표지된 NTP-특이 항체를 고정화된 NTP-특이 항체가 NTP에 결합되기에 충분한 시간 동안 항온 처리하는 단계 ;
(d) 상기 단계 (c)에서 얻은 항온 처리 혼합물로부터 고형상 지지체를 분리시키는 단계 ; 및
(e) 결합된 표지를 검출하여 NTP를 검출 및 정량하는 단계.
대안으로, 샘플내의 표지된 NTP-특이 항체/NTP 복합체는 상기 복합체를 고정화 항체 또는 단백질과 접촉시킴으로써 반응 혼합물로부터 분리할 수 있다. 상기 항체 또는 단백질은 면역 글로불린에 대하여 특이성이 있다. 그 예로는 스타필로코커스(Staphylococcus) 단백질 A. 스타필로코커스 단백질 G, 항-IgM 또는 항-IgG 항체 등이 있다. 이러한 항-면역 글로불린 항체는 다클론이지만, 바람직한 것은 단일클론이다. 이어서, 고형 지지체를 적당한 완충액으로 수세하여 고정화된 NTP 표지 NTP-특이 항체 복합체를 얻을 수 있다. 이어서 표지를 검출하여 NTP를 측정할 수 있다.
본 발명의 상기 관점은 하기 a) 및 b) 단계를 포함하여 샘플내의 NTP 또는 이들의 단편을 검출하는 방법에 관한 것이다.
a) NTP 함유 여부가 의심스런 샘플을 NTP에 결합되는 NTP-특이 항체 또는 이들의 단편과 접촉시키는 단계 ; 및
b) 복합체 형성 여부를 검출하는 단계.
또한, 샘플내의 NTP를 검출하기 위한 본 발명의 방법은 하기 단계 (c) 내지(e) 단계를 추가로 포함한다 :
(c) 단계 (a)에서 얻은 혼합물을 Fc 결합 분자(예컨대 항체, 스타필로코커스 단백질 A, 또는 스타필로코커스 단백질 G)와 접촉시키는 단계(이 때, 상기 Fc 결합 분자는 고체상 지지체에 고정되고, NTP-특이항체에 대하여 특이성이 있어서 NTP/NTP-특이 항체 고정화 항체 복합체를 생성한다) ;
(d) 단계 (c)에서 얻은 고형상 지지체를 수세하여 비결합된 NTP/NTP-특이 항체 복합체를 제거하는 단계 ; 및
(e) 상기 고형 지지체에 결합된 표지를 검출하는 단계.
물론, 검출 가능한 표지된 항체 및 NTP의 특정 농도, 항온 처리 온도 및 시간, 기타 분석 조건은 샘플내의 NTP의 농도, 샘플의 성질 등을 비롯한 각종 요인에 따라 달라질 수 있다. 주어진 많은 항-NTP 항체의 결합 활성은 공지 방법에 따라 측정할 수 있다. 당 분야의 숙련자는 통상의 실험을 통해 작업 및 최적 분석 조건을 결정할 수 있다.
수세, 교반, 진탕, 여과 등과 같은 기타 단계들은 특정 상황에 필요한 대로 또는 관례대로 첨가될 수 있다.
NTP-특이 항체를 검출 가능하게 표지화하는 한 방법은 효소에 동일물을 결합시키는 것이다. 상기 효소는 그들의 기질에 노출될 때 검출될 수 있는 화학부를 생성하는 방식, 예컨대 분광 광도법, 형광 분석법 또는 가시 방법으로 기질과 반응시킨다. NTP-특이 항체를 검출 가능하게 표지하는 데 사용할 수 있는 효소로는 말레이트 탈수소 효소, 스타필로코커스 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이소머라제, 효모 알콜-탈수소 효소,α-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 캐탈라제, 글루코스- VI-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스테라제를 들 수 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다.
검출은 임의의 각종 면역 분석법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, NTP-특이 항체 또는 항체 단편을 방사성에 의해 표지함으로써, 방사성 면역 분석법을 이용하여 NTP를 검출할 수 있다. 방사성 면역 분석법의 좋은 예가 본원에서 참고로 인용한 하기 문헌에 개시되어 있다 : 워크외 다수의 문헌 [Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, 노쓰 홀랜드 퍼블리싱 컴패니, 뉴욕(1978), 특히 "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques"이라는 제목의 장(Chard)].
방사성 동위 원소는 감마 계수기 또는 섬광 계수기 또는 자동 방사선 사진술을 이용하여 검출할 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소는3H,125I,131I,35S,14C이고, 이중 가장 바람직한 것은125I 이다.
NTP-특이 항체를 형광 화합물로 표지할 수도 있다. 형광 표지된 항체는 적당한 파장의 광에 노출될 때 발광되기 때문에 항체의 존재가 검출될 수 있다. 가장 널리 사용된 형광 표지화 화합물로 플루오레스세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프트알데히드 및 플루오레스카민 이있다.
NTP-특이 항체는152Eu, 또는 다른 란타니드계 물질 같은 형광을 발하는 금속을 사용하여 검출 가능하게 표지될 수 있다. 이들 금속들은 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 같은 금속 킬레이트 기를 사용하여 NTP-특이 항체에 부착시킬 수 있다.
NTP-특이 항체 또한 화학 발광 화합물에 커플링 됨으로써 검출 가능하게 표지화될 수 있다. 화학 발광체가 붙은 NTP-특이 항체의 존재는 화학 반응 과정중에 발생하는 발광의 존재를 검출하여 측정된다. 특히 유용한 화학 발광 표지 화합물의 예로는 루민올, 이소루민올, 열적 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르가 있다.
또한, NTP-특이 항체를 비오틴으로 표지화한 후에 아비딘과 반응시킬 수 있다. 비오틴-표지화된 DNA 단편은 아비딘 브리지에 의해서 NTP-비오티닐화된 단일클론 항체에 연결될 것이다. 이어서 NTP 분자는 특이적인 프라이머를 가진 DNA 단편의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 검출된다(사노 등,Science 258: 120-122(1992)).
마찬가지로, 생발광성 화합물을 사용하여 본 발명의 NTP-특이 항체를 표지화할 수 있다. 생발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 일종의 화학발광이다. 생발광성 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출하므로써 측정된다. 표지화의 목적으로 중요한 생발광성 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 에쿠오린이다.
NTP-특이 항체의 검출은, 예를 들어 검출가능한 표지가 방사능 감마 방사체인 경우 섬광 계수기에 의해서, 또는 표지가 형광물질인 경우 형광측정기에 의해서 수행할 수도 있다. 효소 표지의 경우에 검출은 효소에 대한 기질을 사용하는 비색 방법에 의해서 수행할 수 있다. 또한 유사하게 제조된 표준물질과 비교해서 기질의 효소 반응의 정도를 육안으로 대조하므로써 검출을 수행할 수도 있다.
그와 같은 검출가능하게 표지된 항체의 촛점의 검출은 전술한 바와 같은 질병 또는 장애 상태를 시사한다. 본 발명에 있어서, 상기 분석법을 통해 검출되는 NTP는 생물학적 샘플에 존재할 수 있다. NTP를 함유하는 임의의 샘플을 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 진단 방법의 한가지 장점은 침해성 조직의 제거를 방지할 수 있다는 것이다. 그러므로, 샘플은 생물학적 용액, 예를 들면 뇌척수액, 양수, 혈액, 혈청, 뇨 등인 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 전술한 샘플만을 이용하는 분석법에 제한되는 것이 아니며, 당분야의 업자들은 다른 샘플들을 사용할 수 있는 적당한 조건을 결정할 수 있을 것이다.
예를 들면, 3-부위 단일 클론 항체에 근거한 면역방사계측법(M-IRMA)을 사용하여 CSF와 같은 생물학적 유체내의 NTP 농도를 측정할 수 있다. 통상적인 방식으로, AD에 걸린 것으로 생각되는 시험 대상으로부터 척수 탭 방식에 의해 CSF를 얻을 수 있다. 따라서, AD의 진단은 정상 농도에 비하여 NTP 농도가 크게 증가되었음을 밝히는 간단하고 비침해적인 면역분석법에 의해서 확정될 수 있다.
전술한 바와 같은 한가지 실시예에서, AD에 대한 조사는 생물학적 유체의 샘플을 제거하고 그 샘플을 검출가능하게 표지된 항체(또는 항체 단편)의 존재하에 항온처리하므로써 달성된다. 바람직한 실시예에서, 이 기법은 자기 결상법, 형광사진법 등의 방법을 통해서 비침해적인 방식으로 수행된다.
바람직하게는, NTP를 형질발현하는 세포의 검출은 생체내 결상 기법에 의해서 수행되며, 이 경우에 표지화된 항체(또는 그 단편)가 시험 대상에게 제공되고, NTP의 존재는 임의의 조직 샘플을 사전 제거하는 일 없이 검출된다. 그와 같은 생체내 검출 절차는 다른 검출 방법에 비해서 침해도가 적다는 장접을 가지며, 더욱이 환자로부터 용이하게 제거될 수 없는 뇌 조직과 같은 조직내의 NTP의 존재도 검출할 수가 있다.
생체내 결상 기법을 사용하여, AD와 뇌 종양을 구분할 수가 있는데, NTP는 AD 환자의 뇌 전역에 걸쳐 검출되지만 뇌 종양의 경우에는 NTP가 불연속적인 침착물의 형태로 편재화될 것이기 때문이다. 예를 들면, AD 환자의 뇌에서는 NTP가 측두골, 정수리 및 전면 피질 뿐만 아니라 편도선과 해마에서도 발견될 것이다. 성상세포종이 선호하는 부위로는 대뇌, 소뇌, 간뇌의 시신경상, 시신경 교차 및 접합부를 들 수 있으며(Harrison's Principles of Internal Medicine, 피터스도프 등 편집, 제10판, 맥그로힐 북 컴패니, 뉴욕, p2076 (1983)), 신경교아종 다형체는 주로 대뇌에 소재한다(상기 문헌 p2075).
당업자에게 여러가지 다양한 생체내 표지 및 표지화 방법이 공지되어 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 표지의 종류의 예로서는 방사성 동위원소 및 상자성 동위원소를 들 수 있다. 당업자라면 본 발명에 사용된 항체에 결합시키기 위한 다른적당한 표지들을 알 수 있을 것이며, 또한 통상의 실험을 통해서 그들을 확인할 수 있을 것이다. 또한, 상기 표지들의 항체에의 결합은 당업자에게 공지된 통상의 표준 기법을 사용하여 수행할 수 있다.
생체내 진단용 방사능핵종을 선별함에 있어 중요한 인자는 방사능핵종의 반감기가 표적에 의해 최대로 흡수된 시간에도 검출가능할 정도로 충분히 길되, 숙주에 유해한 방사선을 최소화하기에 충분히 짧은 시간이어야 한다는 것이다. 이상적으로, 생체내 결상 기법에 사용되는 방사능핵종은 미립자 방출이 없어야 하지만, 140-200 keV 범위에서 다량의 광자를 산출하며, 이는 통상적인 감마 카메라를 사용하여 용이하게 검출할 수 있다.
생체내 진단의 경우 방사능직종은 중간 작용기를 사용하여 직접 또는 간접적으로 항체에 결합시킬 수 있다. 금속 이온으로서 존재하는 방사능 동위원소를 면역글로불린에 결합시키는데 자주 사용되는 중간 작용기는 DTPA 및 EDTA 이다. 면역글로불린에 결합할 수 있는 대표적인 이온의 예로서는99mTC,123I,111In,131I,97Ru,67Cu,67Ga,125I,68Ga,72As,89Zr, 및201Tl을 들 수 있다.
진당용 생체내 결상 기법의 경우에는 이용가능한 검출장치의 유형이 소정의 방사능핵종을 선별하는데 있어 주요한 인자이다. 선택된 방사능핵종은 주어진 유형의 장치에 대해서 검출가능한 붕괴 형태를 가져야 한다. 일반적으로, 본 발명에 있어서는 진단 영상을 가시화하기 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, PET, 감마, 베타 및 MRI 검출기를 사용하여 진단 영상을 가시화할 수 있다.
또한 본 발명에 유용한 항체는 생체내 진단용 상자성 동위원소로 표지화될 수도 있다. 자기 공명 결상(MRI)의 경우에 특히 유용한 원소의 예로서는157Gd,55Mn,162Dy, 및56Fe를 들 수 있다.
본 발명에 유용한 항체(또는 이의 단편)는 체조직, 체액(예: CSF), 또는 뇌추출물내에서 NTP의 존재를 검출하기 위한 시험관내 면역분석법에 사용하기에도 적합하다. 그와 같은 면역분석법에 있어서는 항체(또는 이의 단편)를 전술한 바와 같이 액상으로, 바람직하게는 고체상 담체에 결합된 액상으로 사용할 수 있다.
당업자라면 본 발명에 따라 사용할 수 있는 다른 적당한 표지를 알 수 있을 것이다. 이러한 표지의 항체 또는 그 단편에의 결합은 당업자에게 공지된 통상의 표준 기법을 사용하여 수행할 수 있다. 대표적인 기법이 문헌 [(케네디 등, Clin.Chim. Acta 70:1-31(1976)), 및 (슈어스 등,Clin, Chim, Acta 81:1-40(1977))]에 기술되어 있다. 후자의 문헌에 기술된 연결 기법은 글루타르알데히드 기법, 과요오드산염 기법, 디말레이미드 기법, m-말레이미도벤질-N-히드록시 숙신이미드 에스테르 기법이며, 이들은 모두 본 명세서에 참고로 인용하였다.
동일계상에서의 검출은 환자로부터 조직학적 표본을 제거하고, 본 발명의 표지된 항체 조합물을 그 표본에 제공하므로써 수행될 수 있다. 항체(또는 그 단편)는 표지된 항체(또는 그 단편)를 도포하거나 피복하는 방법에 의해서 제공되는 것이 바람직하다. 그와 같은 절차를 통해서 NTP의 존재뿐만 아니라 조사된 조직상의 NTP의 분포를 확인할 수 있다. 본 발명을 실시함에 있어서, 당업자라면 상기의 동일계상 검출을 달성하기 위해 임의의 광범위한 조직학적 방법(예: 염색 절차)을 변형시킬 수 있음을 쉽게 파악할 수 있을 것이다.
본 발명의 결합 분자는 "2-부위" 또는 "샌드위치" 분석으로도 알려져 있는 면역측정 분석의 활용에도 적용될 수 있다. 통상의 면역측정 분석에 있어서는, 소정량의 미표지된 항체 (또는 항체 단편)를 시험하고자 하는 유체중에 불용해성인 고체 지지체(즉,CSF)에 결합시키고, 소정량의 검출가능하게 표지된 가용성 항체를 첨가하여, 고체-상 항체, 항원 및 표지된 항체간에 형성된 3원 복합체의 검출 및 또는 정량을 수행한다.
통상의 바람직한 면역측정 분석에는 고체상에 결합된 항체를 우선 시험하고자 하는 샘플과 접촉시켜 2원 고체상 항체-항원 복합체 형성에 의해 샘플로부터 항원을 추출하는 "전방" 분석이 포함된다. 적절한 항온처리 기간후, 고체 지지체를 세척하여 미반응된 항원(있다면)을 포함하여, 유체 샘플의 잔류물을 제거해낸 후, 미지량의 표지된 항체("리포터 분자"로서 기능함)를 함유하는 용액과 접촉시킨다. 미표지된 항체를 통해 고체 지지체에 결합된 항원과 표지된 항체의 복합체를 형성시키는 2차 항온처리 기간후, 고체 지지체를 2회 세척하여 미반응 표지 항체를 제거해낸다. 이러한 유형의 전방 샌드위치 분석은 항원이 존재하는지의 여부를 결정하는 단순한 "유/무" 분석도 가능하며 또는 표지된 항체의 측정량을 기지량의 항원을 함유하는 표준 샘플로 얻은 수치와 비교함으로써 정량적인 분석도 가능하다. 이러한 "2-부위" 또는 "샌드위치" 분석은 문헌[Wide, 199-206페이지,Radioimmune Assay Method, Kirkham and Hunter 공저, E. & S. Livingstone, Edinburgh, 1970]에 기재되어 있다.
본 발명의 항원으로 사용가능할 수도 있는 다른 유형의 "샌드위치" 분석에서는, 소위 "동시" 및 "역방향" 분석이 이용된다. 동시 분석은 고체 지지체에 결합된 항체와 표지된 항체 양자 모두를 시험하고자 하는 샘플에 동시에 첨가하는 단일 항온처리 단계를 포함하고 있다. 항온처리 완료후, 고체 지지체를 세척하여 유체 샘플의 잔류물과 복합체를 형성하지 않은 표지된 항체를 제거해낸다. 이후, 고체 지지체와 결합된 표지된 항체의 존재를 통상의 "전방" 샌드위치 분석에서와 같이 측정한다.
"역방향" 분석에서는, 1차로 표지된 항체의 용액을 유체 샘플에 첨가한후, 적절한 항온처리 기간이 지난 다음 고체 지지체에 결합된 미표지된 항체를 첨가하는 단계별 방식을 이용한다. 2차 항온처리후, 고체상을 통상의 방식으로 세척하여, 시험하고자 하는 샘플의 잔류물과 미반응 표지 항체의 용액을 제거해낸다. 이후, 고체 지지체와 결합된 표지된 항체를 "동시" 및 "전방" 분석에서와 같이 측정한다.
전술한 생체외 또는 생체내 검출 방법은 조직을 제거하지 않고서도 AD의 검출 및 진단에 사용할 수 있다. 이러한 검출 방법은 생체 샘플중 NTP의 농도를 평가하고 비교함으로써 AD에서의 신경학적 치매 단계의 결정에 용이하게 사용할 수도 있다.
본원에서 사용된 유효량의 진단 시약(예, 항체 또는 항체 단편)은 목적하는 진단적 분별을 달성할 수 있는 것으로 환자의 연령, 상태, 성별, 질환 정도와 의사에 의해 조정되는 다른 변수와 같은 요인에 따라 달라지게 된다. 통상적으로 진단시험에 사용되는 이러한 물질의 양은 일반적으로 0.1mg 내지 5mg 및 바람직하게는 0.1mg 내지 0.5mg 이다.
본 발명의 분석은 또한 키트의 제작에도 적절히 응용할 수 있다. 이러한 키트는 캐리어 수단을 포함하고 있으며, 이는 폐쇄된 구획내에 각기 별도의 면역분석인자를 함유하고 있는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기 수단을 수용하도록 세분되어 있다.
예를 들면, 한 용기 수단은 고체상 지지체상에 고정된 제1 항체를 포함하고 있고, 다른 용기 수단은 용액중 검출가능하게 표지된 제2 항체를 포함할 수 있다. 추가의 용기 수단은 검출하고자 하는 NTP의 연속 희석액을 함유하는 표준 용액을 포함할 수도 있다. NTP의 표준 용액을 사용하여 횡축상에 플로팅된 NTP의 농도와 종축상의 검출 시그날로 표준 곡선을 산출할 수 있다. 이러한 플롯으로부터 NTP를 함유하는 샘플로부터 얻은 결과를 삽입하여 NTP의 농도를 산출할 수 있다.
IV. NTP의 분리
전술한 바와 같이 재조합 DNA로부터 형질발현하여 본 발명의 NTP 단백질 또는 단편을 수득할 수 있다. 대안의 방법으로, 생체 물질로부터 NTP를 정제할 수도 있다.
본 발명의 목적에 적합한, 정제 방법중 한가지는 다음의 단계들로 구성되어 있으며, 이는 단지 예시의 목적으로 제시된 것일뿐 이들로만 한정하고자 하는 것은 아니다.
NTP를 정제하는데 있어, 1 단계는 우레아, 포름산, 세정제 또는 티오시아네이트와 같은 가용화제 존재 또는 부재하에 완충액중에서 뇌 조직 또는 CSF와 같은 생체 샘플로부터 NTP 분획을 추출하는 것을 포함한다.
2 단계는 용해된 물질을 모노-Q 또는 모노-S 컬럼(파마시아 LKB 바이오테크놀로지, 인코오포레이티드; Piscataway, NJ)상에서 이온 교환 크로마토그래피 처리하는 것을 포함한다. 유사한 방법으로, 예를 들어 전하 밀도, 전하 분포 및 분자 크기에 따라 분자를 분리할 수 있는 기타의 방법에 의해 용해된 물질을 분리할 수도 있다. M-IRMA 같은 면역분석법에 의해 각 분획에 대해 이온-교환 수지로부터의 NTP의 용출을 검색하였다. 면역반응 피이크를 투석한후, 친액성화시키고 분자 체나 겔 크로마토그래피 처리한다.
분자 체나 겔 크로마토그래피는 분자 크기에 의거하여 분리를 수행하는 분배크로마토그래피의 유형이다. 이러한 유형의 분리에는 덱스트란, 폴리아크릴아미드 및 아가로즈 겔이 보편적으로 사용된다. 본 발명에 유용한 겔의 종류중 한 가지는 세파로즈 12 (Phrmacia LKB 바이오테크놀로지, 인코오포레이티드)이다. 그러나, 크기에 의거하여 분자를 효과적으로 분리해내는 데 당해 기술분야의 숙련된 자에게 공지된 다른 방법을 사용할 수도 있다.
NTP에 대한 정제 프로토콜에 있어, 4 단계는 나트륨 도데실 설페이트- 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 추가 겔 크로마토그래피 정제 단계, 및 예를 들어은 염색법과 같은 염색에 의해 면역반응 피이크를 분석하는 것을 포함한다.
정제 방법에 있어, 5 단계는 SDS-PAGE 이후 수득된 NTP를 친화성 크로마토그래피 또는 분리하고자 하는 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 분자간의 친화성에의거한 기타 다른 과정으로 처리하는 것을 포함한다. NTP를 더욱 정제시키고자, 항-NTP MAbs (예, Th9 또는 거의 순수한 NTP에 대한 특이적 mABs)에 접합된 세파로즈상에서 친화성 크로마토그래피하는 과정을 이용할 수 있다. 역상 HPLC 또는 양호한 피이크 해상도를 가진 급속 분리를 특징으로 하는 기타 다른 방법 같은 대안의 방법을 사용하여도 무방하다.
NTP를 정제하는 다른 방법은 AD 환자로부터 얻은 농축 CSF를 사용하는 것이다. 이러한 과정을 위해, 30 내지 40㎖를 동결건조나 아미콘 여과 등에 의해 농축시키고 이를 2차원 겔 전기영동 처리를 한다. pH 구배에서 전하에 의해 한 방향으로 단백질을 분리한 후, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 다른 방향으로 분자 체 크로마토그래피 처리를 한다. NTP-면역반응 단백질이 웨스턴 블롯 분석에 의해 Th 단일클론 항체(예, Th 9)에 의한 점들로 확인된다. 이 겔을 전단하여 겔로부터 NTP 단백질을 용출시킨다. 이러한 방식으로 정제한 NTP는 서열결정하거나, 또는 새로운 단일클론 항체를 작제하는데 사용할 수 있다.
전술한 바람직한 방법 대신에 다른 정제 단계로 대체할 수도 있다. 당해 기술분야의 숙련자라면, 과도한 실험 없이도 대안의 정제 방안을 고안해낼 수 있을 것이다.
V. 안티센스 올리고뉴클레오티드와 리보자임을 사용한 유전자 치료법
안티센스 올리고뉴클레오티드와 관련하여서는 원핵생물[Mizuno et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1966-1970 (1984)] 및 진핵생물[Heywood,Nucleic Acids Res. 14:6771-6772 (1986)] 양자 모두에서의 유전자 형질발현의 자연 발생적인 생체 저해제로서 알려져 있고, 이들 서열은 아마도 상보적인 mRNA 서열에 하이브리드화됨으로써 기능하여 그 결과 하이브리드화 해독 중지[Paterson, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:4370-4374(1987)]를 초래하는 것 같다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 특이적 유전자 또는 RNA 메세지에 상보적이 되도록 제작된 짧은 길이의 합성 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드 분자이다. 이들 올리고머는 표적 DNA 또는 mRNA 서열에의 결합을 통해, 그 유전자의 전사나 해독은 선별적으로 차단되고 이러한 유전자에 의해 발병된 질환 과정은 중지될 수 있다 [참조예, Jack Cohen,Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press (1989)]. mRNA의 세포질내 위치는 세포내로 도입되는 안티센스 올리고뉴클레오티드에게 접근이 용이할 것으로 판단되는 표적을 제공한다. 그러므로, 이 분야의 연구는 대부분 표적으로서의 mRNA에 집중되어 왔다. 현재는, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써, 생체외 및 조직 배양에서의 유전자 형질발현의 조절에 대한 연구에 유용한 수단이 제공된다[Rothenberg, et al.,J. Natl. Cancer Inst. 81:1539-1544 (1989)].
안티센스 치료법은 세포내에 위치하고 있는 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하는 외인성 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것이다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 항암 치료를 위해 전신 투여할 수도 있다 [Smith, 국제출원 WO90/09180]. 본원 명세서에 기술된 바와 같이, NTP-관련 단백질은 신경외배엽 종양 세포, 악성 성상세포종 세포, 신경교아종 세포 및 비교적 고 농도(즉, 대조군 대비)의 AD 환자의 뇌 조직에 의해 생성된다. 따라서, 본 발명의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 AD 뿐아니라, 신경외배엽 종앙, 악성 성상세포종 및 신경교아종의 치료에 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 S-올리고뉴클레오티드 같은 유도체(포스포로티오에이트 유도체 또는 S-올리고, 잭 코헨의 상기 문헌 참조)가 포함된다. S-올리고(뉴클레오시드 포스포로티오에이트)는 포스페이트기의 비가교 산소 원자를 황 원자로 치환한 올리고뉴클레오티드(O-올리고)의 등전 유사체이다. 본 발명의 S-올리고는 상응하는 O-올리고를 황 전달 시약인 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1- 디옥시드로 처리하여 제조할 수 있다 [참조, Iyer et al.,J. Org. Chem. 55:4693-4698(1990); 및 Iyer et al.,J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254(1990), 이들 문헌은 본원 명세서에 전문 참고로 인용된 것임].
본원 명세서에서 기술된 바와 같이, NTP cDNA 클론의 서열 분석 결과, NTP는 PTP DNA 서열과 비상동성인 서열을 포함하고 있는 것으로 나타났다 (제9도 참조). 따라서 본 발명의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드로는 NTP에 특이적인 서열에 상보적이고 안정하게 하이브리드화하는 RNA 또는 DNA가 가능하다. 이러한 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 사용하면, NTP mRNA에는 선택적으로 하이브리드화하고 PTP를 규정하는 mRNA에는 하이브리드화하지 않는다. 본 발명의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기와 같이 AD 3-4 cDNA의 비상동성 서열을 암호화하는 안티센스 DNA 분자의 15량체 내지 30량체 단편인 것이 바람직하다:
상기 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 AD10-7 mRNA의 5'-말단부에 결합한다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하면 NTP 유전자의 형질발현을 하향 조절하거나 억제할 수도 있다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드(30량체)의 일례에는 다음과 같은 것들이 있다:
본 발명에는 유효량의 본 발명의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드 1종 이상과 함께 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약학 조성물도 포함된다. 구체예 중 일례에 있어서는, 단일 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 다른 구체예에서는, 인접 NTP 게놈 영역에 상보적인 2종의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 인접 게놈 영역이나 상응하는 mRNA에 상보적인 2종의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하면, 더욱 효율적인 NTP 게놈 전사나 mRNA 해독의 저해가 이루어져, 그결과 NTP 생성의 보다 효과적인 저해가 달성된다.
NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 의한 안티센스 분자의 유입을 촉진시키는 제제와 함께 공동투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드를 리포좀의 형태를 취할 수 있는 친유성 양이온성 화합물과 배합할 수도 있다. 세포내로 뉴클레오티드를 도입하는데 리포좀을 사용하는 방안은 미국 특허 제4,897,355호 및 제4,394,448호(상기 문헌들은 전문 참고문헌으로 인용된 것임)에 교시되어 있다 [생체 물질을 함유하는 리포좀의 일반적인 제조 방법에 대해서는 미국 특허 제4,235,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270호 참조].
대안적 방법으로, NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드를 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 바람직한 스테롤은 콜레스테롤이다.
추가로, NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 여기에 유용한 펩티드의 예로는 펩티드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩티드 독소가 포함된다. 신종양 세포에 의해 선택적으로 흡수되는 펩티드를 선택함으로써, 안티센스 제제의 특이적인 전달이 효과적으로 이루어질 수 있다. NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 활성화된 아미노알킬 유도체를 형성시킴으로써 5'OH 기를 통해 공유 결합시킬 수도 있다. 이후, 선택된 펩티드를 아미노 및 설프하이드릴 반응성 헤테로 이중 기능성 시약을 통해 활성화된 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드에 공유 부착시킬 수 있다. 상기 시약은 펩티드내에 존재하는 시스테인 잔기에 결합된다. 이 세포를 펩티드에 결합된 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드에 노출시키면, 펩티딜 안티센스 제제는 세포내로 도입되고 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 NTP mRNA에 결합하여 해독을 저해시킨다[Haralambid et al, WO 8903849; Lebleu et al., EP 0263740].
본 발명의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드와 약학 조성물은 의도하는 목적을 달성시키는 경로에 의해 투여할 수 있다. 예를들면, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복막내 또는 경피 경로에 의해 투여할 수 있다. 투여 용량은 수혜자의 연령, 건강상태 및 체중, 병행 치료법(있다면)의 종류, 치료의 빈도 및 목적하는 효과의 특성에 따라 좌우된다.
본 발명의 범주내의 조성물은 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드가 환자의 암 세포의 증식을 저해 및/또는 분화를 자극시키거나 또는 AD를 경감시키기에 효과적인 양으로 함유되어 있는 모든 조성물을 포함한다. 개개의 필요에 따라 달라지겠지만, 각 성분의 유효량의 최적 범위의 결정은 당해 기술분야의 숙련자에 의해 이루어진다. 통상적으로 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포유동물, 예를 들면 인간에게 0.005 내지 1 mg/kg/일의 용량 또는 1일당 치료받을 포유동물의 체중에 대하여 동량의 약학적으로 허용되는 이들의 염을 투여할 수 있다.
대안적 방법으로, 전사된 이중체 DNA 영역(인트론, 엑손 또는 양자 모두 포함)을 결합시켜 삼중 나선체를 형성시킴으로써 NTP 유전자의 전사를 방해하도록 조작된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제조할 수도 있다 [Froehler et al., WO 91 06626: Toole, WO 92/10590]. 삼중 나선체 형성에 바람직한 올리고뉴클레오티드는 두 영역 이상의 올리고뉴클레오티드에 대해 역전된 극성을 가진 올리고뉴클레오티드 이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 3'---5'-L-5'---3' 또는 5'---3'-L-3'---5'(이때, L은 올리고뉴클레오티드간의 0 내지 10 염기 올리고뉴클레오티드를 나타냄) 같은 상반된 극성의 직렬 서열을 포함하고 있다. 역전된 극성형태는 엑소뉴클레아제 분해에 대한 1본쇄 올리고뉴클레오티드를 안정화시킨다[Froehler et al.,상기 참고문헌 참조]. 바람직한 삼중 나선체-형성 올리고뉴클레오티드는 상기 서열번호 1-3에 의거한 것이다:
따라서, 삼중 나선체-형성 올리고뉴클레오티드 1 및 2는 각각 3'[SEQ IDNO:1]5'-L-5'[SEQ ID NO: 1]3' 및 5'[SEQ ID NO:1]3'-L-3'[SEQ ID NO:1]5'로 표시된다. 삼중 나선체-형성 올리고뉴클레오티드 3 및 4은 각각 3'[SEQ ID NO:2]5'-L-5'[SEQ ID NO: 2]3' 및 5'[SEQ ID NO:2]3'-L-3'[SEQ ID NO: 2]5'로 표시된다. 삼중 나선체-형성 올리고뉴클레오티드 5 및 6은 각각 3'[SEQ ID NO:3]5'-L-5'[SEQ ID NO:3]3' 및 5'[SEQ ID NO:3]3'-L-3'[SEQ ID NO: 3]5'로 표시된다. 물론, SEQ ID NOs, 4-6 또는 그 단편으로 유사한 삼중 나선체-형성 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다.
치료제 적용분야에 있어서는, 삼중 나선체-형성 올리고뉴클레오티드를 전술한 바와 같이 전신 또는 국소 투여를 비롯하여 각종 투여 방식에 적합한 약학 제제로 제형화할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전술한 바와 같은 당해 기술분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있는 방법중 어떠한 것에 따라 제조하여도 무방하다.
리보자임은 mRNA 기능을 저해하는 대안적 방법을 제공한다. 이 리보자임은 RNA 효소, 자가-스플라이싱성 RNA 및 자가-절단성 RNA일 수도 있다 [Cech et al.,Journal of Biological Chemistry 267:17479-17482 (1992)]. 특정의 표적 서열에 대해 트랜스로 지향된 엔도뉴클레아제 활성을 가지고 있는 리보자임을 새로이 작제하는 것이 가능하다. 이들 리보자임은 다양한 서열에 대해 작용할 수 있기 때문에, 리보자임은 실질적인 임의의 RNA 기질에 대한 것으로 디자인될 수 있다. 따라서, 리보자임은 특정 유전자의 형질발현을 저해하는 매우 가변적인 수단으로 안티센스 작제물에 대한 대안으로 제공된다.
클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제 mRNA에 대한 리보자임은 성공적으로 작제된 바 있다 [Haseloff et al.,Nature 334:585-591 (1988): Uhlenbeck et al.,Nature 328:596-600 (1987)]. 리보자임은 세 구조 도메인 1) 5' 방향으로 절단 부위에 인접하는 뉴클레오티드의 고 보존성 영역; 2) 염기-쌍 스템을 형성하는, 리보자임의 자연 발생적 절단 도메인내에 포함된 고 보존성 서열: 및 3) 양단상에 절단 부위에 인접하고 절단 부위와 관련하여 리보자임의 정확한 배열 및 기질과 효소의 결합을 확실하게 해주는 영역을 포함하고 있다. 이러한 모델에 따라 작제된 RNA 효소는 생체외에서 RNA 서열의 특이적 절단에 적합한 것으로 이전에 판명된 바 있다 [Haseloff et al., 상기 참고문헌 참조].
대안적 방법으로, 활성 부위가 담배 링 스포트(ring spot) 바이러스의 부수체 (satellite) RNA의 (-) 가닥으로부터 유래된 헤어핀 리보자임을 사용할 수도 있다[Hampel et al., Biochemistry 28: 4929-4933(1989)]. 최근에는, 인간 면역 결핍증 비루스 1형 RNA를 절단하는 헤어핀 리보자임을 작제했다[Ojwang 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10802-10806 (1992)]. 다른 자가-절단 RNA 활성은 델타형 간염 바이러스와 관련이 있다 [Kuo et al.,J. Virol. 62:4429-4444 (1988)].
상기에서 논의한 바와 같이, NTP 리보자임에 바람직한 표적은 PTP 서열과 비상동성인 뉴클레오티드 서열이다. 본 발명의 NTP 리보자임 분자는 전술한 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제 리보자임 또는 헤어핀 리보자임에 의거하여 고안하였다. 대안적 방안으로, NTP 리보자임 분자는 화학적 및 효소적 분해에 대한 안정성이 증대되어, 치료제로서 유용한, 촉매적 활성을 가진 리보자임 작제물에 대해 기재한 문헌 [Eckstein et al., 국제출원 WO 92/07065]에 의해 기술된 바와 같이 고안된다.
대안적 방법에서는, 내인성 리보자임인 RNase P가 세포내 NTP mRNA로 지향하여, 이후 세포 리보자임에 의해 절단되는 외부 가이드 서열 (EGS)을 작제할 수 있다 [Altman et al., 미국 특허 제5,168,053호]. NTP EGS는 NTP mRNA와 3'-NCCA 뉴클레오티드 서열 (이때, N은 퓨린(상기 문헌 참조)이 바람직함)에 상보적인 10 내지 15개의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 후술하는 바와 같이, NTP EGS 분자가 세포로 전달된 후, 이 분자는 NTP mRNA와, 상보적인 NTP EGS 서열간에 염기쌍을 형성하여, 염기쌍을 형성한 영역의 5' 말단 뉴클레오티드에서의 RNase P에 의한 NTP mRNA의 절단을 촉진시켜 표적 NTP mRNA 종에 결합한다(상기 문헌 참조).
본 발명에는 유효량의 본 발명의 NTP 리보자임 또는 NTP EGS 1종 이상과 함께 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약학 조성물도 포함된다. NTP 리보자임 또는 NTP EGS를 세포에 의한 리보자임이나 NTP EGS 분자의 유입을 촉진시키는 제제와 함께 공동투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, NTP 리보자임 또는 NTP EGS를 리포좀의 형태를 취할 수 있는 친유성 양이온성 화합물과 배합할 수도 있다. 대안적 방법으로, NTP 리보자임 또는 NTP EGS를 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 바람직한 스테롤은 콜레스테롤이다.
본 발명의 NTP 리보자임 또는 NTP EGS와 약학 조성물은 의도하는 목적을 달성시키는 경로에 의해 투여할 수 있다. 예를 들면, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복막내 또는 경피 경로에 의해 투여할 수 있다. 투여 용량은 수혜자의 연령, 건강상태 및 체중, 병행 치료법(있다면)의 종류, 치료의 빈도 및 목적하는 효과의 특성에 따라 좌우된다. 예를 들어, 독성의 징후 없이, 700 mg 정도의 많은 양의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 10일에 걸쳐 환자에게 정맥 투여하였다(즉, 0.05 mg/kg/시간) [Sterling, "Systemic Antisense Treatment Reported,"Genetic Engineering New 12(12):1, 28 (1992)].
본 발명의 범주내의 조성물은 NTP 리보자임 또는 NTP EGS가 환자의 암세포의 증식을 저해 및/또는 분화를 자극시키거나 또는 AD를 경감시키기에 효과적인 양으로 함유되어 있는 모든 조성물을 포함한다. 개체의 필요에 따라 달라지겠지만, 각 성분의 유효량의 최적 범위의 결정은 당해 기술분야의 숙련자에 의해 이루어진다.
용액내 원료 화학물질로서 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 NTP EGS를 투여하는 것외에도, 치료제 분자를 약학적으로 사용할 수 있는 제제내로의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 NTP EGS의 프로세싱을 용이하게 해주는 부형제 및 보조제를 함유한 적합한 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약학 제제의 일부로서 투여할 수도 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, NTP EGS의 수용액을 수용성 형태, 예를 들면 수용성 염 형태로 포함한다. 또한, 적절한 유성 주사 현탁액으로서 활성 화합물의 현탁액을 투여할 수도 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클로는 지유, 예를 들면, 참기름이나 합성 지방산, 예를 들면 에틸 올레에이트나 트리글리세라이드가 포함된다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증대시키는 성분, 예를 들면 나트륨 카르복시메틸 셀룰로즈, 소르비톨 및 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 안정화제를 함유할 수도 있다.
대안적 방안으로, NTP 안티센스 RNA 분자, NTP 리보자임 및 NTP EGS는 생체내에서 복제가 불가능한 것이 바람직한 비리온의 형태로 투여되는 DNA 작제물에 의해 암호화될 수도 있다(참조예, Taylor, WO 92/06693). 예를 들어, 이러한 작제물은 포진계 바이러스를 사용하여 투여할 수 있다 [Gage et al., 미국 특허 제5,082,670호]. 대안적 방안으로, NTP 안티센스 RNA 서열, NTP 리보자임, 및 NTP EGS는 레트로바이러스와 같은 비리온의 형태로 투여되는 RNA 작제물에 의해 암호될 수도 있다. 레트로바이러스 벡터의 작제는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다 [참조예, Brown 등 "Retroviral Vectors," inDNA Cloning:A Practical Approach, Volume 3, IRL Press, Washington, D. C. (1987)].
중추 신경계에서의 유전자 형질발현에 대한 특이성은 세포-특이적 인핸서 및 프로모터 같은 적절한 세포-특이적 조절 서열을 사용함으로써 부여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 서열로는 JC 바이러스의 핍지신경교(oligodendroglial)-특이적 형질발현, 지단백 단백질의 신경교-특이적 형질발현 및 신경교 원섬유 산 단백질 유전자의 신경교-특이적 형질발현을 조절하는 서열들이 있다 [Gage et al., 상기 참고문헌 참조]. 단백질 인산화는 신경세포 조절에 중요하므로[Kennedy, "Second Messengersand Neuronal Function," inAn Introduction to Molecular Neurobiology, Hall, Ed., Sinauer Associates, Inc. (1992)], 단백질 키나제 프로모터 서열을 사용하여 충분한 NTP 유전자 형질발현 수준을 달성할 수 있다.
따라서, 유전자 치료법을 이용하면, 특정 NTP 형태의 부적합한 형질발현을 저해함으로써 AD를 경감시킬 수 있다. 또한, 유전자 치료법을 사용하여, 적절한 특정 NTP 형태의 적절한 형질발현 수준을 제공함으로써, AD를 경감시킬 수 있다. 이 경우, 전술한 바와 같은 바이러스 형태로 투여된 DNA 또는 RNA 작제물에 의해 특정 NTP 핵산 서열이 암호화될 수 있다. 대안적 방법으로, NTP 서열을 포함하는 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하거나 또는 세포내로 외부의 DNA를 도입시키는 다른 널리 공지된 기술 [Sambrook et al., 상기 참고문헌 참조]을 사용하여 "공여체 세포"를 생체외에서 변형시킬 수도 있다. 이러한 공여체 세포로는 섬유아세포, 신경 세포, 신경교 세포 및 결합 조직 세포가 있다 [Gage et al., 상기 참고문헌 참조]. 유전자 조작 이후, 공여체 세포를 충추 신경계내로 이식하고, 따라서, 유전적-변형된 세포가 NTP 치료제 형태를 제공한다(상기 문헌 참조).
또한, 이러한 비리온은 혈류로 도입되어 뇌로 전달될 수도 있다. 이는 비리온의 투여 이전에 뇌 혈관 장벽(barrier)의 삼투압 파괴를 통해 달성된다 [참조예, Neuwelt, 미국 특허 제4,866,042호]. 뇌 혈관 장벽은 만니톨, 아라비노즈 또는 글리세롤 같은 약학적으로 효과적인, 무독성 고장성 용액을 투여함으로써, 파괴될 수 있다(상기 문헌 참조).
다음의 E. 콜리의 클론이 미국 모식균 배양 수집소(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 소재)에 부타페스트 조약에 따라 기탁되었다: G2-2 PstI-DH5 (ATCC No. 69257); G5d-PstI-DH5 (ATCCNo. 69258); 1-9a-LK-1 blue (ATCC No. 69259); AD3-4-DH1 (ATCC No. 69260); HB4-XL-blue (ATCC No. 69261): AD10-7-DH1 (ATCC No. 69262); AD2-2-DH1 (ATCC No. 69263); G5d-1PstI-EcoRI-DH5 (ATCC No. 69264); 및 G2-2PstI-EcoRI-DH5 (ATCC No. 69265).
지금까지 본 발명과 관련하여 일반적인 사항을 기술하였으나, 이하 실시예를 참조로 하면, 본 발명이 더욱 쉽게 이해될 것이며, 이하 실시예는 예시를 목적으로 저시된 것으로, 특기하지 않는한 본 발명을 제한하려는 의도로 제시되지 않았음을 주지하기 바란다.
실시예 1
세포주의 NTP 면역 반응성 발현
Th9 단일클론 항체를 사용하여 사상 단백질 면역 반응성을 발현하는 중추 신경계 유래의 세포주 7개가 동정되었다. 상기 항체는 단백질의 췌장 형태에 대해 생성되었지만[Gross 등 J. Clin. Invest. 76 : 2115-2126(1983)], 뇌조직 및 뇌척수액에 존재하는 사상 단백질과 교차 반응하는 것이다(Ozturk 등.,Proc. NatI. Acad. USA 86: 419-423(1989): de la Monte 등.,J. Clin. Invest. 86: 1004-1013(1990) ; de la Monte 등.,J. Neurol. Sci. 113: 152-164(1992) ; de la Monte 등.,Ann. Neurol. 32: 733-742(1992)).
상기 세포주 7개는 다음과 같다 : PNET1과 PNET2라 명명된 2개의 원시적인 신경외 배엽 종양(PNET) 세포주 ; 3개의 신경교아종 세포주 Hg1 16, Hgl 17 및 C6 : A 172 신경교 세포주 ; SH-Sy5y 신경아세포종 세포주, 여기에서 신경교아종 세포주 및 A172 세포는 ATCC에서 얻은 것이고, SH-Sy5y 세포는 Sloan-Kettering Memorial Hospital 의 Biedler 의사에게 얻은 것이며, PNET 세포주는 전술된 것으로서[The et al.,Nature genetics 3: 62-66(1933)] MGH 암 센터의 Rene' Bernards 박사로부터 얻은 것이다. 갓태어난 송아지의 혈청 10% 가 보강된 얼의 변형 이글 배지(Earl's Modified Eagle Medium)에 모든 세포주를 유지시켰다. 이 배지에는 항생제가 첨가되지 않았다.
사상 단백질을 발현하는 세포와 다른 면역 반응성을 나타내는 세포를 조사하기 위해, 배양물을 2 mM EDTA 함유의 인산염 완충염수(PBS, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4, pH7.3)중에서 수거하였다. 슬라이드 하나당 105개 세포를 사용하여 시토스핀 제제물을 만든후, 100% 메탄올(-20℃)에 즉각적으로 고정시키고, 공기건조하고, 사용전까지 -80℃에서 보관하였다. 면역 염색을 시행하기 전에 슬라이드를 실온에 두어 균형화한뒤 PBS 중에서 수화시켰다. 3%의 비면역된 말의 혈청으로 비특이적 항체 결합을 차단시켰다. 동일 배양물에서 얻은 복사판 시토스핀 제제물을 5 또는 10 ㎍/ml의 1차 항체와 함께 밤새도록 항온처리하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 벡타스테인 엘리트 키트[Vectastain Elite kit(Vector Lab, Burlingame, CA)]를 사용하는 아비딘-비오틴 양고추냉이 퍼옥시다제 방법과, 색원체로서 3-3'디아미노벤지딘 (0.5mg/ml + 0.03% 의 과산화수소)을 사용하면 면역 반응성이 나타났다. 이후 세포를 헤마톡실린으로 대비염색시키고, 등급이 있는 알콜용액에서 탈수시키고, 크실렌으로 세정하고, 피셔 사이언티픽(FisherScientific)에서 시판하는 퍼마운트(Permount) 카버글래스로 덮어서 보관하였다.
각각의 세포주로 구성된 시토신 제제물을 사상 단백질 단일클론 항체 Th9, Th7, Th10, Th29, Th34, Th46, Th67 및 Th90으로 면역 염색시켰다. 또한, 복사판 슬라이드를 양성 대조군 단일클론 항체(신경섬유 신경교 원섬유성 산성 단백질(GFAP) 및 비멘틴)와 음성 대조군 단일클론 항체(데스민, B 형 간염 표면 항원-5C3)로 면역염색시켰다. 본 발명자의 실험실에서 생산한 5C3(Fujita 등,Gastroenterology 91: 1357-1363(1986))를 제외하고는 이 대조항체들은 뵈링거-만하임(Boehringer-Mannheim)에서 구입한 것이다. 모든 혈청학적 시약들을 1% 의 소의 혈청 알부민(BSA) 함유의 PBS 중에 희석시키고, 1 차 항체와 함께 항온처리한 것 하나를 제외한 모든 항온처리는 실온하에 다습실에서 항온처리하였다. 각 단계 사이에 PBS를 3회 바꾸면서 슬라이드를 세척하였다.
PNET1 및 PNET2 세포는 고분자량 및 중간 분자량의 신경섬유 단백질을 발현했으나, 신경교 원섬유성 산성 단백질이나 비멘틴은 거의 또는 전혀 발현되지 않았다. PNET1, PNET2 및 SH-Sy5y 세포는 GAP-43을 발현했다. 이 GAP-43은 미성숙 뉴런과 재생성 세포 성장을 수행하는 뉴런에서 높은 빈도로 발현되는 상당량의 칼모듈린-결합 인단백질이다(Benowitz 등.,J. Neurosci. 3: 2153-2163(1983) ; DeGraan 등,Neurosci, Lett, 61: 235-241 (1985) : Kalil 등.,J. Neurosci. 6: 2563-2570(1986)). A172 및 C6 세포는 GFAP 및 비멘틴을 발현했다. 하지만, A172는 또한 순수한 신경교 세포특성에 의문을 던지면서 신경섬유 면역반응성을 나타냈다. 어느 세포주도 데스민 또는 B 형 간염 표면 항원에 대한 단일클론 클론 항체와 면역 반응성을 나타내지 않았다. 음성 대조군 세포주로서, Huh 7 간세포암 세포주를 유사하게 면역염색시켰으며 상기 항체와 어떠한 면역 반응성도 나타내지 않은 것으로 밝혀졌다. 하지만, Huh 세포들은 인슐린 수용체 기질 단백질인 IRS-1에 대한 단일클론 항체와는 면역반응하였다(데이타 제시 되지 않았다). 이 IRS-1은 상기 세포주의 음성 대조군으로서 사용되었다(Sasaki 등.,J. Biol. Chem. 268: 1-4(1993)).
Th9 단일클론 항체를 사용하면, 사상단백질의 면역 반응성이 일차 PNET(A), 일차 신경교아종(F) PNET 1(B) 및 C6 세포 (G)에서 검출되었지만 간세포암 세포주에서는 검출되지 않았다(제1A도-제1J도). 또한, Th9 면역 반응성이 9개의 일차 인간 CNS PNET 중 8개 및 일차 인간 신경교아종 5개 모두의 조직 절편에서 검출되었다(제1A도-제1J도). 5개의 세포주 모두가 Th9 단일클론 항체와 강력한 면역 반응성을 나타내긴 했지만, 이들은 다른 Th 단일클론 항체에 대해 나타난 면역 반응성과는 달랐다. Th10(C, H), Th 7(D, I) 또는 Th46 단일클론 항체에 의한 면역 염색 반응은 PNET1(C-E) 및 C6 (H-J)에서 소량(C, D)으로 나타나거나 또는 부재(H, I, E, J)로 나타났다. PNET2 세포는 Th7 및 Th29와 면역반응을 적게 나타낸 반면, 다른 Th 단일클론 항체와는 면역염색되지 않았다. A172, C6 및 SH-Sy5y 세포는 Th9 이외의 Th 단일클론 항체와는 면역 반응성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. Huh7 세포는 사용된 사상 단백질 단일클론 항체 어느것과도 면역 반응을 일으키지 않은 반면, 인간 췌장 조직은 Th 항체 모두(사상 단백질의 정제된 췌장형에 대해 생성된 것이다)와 면역반응성이 있었다(Gross 등.,J. Clin Invest. 76: 2115-2126(1985)).
실시예 2
단일클론 항체계 면역방사 계측법(M-IRMA)에 의한 사상 단백질의 분석
배양된 세포를 PBS 중에 세척하고, 2mM EDTA 함유의 PBS 중에서 회수하였다. 15 분간 1000 x g의 원심분리로 펠릿화시킨뒤 용해 완충액에 재현탁시켰다. 이 완충액은 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1% 트리톤 X-100, 2mM EGTA, 10mM EDTA, 100 mM NaF, 1mM Na4P2O7, 2mM Na3VO4, 100 ㎍/ml의 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1 ㎍/ml의 아프로티닌, 1 ㎍/ml의 펩스타틴 A 및 1 ㎍/ml의 류펩틴을 함유하였다. 용해물을 14,000 x g에서 10분간 원심분리해서 얻은 상청액에 대해 웨스턴 블롯 분석, 면역 침전 연구 및 M-IRMA를 수행하였다. 로우리 비색 분석법으로 단백질 농도를 측정하였다. 시료를 -40℃에서 보관하였다.
M-IRMA는 고도로 민감한 2 부위 또는 3 부위 전방 샌드위치 분석방법으로서 세포용해물, 조직 배양 배지, 조직 균질물 및 체액에서 NTP(pmol)의 정량분석을 가능케한다(Ozturk 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 419-423(1989) : de la Monte 등.,J. Clin. Invest. 86: 1004-1013(1990) : de la Monte 등,J. Neurol. 113: 152-164 (1992) : de la Monte 등.,Ann. Neurol. 32: 733-742(1992) ; Gross 등.,J. Clin. Invest. 76: 2115-2126(1985)). 또한, SDS-PAGE로 혼합시, M-IRMA는 사상단백질 및 관련종의 분자 크기를 알아내는 데 사용될 수 있다. (Ozturk 등.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 419-423(1989) ; de la Monte 등.,J. Clin. Invest. 86: 1004-1013(1990) ; de la Monte 등.,J. Neurol. Sci. 113: 152-164 (1992) ; de la Monte 등.,Ann, Neurol. 32: 733-742(1992). M-IRMA는 고체상 매트릭스에 결합된 단일클론 항체 Th7 및 Th10을 사용하여 생물학적 시료에 존재하는 면역반응성 사상 단백질을 포집한 뒤 동일한 단백질에 대한 제3의 방사성 표지된 트레이서 모노클론 항체(Th9)로 포집된 항원을 검출하는 것을 포함한다. 간략히 언급하면, 1/4" 폴리스티렌 비드(Precision Ball, Inc)를 사상단백질에 대한 하나 또는 두개의 단일클론 항체(통상 Th7 + Th10)로 코팅시켰다. 세포용해물 또는 조직 균질물의 상청분류액(Ozturk et al.,Proc, Natl. Acad. Sci. USA 86: 419-423(1989); de la Monte et, al.,J. Clin. Invest. 86: 1004-1013(1990); de la Monte et. al.,J. Neurol. Sci. 113; 152-164(1992); de la Monte et al.,Ann. Neurol, 32: 733-742 (1992))을 피복된 비드와 밤새도록 항온처리하여 시료내에 존재하는 사상단백질을 포집하였다. 비드를 PBS 중에서 5회 세척한뒤 트레이서로서125I 표지된 Th9와 함께 항온처리하여 포집된 사상 단백질을 검출하였다. 용해물 또는 조직 균질물의 사상 단백질의 농도는 정제된 사상 단백질의 공지된 양에 의해 제시되는 표준 곡선에 의해 결정되었다. 이러한 고민감성 분석은 용액중의 사상 단백질 10pmol 만큼 작은 것도 검출할 수 있다. SDS-PAGE로 분별한 사상 단백질 분석을 위해 젖은 겔을 2 mm 간격으로 잘랐다. 그리고 그 단백질을 실온에서 24 시간 동안 진탕시켜 PBS 0.5 ml를 사용하여 각 분획으로부터 용출하였다. 용출물에 사상단백질이 존재하는지 여부를 M-IRMA로 직접 분석하였다.
Th7, Th10, TH34, 및 Th 29로 PNET1 세포를 광범위하게 면역세포 화학 염색을 행하면, M-IRMA에 의해 이들 세포내에서 면역반응성이 쉽게 측정되었다. 부언하면, 포집 항체로서 사용된 Th7, Th10, Th34 및 Th29 단일클론 항체(MoAb)(단독 또는 두개를 조합 사용가능) 및 트레이서로서125I-표지된 Th9를 사용하면, 사상단백질이 유사하게 고농도로 얻어졌다(제2도). 이와는 대조적으로, PNET2, C6 및 A172 세포에서 이것은 Th9와 강력한 면역 반응성을 나타냈지만, 항원을 포집하는데 사용되었던 Th 단일클론 항체와 면역세포화학 염색은 거의 또는 전혀 나타내지 않았으며, M-IRMA에 의해 검출된 사상 단백질의 양은 PNET1 세포에서 측정한 것보다 훨씬 낮았다(제2도). 이와 유사하게, 사상 단백질의 단일클론 항체 어느 것하고도 면역세포 화학염색되지 않는 Huh 7 세포는 M-IRMA로 관찰했을때 세포 용해물에서 사상 단백질의 실제로 검출 가능한 양을 지니지 않았다. 세포용해물에서 사상 단백질의 농도는 포집항체로서 Th7 및 Th10을 사용하여 정제된 PTP로 그려지는 표준 곡선에서 컴퓨터로 계산되었다. 전체 단백질의 평균 S.D.pg/mg로 표시된 결과는 다음과 같았다 :
실시예 3
종양 세포주에서의 신경사 단백질의 특성 분석
웨스턴 블롯 분석에서, 100 ㎍의 단백질을 함유한 시료를 미리표지시킨 분자량의 표준시료와 함께 SDS-PAGE로 분별시켰다. 반-건조 전달장치(IntegratedSystems)를 사용하여 나일론 막(Immobilon-P 전달 막, Millipore)에 블로팅하고 Tris 완충염수(TBS : 10mM 트리스 0.85% 염화나트륨, pH7.5)에서 막을 세척한 뒤 3% BSA 함유의 TBS로 차단시켰다. 블롯을125I 표지한 Th9 단일클론 항체와 함께 4℃에서 밤새도록 배양시켰다. TBS-BSA에서 3 회 15 분간, 1 회 30 분간 실온에서 막을 세척하여 비특이적으로 결합된 프로브를 제거하였다. 코닥 XAR 필름을 사용하여 자동방사선 사진법으로 결과를 분석하였다.
면역 침전 연구용 샘플을 제조하기 위해, 단백질 약 1 mg/ml을 함유하는 세포 용해물 샘플 1 ml를 면역 침전 연구에 사용하였다. 용해물은 비관련성 항체(5C3 또는 안티데스민)으로 먼저 예비 세정한 뒤 단백질 A 세파로즈로 세정하였다. 5 내지 10 ㎍의 Th9 및 단백질 A 세파로즈(Sasaki 등.,J. Biol. Chem. 268:1-4(1993))를 사용하여 사상 단백질을 면역 침전하였다. 원심분리에 의해 수거된 면역 복합체를 2% SDS 및 10mM β-메르캅토에탄올 함유의 완충액에 재현탁시킨 뒤 변성 및 감소 조건하에서 SDS-PAGE에 처리하였다(상기 문헌 참조). 미정제 세포성 용해물(100 ㎍ 단백질)을 동시에 분석하였다. 단백질을 Immobilion-P 막상에 블로팅하고125-I 표지(상기 참조) Th9로 프로브하여 사상 단백질 및 관련된 분자를 검출하였다. B형 간염 표면 항원(5C3) 또는 데스민에 대한 단일 클론 항체를 사용하여 음성 대조군 실험을 동시에 수행하였다.
100 mm2페트리 디쉬에서 배양한 세포의 단일층을 사용하여 대사성 표지화 실험을 수행하였다. 표지화전에, 세포를 2 시간 동안 메티오닌 및 시스테인이 없는배지에 노출시켰다. 배지에 이후 [35S] 메티오닌 또는 [35S] 시스테인 각기 300 μCi를 함유하는 3ml의 DMEM을 넣었다. 3 시간 동안 표지화한후, 방사성 표지된 아미노산이 결여되어 있으면서 10mM 메티오닌이 보강된 완전 배지에서 시간 간격을 두고 세포를 배양하였다. 세포 용해물을 전술된 것처럼 제조하였다. Th9 단일 클론 항체 및 단백질 A 세파로즈를 사용하여 사상 단백질을 면역침전시키고, SDS-PAGE 및 필름 자동 방사선 사진법으로 면역 침전 생성물을 분석하였다.
생체내의 포스포릴화 연구를 위해 대사성 표지 연구에 기술된 대로 배양된 세포를 TBS로 2회 세척하고, 투석 처리된 갓태어난 송아지의 혈청 10%를 함유하는 인산염 부재의 Dulbecco의 MEM과 함께 세포를 2시간동안 배양시켰다. 이후, 세포를 TBS로 세척하고, 400 μCi/ml의 [32P] 오르토인산 함유의 동일한 배지와 함께 3시간동안 배양하였다. 사상 단백질, 양성(p36) 및 음성(데스민) 대조 단일클론 항체로 면역 침전시킨 뒤 SDS-PAGE 처리하면 세포 용해물이 분석되었다.
신경사 단백질의 글리코실화 상태를 연구하기 위해서, 약 100 ㎍의 단백질을 함유하는 세포 배양 용해물을 SDS-PAGE 처리하고, 분별된 단백질을 Imnobilon-P 막(Millipore)에 전이시켰다. 과요오드산 산화반응 및 이어서 비오틴화, 그리고 비색계 기질로서 스트렙트아비딘-알칼리 포스파타제 프로브와 NBT/BCIP를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 O- 및 N-글리칸을 검출하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 Glyco Track Kit(옥스포트 글리코 시스템, 뉴욕 로즈데일 소재)를 사용하여 분석을 수행하였다.
웨스턴 블롯 분석, 면역 침전과 그에 이은 웨스턴 블롯 분석, 대사적 표지법과 그에 이은 면역 침전, 및 M-IRMA와 결합된 SDS-PAGE의 4가지 상이한 방법으로 PNET1, PNET2, SH-Sy5y, C6 및 A172 세포의 용해물 중에서 Th9-면역반응성 단백질을 검출하였다.125T-표지된 Th9를 사용한 미정제 세포성 용해물을 웨스턴 블롯 분석한 결과 상기 세포주에서 ∼21 kDa의 밴드가 나타났지만(제3도의 화살표 참조) 시그날 강도는 약했다. 이와는 대조적으로, 인간 췌장 조직 용해물에서는 웨스턴 블롯 분석에 의해 기대됐던 17 kDa의 분해되지 않은 췌장의 사상 단백질 및 14 kDa의 분해된 췌장의 사상 단백질이 쉽게 검출되었다(제3도). 인간의 간세포암 세포주의 용해물에서는 사상 단백질이 검출되었다. 뉴런 및 신경교의 세포주와 비교할때 사상 단백질은 췌장 조직에서 상당히 높은 양으로 나타났는데 이것은 뇌조직과 뇌척수액과 비교된 췌장 및 췌장액에서 사상 단백질이 106배 높은 양으로 나타난 종래의 발견과 일치했다(Ozturk 등.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:419-423(1989); de la Monte 등.,J. Clin. Invest. 86:1004-1013(1990); del la Monte 등.,J. Neurol. Sci. 113:152-164(1992); de la Monte 등.,Ann. Neurol. 32:733-742(1992). PNET 및 신경교 세포에 의해서 합성되는 사상 단백질이 PTP 및 NTP의 경우에서 처럼 분비될 수 있다고 예상할 수 있지만, 사상 단백질은 웨스턴 블롯 분석시 조직 배양 배지에서 검출되지 않았을 뿐 아니라, 심지어 동결 건조에 의해 배지를 4배 또는 5배 농축한 후에 조차도 검출되지 않았다. Th7+Th10 또는 Th9로 용해물을 면역 침전한 뒤125I- 표지된 Th9(직접)을 사용한 웨스턴 블롯 분석을 수행하거나 또는125I-표지된 단백질 A(간접)에 의해 표지되지 않은 Th9를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 수행하면 PNET 및 신경교세포주에서 Th9- 면역반응성 사상 단백질이 쉽게 검출되었다. 이 두가지 방법으로 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출된 것들과 비슷한 21 kDa 사상 단백질 관련종을 입증했다. 또한, ∼17 kDa 밴드가 PNET 및 신경교 세포에서 관찰되긴 했지만, 시그날은 웨스턴 블롯 분석에 의해 나타난 것처럼 비연속적이었고 레벨 또한 낮았다. 음성 대조군으로서, Huh7, HepG2 및 FOCUS(Lun 등.,In Vitro(Rockville) 20:493-504(1984)) 인간 간세포암 세포주를 동일한 조건하에서 동시에 연구하였다. Th9-면역반응성 단백질은 세포성 용해물 중에서 검출되지 않았다.
35S-메티오닌 또는35S-시스테인으로 대사상 표지화를 수행한 뒤 Th9 단일클론 항체를 사용하여 면역 침전을 행하면 PNET 및 신경교 세포중에 존재하는 사상 단백질의 분자 크기는 가장 현저하게 입증되었다. 데스민 또는 B형 간염 표면 항원(5C3)에 대한 단일 클론 항체를 면역 침전용 음성 대조군으로서 사용하였다. 면역 침전된 생성물을 SDS-PAGE 분석한 결과 PNET 및 신경교세포주 모두에서 ∼26 및 ∼21 kDa의 Th9-면역반응성 단백질이 검출되었다(제4B도). PNET1 세포에서, 21 kDa 밴드는 이중으로 나타났다(제4A도); 분자량이 약간 높은 종은 ∼21 kDa에서 우세한 밴드보다는 약하게 나타났다. 또한, PNET 및 신경교 세포주에는, ∼21 kDa 밴드와 거의 동일한 강도를 갖는 밴드와 관련된 ∼17 kDa Th9-면역반응성 단백질이 있다. C6 세포에서는 PNET 세포에서 검출되지 않은 ∼26 kDa, ∼14 내지 15 kDa 및∼8 kDa Th9-면역반응성 단백질이 존재했다(제4도, 화살표)
SDS-PAGE/M-IRMA 결과 SH-Sy5y, PNET1, A172 및 C6 세포에서는 21 kDa 및 17 kDa 사상 단백질이 존재하였고, 간세포암 세포에서는 이들이 존재하지 않았다(제4-5도). SDS-PAGE에 이해 분별된 세포성 단백질을 2mm 간격으로 자른 겔로부터 용출하고 포집 항체로서 Th7+Th10과 트레이서로서125I-표지된 Th9를 사용하여 M-IRMA로 사상 단백질 면역반응성에 대해 직접 분석하였다. 소량에도 불구하고, 모든 신경 외배엽 세포주에서는 두개의 뚜렷한 피크가 나타났지만 동일 방식으로 동시에 분석된 Huh7 간세포암 세포에서는 나타나지 않았다. 이들 겔에서는 존재할 것으로 추정되었던 ∼14 내지 15 kDa 단백질과 ∼17 kDa 단백질을 구별하지 못했다.
PNET1 및 C6 세포를32P 또는35S 메티오닌으로 대사적으로 표지하고, Th9 단일 클론 항체를 사용하여 사상 단백질을 용해물로부터 면역 침전시켰다(제6도). 음성 대조군으로서, 데스민 단백질에 대한 단일 클론 항체 및 세포 용해물 동량을 사용하여 면역 침전 연구를 수행하였다(제6도, 오른쪽 패널).35S 메티오닌으로 표지된 세포에서, Th9-면역반응성 밴드는 ∼26 kDa 및 ∼21 kDa(상단 화살표), ∼17 kDa(하단 화살표) 및 ∼14 내지 15 kDa에서 나타났다(제6도).32P로 표지한 후, 21 kDa 밴드만이 Th9 단일클론 항체를 사용한 면역 침전에 의해 관찰되었다. 다른 분자량을 가진 종들은 포스포릴화되지 않은 것으로 나타났다(제6도). 포스포릴화된 Th9-면역반응성 단백질은 C6 세포에서는 검출되었지만, PNET1 세포에서는 검출되지않았다. 하지만, 이것은 PNET1 세포가 C6 세포보다는 느리게 성장하므로 인한 표지화 작업의 효율도가 낮기 때문이었다. 면역 침전을 위해 데스민에 대한 단일 클론 항체를 사용하면 14 kDa 내지 26 kDa 범위에서 밴드가 검출되지 않았다(제6도). 탄수화물 부위는 Th9 면역 침전된 단백질상에서는 검출되지 않았다 (데이타는 제시 안됨).
사상 단백질의 최고농도는 PNET1 세포의 차융합 배양물에서 성장 곡선 로그 단계시에 측정되었으며, 가장 낮은 농도는 혈청이 고갈된 상태로 밤새 배양된 배양물(성장 억제 배양물)에서 나타났다(제7도). 100% 융합된 배양물은 증식성 배양물과 비교해볼때 좀더 낮은 양의 사상 단백질을 발현시켰다. Huh7 간세포의 암세포(음성 대조군)를 동시에 동일 배양 조건에서 연구했지만 사상 단백질의 양은 전반적으로 낮았다.
놀랍게도, 이러한 다양한 조건하에서 배양된 PNET 세포를 면역 세포 화학적으로 염색한 결과 사상 단백질의 양에는 변화가 없었다. 하지만, M-IRMA에 의해 변화된 사상 단백질의 양은 면역 세포 화학법으로 검출되지 않을 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 혈청이 고갈됨으로써 유발된 세포성 사상 단백질 양의 감소는 세포의 표현형이 변화됐기 때문인 것에 기인하였다. 세포가 100% 융합을 이룬 경우 또는 세포가 혈청 고갈 과정을 밤새도록 받은 경우, 세포체는 크기가 감소했고, 양적인 변화가 크게 나타났을 뿐 아니라 신경 섬유 단백질 G AP-43과 GFAP에 대한 면역반응성 분포도가 또한 크게 변화되었다(제8도). 50%의 융합을 보인 PNET 배양물에서, 세포는 크기가 정확했고 신경 섬유 및 GAP-43 면역반응성의 극성 분포도가 종종 나타난 반면, 100%의 융합 및 혈청 고갈된 PNET 배양물은 신경 섬유 및 GAP-43 두 경우 모두 확산된 핵주위부 세포제의 면역반응성을 나타냈다. 정확한 면역반응성은 신경염에서 신경 섬유와 GAP-43의 분포와 일치할 수 있다. 이와는 대조적으로, 50% 융합성 PNET 배양물은 GFAP 면역반응성이 없는 반면, 100% 융합성 및 혈청 고갈 배양물은 GFAP-양성 세포를 상당량 지녔다. 또한 GFAP 면역반응 세포의 양은 100% 융합성의 혈청 고갈 배양물에서 가장 크게 나타났고, 그 다음에 50%의 융합성의 혈청 고갈된 배양물에서, 세번째는 10%의 태내 송아지의 혈청을 함유하는 배지를 가진 100% 융합성 배양물에서 나타났다. 그러므로, 혈청 고갈 작업을 밤새 받은 PNET 세포에서 측정한 사상 단백질의 양이 감소된 것은 신경교 성상 세포의 표현형에 대해 세포가 차별화됐기 때문인 것에 기인한다. C6 세포와 기타 신경교아종 세포주는 Th9 단일 클론 항체에 대해 강한 면역반응성을 나타냈지만 M-IRMA에 측정된 사상 단백질의 양은 Th7 및 Th10을 함유하는 기타 다른 사상 단백질 항체에 대해 낮은 면역반응성을 나타내는 것에 부분적으로 기인한다(제1A도-제1J도 참조).
실시예 4
인간 cDNA 라이브러리로부터 신경사 단백질의 클로닝
17 내지 18 주된 태아 뇌로부터 제조한 인간 뇌 cDNA 라이브러리(미국, 캘리포니아, 라 졸라에 소재하는 스트라타진), 2 년된 측두엽 신피질 (스트라타진), 알쯔하이머 병을 앓고 있는 환자의 대뇌 피질(미국, 캘리포니아, 샌디에고에 소재하는 비트로겐)을 쥐 PTP cDNA의 뉴클레오티드 235-650에 상응하는 416 bp DNA로부터 생성한 프로브를 사용하여 검색하였다. O18로 명명한 쥐 PTP cDNA를 문헌[참조:Terazono 등,J. Biol. Chem. 263:2111-2114(1988); Watanabe 등,J. Biol.Chem. 265:7432-7439(1990)]에 공개된 서열의 뉴클레오티드 45-104 및
345-404에 상응하는 60량체 합성 DNA 프로브를 사용하여 쥐 췌장 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 각각의 라이브러리로부터 약 2 x 106개의 플라크 또는 콜로니를 표준 기법(Sambrook 등의 상기 문헌 참조)을 이용하는 저-엄증도 하이브리드화로 검색하였다. 추정적인 클론은 플라크/콜로니 정제하였으며, DNA 삽입물은 T7 폴리머라제(USB 시쿼나아제; 미국, 오하이오, 클리블랜드에 소재하는 유나이티드 스테이츠 바이오케미칼 코오포레이션)를 사용하는 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법으로 서열을 결정하였다. 상기 서열을 진뱅크 데이타베이스와 비교하고, 기타 신경사 단백질 cDNA들의 핵산 서열과 함께 정렬시켰다.
1. 인간 태아 뇌 라이브러리로부터 분리한 CNS 신경사 단백질 cDNA
1.35 kilobase(kb)의 1-9a CNS 신경사 단백질의 부분적인 cDNA를 개방형 해독틀에 상응하는 소 단편과 3'비해독 부분과 상응하는 잔사로 분리하였다 (제9A도). 추가 150 뉴클레오티드의 서열은 5'고정 PCR 증폭 생성물로부터 수득하였다. 5'고정 PCR 증폭의 두번째 실행으로 추가의 상류 600 bp 생성물을 수득하였다(제9B도). 1-9a cDNA 서열의 일부분은 인간 PTP cDNA 및 Reg 유전자의 5'단부와 매우 상동성이 있었다(제10A도). 이외에, 초기 5'고정 PCR 생성물은 Reg 유전자의 5'단부와 60%, 및 인간 Reg 유전자의 엑손 2와 63%의 상동성을 나타냈다(제10B도). 게다가, 프로브는 인간 뇌 및 췌장 mRNA와 하이브리드화된 1-9a cDNA의 590 bp 5'단부 단편으로부터 생성하였다(제12A도-제12C도). 또한, 1-9a서열은 그들의 완전 서열의 한 단부에서 중첩이 상당부분 존재한다는 점에서 AD2-2 및 AD3-4 cDNA와 상동성이 있었다(제10B도).
2. 2 년된 측두골 피질 라이브러리로부터 분리한 CNS 신경사 단백질 cDNA
HB4 클론은 2 년된 측두골 피질 라이브러리로부터 분리한 593 bp의 부분적인 cDNA이었다. 이 cDNA는 그의 5'단부에 개방형 해독틀을 포함하며, 뉴클레오티드 275에서 종결되었다. 뉴클레오티드 475에서 시작하는 폴리아데닐화 신호 및 폴리-A 꼬리를 가진 서열 말단이 존재하였다(제11D도). 부분적인 HB4 클론의 유추한 아미노산 서열로 분자량이 10.4 kDa이고, pI 가 12.1인 단백질을 예상할 수 있었다. HB4 cDNA는 인간 PTP cDNA(제11E도), 인간 Reg 유전자의 단편(제11E도)과 총 50%의 핵산 상동성을 나타냈다.
3. 알쯔하이머 병 라이브러리로부터 신경사 단백질 cDNA의 분리
AD 뇌 라이브러리로부터 4개의 관련 cDNA를 O18 쥐 PTP cDNA를 분리하였다. 이들 클론들은 AD 2-2, AD 3-4, AD 4-4 및 AD 16c(소위 AD 10-7)으로 명명하였다 (제16D도 - 제16S도).
AD 2-2 cDNA는 약 1.2 kb이며, 1-9a cDNA, AD 16c, 쥐 PTP cDNA 및 인간 Reg 유전자의 엑손 1과 매우 상동성이 있었다(제17도). AD 2-2 프로브는 AD 3-4 프로브를 사용하여 획득한 것과 유사한 게놈성 서던 블롯 형태를 생성하였다. 제16E도는 AD 뇌 라이브러리로부터 분리한 AD 2-2 cDNA 클론의 완전 뉴클레오티드 서열을 나타내고 있다. 상기 서열에 기초하여 무작위 프라이머가 생성하는 프로브는 인간 뇌및 신경 세포 샘플과 하이브리드를 형성하나, 신경교 세포주나 췌장 RNA와는 하이브리드를 형성하지 않았다.
제16F도, 제16I도, 제16J도 및 제16K도는 AD 뇌 라이브러리로부터 분리한 AD 3-4 cDNA 클론의 부분적인 뉴클레오티드 서열을 나타내고 있다. 무작위 프라이머가 생성하는 AD 3-4 프로브는 2개의 mRNA 전사체 즉, 1.6 kb 및 3.4 kb의 전사체를 산출하였다. 이들 mRNA 종들은 연령별 대조군(N=8)과 비교하여 평균 2 배 높게 AD 뇌에서 과발현되었다.
1.6 kb의 AD 3-4 cDNA 클론은 동시에 분리한 다른 클론(AD 5-3)과 동일하였다(제18A도). AD 3-4 /AD 5-3 cDNA는 1-9a 5'고정 PCR 생성물(제18B도) 뿐아니라 인간 Reg 유전자 및 Gen2a-EP 게놈성 클론(제18B도)과 실질적일 상동성을 나타냈다. AD 3-4 프로브를 사용하는 인간 게놈성 DNA의 서던 블롯 분석은 AD 2-2 프로브를 사용하여 획득한 것과 유사한 형태를 나타냈다.
제16L도 및 제16M도는 동시에 분리한 다른 클론(AD 3-5)과 동일한, 0.8 kb의 부분 cDNA 클론인 AD 4-4의 부분적인 뉴클레오티드 서열을 나타내고 있다. 이 AD 4-4 클론은 AD 2-2 및 1-9a cDNA와 실질적인 상동 서열을 공유한다(제19도). 제16N도는 AD 뇌 라이브러리로부터 분리한 부분적인 cDNA의 완전 뉴클레오티드 서열을 나타내고 있다. 이 cDNA는 뇌 및 뉴런 세포주 mRNA와 하이브리드화되어 단일의 1.4 kB 전사체를 산출하였다.
제16O도는 AD 2-2와 72% 상동성인 0.5 kb의 부분적인 cDNA 클론 AD 16c(또는 AD 10-7로도 부름)의 뉴클레오티드 서열 및 인간 PTP와 Reg 유전자 서열과 정렬함을 나타내고 있다(제20A도 및 제20B도).
제16R도는 AD 뇌 라이브러리로부터 분리한 AD 10-7의 완전 뉴클레오티드 서열을 나타내고 있다. 안티센스 cRNA 프로브 또는 무자위 프라이머가 생성하는 DNA 프로브를 이용하는 노던 블롯의 하이브리드화로 뉴런 세포 내에서 2.6, 1.9, 1.4 및 0.9 kB의 mRNA 전사체를 검출하였다. 뉴런 세포주는 단지 두개의 큰 전사체를 발현하였지만, 성인의 뇌는 매우 낮거나 검출할 수 없는 수준으로 2.6 kB 및 1.9 kB의 두개의 작은 전사체를 주로 발현하였다. AD 10-7 프로브를 이용하여 인간의 간, 난소, 나팔관, 결장, 위, 비장, 직장, 갑상선, 12주된 태반 및 신장으로부터 얻은 RNA의 노던 블롯 분석은 음성이었다.
제16S도는 AD 뇌 라이브러리로부터 분리한 AD 16c cDNA 클론의 완전 뉴클레오티드 서열을 나타내고 있다. 무작위 프라이머가 생성하는 DNA 프로브를 이용하는 노던 블롯의 하이브리드화로 AD 10-7 cDNA를 사용하여 얻은 것과 동일한 결과를 수득하였다. AD 16c 클론은 AD 10-7과 거의 동일한 650 bp 단편을 공유하였다. 이외에, 상승된 수준의 AD 16c mRNA는 노던 블롯 분석으로 노화된 대조용 뇌와 비교하여 AD 뇌에서 검출하였다.
실시예 5
뇌 신경사 단백질 유전자 발현의 분석
신경사 단백질 mRNA 발현은 하기 신경외배엽 종양으로부터 유도된 세포주내에서 조사하였다: PNET1 및 PNEST2로 명명된 중추신경계 초생 신경 외배엽 종양 세포: HGL-16 및 HGL-17 인간 신경교아종세포: A172 신경교종 세포; C6 쥐 신경교종세포; 및 SH-Sy5y 신경교아종세포. 이외에, 알쯔하이머 병 또는 비신경학적 질병(노화된 대조군)을 가진 환자의 뇌 조직 및 배 또는 출생후에 발육하는 쥐 뇌를 신경사 단백질 mRNA 발현에 대해 분석하였다. 인간 및 쥐의 췌장으로부터 추출한 RNA를 양성 대조군으로 사용하였다.
RNA는 5 M 구아니디늄 이소티오시아네이트내에 추출한후, 세슘클로라이드 단계 구배를 통해 원심분리하여 분리하였다(Sambrook 등의 상기 문헌 참조). RNA는 260 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정하므로써 정량하였다. 신경사 단백질 mRNA 전사체의 크기는 노던 블롯 분석으로 평가하고, 발현 수준은 RNA 도트 블롯 하이브리드화로 평가하였다. 노던 블롯 분석은 1%의 아가로즈-포름알데히드 겔을 통해 총 세포성 RNA 15 ㎍을 함유하는 전기영동 샘플을 사용하여 수행하였다. RNA를 나일론 막에 이전시키고, 자외선으로 가교시키고, 1-9A cDNA의 600 bp 단편으로부터 생성되는 프로브로 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 연구를 위해 사용한 단편은 인간 PTP cDNA와 가장 상동적인 부분을 포함하였다. 상기 프로브는 무작위 프라이머 법을 사용하여 [32P] α-dCTP(미국, 일리노이, 알링톤 헤이츠에 소재하는 아메르샴 코오포레이션)로 표지시켰다. 상기 블롯들을 50% 포름아미드, 5 x SSPE, 10 x 덴하르트(100 x 덴하르트는 2% 피콜, 2% 소 혈청 알부민, 2% 폴리비닐피롤리딘임), 0.5% SDS(나트륨 도데실 설페이트), 및 전단 변성된 연어 정자 DNA 100 ㎍/㎖를 포함하는 완충액내에서 2 x 106dpm/ml의 프로브와 42℃에서 밤새 하이브리드화시켰다. 상기 막을 0.25% SDS를 함유하는 SSPE 내에서 표준 방법을 사용하여 세척하였다. 상기 막을 -80℃에서 코닥 XAR 필름에 노출시켜 방사능사진을 생성하였다. 이어서 상기 막에서 프로브를 제거한 후, 18s RNA에 상응하는 합성 30 량체와 재하이브리드화시켜 샘플 로딩을 평가하였다.
1-9a cDNA로부터 제조한 프로브를 사용하는 총 세포성 RNA의 노던 분석은 중추신경계(CNS) 종양 세포주내에서 두개의 우성 전사체를 나타냈다: 한 전사체는 1.6 kb 이고, 나머지 하나는 0.9 kb였다(제12A도). 추가로 SH-Sy5y 신경 아세포종 및 PNET1 세포주내에서 더 큰 4.2 kb의 전사체도 검출되었다. 4.2 kb의 전사체는 기처리한 mRNA를 나타낼 수 있다. 동일 크기의 전사체는 성장한(R.뇌) 및 신생(NB) 쥐에서 검출되었으나, 0.9 kb 전사체는 성숙 뇌에서 더 풍부한 반면 1.6 kb 전사체는 신생 쥐 뇌에서 더 풍부하였다. 긴 췌장(R.Panc.)에서, 0.9 kB 전사체만 검출되었으며, 이는 쥐 PTP mRNA의 크기와 상응하였다[참조: Terazono 등,J. Biol.Chem. 263:2111-2114 (1988); Watanabe 등,J. Biol.Chem. 265:7432-7439 (1990)]. mRNA 전사체는 정상간(N1 간)에서는 검출되지 않았다. 1-9a cDNA의 3'부위로부터 생성된 프로브를 사용하여, 1.6 kb 전사체를 확인하였으나 0.9 kb 전사체는 확인되지 않았다(제12B도). 1-9a cDNA의 5'최단부에 상응하는 30량체 프로브를 사용하여 더 분자량이 큰 mRNA 전사체를 검출하였다(제12C도). 0.9 kb 전사체도 상기 블롯의 더 긴 노출로 입증하였다.
인간 뇌 RNA 의 노던 분석은 우성 1.6 kb 전사체를 나타냈으며, 또한 두개 및 종종 세개의 더 작은 전사체 즉, 1.2 kb, 0.9 kb 및 0.8 kb 전사체를 나타냈다(제13B도). 세포주에서의 상기 발견과 대조적으로, 4.2 kb의 mRNA 전사체는 성인 뇌에서는 거의 관찰되지 않았다. 인간 췌장과의 하이브리드화는 PTP mRNA의 크기에 상응하는 0.8 kb 전사체를 나타냈다. 1-9a 프로브를 사용하여 인간 뇌 및 췌장에서 검출된 전사체는 PTP cDNA 프로브를 사용하여 관찰된 전사체와 그 크기가 동일하였다.
1-9a cDNA의 600 bp 단편(NTP)을 사용하는, 총 RNA 5 ㎍에 대한 도트 블롯 RNA 하이브리드화는 노화된 대조군 뇌와 비교시 AD에서 더 높은 수준의 발현을 입증하였다(제13A도). β-액틴에 상응하는 cDNA와 동일한 막의 재하이브리드화는 각각의 도트내에서 RNA의 유사한 로딩을 입증하였다. AD 뇌 조직내에서 1-9a 관련된 mRNA의 상승된 수준의 관찰은 인간 PTP cDNA에 상응하는 60량체 프로브를 사용하는, 이전에 보고된 자료와 유사하였다[참조: de la Monte 등, J. Clin.Invest 86:1004-1013(1990)]. AD 뇌와 대조군 뇌의 차이점은 제13A도 및 제13B도에 나타나는 바와 같이 1.6 kb, 0.9 kb, 및 0.8 kb 전사체의 농도 차이에 기인하는 것으로 나타났다.
AD 라이브러리로부터 분리한 AD-NTP 3-4 cDNA는 뉴런에서 유래한 신경외배엽 종양 세포주 및 인간 뇌 조직으로부터의 RNA와 하이브리드화하였다. 상기 세포주내에서, 1-9a 프로브를 사용하여 관찰한 바와 같이 1.6 kb 및 0.9 kb 전사체를 검출하였다(제21C도). 그러나, 인간 뇌내에서, ∼4 kb, 1.6 kb 및 0.9 kb 전사체를 검출하였으며, 세개의 전사체 모두에 대한 발현 수준은 노화된 대조군 뇌와 비교시 AD내에서 더 높았다(제21D도).
AD 4-4 cDNA 프로브는 단지 뉴런 세포주내에서 단지 0.9 kb 전사체와 하이브리드화하였다.
실시예 6
신경외배엽 종양 세포주 및 알쯔하이머 병 환자의 뇌로부터의 신경사 단백질 cDNA의 직접 클로닝 및 서역결정
신경사 단백질 cDNA를 PNET1, PNET2, SH-Sy5y 및 A172 세포, 및 알쯔하이머 병 및 노화된 대조군 RNA로부터 3'- 및 5'-RACE 법을 사용하여 직접 클로닝하였다[참조: Frohman 등,Proc. Natl. Sci. USA 85: 8998(1989) ; Ohara 등,Proc. Natl. Sci. USA 86:5673(1989) ; Loh 등,Science 243:217(1989)]. 간략히 설명하면, RNA는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 역전사시켰다. 5'-RACE 반응을 위해, cDNA는 1-9a 서열의 5'-부위에 상응하는 특이 17량체 및 17 dT 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시켰다. 생성되는 PCR 생성물을 또다른 내부의, 그러나 5'-단부와 중첩하는 프라이머 및 1-9a 서열의 3'-부위에 상응하는 특이성 3'-17량체를 사용하여 재증폭시켰다. 3'-RACE 반응을 위해, cDNA는 일차로 말단 데옥시뉴클레오티드 트랜스퍼라아제를 이용하여 dCTP로 꼬리를 단 후, 1-9a 클론의 뉴클레오티드 781-797에 상응하는 특이 17량체 및 dG(17량체)를 사용하여 증폭시켰다. 두 번째의 정착된 PCR 증폭은 3'단부의 뉴클레오티드 766-792에 상응하는 특이성 17량체 및 5'단부에 대한 dGTP(17량체)를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물은 1-9a cDNA 클론의 내부 DNA 단편 및 O18 쥐 PTP cDNA 클론으로부터 생성되는 프로브를 사용하여 서던 블롯 분석하였다. PCR 생성물은 겔 정제하고, 우라실 데옥시트랜스퍼라아제를 사용하여 pAmpl 벡터내로 연결하였다. 서브클로닝된 DNA 삽입물은 T7DNA 폴리머라제를 사용하는 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법으로 서열결정하였다.
CNS 신경사 단백질 전사체는 역전사후 1-9a cDNA 서열의 5'및 3'부위에 상응하는 특이성 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 신경외배엽 종양 세포주 및 AD 인간 뇌내에서 검출하였다. PCR 생성물의 서던 블롯 분석으로 두개의 우성 교차-하이브리드화종 즉, 0.8 kb 및 1.0 kb 종을 확인하였다(제14A도 및 제14B도). 추가로 SH-Sy5y 세포내에서 더 큰 1.8 kb PCR 생성물도 검출하였다. PNET1, PNET2, SH-Sy5y 및 A172 세포내에서, 1-9a 프로브와 하이브리드화된 0.4 kb의 PCR 생성물을 관찰하였다. 알쯔하이머 병 환자의 뇌내에서 더 높은 수준의 신경사 단백질 mRNA와 상응하여 하이브리드화 신호는 노화된 대조군 샘플과 비교시 AD 샘플내에서 더 강했다.
SH-Sy5y 세포로부터 생성된 PCR 생성물을 서브클로닝하고 서열결정하였다. 클로닝된 단편의 서던 분석은 1-9a cDNA와의 강한 하이브리드화 및 O18 cDNA(쥐 PTP)와의 덜 강하나 분명한 하이브리드화를 나타냈다 (제14C도). SH-Sy5y PCR 클론(Sy-NTP)의 핵산 서열은 1-9a cDNA 서열과 동일하였다.
실시예 7
인간 뇌 신경사 단백질을 암호화하는 게놈성 클론의 분리
인간 게놈성 DNA 라이브러리를 2 년된 측두골 피질 라이브러리로부터 분리한 1-9a 인간 뇌 신경사 단백질 cDNA의 600 bp 단편으로 제조한 프로브를 사용하여 검색하였다. 1-9a cDNA 단편은 인간 PTP와 60%의 핵산 서열 상동성을 보유하는 부위를 포함하였다. 콜로니 정제후 추정적인 게놈성 클론을 O18 쥐 PTP cDNA 단편과의교차-하이브리드화에 대해 조사하였다. 1-9a 및 O18 프로브 둘다와 하이브리드화되는EcoRI.PstI 및EcoRI/PstI 제한 단편을 p블루스크립트 II 벡터(미국, 위스콘신, 매디슨에 소재하는 프로메가 인코오포레이티드)내로 서브클로닝한 후, T7 폴리머라제(USB 시쿼나제) 또는 폴리머라제 연쇄 반응 증폭과 벤트 폴리머라제를 사용하는 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법으로 서열 결정하였다.
G2-2PstI, G2-2PstI-EcoRI. G5d-1PstI 및 G5d-1PstI-EcoRI로 명명된 4개의 게놈성 단편을 인간 게놈성 DNA 라이브러리로부터 분리하였다(제22A도 내지 제22D도). 이들 게놈성 단편 모두는 1-9a 및 O18 cDNA 프로브 둘다로 하이브리드화 되었으며, 그들의 크기는 1.5 kb 내지 3 kb였다. 부분적인 핵산 서열 정보는 G2-2PstI와 인간 Reg 유전자 및 인간과 쥐의 PTP cDNA(제23A도); G2-2PstI-EcoRI과 Reg 유전자 및 쥐 PTP cDNA 둘다(제23B도), 또한 AD 2-2, AD 3-4와 1-9a cDNA(데이타 미제시); G5d-1PstI과 Reg 유전자 및 인간 PTP(제23C도); 및 G5d-1PstI-EcoRI과 Reg 유전자, 인간 PTP, 1-9a 및 AD4-4사이의 상동성을 나타냈다.
실시예 8
LacZ 융합 단백질의 시험관내 발현 및 그의 신경사 단백질에 대한 관계성 입증
1-9a cDNA 클론 또는 4개의 게놈성 클론중 하나를 포함하는 박테리아내에서 융합 단백질의 발현은 표준 기법(Sambrook 등, 상기참조)을 이용하여 이소프로필티오-β-D-갈락토시드(IPTG)로 유도하였다. 유도 및 비유도된 배양물로부터의 미정제 박테리아 용균물은 SDS-PAGE를 수행한후, 신경사 단백질에 대한 Th9 단일클론 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석[참조: Sasaki 등,J. Biol. Chem. 268: 1-4(1993)]을 수행하고,125I-표지된 단백질 A를 사용하여 결합된 항체를 검출하였다. 또한, 클로닝된 DNA를 함유하는 박테리아 론(lawn)은 융합 단백질을 발현하도록 IPTG로 유도하고, 레플리카 필터를 Th9 단일클론 항체로, 그 다음에125I 표지된 단백질 A로 직접 프로브 처리하였다.
신경사 단백질 면역반응성은 IPTG-유도된 콜로니에 대한 직접 항체 결합에 의해 박테리아 융합 단백질내에서 입증하였다(제24A도-제24D도). 신경사 단백질 면역반응성은 PTP에 대한 Th9, Th7, Th10 단일클론 항체의 혼합용액[참조: Sasaki 등,J. Biol. Chem. 268: 1-4(1993)] 및125I-표지된 단백질 A을 사용하여 검출하였다.
실시예 9
AD 및 노화된 대조군 뇌내에서 AD16c mRNA의 상대 수준
AD16 cDNA 프로브를 사용하여 노던 블롯 분석을 수행하였다. 블롯들을 재프로브시켜 각 레인에서 RNA의 로딩을 평가하기 위한 18s 리보좀 RNA를 검출하였다. 불포화 방사능사진은 분자 역학 상 분석기를 사용하여 농도 분석을 수행하였다. AD16c 및 18s RNA 하이브리드화 신호의 비는 각각의 경우에 대해 플롯하였으며, 그 결과는 제25A도 및 제25B도에 그래프로 묘사하였다. 표준오차를 보유하는 평균비(AD16c 의 상대수준)는 더 작은 우측 그래프에 도시하였다. 상기 발견들은 6개의 상응하는 연령별 대조군중 1개에 비해 9개의 AD 뇌중 6개에서 AD16c mRNA의상승된 발현 수준을 확인시켜 주었다. 상기 평균 수준의 차이는 통계학적으로 매우 중요했다(P<0.005). AD10-7 프로브를 사용하는 경우에도 유사한 결과를 수득하였다. 이들 결과는 대조군 뇌에 비해 AD 뇌내에서 발현수준의 통계학적으로 중요한 증가가 존재함을 입증하였다.
실시예 10
재조합 AD10-7 융합 단백질의 제조 및 단일클론 항체를 사용하는 이의 검출
3개의 상이한 해독틀(2개의 부정확한 A 및 B, 및 하나의 정확한 C)내에서 AD10-7 cDNA를 pTrcHIS 벡터(미국, 샌디에고에 소재하는 비트로겐)에 연결시켰다. 상기 세개의 플라스미드증 하나를 사용하여 형질전환시킨 박테리아를 IPTG로 유도하고, 박테리아 용균물을 0, 1 및 5 시간후에 단백질 발현에 대해 조사하였다. 상기 단백질을 SDS-PAGE로 분류하고, 발현된 태그 단백질에 대한 단일클론 항체(T7-태그 마우스 단일클론 항체, 노보겐)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 상기 블롯들은 발색원으로서 디아미노벤지딘과 함께 아비딘-비오틴을 사용하는 양고추냉이 퍼옥시다제법으로 전개시켰다(제26도). ∼45 kDa에 상응하는 밴드는 단지 정확한 해독틀(C)(화살표)내에 연결된 AD10-7을 포함하는 플라스미드 DNA를 사용하여 형질전환된 박테리아내에서 검출하였다. 동일 크기의 단백질은 토끼 적혈구 용균물 분석 시스템에서 AD10-7 cDNA의 시험관내 해독에 의해 관찰하였다. 양 시스템에서, 융합 파트너 펩티드는 ∼3 kDa이었으며, 이는 cDNA가 약 ∼42 kDa의 단백질을 암호화함을 나타내는 것이다. ∼42 kDa NPT종은 뉴런세포주 및 인간 뇌 조직의 웨스턴 블롯으로 평이하게 검출하였다.
실시예 11
동일계내 하이브리드화에 의한 AD10-7 mRNA 발현의 뉴런의 국소분포의 입증
센스 및 안티센스 cDNA 프로브는 각각 SP6 또는 T7 DNA-의존성 RNA 폴리머라제를 사용하여 선형화된 AD10-7 플라스미드 DNA로부터 생성하였다. 상기 안티센스 프로브를 이 클론을 위해 상기한 바와 같은 뉴런세포주 mRNA와 하이브리드화시켰다. 한편, cRNA 센스 프로브는 RNA와 하이브리드화되지 않았음을 노던 블롯 분석으로 확인하였다. 디곡시게닌-UTP로 표지한 cDNA 프로브는 초기 AD로부터 인간 뇌 조직 단편과 하이브리드화시켰다. 상기 단편들을 강하게 세척한후 [참조: de la Monte 등,J. Clin.Invest. 86: 1004-1013(1990)], 하이브리드화된 프로브는 디곡시게닌에 대한 퍼옥시다제 또는 알칼린 포스파타제 접합된 단일클론 항체를 사용하여 검출하고, 비색 반응은 표준 방법으로 확인하였다. 명시야 및 암시야 현미경 기술에 의한 단편의 조사는 단지 뉴런내에서 AD10-7만의 하이브리드화를 입증하였다(제27도;(제27A도)내에서 세포체상의 백색 그레인의 조밀한 응집물). 대조하여, 노던 블롯 분석에 의한 발견과 유사하게 센스 AD10-7 cRNA 프로브는 뇌 조직과 하이브리드화되지 않았다(제27B도).
전술한 실시예는 바람직한 구체예를 언급한 것이지만, 이는 본 발명을 제한하지 않는 것으로 이해해야 한다. 본 발명은 여러가지 변형 실시가 가능하며, 상기 변형이 첨부하는 특허 청구의 범위에 의해 정해지는 본 발명의 범위내에 포함됨은 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에서 언급한 모든 문헌 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 명백한 것이다. 본 명세서에서 언급한 모든 문헌 및 특허 출원은 각각의 개별적인 문헌 또는 특허 출원 전체가 참고로 인용되는 것으로 특히 및 개별적으로 지시되는 바와 동일한 정도로 참고로 인용하였다.

Claims (41)

  1. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69257로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 G2-2 Pst1 DNA 분자에 의해 암호화되고 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하는 NTP.
  2. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69258로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 G5d-Pst1 DNA 분자에 의해 암호화되고 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하는 NTP.
  3. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69259로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 1-9a DNA 분자에 의해 암호화되고 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하는 NTP.
  4. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69260으로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 AD3-4 DNA 분자에 의해 암호화되고 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하는 NTP.
  5. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69261로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 HB4 DNA 분자에 의해 암호화되고 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하는 NTP.
  6. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69262 로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 AD10-7 DNA 분자에 의해 암호화되고 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하는 NTP.
  7. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69263으로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 AD2-2 DNA 분자에 의해 암호화되고 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하는 NTP.
  8. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69264로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 G5d-1 Pst1-EcoR1 DNA 분자에 의해 암호화되고 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하는 NTP.
  9. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69265로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 G2-2 Pst1-EcoR1 DNA 분자에 의해 암호화되고 어떠한 천연 불순물도 실질적으로 부재하는 NTP.
  10. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69257로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 G2-2 Pst1 DNA 분자로 구성된 NTP를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  11. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69258로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 G5d-Pst1 DNA 분자로 구성된 NTP를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  12. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69259로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 1-9a DNA 분자로 구성된 NTP를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  13. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69260으로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 AD3-4 DNA 분자로 구성된 NTP를 암호하는 분리된 핵산 분자.
  14. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69261로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 HB4 DNA 분자로 구성된 NTP를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  15. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69262로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 AD10-7 DNA 분자로 구성된 NTP를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  16. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69263으로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 AD2-2 DNA 분자로 구성된 NTP를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  17. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69264로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 G5d-1 Pst1-EcoR1 DNA 분자로 구성된 NTP를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  18. 미국 버지니아주 마나사스 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 69265로 기탁된 E.coli 세포에 존재하는 G2-2 Pst1-EcoR1 DNA 분자로 구성된 NTP를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 NTP가 인간 NTP인 NTP를 암호화하는 유전자 서열로 구성된 핵산 분자.
  20. 제10항 내지 18항 중 어느 하나의 항에 있어서, NTP를 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 플라스미드인 핵산 분자.
  21. 제20항의 플라스미드를 사용하여 형질전환시킨 숙주.
  22. PTP에 비반응성이고 NTP에 반응성인 모노클로날 항체와 반응하며 신경 조조직에 분리된 NTP를 제조하기 위해 제20항의 플라스미드를 사용하는 방법으로서,
    (a) 상기 NTP를 암호화하는 상기 유전자 서열을 포함하는 상기 플라스미드를 숙주 세포내에 도입하여 재조합 숙주 세포를 제조하는 단계;
    (b) 상기 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) PTP에 비반응성이고 NTP에 반응성인 모노클로날 항체와 반응하고 신경 조직에서 분리된 NTP를 상기 재조합 숙주 세포로부터 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 NTP를 암호화하는 상기 유전자 서열이 알츠하이머병을 가진 환자의 뇌 조직에서 획득되는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, NTP를 암호화하는 상기 유전자 서열이 인간 신경 종양 세포주에서 획득되는 것인 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 숙주는 E.coli인 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 NTP를 암호화하는 상기 유전자 서열은 벡터에 의하여함유되는 것인 방법.
  27. 제22항에 있어서, 상기 NTP를 암호화하는 상기 유전자 서열은 유도가능한 프로모터의 조절하에 있는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 프로모터는 람다 P1프로모터인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 프로모터는 tac 프로모터인 방법.
  30. PTP에 비반응성이고 NTP에 반응성인 모노클로날 항체와 반응하고 신경 조직에서 분리되는 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항의 NTP를 암호화하는 핵산 서열에 상보적이고, PTP 핵산 서열에 비상동성이며 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 구성된 군으로부터 선택된 15량체 내지 30량체 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  31. 제30항에 있어서, DNA인 안티센스 올리코뉴클레오티드.
  32. 제30항에 있어서, o-올리고뉴클레오티드인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  33. 제30항에 있어서, S-올리고뉴클레오티드인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  34. PTP에 비반응성이고 NTP에 반응성인 모노클로날 항체와 반응하고 신경 조직에서 분리되는 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항의 NTP를 암호화하는 핵산 서열에 상보적이고, PTP 핵산 서열에 비상동성인 표적 서열로 구성된 리보자임.
  35. 제34항의 리보자임을 암호화하는 DNA 분자.
  36. X는, PTP에 비반응성이고 NTP에 반응성인 모노클로날 항체와 반응하고 신경 조직에서 분리되는 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항의 NTP를 암호화하는 핵산 서열에 상보적이고, PTP 핵산 서열에 비상동성이며, 서열 번호 1 내지 12로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열로 구성된, L은 올리고뉴클레오티드 연결체를 의미하는, 서열 3'X5'∼L-5'X3'을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  37. X는, PTP에 비반응성이고 NTP에 반응성인 모노클로날 항체와 반응하고 신경 조직에서 분리되는 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항의 NTP를 암호화하는 핵산 서열에 상보적이고, PTP 핵산 서열에 비상동성이며, 서열 번호 1 내지 12로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 서열로 구성된, L은 올리고뉴클레오티드 연결체를 의미하는, 서열 5'X3'-L-3'X5'을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  38. (a) PTP에 비반응성이고 NTP에 반응성인 모노클로날 항체와 반응하고 신경 조직에서 분리되는 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항을 NTP를 암호화하는 핵산 서열에 상보적이고, PTP 핵산 서열에 비상동성인 10 내지 15 뉴클레오티드 서열; 및
    (b) N이 퓨린인 3'-NCCA 뉴클레오티드 서열
    로 구성된 리보뉴클레오티드 NTP 외부 가이드 서열.
  39. 제38항에 있어서, DNA인 NTP 외부 가이드 서열.
  40. 제10항 내지 제18항 중 어느 하나의 항의 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
  41. 제40항의 발현 벡터를 포함하는 비리온.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5804560A (en) * 1995-01-06 1998-09-08 Sibia Neurosciences, Inc. Peptide and peptide analog protease inhibitors
WO1997021807A1 (fr) * 1995-12-12 1997-06-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveaux adn, nouveaux polypeptides et nouveaux anticorps
US5936078A (en) * 1995-12-12 1999-08-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. DNA and protein for the diagnosis and treatment of Alzheimer's disease
US7226730B1 (en) 1997-02-26 2007-06-05 The General Hospital Corporation Transgenic animals and cell lines for screening drugs effective for the treatment or prevention of Alzheimer's Disease
KR20000075748A (ko) 1997-02-26 2000-12-26 마빈 씨. 구트리 알츠하이머 병의 치료 또는 예방에 유효한 약물을 선별하기 위한 유전자 변형동물 및 세포계
CA2323889A1 (en) 1997-03-12 1998-09-17 Robert W. Esmond A method for treating or preventing alzheimer's disease
DK1392347T3 (da) 2001-05-16 2005-12-12 Nymox Corp Fremgangsmåde til at forhindre celledöd med anvendelse af segmenter af neurale trådproteiner
EP1541166B1 (en) * 2001-05-16 2007-12-19 Nymox Corporation Preventing cell death using segments of neural thread proteins
US6770797B2 (en) 2001-06-01 2004-08-03 Rhode Island Hospital Non-Transgenic nonhuman model for Alzheimer's Disease using a AD7c-NTP nucleic acid
US7317077B2 (en) 2001-11-16 2008-01-08 Nymox Pharmaceutical Corporation Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
EP1714979A3 (en) * 2001-11-16 2007-04-25 Nymox Corporation Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
DK1994152T3 (da) 2006-02-28 2013-03-11 Nymox Corp Peptider der er effektive i behandlingen af tumorer og andre tilstande der kræver fjernelse eller destruktion af celler
US20080027005A1 (en) * 2006-07-31 2008-01-31 Paul Averback Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells
US11628202B2 (en) 2015-07-24 2023-04-18 Nymox Corporation Methods of reducing the need for surgery in patients suffering from benign prostatic hyperplasia
US10183058B2 (en) 2016-06-17 2019-01-22 Nymox Corporation Method of preventing or reducing the progression of prostate cancer
US10172910B2 (en) 2016-07-28 2019-01-08 Nymox Corporation Method of preventing or reducing the incidence of acute urinary retention
US10532081B2 (en) 2016-09-07 2020-01-14 Nymox Corporation Method of ameliorating or preventing the worsening or the progression of symptoms of BPH
US10335453B2 (en) 2017-03-01 2019-07-02 Nymox Corporation Compositions and methods for improving sexual function
WO2023217890A1 (en) * 2022-05-10 2023-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antisense oligonucleotides targeting cfp-elk1 intergene region

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990006993A1 (en) * 1988-12-21 1990-06-28 The General Hospital Corporation Method of detecting neurological disease or dysfunction

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990006993A1 (en) * 1988-12-21 1990-06-28 The General Hospital Corporation Method of detecting neurological disease or dysfunction

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