ES2312913T3 - Expresion genica de la proteina de la cadena neural y deteccion de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
Expresion genica de la proteina de la cadena neural y deteccion de la enfermedad de alzheimer. Download PDFInfo
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Abstract
Una proteína de la cadena neural (NTP) que carece sustancialmente de cualquier impureza natural y codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 presente en las células E. coli que están depositadas en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassass, Va., con el nº de acceso 69260.
Description
Expresión génica de la proteína de la cadena
neural y detección de la enfermedad de Alzheimer.
La presente invención pertenece al campo de la
ingeniería genética y la biología molecular. Esta invención se
refiere a hospedadores recombinantes que expresan nuevas proteínas
asociadas con la enfermedad de Alzheimer, tumores
neuroectodérmicos, astrocitomas malignos y glioblastomas. Esta
invención se refiere específicamente a los hospedadores y vectores
recombinantes que contienen los genes que codifican las proteínas de
la cadena neural. Esta invención también se refiere a proteínas de
la cadena neural sustancialmente puras, a métodos de
inmunodiagnóstico y de diagnóstico molecular para detectar la
presencia de proteínas de la cadena neural y al uso de secuencias
de ácido nucleico que codifican proteínas de la cadena neural en
terapia génica.
La enfermedad de Alzheimer (AD) es la causa mas
frecuente de demencia en los Estados Unidos, y afecta a más de dos
millones de individuos cada año. Es un trastorno cerebral
degenerativo caracterizado clínicamente por pérdida de memoria,
confusión y deterioro físico gradual. Es la cuarta causa más común
de muerte. Prácticamente se desconoce la etiología de la
enfermedad, pero se ha atribuido a diversos virus, toxinas, metales
pesados así como a defectos genéticos. En el momento actual esta
enfermedad es incurable.
Hasta hace bastante poco, se pensaba que la AD
representaba relativamente pocos de los casos clasificados
generalmente como demencia senil. Otros factores pueden llevar a
esta afección, incluyendo ictus leves repetidos, trastornos de
tiroides, alcoholismo y deficiencias de ciertas vitaminas, siendo
muchos de ellos potencialmente tratables. Entonces, puede
apreciarse que un ensayo de diagnóstico específico para la AD sería
muy útil para el diagnostico clínico y un tratamiento clínico
apropiado de pacientes que presentan síntomas comunes para todas
estas afecciones.
Los cerebros de individuos con AD muestran
acumulaciones patológicas características de un material fibroso
congófilo que se presenta como ovillos neurofibrilares dentro de los
cuerpos de las células neuronales, y placas neuríticas (o seniles).
También pueden encontrarse ovillos neurofibrilares en las paredes de
ciertos vasos sanguíneos cerebrales. Los componentes estructurales
organizados principales de los ovillos neurofibrilares son
filamentos helicoidales emparejados. También aparecen depósitos de
amiloide cualitativamente indistinguibles en cerebros normales
envejecidos, pero en mucho menor número y con una distribución
topográfica restringida.
Recientemente ha habido una actividad de
investigación considerable en relación con la caracterización de
proteínas encontradas en placas neuríticas y ovillos neurofibrilares
asociados con la AD y otras enfermedades neurológicas. Se ha
clonado y secuenciado una de las proteínas amiloides descritas
inicialmente por Glenner et al. (Glenner et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun.
120:1131-1135 (1984): Patente de Estados
Unidos Nº 4.666.829). Se ha determinado que la proteína amiloide A4
encontrada en placas neuríticas y vasos sanguíneos es un componente
de un precursor de 695 aminoácidos; una proteína que, según se ha
postulado, funciona como receptor de la superficie celular
glicosilado (Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82:4245-4249 (1985), Kang et
al., Nature 325: 733-736 (1987).
Además, se ha postulado que la proteína amiloide funciona como una
molécula de adhesión celular y como una proteína de los canales de
iones de calcio (Hooper, J. NIH Res.
4:48-54 (1992); Rensberger, Wayward
Protein Molecule May Be Elusive Killer of Brains Cells, The
Washington Post, 25 de enero de 1993, \NAK1, en A3 (1993)).
El gen que codifica A4 está localizado en el cromosoma 21 (Kang
et al. ibid.; Goldgaber et al., Science
235:877-880 (1987); Tanzi et al.,
Science 235:880-885 (1987); St.
George-Hyslop et al., Science
235:885-889 (1987)) pero aparentemente no
está asociado a la forma familiar de la enfermedad (Van Broekhoven
et al., Nature 329: 153-155
(1987)). Parece haber muy poca, si hay alguna, homología de
secuencias de proteínas entre la proteína amiloide A4 y \beta, su
precursor de mayor peso molecular, y la proteína de la cadena
pancreática (PTP) (Gross et al., J. Clin Invest.
76:2115-2126 (1985)).
Se han descrito otras proteínas que se
consideran asociadas con la enfermedad, incluyendo la ubiquitina,
ALZ-50, las proteínas \tau asociadas con los
microtúbulos y MAP2, y la proteína del neurofilamento (véase, por
ejemplo, Manetto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:4502-4505 (1988): Wolozin et al.,
Science 232:648-651 (1986); Selkoe,
Neurobiol, Aging 7:425-432 (1986);
Perry et al., en: Alterations of the Neuronal Cytoskeleton
in Alzheimer's Disease, Plenum, New York, páginas
137-149 (1987)). Más recientemente, se ha encontrado
un inhibidor de serina proteasa denominado \alpha_{1}
-anti-quimotripsina en depósitos de amiloide
asociados con la AD (Abraham et al., Cell 52:
487-501 (1988)).
Actualmente no se dispone de ningún ensayo de
diagnóstico útil para la AD que se esté poniendo en práctica
clínicamente. Solamente es posible un diagnóstico definitivo post
mórtem, o durante la vida por medio de una biopsia cerebral, para
revelar la presencia de placas características, los ovillos, los
filamentos helicoidales emparejados y otros depósitos
cerebrovasculares que caracterizan el trastorno. Este procedimiento
quirúrgico invasivo es intrínsecamente peligroso y, por lo tanto,
rara vez se utiliza. Como resultado, se estima un diagnóstico
clínico erróneo de AD de aproximadamente 20%-30%.
El prototipo de molécula de proteína de cadena
es la proteína de la cadena pancreática (PTP) que tiene la
propiedad física poco habitual de formar fibrillas insolubles a pH
neutro, pero es muy soluble a pH ácido o alcalino (Gross et
al., supra). La PTP es muy abundante, se sintetiza por
las células acinares pancreáticas y se secreta en el jugo
pancreático en concentraciones superiores a 1 mg/ml (Id.). Se ha
demostrado un aumento de inmunorreactividad de proteínas de cadena
en cerebros con lesiones de AD, usando anticuerpos monoclonales
contra PTP (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86: 419-423 (1989)). Además, se usó un ensayo
inmunorradiométrico de tipo sándwich directo y muy sensible para
demostrar que entre la PTP y la proteína relacionada presente en el
cerebro se compartían al menos tres epítopos antigénicos distintos
(Id.). A pesar de las similitudes, las formas pancreática y
neuronal de la proteína de cadena son casi con toda certeza
distintas, ya que las moléculas de ARNm y las proteínas difieren en
tamaño y muchos de los epítopos antigénicos presentes en la
proteína de la cadena pancreática no se pueden detectar en el tejido
cerebral (de la Monte et al., J. Clin. Invest.
86:1004-1013 (1990); de la Monte et.
al., J. Neurol. Sci. 113:152-164
(1992); de la Monte et. al., Ann. Neurol.
32:733-742 (1992)).
La forma del sistema nervioso central de la
proteína de la cadena, denominada en lo sucesivo "proteína de la
cadena neural" (NTP), se ha identificado en tejido cerebral de
casos con AD y Síndrome de Down (Wands et al., Publicación
de Solicitud de Patente Internacional Nº WO 90/06993). Se ha
encontrado NTP en todos los cerebros con AD estudiados en los que
existen cambios neuropatológicos característicos de la enfermedad
(Id.). La parte de inmunorreactividad soluble extraíble con
solución salina tiene un peso molecular de aproximadamente 17 a 20
kD (Id.).
Las mediciones cuantitativas de la
inmunorreactividad de NTP en diversas regiones de cerebros con AD
revelaron niveles que variaban de 12 a 295 ng/g de tejido (Media =
116 ng/g de tejido) en comparación con 1-11 ng/g de
tejido (Media = 5 ng/g de tejido) en áreas comparables de cerebros
de control (Id.).
La inmunocitoquímica realizada con anticuerpos
monoclonales dirigidos contra la forma pancreática de PTP demostró
que la NTP se localiza dentro de las células, dentro de procesos
finos en el interior del neuropilo o es extracelular tanto en
cerebros con AD como en cerebros con Síndrome de Down (Id.).
Dos tipos de células contienen NTP: las neuronas y los astrocitos
(Id.). Las neuronas afectadas son del tipo piramidal grande que
típicamente contiene los ovillos neurofibrilares bien conocidas en
el cerebro con AD (Id.).
El hecho de que la acumulación de NTP dentro de
las neuronas sea intrínsecamente importante o esté relacionada
integralmente con la evolución de las lesiones de AD se corrobora
por la presencia de patrones idénticos de inmunomarcaje para NTP en
cerebros con Síndrome de Down, pero no en cerebros de control
(Id.). Es importante tener en cuenta que estas mismas
anomalías estructurales de AD aparecen en los cerebros de todos los
individuos de mediana edad con Síndrome de Down, presenten o no
demencia. También hay una mayor incidencia de AD entre los miembros
de la familia de los pacientes con Síndrome de Down. Además, las
diferencias regionales en las densidades de neuronas que contienen
NTP tienen su paralelo en las distribuciones de densidad de los
ovillos neurofibrilares tanto en la AD como en el Síndrome de Down.
Esto proporciona pruebas adicionales de que la NTP es relevante
para la patofisiología de la AD. Aún no se sabe si la NTP se acumula
dentro del pericarion neuronal, como resultado de un metabolismo o
transporte celular aberrante.
Existe la necesidad de un ensayo de diagnóstico
definitivo que pueda realizarse en individuos que se sospecha que
tienen o con riesgo de padecer AD. La presente invención satisface
estas necesidades y proporciona ventajas adicionales.
La manera en la que estos y otros objetos se
consiguen por medio de la presente invención serán evidentes tras
el compendio y la descripción detallada presentada a
continuación.
A menos que se definan de otra manera, varios
elementos usados en la presente memoria tienen el mismo significado
conocido en la técnica a la que pertenece la invención.
Esta invención se refiere a hospedadores
recombinantes que expresan una nueva proteína asociada con la
enfermedad de Alzheimer, tumores neuroectodérmicos, astrocitomas
malignos y glioblastomas. Esta invención se refiere específicamente
a los hospedadores y vectores recombinantes que contienen el gen que
codifica la proteína de la cadena neural (NTP) que tiene un peso
molecular de aproximadamente 42 kDa. En el primer aspecto, la
presente invención se refiere a una proteína de la cadena neural
(NTP) que carece sustancialmente de cualquier impureza natural y
que se codifica por la molécula de ADN AD3-4DH1
presente en las células E. coli depositadas en la Colección
Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection)
Manassass, Va., con el número de acceso 69260. Esta invención
también se refiere a las proteínas de la cadena neural
sustancialmente puras, a métodos de inmunodiagnóstico y de
diagnóstico molecular para detectar la presencia de proteínas de la
cadena neural, y al uso de secuencias de ácido nucleico que
codifican las proteínas de la cadena neural en terapia génica.
En particular, la invención incluye un método
in vitro para detectar la presencia de una NTP codificada por
la molécula de ADN AD3-4DH1, que comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra biológica de un sujeto humano que se sospecha que contiene NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 con al menos una molécula capaz de unirse a dicha NTP; y
- (b)
- detectar la molécula unida a dicha NTP.
La invención además incluye el método anterior,
donde la molécula de unión se selecciona entre el grupo consistente
en:
- (a)
- un anticuerpo que carece sustancialmente de impurezas naturales;
- (b)
- un anticuerpo monoclonal; y
- (c)
- un fragmento de (a) o (b).
La invención también incluye el método anterior,
donde la molécula de detección está marcada de forma detectable y
donde se usa una combinación de dichas moléculas de unión.
La invención también incluye un método in
vitro para detectar la presencia de una secuencia genética que
codifica una NTP codificada por una molécula de ADN
AD3-4DH1 en una muestra biológica usando una sonda
polinucleotídica derivada de una NTP humana recombinante de esta
invención.
La invención también incluye un método para
determinar la presencia de una afección en un sujeto humano,
incluyendo dicha afección, pero sin limitación, el grupo
consistente en la enfermedad de Alzheimer, la presencia de tumores
neuroectodérmicos, la presencia de astrocitomas malignos y la
presencia de gliomas.
La invención también incluye un método para
diagnosticar la presencia de AD en un sujeto humano que se sospecha
que tiene AD, que comprende:
- (a)
- incubar una muestra biológica de dicho sujeto que se sospecha que contiene una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 con una molécula capaz de identificar una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1; y
- (b)
- detectar la molécula que se une en la muestra, donde la detección indica que el sujeto tiene AD.
La invención también incluye un método para
diagnosticar la presencia de tumores neuroectodérmicos en un sujeto
humano que se sospecha que tiene tumores neuroectodérmicos, que
comprende:
- (a)
- incubar una muestra biológica de dicho sujeto que se sospecha que contiene una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 con una molécula capaz de identificar una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1; y
- (b)
- detectar la molécula que se une en la muestra, donde la detección indica que el sujeto tiene tumores neuroectodérmicos.
La invención también incluye un método para
diagnosticar la presencia de un astrocitoma maligno en un sujeto
humano que se sospecha que tiene un astrocitoma maligno, que
comprende:
- (a)
- incubar una muestra biológica de dicho sujeto que se sospecha que contiene una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1, en presencia de una molécula de unión capaz de identificar una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1; y
- (b)
- detectar la molécula que se une en la muestra, donde la detección indica que el sujeto tiene un astrocitoma maligno.
La invención también incluye un método para
diagnosticar la presencia de un glioblastoma en un sujeto humano
que se sospecha que tiene un glioblastoma, que comprende:
- (a)
- incubar una muestra biológica de dicho sujeto que se sospecha que contiene una NTP codificada por AD3-4DH1 en presencia de una molécula de unión capaz de identificar una NTP codificada por AD3-4DH1; y
- (b)
- detectar la molécula que se une en la muestra, donde la detección indica que el sujeto tiene un glioblastoma.
La invención también incluye los métodos
anteriores, donde se extrae una muestra biológica de un sujeto
humano antes de poner en contacto la muestra con la molécula.
La invención también incluye los métodos
anteriores, donde la detección de cualquiera de las moléculas unidas
a la proteína se realiza por medio de formación de imágenes in
situ.
La invención también incluye los métodos
anteriores, donde la detección de cualquiera de las moléculas unidas
a la proteína se realiza por medio de formación de imágenes in
vivo.
La invención también incluye los métodos
anteriores, donde la muestra biológica se hace reaccionar con la
molécula de unión de una manera y en condiciones suficientes para
determinar la presencia y la distribución de la proteína.
La presente invención también se refiere
particularmente a los métodos de diagnóstico indicados
anteriormente, donde el inmunoensayo comprende dos anticuerpos
diferentes unidos a un soporte en fase sólida, junto con un tercer
anticuerpo marcado de forma detectable diferente en solución.
La invención también se refiere a un método para
producir una NTP codificada por AD3-4DH1,
comprendiendo dicho método:
- (a)
- cultivar un hospedador recombinante que comprende un gen humano que codifica dicha NTP codificada por AD3-4DH1; y
- (b)
- aislar dicha NTP de dicho hospedador.
Además, la invención se refiere a una NTP
sustancialmente pura codificada por AD3-4DH1
obtenida por medio de dicho proceso.
La invención también se refiere a ribozimas que
comprenden una secuencia diana que es complementaria a la secuencia
de una NTP codificada por AD3-4DH1 y no homóloga a
secuencias de ácido nucleico de PTP, así como a composiciones
farmacéuticas que comprenden dichas ribozimas y un vehículo
farmacéutica mente aceptable.
La invención también se refiere a un método para
conseguir la administración farmacéutica de NTP codificada por
AD3-4DH1 en el cerebro a través de vehículos o
vectores de expresión aceptables.
La invención también se refiere a
oligodesoxinucleótidos que forman regiones de triple cadena con el
gen de la NTP codificada por AD3-4DH1 (secuencias
de ácidos nucleicos) y que no son homólogos a secuencias de ácido
nucleico de PTP, así como a composiciones farmacéuticas que
comprenden dichos oligodesoxinucleótidos y un vehículo farmacéutica
mente aceptable.
La invención también se refiere a métodos para
el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Alzheimer esporádica
y familiar.
Las Figuras 1A-1J muestran
inmunorreactividad de la proteína de la cadena neural en tumores
procedentes del SNC.
La Figura 2 representa un gráfico que muestra
los niveles de proteína de la cadena neural en células de carcinoma
hepatocelular PNET1, PNET2, A172, C6 y Huh7 medidos por un ensayo
inmunorradiométrico basado en anticuerpos monoclonales de tipo
sándwich directo (M-IRMA).
La Figura 3 muestra el tamaño molecular de
proteínas de la cadena neural en células SH-Sy5y,
A172 y C6 demostrado por inmunoprecipitación y análisis de
transferencia de Western usando el anticuerpo monoclonal Th9.
La Figura 4 muestra los tamaños moleculares de
proteínas de la cadena neural en células PNET1 (a) y en células de
glioblastoma (b) demostrados por marcaje metabólico de pulso y
persecución con ^{35}S-metionina, e
inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal Th9 (Figura 4A).
Los pesos moleculares son 8, 14, 17, 21, 26 y 42 kDa (flechas).
Las Figuras 5A-5E representan
una serie de cinco gráficos que muestran las proteínas de la cadena
neural de 21 kDa y 17 kDa en células SH-Sy5y,
PNET1, A172 y C6 y su ausencia en células Huh7 por
SDS-PAGE/M-IRMA.
La Figura 6 representa un gel que muestra que la
proteína de la cadena neural de 21 kDa en células de gioblastoma C6
está fosforilada.
La Figura 7 representa un gráfico de barras que
muestra la expresión de la proteína de la cadena neural alterada en
células PNET1 en fase de crecimiento.
Las Figuras 8A-8F muestran el
fenotipo alterado de células PNET1 con cese del crecimiento celular
y privación de suero durante una noche.
La Figura 9 muestra la secuencia de ADNc parcial
de 1-9a y la Figura 9A muestra una secuencia parcial
del segundo producto de PCR de anclaje 5' correspondiente a la
región 5' del ADNc de 1-9a (secuencia WP5').
La Figura 10 muestra el alineamiento de
secuencias parciales entre 1-9a y la PTP humana y el
gen Reg (la secuencia de ácido nucleico correspondiente al clon
genómico de la PTP humana).
La Figura 10A muestra el alineamiento entre
1-9a y el Exón 2 del gen Reg humano, y entre el
primer producto de PCR de anclaje 5' de 1-9a
(WP03-417) y el Exón 2 y Reg.
La Figura 10B muestra el alineamiento entre
1-9a y su segundo producto de PCR de anclaje 5'
(WP5') y los ADNc de AD 3-4 y AD
2-2.
La Figura 11A muestra las secuencias de ácido
nucleico y de aminoácidos deducida parciales del ADNc de HB4. Las
Figuras 11B y 11C muestran un gráfico de ventana de hidrofilia de
proteína. Tamaño de ventana de hidrofilia = 7; escala =
Kyte-Doolittle.
La Figura 11D muestra el alineamiento entre HB4
y la PTP humana.
La Figura 11E muestra el alineamiento entre HB4
y el gen Reg humano.
Las Figuras 12A-12C muestran la
expresión de moléculas de ARNm que corresponden a la secuencia de
ADNc de la proteína de la cadena neural del SNC
1-9a en líneas celulares de tumor neuroectodérmico y
en páncreas de rata.
Las Figuras 13A y 13B muestran transcritos de
ARNm que corresponden a la secuencia de ADNc de la proteína de la
cadena neural del SNC 1-9a en cerebro humano. Esta
figura también demuestra los mayores niveles de ARNm relacionados
con proteínas de la cadena neural del SNC 1-9a en
cerebros con AD en comparación con controles de edad similar
(Figura 13A). La Figura 13B muestra cuatro transcritos diferentes
con mayor abundancia de los ARNm de menor tamaño molecular en caso
de AD en comparación con los controles de edad similar.
Las Figuras 14A-14C muestran un
análisis de transferencia de Southern 1-9a de los
ADNc derivados de RT/PCR en líneas de células neuroectodérmicas.
Amplificación por PRC de A y B de secuencias de ARNm de
1-9a en líneas de células neuroectodérmicas, y
usando ARNm de cerebro de rata recién nacida (NB), cerebro con AD y
cerebro de control de edad similar. La Figura 14A es una exposición
mas prolongada de la Figura 14B. La Figura 14C muestra hibridación
de la misma mancha de transferencia usando la sonda de PTP de rata
O18.
Las Figuras 15A y 15B
(SE-RT/PCR) muestran hibridación de las sondas
1-9a y O18 con varios clones aislados a partir de
células SH-Sy5y por transcripción inversa de ARNm y
amplificación con cebadores que corresponden a la secuencia
conocida del ADNc parcial de 1-9a.
Las Figuras 16A, 16D y 16E muestran las
secuencias de ácido nucleico parciales de los ADNc de AD
2-2 aislados a partir de la biblioteca de cerebro
con AD. Las Figuras 16B y 16C muestran un gráfico de ventana de
hidrofilia de AD2-2 T7. Tamaño de ventana de
hidrofilia = 7; escala = Kyte-Doolittle.
Las Figuras 16F, 16I, 16J y 16K muestran las
secuencias de ácido nucleico parciales de los ADNc de AD
3-4 aislados a partir de la biblioteca de cerebro
con AD. Las Figuras 16G y 16 H muestran un gráfico de ventana de
hidrofilia de AD 3-4. Tamaño de ventana de
hidrofilia = 7; escala = Kyte-Doolittle.
Las Figuras 16L, 16M y 16N muestran las
secuencias de ácido nucleico parciales de los ADNc de AD
4-4 aislados a partir de la biblioteca de cerebro
con AD.
La Figura 16O muestra las secuencias de ácido
nucleico parciales de los ADNc de AD 16c (también denominados AD
10-7) aislados a partir de la biblioteca de cerebro
con AD. Las Figuras 16P y 16Q muestran un gráfico de ventana de
hidrofilia de AD 16c-T7. Tamaño de ventana de
hidrofilia = 7; escala = Kyte-Doolittle.
La Figura 16R muestra la secuencia de
nucleótidos completa del clon de ADNc de AD10-7 que
se aisló a partir de una biblioteca AD.
La Figura 16S muestra la secuencia de
nucleótidos completa del clon de ADNc de AD16c que se aisló a partir
de una biblioteca AD.
La Figura 17 muestra el alineamiento de
secuencias parciales entre AD 2-2 y el gen Reg
humano.
La Figura 17A muestra el alineamiento de
secuencias parciales entre AD 2-2 y el Exón 1 de Reg
y la PTP de rata.
La Figura 17B muestra el alineamiento de
secuencias parciales entre AD 2-2 y
1-9a.
La Figura 17C muestra el alineamiento de
secuencias parciales entre AD 2-2 y AD 16c.
La Figura 18 muestra el alineamiento de
secuencias parciales entre AD 3-4 (también
denominado AD 5-3) y el gen Reg.
La Figura 18A muestra el alineamiento de
secuencias parciales entre AD 3-4 y los productos de
PCR de anclaje 5' del ARNm de 1-9a; denominados
WPO3-5 y 18-4.
La Figura 18B muestra el alineamiento de
secuencias parciales entre AD 3-4 y el clon genómico
EcoRI/PstI de G2a-a.
La Figura 19 muestra el alineamiento de
secuencias parciales entre AD 4-4 y AD
2-2 y 1-9a (también denominado
SE-4 correspondiente al clon de PCR que es idéntico
a 1-9a).
La Figura 20 muestra el alineamiento de
secuencias parciales entre AD 16c y el gen Reg.
La Figura 20A muestra el alineamiento de
secuencias parciales entre AD 16c y la PTP humana.
La Figura 20B muestra el alineamiento de
secuencias parciales entre AD 16c y AD 2-2.
Las Figuras 21A-21D muestran un
análisis de transferencia de Southern genómico usando AD
3-4 como sonda, la Figura 21B muestra un patrón
similar de hibridación en una transferencia de Southern genómica
usando AD 2-2 como sonda. Las Figuras
21A-21D muestran un análisis de transferencia de
Northern de líneas celulares de tumor neuroectodérmico usando AD
3-4 como sonda. Las cuatro líneas celulares que
presentan transcritos de AD 3-4 son de fenotipo
neuronal; el ARNm de la célula de glioma C6 no hibrida con la sonda
de AD 3-4. La Figura 21D muestra un análisis de
Northern de tejido de lóbulo temporal de cerebro humano con AD y
cerebro de control de edad similar usando la sonda de AD
3-4, y muestra una sobreexpresión del gen
correspondiente en caso de AD (calles marcadas como A) en
comparación con los cerebros de control de edad similar (calles
marcadas
como C).
como C).
Las Figuras 22, 22A, 22B, 22C, 22D, 22E, 22F,
22G y 22H muestran secuencias parciales de cuatro clones genómicos
(aislados usando tanto ADNc de 1-9a como ADNc de
O-18 de PTP de rata como sondas).
Las Figuras 23 y 23A muestran el alineamiento de
la secuencia parcial PstI de G2a-2 con el gen
Reg.
La Figura 23B muestra el alineamiento de la
secuencia PstI-EcoRI de G2a-2 y el gen
Reg y la PTP de rata.
Las Figuras 23C y 23D muestran el alineamiento
de la secuencia PstI de G5d-1 y el gen
Reg.
Las Figuras 24A-24D muestran la
expresión de la proteína de la cadena neural por el ADNc de
1-9a (Figura 24A) y el clon genómico PstI de
G2a-2 (Figura 24B). Las Figuras 24C y 24D muestran
la expresión negativa por el clon genómico EcoRI/PstI
de G5d-1 y pBluescript que carece de un inserto
clonado, respectivamente.
Las Figuras 25A y 25B representan un análisis de
transferencia de Northern del ARNm de AD16c en cerebros con AD y
cerebros de control de edad similar. Los datos muestran niveles
elevados de expresión de ARNm de AD16c en 6 de 9 cerebros con AD en
comparación con 1 de 6 cerebros de control de edad similar.
La Figura 26 representa un análisis de
transferencia de Western de proteínas de fusión
AD10-7 usando anticuerpos monoclonales contra la
proteína marcadora expresada (anticuerpos monoclonales de ratón
T7-marcador).
Las Figuras 27A y 27B representan análisis
microscópicos de campo brillante y de campo oscuro de la hibridación
in situ de sondas de ARNc con sentido y antisentido para
secciones de tejido cerebral humano con AD en sus primeras
fases.
En la descripción que se proporciona a
continuación, se utilizan ampliamente varios términos usados en la
tecnología de ADN recombinante. Para proporcionar una comprensión
clara y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones,
incluyendo el alcance que se dará a dichos términos, se proporcionan
las siguientes definiciones.
Vector de clonación. Un ADN plasmídico o
de fago u otra secuencia de ADN que es capaz de replicarse de forma
autónoma en una célula hospedadora y que se caracteriza por uno o un
pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasas de
restricción en los que dichas secuencias de ADN pueden cortarse de
una forma determinable sin perder la función biológica esencial del
vector, y en los que puede insertarse un fragmento de ADN para
llevar a cabo su replicación y clonación. El vector de clonación
puede contener además un marcador adecuado para uso en la
identificación de células transformadas con el vector de clonación.
Los marcadores, por ejemplo, proporcionan resistencia a la
tetraciclina o resistencia a la ampicilina.
Vector de expresión. Un vector similar a
un vector de clonación pero que puede aumentar la expresión de un
gen que se ha clonado en su interior, después de la transformación
de un hospedador. El gen clonado normalmente se coloca bajo el
control (es decir, unido de forma funcional) de ciertas secuencias
de control tales como secuencias promotoras. Las secuencias
promotoras pueden ser constitutivas o inducibles.
Sustancialmente pura. Como se usa en la
presente memoria, significa que la proteína purificada deseada
carece esencialmente de componentes celulares contaminantes,
estando asociados dichos componentes con la proteína deseada de
forma natural, como se demuestra por una sola banda después de una
electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil
sulfato sódico. Los componentes contaminantes celulares pueden
incluir, pero sin limitación, impurezas proteicas, de carbohidratos
o lipídicas.
La expresión "sustancialmente pura" se
utiliza además para describir una molécula que es homogénea por una
o más características de pureza u homogeneidad usadas por los
especialistas en la técnica. Por ejemplo, una NTP sustancialmente
pura mostrará características constantes y reproducibles dentro de
las desviaciones experimentales convencionales para parámetros
tales como los siguientes: peso molecular, migración cromatográfica,
composición de aminoácidos, secuencia de aminoácidos, extremo N
bloqueado o no bloqueado, perfil de elución de HPLC, actividad
biológica y otros parámetros similares. Sin embargo, la expresión no
pretende excluir mezclas artificiales o sintéticas del factor con
otros compuestos. Además, la expresión no pretende excluir tampoco
proteínas de fusión de NTP aisladas a partir de un hospedador
recombinante.
Hospedador recombinante. De acuerdo con
la invención, un hospedador recombinante puede ser cualquier célula
procariota o eucariota que contiene los genes clonados deseados en
un vector de expresión o vector de clonación. Esta expresión
también pretende incluir las células procariotas o eucariotas que se
han modificado por ingeniería genética para contener el gen o los
genes deseados en el cromosoma o genoma de ese organismo.
Vector recombinante. Cualquier vector de
clonación o vector de expresión que contenga el gen o los genes
clonados deseados.
Hospedador. Cualquier célula procariota o
eucariota que sea el receptor de un vector de expresión o vector de
clonación replicable. Un "hospedador", como se usa este término
en la presente memoria, también incluye células procariotas o
eucariotas que pueden modificarse por ingeniería genética mediante
técnicas bien conocidas para contener el gen o los genes deseados
en su cromosoma o genoma. Como ejemplo de estos hospedadores véase
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratoty
Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, New York (1989).
Promotor. Una secuencia de ADN descrita
generalmente como la región 5' de un gen, localizada próxima al
codón de inicio. La transcripción de un gen o genes adyacentes se
inicia en la región promotora. Si un promotor es un promotor
inducible, la velocidad de transcripción aumenta en respuesta a un
agente de inducción. Por el contrario, la velocidad de
transcripción no se regula por un agente de inducción si el promotor
es un promotor constitutivo.
Gen. Una secuencia de ADN que contiene la
información necesaria para expresar un polipéptido o proteína.
Gen estructural. Una secuencia de ADN que
se transcribe en un ARN mensajero (ARNm) que después se traduce en
una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido
específico.
Gen de ARN antisentido/ARN antisentido.
En eucariotas, el ARNm se transcribe mediante la ARN polimerasa II.
Sin embargo, también se sabe que se puede construir un gen que
contenga una plantilla de la ARN polimerasa II donde se transcribe
una secuencia de ARN que tiene una secuencia complementaria a la de
un ARNm específico, pero normalmente no se traduce. Dicha
construcción génica se denomina en la presente memoria "gen de ARN
antisentido" y dicho transcrito de ARN se denomina "ARN
antisentido". Los ARN antisentido normalmente no se pueden
traducir debido a la presencia de codones de terminación de la
traducción en la secuencia de ARN antisentido.
Oligonucleótido antisentido. Una molécula
de ADN o ARN que contiene una secuencia de nucleótidos
complementaria a la de un ARNm específico. Un oligonucleótido
antisentido se une a la secuencia complementaria de un ARNm
específico e inhibe la traducción del ARNm.
Terapia antisentido. Un método de
tratamiento donde se administran oligonucleótidos antisentido a un
paciente para inhibir la expresión de la proteína
correspondiente.
ADN complementario (ADNc). Un gen de
"ADN complementario" o "ADNc" incluye genes recombinantes
sintetizados mediante transcripción inversa de ARNm y de los que se
han retirado las secuencias intermedias (intrones).
Expresión. Expresión es el proceso por
medio del cual se produce un polipéptido a partir de un gen
estructural. El proceso implica la transcripción del gen en ARNm y
la traducción de dicho ARNm en uno o más polipéptidos.
Homólogo/no homólogo. Dos moléculas de
ácido nucleico se consideran "homólogas" si sus secuencias de
nucleótidos comparten una similitud mayor de 50%, determinada por
algoritmos de codificación HASH (Wilber, W.J. y Lipman, D.J.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 80:726-730 (1983)).
Dos moléculas de ácido nucleico se consideran "no homólogas"
si sus secuencias de nucleótidos comparten una similitud menor de
50%.
Ribozima. Una ribozima es una molécula de
ARN que contiene un centro catalítico. El término incluye enzimas
de ARN, ARN de auto-corte y empalme, y ARN de
autoescisión.
Terapia con ribozimas. Un método de
tratamiento en el que se administra una ribozima a un paciente para
inhibir la traducción del ARNm diana.
Fragmento. Un "fragmento" de una
molécula tal como NTP pretende hacer referencia a cualquier subserie
de polipéptidos de dicha molécula.
Derivado funcional. La expresión
"derivados funcionales" pretende incluir "variantes",
"análogos" o "derivados químicos" de la molécula. Una
"variante" de una molécula tal como NTP pretende hacer
referencia a una molécula natural sustancialmente similar a la
molécula entera, o a un fragmento de la misma. Un "análogo" de
una molécula tal como NTP pretende hacer referencia a una molécula
no natural sustancialmente similar a la molécula entera o a un
fragmento de la misma.
Se dice que una molécula es "sustancialmente
similar" a otra molécula si la secuencia de aminoácidos de las
dos moléculas es sustancialmente igual y si las dos moléculas poseen
una actividad biológica similar. De esta manera, siempre que dos
moléculas posean una actividad similar, se consideran variantes como
se usa dicha expresión en la presente memoria aunque una de las
moléculas contenga restos aminoacídicos adicionales no encontrados
en la otra, o aunque la secuencia de restos aminoacídicos no sea
idéntica.
Como se usa en la presente memoria, se dice que
una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando
contiene restos químicos adicionales que normalmente no forman parte
de la molécula. Estos restos pueden mejorar la solubilidad,
absorción, vida media biológica, etc. de la molécula. Como
alternativa, los restos pueden reducir la toxicidad de la molécula,
eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la
molécula etc. En Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)
se describen ejemplos de restos capaces de mediar dichos efectos y
serán evidentes para los especialistas habituales en la técnica.
NTP. El término "NTP" se refiere a
una proteína de la cadena neural codificada por la molécula de ADN
AD3-4DH1 descrita en la presente memoria.
Inmunorreacción en Cadena de la
Polimerasa. Un método para la detección de antígenos usando
conjugados específicos de anticuerpo-ADN. De
acuerdo con este método, se usa una molécula enlazadora con una
afinidad de unión biespecífica por ADN y anticuerpos para unir una
molécula de ADN específicamente a un complejo de
antígeno-anticuerpo. Como resultado, se forma un
conjugado de antígeno-anticuerpo-ADN
específico. El ADN unido puede amplificarse por la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleotídicos
apropiados. La presencia de productos de PCR específicos demuestra
que las moléculas de ADN se unen específicamente a complejos de
antígeno-anticuerpo, indicando de esta manera la
presencia del antígeno. (Sano et al., Science
258: 120-122 (1992)).
Por ejemplo, Sano et al., supra,
construyeron una quimera de estreptavidina-proteína
A que posee una afinidad de unión específica por la biotina y la
inmunoglobulina G. Esta quimera (es decir, la "molécula
enlazadora") se usó para unir un ADN biotinilado específicamente
a complejos de antígeno-anticuerpo monoclonal que se
habían inmovilizado en pocillos de placas de microtitulación.
Posteriormente se amplificó mediante PCR un segmento del ADN
unido.
Esta invención se refiere a una proteína de la
cadena neural (NTP) codificada por una molécula de ADN
AD3-4DH1, a secuencias genéticas que codifican el
ARNm de NTP o el ARNm antisentido, a vectores de expresión que
contienen las secuencias genéticas, a hospedadores recombinantes
transformados por dichos vectores y al ARN para la NTP codificada
por la molécula de ADN AD3-4DH1 y el ARN antisentido
producido por dicha expresión de hospedadores recombinantes
transformados. Esta invención también se refiere a ribozimas de NTP
y a moléculas de ADN recombinantes que codifican ribozimas para la
NTP codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 y
oligonucleótidos antisentido para la NTP codificada por la molécula
de ADN AD3-4DH1. Esta invención también se refiere a
anticuerpos dirigidos contra una NTP, así como al uso de
anticuerpos de NTP codificada por una molécula de ADN
AD3-4DH1 y secuencias de ácidos nucleico de la NTP
codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 para la
detección de la presencia de una NTP codificada por una molécula de
ADN AD3-4DH1 en muestras biológicas. La invención
también se refiere al uso de secuencias codificantes de la NTP
codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 en
terapia génica.
Las secuencias de ADN que codifican una NTP
proceden de diversas fuentes. Estas fuentes incluyen ADN genómico,
ADNc, ADN sintético y combinaciones de los mismos.
El ADN genómico de una NTP humana puede
extraerse y purificarse a partir de cualquier célula o tejido
humano, por medios bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véase
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989). El ADN genómico de la NTP de la invención puede incluir o no
intrones naturales. Además, dicho ADN genómico puede obtenerse en
asociación con la región promotora 5' de las secuencias del gen de
NTP y/o con la región de terminación de la traducción 3'. Además,
dicho ADN genómico puede obtenerse en asociación con secuencias de
ADN que codifican la región 5' no traducida del ARNm de la NTP y/o
con las secuencias genéticas que codifican la región 3' no
traducida. En la medida en la que una célula hospedadora puede
reconocer las señales reguladoras de la transcripción y/o la
traducción asociadas con la expresión del ARNm y la proteína,
pueden retenerse las regiones 5' y/o 3' no transcritas del gen
nativo, y/o las regiones 5' y/o 3' no traducidas del ARNm, y
emplearse para la regulación de la transcripción y la
traducción.
traducción.
Como alternativa, un ARNm de NTP puede aislarse
a partir de cualquier célula que exprese una NTP y usarse para
producir ADNc por medios bien conocidos en la técnica (por ejemplo,
véase Sambrook et al., supra). Preferiblemente, la
preparación de ARNm usada estará enriquecida en ARNm que codifica
una NTP de forma natural, por aislamiento a partir de células que
producen grandes cantidades de una NTP, o in vitro, por
técnicas usadas comúnmente para enriquecer preparaciones de ARNm
con secuencias específicas, tales como centrifugación en gradiente
de sacarosa, o de ambas maneras. Un ARNm de NTP puede obtenerse a
partir de tejido neuronal de mamífero o a partir de líneas
celulares procedentes de dicho tejido. Preferiblemente, se
construyen bibliotecas de ADNc humanas a partir de cerebro fetal de
17-18 semanas, a partir de neocórtex de lóbulo
temporal de dos años de edad, a partir del córtex cerebral de
cerebro con AD en fase terminal o a partir de líneas celulares
procedentes de tejido neuronal humano. Estas líneas celulares
pueden incluir, pero sin limitación, células de tumores
neuroectodérmicos primitivos del sistema nervioso central (tales
como PNET1 o PNET2, como se describe en la presente memoria),
células de neuroblastoma (tales como SH-Sy5y, como
se describe en la presente memoria) ó células de glioma humano
(tales como A172; ATCC CRL 1620). Como alternativa, puede prepararse
una biblioteca de ADNc de rata a partir de ARNm aislado de células
de glioma de rata, por ejemplo, células de glioma de rata C6 (ATCC
CCL107).
Para la clonación en un vector, se rompen
aleatoriamente o se escinden enzimáticamente preparaciones de ADN
adecuadas (genómicas o de ADNc) respectivamente y se unen a vectores
apropiados para formar una biblioteca de genes recombinantes
(genómica o de ADNc). Una secuencia de ADN que codifica una NTP
puede insertarse en un vector de acuerdo con técnicas
convencionales, incluyendo la obtención de extremos romos o extremos
escalonados para ligamiento, digestión con enzimas de restricción
para proporcionar terminaciones apropiadas, relleno de extremos
cohesivos cuando sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina
para evitar una unión indeseable y ligamiento con ligasas
apropiadas. Se describen técnicas para estas manipulaciones por
Sambrook et al., supra y son bien conocidas en la
técnica.
Pueden explorarse bibliotecas de clones que
contienen NTP y los clones de NTP pueden identificarse por cualquier
medio que seleccione específicamente ADN de NTP tal como, por
ejemplo: 1) por hibridación con una o más sondas de ácido nucleico
apropiadas que contengan una secuencia específica para el ADN de
esta proteína; o 2) por análisis de traducción seleccionado por
hibridación en el que el ARNm nativo hibrida con el clon en
cuestión, se traduce in vitro, y los productos de traducción
se caracterizan adicionalmente; o 3) si las propias secuencias de
ADN clonadas pueden expresar ARNm, por inmunoprecipitación de un
producto de NTP traducido producido por el hospedador que contiene
el clon.
Pueden diseñarse sondas oligonucleotídicas
específicas para una NTP que pueden usarse para identificar clones
para esta proteína a partir del conocimiento de la secuencia de
aminoácidos de la NTP correspondiente, o regiones homólogas de la
PTP. Como alternativa, pueden diseñarse sondas oligonucleotídicas si
se conoce la secuencia de nucleótidos de la PTP (de la Monde et
al., J. Clin Invest. 86:1004-1013
(1990)).
El oligonucleótido o la serie de
oligonucleótidos adecuada capaz de codificar un fragmento del gen de
NTP (o uno que sea complementario a dicho oligonucleótido, o serie
de oligonucleótidos) puede sintetizarse por medios bien conocidos
en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook et al.,
supra). Sambrook et al., supra describen
técnicas de hibridación de ácidos nucleicos y de identificación de
clones. Después se analizan los miembros de la biblioteca de genes
descrita anteriormente que se consideran capaces de realizar dicha
hibridación para determinar el grado y la naturaleza de las
secuencias codificantes de NTP que contienen.
Para facilitar la detección de la secuencia
codificante de NTP deseada, la sonda de ADN descrita anteriormente
se marca con un grupo detectable. Dicho grupo detectable puede ser
cualquier material que tenga una propiedad física o química
detectable. Estos materiales se han desarrollado bien en el campo de
la hibridación de los ácidos nucleicos y, en general, puede
aplicarse a la presente invención la mayoría de los marcadores
útiles en dichos métodos. Son particularmente útiles los marcadores
radiactivos incluyendo ^{32}P, ^{3}H, ^{14}C, ^{125}I o
similares. Puede emplearse cualquier marcador radiactivo que
proporcione una señal adecuada y que tenga una vida media
suficiente. La sonda de ADN puede marcarse, por ejemplo, por
traslado de mellas, por síntesis de reemplazo con ADN polimerasa de
T4, o por cebado aleatorio, entre otros métodos bien conocidos en
la técnica (véase Sambrook et al.,
supra).
supra).
Como alternativa, las sondas de ADN pueden
marcarse con marcadores no radiactivos tales como biotina, una
enzima o un grupo fluorescente.
En un método alternativo para clonar secuencias
de ADN de NTP, se obtienen ADNc de NTP por clonación directa de
ADNc de líneas celulares y tejido cerebral usando los métodos 3' y
5'-RACE, como se describe en la presente memoria.
Preferiblemente, se usa como fuente de ARNm una línea celular de
tumor neuroectodérmico humano o tejido de cerebro con AD.
Por lo tanto, los métodos descritos
anteriormente pueden identificar secuencias de ADN que codifican una
NTP o fragmentos de la misma. Para caracterizar adicionalmente
dichas secuencias de ADN y para producir la proteína recombinante,
es deseable expresar las proteínas codificadas por la secuencia de
ADN.
Para expresar una NTP, se necesitan señales de
transcripción y traducción reconocibles por un hospedador apropiado.
Las secuencias de ADN de NTP clonadas obtenidas por los métodos
descritos anteriormente y preferiblemente en forma bicatenaria,
pueden "unirse de forma funcional" a secuencias que controlan
la expresión transcripcional en un vector de expresión e
introducirse en una célula hospedadora, procariota o eucariota, para
producir NTP recombinante. Dependiendo de la cadena de la secuencia
codificante de NTP que se una de forma funcional a las secuencias
que controlan la expresión transcripcional, también es posible
expresar un ARN antisentido de NTP.
La expresión de NTP en diferentes hospedadores
puede dar como resultado diferentes modificaciones
post-traduccionales que pueden alterar las
propiedades de la NTP. Preferiblemente, la presente invención
incluye la expresión de una NTP en células eucariotas y,
especialmente, en células de mamíferos, insectos y levaduras. Son
hospedadores eucariotas especialmente preferidos las células de
mamífero. Las células de mamífero proporcionan modificaciones
post-traduccionales a la NTP recombinante que
incluyen el plegamiento y/o fosforilación. Más preferiblemente, las
células hospedadoras de mamífero incluyen células de tumores
neuroectodérmicos primitivos del SNC humano, células de
neuroblastoma humano, células de glioma humano o células de glioma
de rata. Las células de tumores neuroectodérmicos primitivos
especialmente preferidas incluyen PNET1 y PNET2, las células de
gioblastoma humano especialmente preferidas incluyen Hg16 y Hg 17,
las células de glioma humano especialmente preferidas incluyen A172
y las células de glioma de rata especialmente preferidas incluyen C6
(véase el Ejemplo 1).
Como alternativa, una NTP puede expresarse por
células hospedadoras procariotas. Preferiblemente, una NTP
recombinante se expresa por dichas células como una proteína de
fusión, como se describe en la presente memoria. Un hospedador
procariota especialmente preferido es E. coli. Las cepas
preferidas de E. coli incluyen Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 y
ER1647 (véase, por ejemplo, Molecular Biology LabFax. Brown
T.A., Ed. Academic Press, New York (1991)). Un hospedador
alternativo preferido es Bacillus subtilis, incluyendo cepas
tales como BR151, YB886, MI119, MI120 y B170 (véase, por ejemplo,
Hardy, "Bacillus Cloning Methods" en DNA Cloning: A
Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)).
Se dice que una molécula de ácido nucleico, tal
como ADN, es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene
secuencias de control de la expresión que a su vez contienen
información reguladora de la transcripción y dichas secuencias
están "unidas de forma funcional" a la secuencia de nucleótidos
que codifica la proteína.
Se dice que dos secuencias de una molécula de
ácido nucleico están unidas de forma funcional cuando están unidas
entre sí de tal manera que se permite que las dos secuencias se
transcriban en el mismo transcrito de ARN o que se permita que un
transcrito de ARN comience en una secuencia que se extenderá en la
segunda secuencia. De esta forma dos secuencias, tales como una
secuencia promotora y cualquier otra "segunda" secuencia de
ADN o ARN están unidas de forma funcional si la transcripción que
comienza en la secuencia promotora produce un transcrito de ARN de
la segunda secuencia unida de forma funcional. Para que estén unidas
de forma funcional no es necesario que las dos secuencias sean
adyacentes entre sí.
Las secuencias promotoras de la presente
invención pueden ser procariotas, eucariotas o virales. Los
promotores adecuados son promotores de represión, constitutivos o
inducibles. Los ejemplos de promotores procariotas adecuados
incluyen promotores capaces de reconocer las polimerasas de T4
(Malik et al., J. Biol. Chem.
263:1174-1181 (1984); Rosenberg et
al., Gene 59:191-200 (1987);
Shinedling et al., J. Molec. Biol.
195:471-480 (1987); Hu et al.,
Gene 42:21-30 (1986)), T3, Sp6 y T7
(Chamberlin et al., Nature
228:227-231 (1970); Bailey et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)
80:2814-2818 (1983); Davanloo et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)
81:2035-2039 (1984); los promotores P_{R}
y P_{L} del bacteriófago lambda (The Bacteriophage Lambda,
Hershey, A.D., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,
NY (1973); Lambda II, Hendrix, R.W., Ed., Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor, NY (1980)); los promotores trp, recA, de
choque térmico y lacZ de E. coli; los promotores de la
\alpha-amilasa (Ulmanen et al.,
Bacteriol. 162:176-182 (1985)) y específico
delta-28 de B. subtilis (Gilman et
al., Gene 32:11-20 (1984)); los
promotores de los bacteriófagos de Bacillus (Gryczan, En:
The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc.,
NY (1982)); promotores de Streptomyces (Ward et al.,
Mol. Gen. Genet. 203:468-478 (1986));
el promotor int del bacteriófago lambda; el promotor
bla del gen de la \beta-lactamasa de
pBR322 y el promotor CAT del gen de la cloranfenicol acetil
transferasa de pBR325, etc. Los promotores procariotas se revisan
por Glick, J. Ind. Microbiol.
1:277-282 (1987)); Cenatiempo,
Biochimie 68:505-516 (1986); Watson
et al., En: Molecular Biology of the Gene, Cuarta
Edición, Benjamin Cummins, Menlo Park, CA (1987); Gottesman,
Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (1984); y
Sambrook et al., supra.
Los promotores procariotas preferidos incluyen
el promotor del gen de la metalotioneína I de ratón (Hamer et
al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288
(1982)); el promotor de TK del virus del Herpes (McKnight, Cell
31:355-365 (1982)); el promotor temprano de
SV40 (Benoist, et al., Nature (London) 290:
304-310 (1981)); y el promotor del gen gal4
de levadura (Johnston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 79:6971-6975 (1982); Silver et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
81:5951-5955 (1984)).
Los promotores mas preferidos de la presente
invención son promotores fuertes. Son ejemplos de estos promotores
preferidos los que reconocen los promotores de la polimerasa de T3,
SP6 y T7; el promotor P_{L} del bacteriófago lambda; el promotor
recA y el promotor del gen de la metalotioneína I de ratón. El
promotor mas preferido para la expresión en células procariotas es
uno que es capaz de reconocer el promotor de la polimerasa de T7.
Las secuencias de dichas secuencias de reconocimiento de polimerasa
se describen por Watson, et al. (En: Molecular Biology of
the Gene, Cuarta Edición; Benjamin Cummins, Menlo Park, CA,
(1987). El promotor mas preferido para la expresión en células de
mamífero es SV40 (Gorman, "High Efficiency Gene Transfer into
Mammalian cells", en DNA Cloning: A Practical Approach,
Volume II, IRL Press, Washington, D.C. páginas
143-190 (1985)).
Esta invención se refiere a métodos de detección
de enfermedades neurológicas en un sujeto humano, utilizando las
sondas de ácidos nucleicos que pueden hibridar con genes de NTP o
transcritos de una NTP codificada por moléculas de ADN
AD3-4DH1, o anticuerpos específicos para una NTP
codificada por moléculas de ADN AD3-4DH1. Por
"enfermedad neurológica" se entiende la enfermedad de Alzheimer
(AD) u otros trastornos neurodegenerativos con cambios patogénicos
de tipo Alzheimer (por ejemplo, enfermedad de Parkinson con
neurodegeneración de tipo AD), así como tumores neuroectodérmicos,
astrocitomas malignos y glioblastomas. Por "sujeto humano" se
entiende cualquier ser humano o cualquier forma del desarrollo del
mismo tal como un embrión o feto humano, antes del nacimiento. Los
métodos de diagnóstico de la presente invención no requieren la
extracción invasiva de tejido neural.
La presente invención también se refiere a
ensayos, tanto a ensayos de hibridación de ácidos nucleicos como a
inmunoensayos, para detectar la presencia de una NTP codificada por
moléculas de ADN AD3-4DH1 en células o en fluidos
biológicos de un sujeto humano usando histología con microscopia
óptica o electrónica, imágenes, ensayos radiactivos o basados en
enzimas, y similares.
Para ensayar una muestra de tejido en relación
con una NTP usando un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos,
puede aislarse ARN a partir del tejido por sección en un criostato y
lisis de las secciones con un detergente tal como SDS y un agente
quelante tal como EDTA, opcionalmente con digestión durante una
noche con proteinasa K (50 \mug/ml). Dicho tejido se obtiene por
autopsia y biopsia. Una cantidad preferida de tejido está en el
intervalo de 1-10 miligramos. Se retiran las
proteínas mediante extracciones con fenol y cloroformo y los ácidos
nucleicos se precipitan con etanol. El ARN se aísla por
cromatografía en una columna de oligo dT y después se eluye de la
misma. También puede realizarse un fraccionamiento adicional de
acuerdo con métodos bien conocidos por los especialistas en la
técnica.
Para la detección de secuencias de ADN o ARN en
tejidos se usan varias técnicas de hibridación molecular; de las
que cada una tiene ciertas ventajas e inconvenientes. Cuando se
dispone de grandes cantidades de tejido, el análisis de la cinética
de hibridación proporciona la oportunidad de cuantificar de forma
precisa la cantidad de ADN o ARN presente, así como de distinguir
secuencias que están muy relacionadas pero no son idénticas a la
sonda, y de determinar el porcentaje de homología.
Las reacciones se realizan en condiciones de
hibridación (Tm-25ºC) en las que la velocidad de
reasociación de la sonda es óptima (Wetmur et al., J.
Mol. Biol. 31:349:370 (1968)). La cinética de la reacción es de
segundo orden cuando las secuencias del tejido son idénticas a las
de la sonda; sin embargo, la reacción presenta una cinética
compleja cuando las secuencias de la sonda tienen una homología
parcial con las del tejido (Sharp et al., J. Mol. Biol.
86:709-726 (1974)).
La relación entre la sonda y el ARN de la célula
se determina por la sensibilidad deseada. Para detectar un
transcrito por célula se requerirían aproximadamente 100 pg de sonda
por \mug de ADN o ARN celular total. Los ácidos nucleicos se
mezclan, se desnaturalizan, se llevan a la concentración de sal y a
la temperatura apropiadas y se dejan hibridar durante diversos
periodos de tiempo. La velocidad de reasociación puede determinarse
cuantificando la cantidad de sonda hibridada por cromatografía en
hidroxiapatita (Britten et al., Science
161:529-540 (1968) o digestión con nucleasa S1
(Sutton, Biochim. Biophys. Acta 240:522-531
(1971)).
Un método de hibridación más flexible es la
técnica de transferencia de Northern. Esta técnica ofrece
variabilidad en la rigurosidad de la reacción de hibridación, así
como en la determinación del estado de las secuencias retrovirales
en la muestra bajo análisis. El análisis de Northern puede
realizarse como se describe en este documento.
Una consideración importante asociada con el
análisis de hibridación de las secuencias de ADN o ARN es el grado
de relación que tiene la sonda con las secuencias presentes en la
muestra que se está estudiando. Esto es importante con la técnica
de transferencia, ya que un grado moderado de homología de secuencia
en condiciones no rigurosas de hibridación puede producir una señal
fuerte aunque la sonda y las secuencias de la muestra representen
genes no homólogos.
La técnica de hibridación particular no es
esencial para la invención, estando dentro del alcance de la
presente invención cualquier técnica usada comúnmente en este
campo. Se describe una tecnología típica de sondas en la Patente de
Estados Unidos 4.358.535 de Falkow et al. Por ejemplo, la
hibridación puede realizarse en una solución que contiene SSC 6x
(SSC 10 x: cloruro sódico 1,5 M, citrato sódico 0,15 M, pH 7,0),
solución de Denhardt 5x (Denhardt 1x: albúmina de suero bovino al
0,2%, polivinilpirrolidona al 0,2% y Ficoll 400 al 0,02%), EDTA 10
Mm, SDS al 0,5% y aproximadamente 10^{7} cpm de ADN obtenido por
traslado de mellas durante 16 horas a 65ºC.
Las sondas marcadas, como se ha descrito
anteriormente, proporcionan un método de diagnóstico general para
la detección de una NTP en un tejido. El método es razonablemente
rápido, tiene un protocolo sencillo, tienen reactivos que pueden
estandarizarse y proporcionarse como kits comerciales y permite una
rápida exploración de un gran número de muestras.
En un método para realizar el procedimiento, un
aislado clínico que contienen transcritos de ARN se fija a un
soporte. El ácido nucleico fijado se pone en contacto con un
polinucleótido marcado que tiene una secuencia de bases
complementaria u homóloga a la cadena codificante del gen de
NTP.
Los ensayos de hibridación de la presente
invención son particularmente adecuados para la preparación y
comercialización en forma de kit, comprendiendo el kit un medio de
soporte compartimentalizado para contener uno o mas medios de
recipiente (vial, tubo de ensayo, etc.) individuales pero próximos,
comprendiendo cada uno de dichos medios de recipiente uno de los
elementos separados a usar en el ensayo de hibridación.
Por ejemplo, puede haber un medio de recipiente
que contenga moléculas de ADNc de NTP adecuadas para el marcaje por
el "traslado de mellas" (véase, por ejemplo, Sambrook et
al., supra, como metodología convencional) o moléculas
de ADNc o ARN de NTP marcadas. Otros medios de recipiente pueden
contener soluciones convencionales para el traslado de mellas de
ADNc de NTP que comprenden ADN polimerasa I/DNasa I y
desoxirribonucleótidos no marcados (es decir, dCTP, dTTP, dGTP y
dATP).
La presencia de ARN de NTP se determina por la
variación en el aspecto y/o cantidad de ARN relacionado con la
sonda en el tejido ensayado.
Las sondas de ADN de esta invención también
pueden usarse para el diagnóstico diferencial de una AD hereditaria
o familiar y una AD no hereditaria o esporádica. La forma familiar
de AD a menudo aparece en una edad anterior y está asociada con el
síndrome de Down en la familia. De esta manera, un ensayo genético
de AD familiar permite realizar un asesoramiento genético a las
familias. Aunque se han dirigido muchos esfuerzos a la
caracterización de un marcador genético para la AD familiar
(Gusella, FASEB J 3:2036-2041 (1989); Hooper,
J NIH Res. 4:48-54 (1992)), el análisis de
asociación genética sólo identifica una secuencia marcadora genética
sin proporcionar el conocimiento de la función de la secuencia
genómica. Por el contrario, las sondas de ADNc descritas en la
presente memoria y obtenidas a partir de individuos con AD
esporádica codifican una proteína conocida de función conocida que
se sobreexpresa en el tejido cerebral de pacientes con AD.
La mayoría de los casos de trastorno AD parecen
ser de la forma esporádica, aunque existen casos familiares bien
documentados (Gusella, supra; Harrison's Principles of
Internal Medicine, Braunwald et al., Eds., Decimoprimera
Edición, Mc Graw-Hill Book Company, New York,
páginas 2012-2013 (1987)). Un paciente con AD
familiar, a diferencia de un paciente con AD esporádica, heredó la
mutación de predisposición a través de las células germinales. Se
ha demostrado que algunos de los casos familiares siguen un patrón
de herencia dominante autosómico (Id.). De esta manera, el
ADN de un paciente con AD familiar contendrá la alteración genética
heredada que está ausente en el ADN de un paciente con AD
esporádica.
Un método de diferenciación entre la AD
esporádica y familiar en un sujeto humano implica obtener una
muestra biológica del sujeto humano que se sospecha que tiene la
enfermedad de Alzheimer. Después, se purifica el ADN de la muestra
biológica. Finalmente, el ADN se pone en contacto con una sonda de
ADN de NTP en condiciones de hibridación. La AD familiar se indica
por la detección de un híbrido de la sonda y el ADN, mientras que
el AD esporádica se indica por la ausencia de detección de
hibridación.
Por ejemplo, la muestra biológica puede ser una
muestra de sangre que se somete a centrifugación diferencial para
enriquecer la muestra en glóbulos blancos antes de que hayan
transcurrido tres días desde la recolección (Park, "PCR in the
Diagnosis of Retinoblastoma", en PCR Protocols, Innis
et al., Eds., Academic Press, Inc., New York; páginas
407-415 (1990)). La muestra de ADN puede prepararse
usando el método de N-lauroilsarcosina
sódica-Proteinasa K, fenol y RNasa (Sambrook et
al., supra). El análisis de ADN puede realizarse mediante
la digestión de la muestra de ADN, preferiblemente 5 microgramos,
con una endonucleasa de restricción (tal como HindIII).
Después, el ADN digerido se fracciona usando electroforesis en gel
de agarosa, preferiblemente un gel de agarosa horizontal al 1%,
durante 18 horas en un tampón que preferiblemente contiene
Tris-HCl 89 mM (pH 8), borato sódico 89 mM y EDTA 2
mM (Gusella et al., Nature 306:234-238
(1983)). Se puede realizar un análisis de Southern usando técnicas
convencionales (Sambrook et al., supra) y las sondas
de ADNc de AD marcadas pueden hibridar en las condiciones descritas
anteriormente. Las sondas de ADN preferidas para este método de
diagnóstico diferencial incluyen 1-9a,
AD3-4, AD4-4 y G2-2
PstI.
Pueden usarse anticuerpos dirigidos contra una
NTP, como se enseña en la presente invención, para detectar y
diagnosticar AD. También pueden usarse diversos métodos de tinción
histológica, incluyendo los métodos de tinción inmunohistoquímica,
eficazmente de acuerdo con las enseñanzas de la invención. La
tinción con plata es sólo un método de visualización de NTP. Para
el especialista en la técnica serán evidentes otros métodos de
tinción útiles en la presente invención, cuya determinación no
implique una experimentación indebida (véase, en general, por
ejemplo, A Textbook of Histology, Eds. Bloom and Fawcett, W.
B. Saunders Co., Philadelphia (1964)).
Un método de exploración para determinar si un
compuesto dado es un derivado funcional de NTP comprende, por
ejemplo, inmunoensayos que emplean metodologías de radioinmunoensayo
(RIA) o de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA),
basados en la producción de anticuerpos específicos (monoclonales o
policlonales) contra una NTP. Para estos ensayos, se obtienen
muestras biológicas por punción venosa (sangre), punción espinal
(líquido cefalorraquídeo (CSF)), orina y otras secreciones
corporales tales como sudor y lágrimas. Por ejemplo, en una forma
de RIA, la sustancia de ensayo se mezcla con antisuero diluido en
presencia de un antígeno radiomarcado. En este método, la
concentración de la sustancia de ensayo será inversamente
proporcional a la cantidad de antígeno marcado unido al anticuerpo
específico y estará relacionada directamente con la cantidad de
antígeno marcado libre. Para los especialistas en la técnica serán
evidentes otros métodos de selección adecuados.
La presente invención también se refiere a
métodos para detectar una molécula de NTP codificada por una
molécula de ADN AD3-4DH1 o derivados funcionales de
la misma en una muestra o sujeto. Por ejemplo, pueden marcarse de
forma detectable anticuerpos específicos para una NTP, o un derivado
funcional, con cualquier marcador apropiado, por ejemplo un
radioisótopo, una enzima, un marcador fluorescente, un marcador
paramagnético o un radical libre.
Como alternativa, pueden marcarse de forma
detectable anticuerpos específicos para una NTP, o un derivado
funcional, con ADN por la técnica de inmunorreacción en cadena de la
polimerasa (Sano et al., Science
258:120-122 (1992)). El procedimiento de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica secuencias de
ácido nucleico específicas por medio de una serie de manipulaciones
que incluyen desnaturalización, hibridación de cebadores
oligonucleotídicos y extensión de los cebadores con ADN polimerasa
(véase, por ejemplo, Mullis et al., Patente de Estados
Unidos Nº 4.683.202; Mullis et al., Patente de Estados Unidos
Nº 4.683.195; Loh et al., Science 243:217 (1988)).
Las etapas pueden repetirse muchas veces, dando como resultado una
gran amplificación del número de copias de la secuencia específica
original. Es posible amplificar únicamente una sola copia de una
secuencia de ADN para producir cientos de nanogramos de producto (Li
et al., Nature 335:414 (1988)). Otros procedimientos
de amplificación de ácidos nucleicos conocidos incluyen sistemas de
amplificación basados en la transcripción (Kwoh et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989); Gingeras et
al., documento WO 88/10315), y la "reacción en cadena de la
ligasa" en la que dos (o mas) oligonucleótidos se unen en
presencia de una diana de ácido nucleico que tiene la secuencia del
"di-oligonucleótido" resultante, amplificándose
de esta manera el dioligonucleótido (Wu et al., Genomics
4: 560 (1989); Backman et al., documento EP 320.308;
Wallace, documento EP 336.731; Orgel, documento WO 89/09835). Por
ejemplo, puede realizarse el ensayo de inmuno-PCR
inmovilizando diversas cantidades del material de ensayo en la
superficie de pocillos de microtitulación (véase Sanzo et
al., supra, página 122, nota a pié de página 7).
Posteriormente, los pocillos se incuban con un anticuerpo
monoclonal contra NTP, se lavan y después se incuban con moléculas
de ADN de NTP biotiniladas que se han conjugado con una quimera de
estreptavidina-proteína (Id.). Esta quimera
se une a la biotina (a través del resto de estreptavidina) y la
parte Fc de una molécula de inmunoglobulina G (a través del resto de
proteína A) (Id., en 120; Sanzo et al.,
Bio/Technology 9:1378 (1991)). Después, los pocillos se lavan
para retirar los conjugados no unidos. Cualquier NTP presente en el
material de ensayo se unirá al anticuerpo monoclonal contra NTP que,
a su vez, está unido al resto de proteína A del conjugado de ADN de
NTP biotinilado - estreptavidina-proteína A.
Después, las secuencias de ADN de NTP se amplifican usando PCR. En
resumen, los pocillos de microtitulación se incuban con
desoxirribonucleósido trifosfatos, cebadores oligonucleotídicos de
NTP y ADN polimerasa de Taq (véase Sanzo et al.,
supra, página 122, nota a pie de página 11). Puede usarse un
aparato de ciclos térmicos automático (tal como el
PTC-100-96 Thermal Cycler, MJ
Research, Inc) para realizar la PCR en condiciones convencionales
(Id.). Posteriormente, los productos de PCR se analizan por
electroforesis en gel de agarosa después de tinción con bromuro de
etidio.
Los especialistas habituales en la técnica
conocen métodos para fabricar y detectar dichos anticuerpos marcados
de manera detectable o sus derivados funcionales y se describen a
continuación con más detalle. Los trabajos de referencia
convencionales que establecen los principios generales de la
inmunología incluyen el trabajo de Klein (Immunology: The
Science of Self-Nonself Discrimination, John
Wiley & Sons, New York (1982)); Kennet et al.
(Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in
Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980)); Campbell
("Monoclonal Antibody Technology", En: Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13 (Burdon, R.,
et al., eds.). Elsevier, Amsterdam (1984)); y Eisen (En:
Microbiology, 3ª Ed. (Davis, et al., Harper &
Row, Philadelphia (1980)).
El término "anticuerpo" se refiere tanto a
anticuerpos monoclonales que son una población sustancialmente
homogénea como a anticuerpos policlonales que son poblaciones
heterogéneas. Los anticuerpos policlonales proceden de los sueros
animales inmunizados con un antígeno. Pueden obtenerse anticuerpos
monoclonales (mAb) contra antígenos específicos por métodos
conocidos por los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo,
Kohler y Milstein, Nature 256:495-497 (1975)
y la Patente de Estados Unidos Nº 4.376.110. Estos anticuerpos
pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG,
IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas.
Los anticuerpos monoclonales, particularmente
los mAb Th7, Th9 y Th10 usados en la presente invención, pueden
prepararse como se ha descrito previamente (Gross et al.,
J. Clin. Invest. 76:2115-2126 (1985); Ozturk
et al., Proc. Natl. Acad: Sci. USA
86:419-423 (1989); de la Monte et al.,
J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990); de la
Monte et al., J. Neurol. Sci.
113:152-164 (1992); de la Monte et al.,
Ann. Neurol. 32:733-742 (1992). Los
anticuerpos monoclonales Th se generaron contra la forma pancreática
purificada de la proteína de la cadena (Id.). También pueden
generarse anticuerpos monoclonales y policlonales específicos para
NTP contra una NTP sustancialmente pura aislada a partir de
hospedadores recombinantes (por ejemplo, véase, Carroll et
al., "Production and Purification of Polyclonal Antibodies to
the Foreign Segment of \beta-Galactosidase Fusion
Proteins", en DNA Cloning: A Practical Approach, Volume
III. IRL Press, Washington, D.C., páginas 89-111
(1987); Mole et al., "Production of Monoclonal Antibodies
Against Fusion Proteins Produced in Escherichia coli", en
DNA Cloning: A Practical Approach, Volume III, IRL Press,
Washington, D.C., páginas 113-1139 (1987)). Como
alternativa, pueden generarse anticuerpos policlonales y
monoclonales específicos para NTP contra una NTP sustancialmente
pura aislada a partir de un material biológico tal como tejido y
líneas celulares cerebrales, usando técnicas bien conocidas.
Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos
monoclonales específicos para las moléculas de NTP codificadas por
la molécula de ADN AD3-4DH1 a partir de proteínas de
origen recombinante, que se expresan, aíslan y purifican a partir
del ADNc (es decir, 1-9a), clones genómicos
(G2-2 PstI) y clones de ADNc de
AD-NTP 3-4. Estas moléculas de NTP
se obtienen a partir de los ADNc y clones genómicos anteriores, se
insertan y se producen en vectores de expresión adecuados (véanse
las Figuras 2A y 2B). Como hay regiones con una homología de
60-70% en los extremos 5' del ADNc de NTP
1-9a y PTP, se pueden obtener anticuerpos
monoclonales que se unan específicamente a las proteínas
recombinantes NTP y no a la forma pancreática realizando una
exploración diferencial rutinaria (véase, por ejemplo, de la Monte
et al., J. Clin. Invest. 86:1004-1013
(1990)). Aunque habrá anticuerpos monoclonales que se unen tanto a
NTP como a PTP, será posible generar anticuerpos monoclonales
específicos para NTP porque hay una divergencia de secuencias
sustancial entre las moléculas de NTP de diversas formas (por
ejemplo, 8, 14, 17, 21 y 42 kDa) y porque un epítopo puede estar
definido por tan sólo 6-8 aminoácidos.
También se entiende que el término
"anticuerpo" incluye tanto moléculas intactas como fragmentos
de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab y
F(ab')_{2},que pueden unirse a antígenos. Los fragmentos
Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc de un anticuerpo
intacto, se eliminan mas rápidamente de la circulación y puede tener
menos unión tisular no específica que un anticuerpo intacto (Wahl
et al., J. Nucl. Med. 24:316-325
(1983)).
Se apreciará que pueden usarse Fab y
F(ab')_{2}y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en
la presente invención, para la detección y cuantificación de una
NTP de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria,
para detectar y diagnosticar AD de la misma manera que un anticuerpo
intacto. Dichos fragmentos se producen típicamente por escisión
proteolítica usando enzimas tales como papaína (para producir
fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos
F(ab')_{2}).
Se dice que un anticuerpo es "capaz de
unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente
con la molécula de tal forma que la molécula se una al anticuerpo.
El término "epítopo" pretende hacer referencia a la parte de
cualquier molécula capaz de unirse a un anticuerpo que también puede
reconocerse por dicho anticuerpo. Los determinantes epitópicos
normalmente consisten en agrupamientos de moléculas de superficie
químicamente activos tales como cadenas laterales de aminoácidos o
de azúcares y tienen características estructurales tridimensionales
específicas así como características de carga específicas.
Un "antígeno" es una molécula que puede
unirse a un anticuerpo y que además es capaz de inducir en un animal
la producción de anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de ese
antígeno. Un antígeno puede tener uno o más de un epítopo. Se
entiende que la reacción específica mencionada anteriormente indica
que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con
su anticuerpo correspondiente y no con los múltiples anticuerpos
distintos que pueden inducirse por otros antígenos.
Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos,
útiles en la presente invención pueden usarse para detectar de
forma cuantitativa o cualitativa la presencia de células que
contienen los antígenos de NTP. De esta manera, los anticuerpos (o
sus fragmentos) útiles en la presente invención pueden emplearse
histológicamente para detectar o visualizar la presencia de una
NTP.
Dicho ensayo para una NTP típicamente comprende
incubar una muestra biológica de dicho sujeto que se sospecha que
tiene dicha afección, en presencia de una molécula de unión marcada
de forma detectable (por ejemplo, un anticuerpo) capaz de
identificar una NTP, y detectar dicha molécula de unión unida en la
muestra.
De esta manera, en este aspecto de la invención
una muestra biológica puede tratarse con nitrocelulosa u otro
soporte sólido capaz de inmovilizar a las células, partículas
celulares o proteínas solubles. El soporte después puede lavarse
con tampones adecuados seguido de tratamiento con el anticuerpo
específico para NTP marcado de forma detectable. El soporte en fase
sólida después puede lavarse con el tampón por segunda vez para
retirar el anticuerpo no unido. Posteriormente puede detectarse la
cantidad de marcador unido en dicho soporte sólido por medios
convencionales.
Por "soporte en fase sólida" se entiende
cualquier soporte capaz de unirse a antígenos o anticuerpos. Los
soportes o vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno,
polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas
naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La
naturaleza del soporte puede ser soluble en alguna medida o
insoluble para los fines de la presente invención. El material de
soporte puede tener prácticamente cualquier configuración
estructural posible siempre que la molécula acoplada pueda unirse a
un antígeno o anticuerpo. De esta manera, la configuración del
soporte puede ser esférica, como en el caso de una perla, o
cilíndrica, como en el caso de la superficie interna de un tubo de
ensayo o la superficie externa de una varilla. Como alternativa, la
superficie puede ser plana, tal como una lámina, tira de ensayo,
etc. Los soportes preferidos incluyen perlas de poliestireno. Los
especialistas en la técnica conocerán muchos otros soportes
adecuados para la unión de anticuerpos monoclonales o antígenos, o
podrán determinarlos mediante el uso de una experimentación de
rutina.
Una realización para realizar el ensayo de
diagnostico de la presente invención en una muestra biológica que
contiene una NTP, comprende:
- (a)
- poner en contacto un anticuerpo marcado de forma detectable específico para una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 con un soporte sólido para efectuar la inmovilización de dicho anticuerpo específico para NTP o un fragmento del mismo;
- (b)
- poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 con dicho soporte sólido;
- (c)
- incubar dicho anticuerpo marcado de forma detectable específico para una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 con dicho soporte durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el anticuerpo específico para NTP inmovilizado se una a la NTP;
- (d)
- separar el soporte en fase sólida de la mezcla de incubación obtenida en la etapa (c); y
- (e)
- detectar el marcador unido y de esta forma detectar y cuantificar la NTP.
Como alternativa, los complejos de anticuerpo
específico para NTP marcado/NTP de una muestra pueden separarse de
la mezcla de reacción poniendo en contacto el complejo con una
proteína o anticuerpo inmovilizado que es específico para una
inmunoglobulina, por ejemplo, la proteína A de
Staphylococcus, la proteína G de Staphylococcus o
anticuerpos anti-IgM o anti-IgG.
Dichos anticuerpos anti-inmunoglobulina pueden ser
policlonales, pero preferiblemente son monoclonales. El soporte
sólido después puede lavarse con un tampón adecuado para dar un
complejo inmovilizado de NTP/anticuerpo marcado específico para
NTP. Después puede detectarse el marcador para dar una medida de
una NTP.
Este aspecto de la invención se refiere a un
método para detectar una NTP codificada por una molécula de ADN
AD3-4DH1 o un fragmento de la misma en una muestra,
que comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene una NTP con un anticuerpo específico para NTP o un fragmento del mismo que se une a una NTP codificada por AD3-4DH1; y
- (b)
- detectar si se forma un complejo.
La invención también se refiere a un método para
detectar una NTP codificada por AD3-4DH1 en una
muestra, que comprende además:
- (c)
- poner en contacto la mezcla obtenida en la etapa (a) con una molécula de unión a Fc, tal como un anticuerpo, proteína A de Staphylococcus o proteína G de Staphylococcus, que está inmovilizada en un soporte en fase sólida y es específica para el anticuerpo específico para NTP, para proporcionar un complejo de NTP/anticuerpo específico para NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 inmovilizado;
- (d)
- lavar el soporte en fase sólida obtenido en la etapa (c) para retirar el complejo de NTP/anticuerpo específico para NTP no unido;
- (e)
- y detectar el marcador unido a dicho soporte sólido.
Por supuesto, las concentraciones específicas de
anticuerpo marcado de forma detectable y NTP, la temperatura y el
tiempo de incubación, así como otras condiciones de ensayo, pueden
variarse dependiendo de diversos factores que incluyen la
concentración de la NTP en la muestra, la naturaleza de la muestra y
similares. La actividad de unión de un lote dado de anticuerpo
anti-NTP puede determinarse de acuerdo con métodos
bien conocidos. Los especialistas en la técnica podrán determinar
las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada
determinación empleando una experimentación de rutina.
A los ensayos se les pueden añadir otras etapas
tales como lavado, agitación, sacudida, filtración y similares
cuando sea habitual o necesario para la situación particular.
Una de las maneras en las que puede marcarse de
forma detectable el anticuerpo específico para NTP es por medio de
su unión a una enzima. Esta enzima, a su vez, una vez expuesta a su
sustrato, reaccionará con el sustrato de tal manera que producirá
un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, por medios
espectofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que
pueden usarse para marcar de forma detectable el anticuerpo
específico para NTP incluyen, pero sin limitación, malato
deshidrogenasa, nucleasa de estafilococos,
delta-V-esteroide isomerasa,
alcohol deshidrogenasa de levadura,
\alpha-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa
fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa
alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa,
\beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa,
catalasa, glucosa VI-fosfato deshidrogenasa,
glucoamilasa y acetilcolinesterasa.
La detección puede realizarse usando cualquiera
de una diversidad de inmunoensayos. Por ejemplo, mediante marcaje
radiactivo de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con
especificidad para NTP, es posible detectar NTP mediante el uso de
ensayos radioinmunes. Puede encontrarse una buena descripción de un
ensayo radioinmune en Laboratory Techniques and Biochemistry in
Molecular Biology, de Work, et al., North Holland
Publishing Company, NY (1978), haciendo referencia en particular al
capítulo titulado "An Introduction to Radioimmune Assay and
Related Techniques" de Chard.
El isótopo radiactivo puede detectarse por
medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de
centelleo o por autorradiografía. Son isótopos particularmente
útiles para los fines de la presente invención: ^{3}H, ^{125}I,
^{131}I, ^{35}S, ^{14}C y preferiblemente ^{125}I.
También es posible marcar el anticuerpo con
especificidad para NTP con un compuesto fluorescente. Cuando el
anticuerpo marcado de forma fluorescente se expone a luz de la
longitud de onda apropiada, su presencia puede detectarse debido a
la fluorescencia. Ente los compuestos marcadores fluorescentes
usados más comúnmente se encuentran isotiocianato de fluoresceína,
rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina,
\alpha-ftaldehído y fluorescamina.
El anticuerpo con especificidad para NTP también
puede marcarse de forma detectable usando metales emisores de
fluorescencia tales como ^{152}Eu, u otros de la serie de los
lantánidos. Estos metales pueden unirse al anticuerpo específico
para NTP usando grupos quelantes de metales tales como ácido
dietilentriaminapentaacético (DTPA) o ácido
etilendiaminatetraacético (EDTA).
El anticuerpo con especificidad para NTP también
puede marcarse de forma detectable por acoplamiento a un compuesto
quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo con especificidad
para NTP marcado con un compuesto quimioluminiscente después se
determina detectando la presencia de luminiscencia que se produce
durante el transcurso de una reacción química. Son ejemplos de
compuestos marcadores quimioluminiscentes particularmente útiles
luminol, isoluminol, éster de acridinio theromatic, imidazol, sal de
acridinio y éster de oxalato.
El anticuerpo con especificidad para NTP también
puede marcarse con biotina y después hacerse reaccionar con
avidina. Un fragmento de ADN marcado con biotina se unirá al
anticuerpo monoclonal biotinilado con NTP mediante un enlace de
avidina. Después se detectan las moléculas de NTP por amplificación
por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del
fragmento de ADN con cebadores específicos (Sano et al.,
Science 258: 120-122 (1992)).
De forma similar, puede usarse un compuesto
bioluminiscente para marcar el anticuerpo con especificidad para
NTP de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de
quimioluminiscencia que puede encontrarse en sistemas biológicos en
los que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción
quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se
determina detectando la presencia de luminiscencia. Son compuestos
bioluminiscentes importantes para los fines del marcaje luciferina,
luciferasa y aecuorina.
La detección del anticuerpo con especificidad
para NTP puede realizarse por un contador de centelleo, por
ejemplo, si el marcador detectable es un emisor gamma radiactivo, o
por medio de un fluorómetro, por ejemplo, si el marcador es un
material fluorescente. En el caso de un marcador enzimático, la
detección puede realizarse por métodos colorimétricos que emplean
un sustrato para la enzima. La detección también puede realizarse
por comparación visual del grado de reacción enzimática de un
sustrato en comparación con patrones preparados de forma
similar.
similar.
La detección de focos de estos anticuerpos
marcados de manera detectable es indicativa de una enfermedad o un
estado disfuncional como se ha descrito previamente. Para los fines
de la presente invención, la NTP que se detecta por este ensayo
puede estar presente en una muestra biológica. Puede usarse
cualquier muestra que contenga una NTP. Sin embargo, una de las
ventajas del diagnóstico de la presente invención es que puede
evitarse la extracción invasiva de un tejido. Por lo tanto,
preferiblemente, la muestra es una solución biológica tal como, por
ejemplo, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, sangre, suero,
orina y similares. Sin embargo, la invención no se limita a ensayos
que usan sólo estas muestras, siendo posible que un especialista en
la técnica determine condiciones adecuadas que permitan el uso de
otras muestras.
Por ejemplo, pueden usarse ensayos
inmunorradiométricos basados en anticuerpos monoclonales de tres
sitios (M-IRMA) para medir los niveles de NTP en un
fluido biológico tal como CSF. Por medio de punción espinal, es
posible obtener de forma rutinaria CSF a partir de individuos que se
sospecha que tienen AD. De esta manera, el diagnóstico de AD puede
establecerse por medio de un inmunoensayo sencillo no invasivo que
revela niveles de NTP muy aumentados por encima de los niveles
normales.
En una realización, como se ha descrito
anteriormente, este examen de AD se realiza extrayendo muestras de
fluido biológico e incubando dichas muestras en presencia de
anticuerpos (o fragmentos de anticuerpos) marcados de forma
detectable. En una realización preferida, esta técnica se realiza de
manera no invasiva mediante el uso de imágenes magnéticas,
fluorografía, etc.
Hay muchos marcadores diferentes in vivo
y muchos métodos de marcaje conocidos por los especialistas
habituales en la técnica. Los ejemplos de los tipos de marcadores
que pueden usarse en la presente invención incluyen isótopos
radiactivos e isótopos paramagnéticos. Los especialistas habituales
en la técnica conocerán otros marcadores adecuados para unirse a
los anticuerpos usados en la invención, o podrán determinarlos
usando una experimentación rutinaria. Además, la unión de estos
marcadores a los anticuerpos puede realizarse usando técnicas
convencionales comunes para los especialistas habituales en la
técnica.
Los anticuerpos (o sus fragmentos) útiles en la
presente invención también son particularmente adecuados para uso
en inmunoensayos in vitro para detectar la presencia de una
NTP en un tejido corporal, fluidos (tales como CSF) o extractos
celulares. En estos inmunoensayos, los anticuerpos (o fragmentos de
anticuerpos) pueden utilizarse en fase líquida o, preferiblemente,
unidos a un soporte en fase sólida, como se ha descrito
anteriormente.
Los especialistas habituales en la técnica
conocerán otros marcadores adecuados que pueden emplearse de acuerdo
con la presente invención. La unión de estos marcadores a
anticuerpos o sus fragmentos puede realizarse usando técnicas
convencionales conocidas comúnmente por los especialista habituales
en la técnica. Se describen técnicas típicas por Kennedy, et
al., (Clin. Chim. Acta 70: 1-31 (1976) y
Schurs et al. (Clin. Chim. Acta
81:1-40 (1977)). Las técnicas de acoplamiento
mencionadas por el último son el método del glutaraldehído, el
método de peryodato, el método de dimaleimida y el método de éster
de
maleimidobencil-N-hidroxi-succinimida.
Puede realizarse detección in situ
extrayendo una muestra histológica de un paciente y proporcionando
la combinación de anticuerpos marcados de la presente invención a
dicha muestra. El anticuerpo (o fragmento) preferiblemente se
proporciona aplicando o añadiendo el anticuerpo marcado (o su
fragmento) a una muestra biológica. Por medio del uso de dicho
procedimiento, es posible determinar no sólo la presencia de una
NTP, sino también la distribución de una NTP en el tejido
examinado. Usando la presente invención, los especialistas
habituales percibirán fácilmente que puede modificarse cualquiera
de una amplia diversidad de métodos histológicos (tales como
procedimientos de tinción) para conseguir dicha detección in
situ.
Las moléculas de unión de la presente invención
pueden adaptarse para la utilización en un ensayo inmunométrico,
también conocido como ensayo de "dos sitios" o de tipo
"sandwich". En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de
anticuerpo no marcado (o fragmento de anticuerpo) se une a un
soporte sólido que es insoluble en el fluido que se está ensayando
(es decir, CSF) y se añade una cantidad de anticuerpo soluble
marcado de forma detectable para permitir la detección y/o
cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo en
fase sólida, el antígeno y el anticuerpo marcado.
Los ensayos inmunométricos típicos y preferidos
incluyen ensayos "directos" en los que el anticuerpo unido a
la fase sólida primero se pone en contacto con la muestra a ensayar
para extraer el antígeno de la muestra por medio de la formación de
un complejo de anticuerpo-antígeno en fase sólida
binario. Después de un periodo de incubación adecuado, se lava el
soporte sólido para retirar el residuo de la muestra de fluido,
incluyendo el antígeno que no ha reaccionado, si lo hay, y después
se pone en contacto con una solución que contiene una cantidad
desconocida de anticuerpo marcado (que funciona como "molécula
indicadora"). Después de un segundo periodo de incubación para
permitir que el anticuerpo marcado forme un complejo con el antígeno
unido al soporte sólido por medio del anticuerpo no marcado, se
lava el soporte sólido por segunda vez para retirar el anticuerpo
marcado que no ha reaccionado. Este tipo de ensayo de tipo sandwich
directo puede ser un ensayo sencillo de "sí/no" para
determinar si el antígeno está presente o puede realizarse de forma
cuantitativa comparando la medida del anticuerpo marcado con la
obtenida para una muestra patrón que contiene cantidades conocidas
de antígeno. Este ensayo de "dos sitios" o de tipo
"sandwich" se describe por Wide en las páginas
199-206 de Radioimmune Assay Method, editado
por Kirkham y Hunter, E & S. Livingstone, Edinburgh, 1970.
En otro tipo de ensayo de tipo "sandwich",
que también puede ser útil con los antígenos de la presente
invención, se usan los denominados ensayos "simultáneo" e
"inverso". Un ensayo simultáneo implica una sola etapa de
incubación, ya que el anticuerpo unido al soporte sólido y el
anticuerpo marcado se añaden a la muestra a ensayar al mismo
tiempo. Después de completarse la incubación, el soporte sólido se
lava para retirar el residuo de muestra de fluido y el anticuerpo
marcado no complejado. Después se determina la presencia de un
anticuerpo marcado asociado al soporte sólido como si fuera un
ensayo de tipo sandwich "directo" convencional.
En el ensayo "inverso" primero se utiliza
la adición por etapas de una solución de anticuerpo marcado a la
muestra de fluido, seguido de la adición de anticuerpo no marcado
unido a un soporte sólido después de un periodo de incubación
adecuado. Después de una segunda incubación, la fase sólida se lava
de forma convencional para retirar el residuo de la muestra a
ensayar y la solución de anticuerpo marcado que no ha reaccionado.
Posteriormente se determina el anticuerpo marcado asociado con un
soporte sólido como en los ensayos "simultáneo" y
"directo".
Los métodos de detección in vivo o in
vitro descritos anteriormente pueden usarse en la detección y
diagnóstico de AD sin necesidad de extraer el tejido. Dichos
métodos de detección pueden usarse para ayudar en la determinación
del estadío de deterioro neurológico en caso de AD por medio de la
evaluación y comparación de una NTP presente en la muestra
biológica.
Como se usa en la presente memoria, una cantidad
eficaz de un reactivo de diagnóstico (tal como un anticuerpo o
fragmento de anticuerpo) es una cantidad capaz de conseguir la
discriminación de diagnóstico deseada y variará dependiendo de
factores tales como la edad, estado, sexo, el grado de enfermedad
del sujeto, contraindicaciones, si las hay, y otras variables que
deberán ajustarse por el médico. La cantidad de estos materiales que
se usan típicamente en un ensayo de diagnóstico generalmente está
comprendida entre 0,1 y 5 mg, y preferiblemente entre 0,1 y 0,5
mg.
El ensayo de la presente invención también es
adecuado idealmente para la preparación de un kit. Dicho kit puede
comprender un medio de soporte que está compartimentalizado para
recibir uno o más medios de recipientes individuales asociados
tales como viales, tubos, y similares, comprendiendo cada uno de
dichos medios de recipiente los elementos separados del
inmunoensayo.
Por ejemplo, puede haber un medio de recipiente
que contiene un primer anticuerpo inmovilizado en un soporte en
fase sólida, y un medio de recipiente adicional que contiene un
segundo anticuerpo marcado de forma detectable en solución. Otros
medios de recipiente adicionales pueden contener soluciones patrón
que comprenden diluciones seriadas de la NTP a detectar. La
soluciones patrón de una NTP pueden usarse para preparar una curva
patrón con la concentración de NTP representada en el eje de las
abscisas y la señal de detección en el eje de las ordenadas. Los
resultados obtenidos a partir de una muestra que contiene una NTP
pueden interpolarse a partir de dicho gráfico para proporcionar la
concentración de la NTP.
Las proteínas de NTP codificadas por la molécula
de ADN AD3-4DH1 o fragmentos de esta invención
pueden obtenerse mediante la expresión de ADN recombinante como se
ha descrito anteriormente. Como alternativa, la NTP codificada por
la molécula de ADN AD3-4DH1 puede purificarse a
partir material biológico.
Para los fines de la presente invención, un
método de purificación que es ilustrativo, sin ser limitante,
consiste en las siguientes etapas.
Una primera etapa en la purificación de una NTP
codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 incluye
la extracción de la fracción de NTP de una muestra biológica, tal
como tejido cerebral o CSF, en tampones, con o sin agentes
solubilizantes tales como urea, ácido fórmico, detergente o
tiocianato.
Una segunda etapa incluye someter el material
solubilizado a cromatografía de intercambio iónico en columnas
Mono-Q o Mono-S (Pharmacia LKB
Biotechnology, Inc; Piscataway, NJ). De forma similar, el material
solubilizado puede separarse por cualquier otro proceso donde las
moléculas pueden separarse, por ejemplo, de acuerdo con la densidad
de carga, la distribución de carga y el tamaño molecular. La elución
de la NTP de la resina de intercambio iónico se controla mediante
un inmunoensayo, tal como M-IRMA, en cada fracción.
Después se dializan los picos inmunorreactivos, se liofilizan y se
someten a un tamiz molecular o cromatografía en gel.
El tamiz molecular o la cromatografía en gel es
un tipo de cromatografía de reparto en la que la separación se basa
en el tamaño molecular. Para este tipo de separación se usan
comúnmente geles de dextrano, poliacrilamida y agarosa. Un gel útil
para la presente invención es Sepharose 12 (Pharmacia LKB
Biotechnology, Inc.). Sin embargo, pueden usarse otros métodos
conocidos por los especialistas en la técnica para separar de forma
eficaz moléculas basándose en el tamaño.
Una cuarta etapa en un protocolo de purificación
para una NTP incluye el análisis de los picos inmunorreactivos por
electroforesis en gel de dodecil sulfato
sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE),
una etapa de purificación cromatográfica en gel adicional y
tinción, tal como, por ejemplo, tinción con plata.
Una quinta etapa en un método de purificación
incluye someter la NTP obtenida después de la
SDS-PAGE a cromatografía de afinidad, o a cualquier
otro procedimiento basado en la afinidad entre una sustancia a
aislar y una molécula a la que puede unirse específicamente. Para
la purificación adicional de una NTP puede usarse cromatografía de
afinidad en Sepharose conjugada con mAb anti-NTP
(tales como Th9 o mAb específicos generados contra la NTP
sustancialmente pura). Son útiles métodos alternativos tales como
HPLC de fase inversa o cualquier otro método caracterizado por una
separación rápida con una buena resolución de los picos.
Otro método para purificar la NTP codificada por
la molécula de ADN AD3-4DH1 es usar CSF concentrado
obtenido a partir de pacientes con AD. Para este procedimiento se
concentran 30-40 mililitros por liofilización o
filtración con Amicon o similares, y se someten a una
electroforesis bidimensional en gel. Las proteínas se separan en
una dirección por carga en un gradiente de pH y después se someten a
cromatografía de tamiz molecular en la otra dirección por
electroforesis en gel de poliacrilamida. Las proteínas
inmunorreactivas con NTP se identifican como manchas por los
anticuerpos monoclonales Th (por ejemplo, Th9) usando análisis de
transferencia de Western. El gel se corta y las proteínas NTP se
eluyen del gel. Las NTP purificadas de esta manera pueden
secuenciarse o usarse para obtener nuevos anticuerpos
monoclonales.
Se apreciará que el método preferido descrito
anteriormente puede sustituirse por otras etapas de purificación.
Los especialistas en la técnica podrán idear esquemas de
purificación alternativos sin experimentación indebida.
Las ribozimas proporcionan un método para
inhibir la función del ARNm. Las ribozimas pueden enzimas de ARN,
ARN de auto-empalme y ARN de
auto-escisión (Cech et al., Journal of
Biological Chemistry 267: 17479-17482
(1992)).
Es posible construir ribozimas de novo que
tengan una actividad endonucleasa dirigida en trans a una cierta
secuencia diana. Como estas ribozimas pueden actuar sobre diversas
secuencias, pueden diseñarse ribozimas para prácticamente cualquier
sustrato de ARN. De esta manera, las ribozimas son herramientas muy
flexibles para inhibir la expresión de genes específicos y
proporcionar una alternativa a construcciones antisentido.
Se ha construido satisfactoriamente una ribozima
contra el ARNm de la cloranfenicol acetiltransferasa (Haseloff
et al., Nature 334:585-591 (1988);
Uhlenbeck et al, Nature 328:596-600
(1987)). La ribozima contiene tres dominios estructurales: 1) una
región muy conservada de nucleótidos que flanquea el sitio de
escisión en la dirección 5'; 2) las secuencias muy conservadas
contenidas en los dominios de escisión naturales de ribozimas, que
forman un tallo de pares de bases; y 3) las regiones que flanquean
el sitio de escisión en los dos lados y aseguran la disposición
exacta de la ribozima en relación con el sitio de escisión y la
cohesión del sustrato y la enzima. Las enzimas de ARN construidas
de acuerdo con este modelo ya han demostrado ser adecuadas in
vitro para la escisión específica de secuencias de ARN (Haseloff
et al., supra).
Como alternativa, pueden usarse ribozimas de
horquilla en las que el sitio activo procede de la cadena menos del
ARN satélite del virus de las manchas anulares del tabaco (Hampel
et al., Biochemistry 28: 4929-4933
(1989)). Recientemente se diseñó una ribozima de horquilla que
escinde el ARN del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo I
(Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:10802-10806 (1992)). Otras actividades del
ARN de auto-escisión están asociadas con el virus
de la hepatitis delta (Kuo et al., J. Virol.,
62:4429-4444 (1988)).
Son dianas preferidas para las ribozimas de NTP
las secuencias de nucleótidos que no son homólogas a secuencias de
PTP. Preferiblemente, la molécula de ribozima de NTP de la presente
invención se diseña basándose en la ribozima de cloranfenicol
acetiltransferasa o ribozimas de horquilla, descritas anteriormente.
Como alternativa, se diseñan moléculas de ribozima NTP como se
describe por Eckstein et al., (Publicación Internacional Nº
WO 92/07065) que describen construcciones de ribozima
catalíticamente activas que tienen mayor estabilidad contra la
degradación química y enzimática, y que por lo tanto son útiles como
agentes terapéuticos.
En una estrategia alternativa, puede construirse
una secuencia guía externa (EGS) para dirigir la ribozima endógena,
RNasa P, al ARNm de NTP intracelular, que posteriormente se escinde
por la ribozima celular (Altman et al., Patente de Estados
Unidos Nº 5.168.053). Preferiblemente, la EGS de NTP comprende una
secuencia de 10 a 15 nucleótidos complementaria a un ARNm de NTP y
una secuencia de nucleótidos 3'-NCCA, donde N es
preferiblemente una purina (Id.). Después de administrar a
las células las moléculas EGS de NTP, como se describe más adelante,
las moléculas se unen a las especies de ARNm de NTP diana formando
pares de bases entre el ARNm de NTP y las secuencias de EGS de NTP
complementarias, promoviendo de esta manera la escisión del ARNm de
NTP por la RNasa P en el nucleótido en el lado 5' de la región que
forma pares de bases (Id.).
Como alternativa, pueden codificarse moléculas
de ARN antisentido de NTP, ribozimas de NTP y EGS de NTP por
construcciones de ADN que se administran en forma de viriones, que
preferiblemente son incapaces de replicar in vivo (véase,
por ejemplo, Taylor, documento WO 92/06693). Por ejemplo, estas
construcciones de ADN pueden administrarse usando virus basados en
el virus del herpes (Gage et al., Patente de Estados Unidos
Nº 5.082.670). Como alternativa, pueden codificarse secuencias de
ARN antisentido de NTP, ribozimas de NTP y EGS de NTP por
construcciones de ARN que se administran en forma de viriones, tales
como retrovirus. La preparación de vectores retrovirales es bien
conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Brown et al.,
"Retroviral Vectors", en DNA Cloning: A Practical
Approach, Volumen 3, IRL Press, Washington, D.C. (1987)).
Puede conferirse especificidad para la expresión
génica en el sistema nervioso central usado secuencias reguladoras
específicas para células apropiadas tales como potenciadores y
promotores con especificidad celular. Por ejemplo, estas secuencias
incluye las secuencias que regulan la expresión específica de
oligodendroglía del virus JC, la expresión específica de glía de la
proteína proteolipídica y los genes de la proteína ácida fibrilar
glial (Gage et al., supra). Como la fosforilación de
proteínas es crítica para la regulación neuronal (Kennedy,
"Second Messengers and Neuronal Function", en An
Introduction to Molecular Neurobiology, Hall, Ed., Sinauer
Associates, Inc. (1992)), pueden usarse secuencias promotoras de
proteína quinasa para conseguir niveles suficientes de expresión
génica de NTP.
De esta manera, puede usarse terapia génica para
aliviar la AD por medio de la inhibición de la expresión
inapropiada de la NTP codificada por la molécula de ADN
AD3-4HD1. Además, puede usarse terapia génica para
aliviar la AD proporcionando el nivel de expresión apropiado de una
forma particular de una NTP codificada por una molécula de ADN
AD3-4HD1. En este caso, pueden codificarse
secuencias de ácido nucleico de NTP particulares por construcciones
de ADN o ARN que se administran en forma de virus, como se ha
descrito anteriormente. Como alternativa, pueden modificarse
"células donadoras" in vitro usando vectores virales o
retrovirales que contienen secuencias de NTP, o usando otras
técnicas bien conocidas para introducir ADN extraño en las células
(véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra). Estas
células donadoras incluyen fibroblastos, células neuronales, células
de glía y células de tejido conectivo (Gage et al.,
supra). Después de la manipulación genética, las células
donadoras se injertan en el sistema nervioso central y, de esta
manera, las células modificadas genéticamente proporcionan la forma
terapéutica de NTP (Id.).
Además, estos viriones pueden introducirse en la
corriente sanguínea para administrarse al cerebro. Esto se consigue
por medio de la ruptura osmótica de la barrera hematoencefálica
antes de la administración de los viriones (véase, por ejemplo,
Neuwelt, Patente de Estados Unidos Nº 4.866.042). La barrera
hematoencefálica puede romperse por medio de la administración de
una solución hipertónica, no tóxica. farmacéuticamente eficaz tal
como manitol, arabinosa o glicerol (Id.).
Los siguientes clones en E. coli se
depositaron de acuerdo con el tratado de Budapest con la Colección
Americana de Cultivos Tipo (12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland, 20852); G2-2 Pstl-DH5
(ATCC Nº 69257); G5d-PstI-DH5 (ATCC
Nº 69258); 1-9a-LX-1
blue (ATCC Nº 69259); AD3-4-DH1
(ATCC Nº 69260); HB4-XL-blue (ATCC
Nº 69261); AD10-7-DH1 (ATCC Nº
69262); AD2-2-DH1- (ATCC Nº 69263);
G5d-1PstI-EcoRI-DH5
(ATCC Nº 69264); y
G2-2PstI-EcoRI-DH5
(ATCC Nº 69265).
Habiendo descrito la invención en general, se
entenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes
ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden
limitar la presente invención a menos que se especifique de otra
manera.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se identificaron siete líneas celulares
procedentes del sistema nervioso central que expresan
inmunorreactividad con proteínas de la cadena usando el anticuerpo
monoclonal Th9 que se generó contra la forma pancreática de la
proteína (Gross et al., J. Clin. Invest.
76:2115-2126 (1985)), pero presenta reacción
cruzada con proteínas de la cadena presentes en tejido cerebral y
líquido cefalorraquídeo (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86:419-423 (1989); de la Monte et
al., J. Clin. Invest. 86:1004-1013
(1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci.
113:152-164 (1992); de la Monte et al.,
Ann. Neurol. 32:733-742 (1992)). Entre ellas
se encontraban las siguientes: dos líneas celulares de tumor
neuroectodérmico primitivo (PNET) denominadas PNET1 y PNET2; tres
líneas celulares de glioblastoma Hg1 16, Hg1 17 y C6; la línea de
células gliales A172; y la línea celular de neuroblastoma
SH-Sy5y. Las líneas celulares de glioblastoma y las
células A172 se obtuvieron a partir de la Colección Americana de
Cultivos Tipo (ATCC). Las células SH-Sy5y se
obtuvieron a partir de Dr. Biedler en el
Sloan-Kettering Memorial Hospital. Las líneas
celulares PNET se han descrito previamente (The et al.,
Nature genetics 3:62-66 (1993)), y se
obtuvieron a partir de Dr. Rene' Bernards en el MGH Cancer Center.
Todas las líneas se mantuvieron en medio de Eagle Modificado por
Earl suplementado con suero bovino fetal al 10% y sin
antibióticos.
Para examinar las células con respecto a la
proteína de la cadena y otras inmunorreactividades, los cultivos se
recogieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (NaCl 137
mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 4,3 mM, KH_{2}PO_{4} 1,4 mM;
pH 7,3) que contenía EDTA 2 mM, y se hicieron preparaciones de
citocentrifugación usando 10^{5} células por portaobjetos. Las
preparaciones de citocentrifugación se fijaron inmediatamente en
metanol al 100% (-20ºC), se secaron al aire y después se almacenaron
a -80ºC hasta que se usaron. Antes de la inmunotinción, los
portaobjetos se equilibraron a temperatura ambiente y se hidrataron
en PBS. La unión de anticuerpo no específica se bloqueó con suero
de caballo no inmune al 3%. Se incubaron preparaciones de
citocentrifugación repetidas procedentes de los mismos cultivos
durante una noche a 4ºC con 5 ó 10 \mug/ml de anticuerpo
primario. La inmunorreactividad se reveló por el método de
peroxidasa de rábano picante con avidina-biotina
usando el kit Vectastain Elite (Vector Laboratories, Burlingame, CA)
de acuerdo con el protocolo del fabricante, y con
3,3'-diaminobenzidina (0,5 mg/ml más peróxido de
hidrógeno al 0,03%) como cromógeno. Las células después se tiñeron
con hematoxilina como colorante de contraste, se deshidrataron en
soluciones de alcohol graduadas, se aclararon en xilenos y se
conservaron bajo cubreobjetos con Permount (Fisher Scientific).
Se inmunotiñeron preparaciones de
citocentrifugación de cada línea celular con los anticuerpos
monoclonales de la proteína de la cadena Th9, Th7, Th10, Th29,
Th34, TH46, Th67 y Th90. Además, se inmunotiñeron portaobjetos de
réplica con anticuerpos monoclonales de control positivos
(neurofilamento, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y vimentina)
y negativos (desmina, antígeno de superficie de hepatitis
B-5C3). Con la excepción de 5C3, que se generó en
el laboratorio del inventor (Fujita et al.,
Gastroenterology 91: 1357-1363 (1986)), los
anticuerpos de control se compraron
(Boehringer-Mannheim). Todos los reactivos
serológicos se diluyeron en PBS que contenía albúmina de suero
bovino (BSA) al 1% y todas las incubaciones excepto la que tenía
anticuerpo primario se realizaron a temperatura ambiente en cámaras
humidificadas. Los portaobjetos se lavaron en tres cambios de PBS
entre cada etapa.
Tanto las células PNET1 como las células PNET2
expresaban proteínas de neurofilamento de peso molecular alto y
medio y poca o ninguna proteína ácida fibrilar glial o vimentina.
Las células PNET1, PNET2 y SH-Sy5y expresaban
GAP-43, una fosfoproteína de unión a calmodulina
abundante que está muy expresada en neuronas inmaduras y en
neuronas que experimentan un crecimiento celular regenerativo
(Benowitz et al., J. Neurosci.
3:2153-2163 (1983); DeGraan et al.,
Neurosci Lett 61:235-241 (1985); Kalil et
al., J. Neurosci. 6:2563-2570 (1986)).
Las células A172 y C6 expresaban GFAP y vimentina. Sin embargo,
A172 también presentaba inmunorreactividad de neurofilamentos, lo
cual suscitó dudas sobre su naturaleza puramente de células gliales.
Ninguna de las líneas celulares manifestó inmunorreactividad con
anticuerpos monoclonales contra desmina o antígeno de superficie de
hepatitis B. Como línea celular de control negativo, se inmunotiñó
de forma similar la línea celular de carcinoma hepatocelular Huh7 y
se descubrió que no presentaba ninguna inmunorreactividad con los
anticuerpos anteriores. Sin embargo, las células Huh fueron
inmunorreactivas con anticuerpos monoclonales contra la proteína
sustrato del receptor de insulina IRS-1 (datos no
mostrados) que se usó como control positivo para esta línea celular
(Sasaki et al., J. Biol. Chem. 268:
1-4 (1993)).
Usando el anticuerpo monoclonal Th9, se detectó
inmunorreactividad de la proteína de la cadena en PNET primarias
(A), glioblastoma primario (F), PNET1 (B) y células C6 (G), pero no
en líneas de células de carcinoma hepatocelular (Figuras
1A-1J). Además, se detectó inmunorreactividad de Th9
en secciones histológicas de 8 de las 9 PNET de SNC humanas
primarias, y de los 5 glioblastomas humanos primarios estudiados
(Figuras 1A-1J). Aunque las 5 líneas celulares
presentaron una inmunorreactividad intensa con el anticuerpo
monoclonal Th9, diferían con respecto a la inmunorreactividad para
otros anticuerpos monoclonales Th. La reacción de inmunotinción
generada con los anticuerpos monoclonales Th10 (C, H), Th7 (D, I) o
Th46 era de bajo nivel (C, D) o estaba ausente (H, I, E, J) en
PNET1 (C-E) y C6 (H-J). Las células
PNET2 presentaron únicamente bajos niveles de inmunorreactividad
con Th7 y Th29 y no manifestaron ninguna inmunotinción con los otros
anticuerpos monoclonales Th. Las células A172, C6 y
SH-Sy5y presentaban una inmunorreactividad pequeña o
nula con anticuerpos monoclonales Th distintos de Th9. Las células
Huh7 no presentaban ninguna inmunorreactividad con ninguno de los
anticuerpos monoclonales de la proteína de la cadena empleados,
mientras que el tejido pancreático humano era inmunorreactivo con
todos los anticuerpos Th que se habían generado contra la forma
pancreática purificada de la proteína de la cadena (Gross et
al., J. Clin. Invest. 76:2115-2126
(1985)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se lavaron células cultivadas en PBS y se
recuperaron en PBS que contenía EDTA 2 mM. Las células se
sedimentaron por centrifugación a 1000 x g durante 15 minutos y
después se resuspendieron en tampón de lisis que contenía
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), Tritón
X-100 al 1%, EGTA 2 mM, EDTA 10 mM, NaF 100 mM,
Na_{4}P_{2}O_{7} 1 mM, Na_{3}VO_{4} 2 mM, 100 \mug/ml
de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 \mug/ml de aprotinina, 1
\mug/ml de pepstatina A y 1 \mug/ml de leupeptina. Las
fracciones de sobrenadante obtenidas por centrifugación de los
lisados a 14.000 x g durante 10 minutos se usaron para el análisis
de transferencia de Western, los estudios de inmunoprecipitación y
M-IRMA. La concentración de proteínas se determinó
por el ensayo colorimétrico de Lowry. Las muestras se almacenaron a
-40ºC.
M-IRMA es un ensayo de tipo
sándwich directo de dos o tres sitios muy sensible que permite la
cuantificación de NTP picomolar en lisados celulares, medio de
cultivo de tejidos, homogeneizados de tejidos y fluidos corporales
(Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA
86:419-423 (1989); de la Monte et al.,
J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990); de la
Monte et al., J. Neurol. Sci.
113:152-164 (1992); de la Monte et al.,
Ann. Neurol 32:733-742 (1992); Gross et
al., J. Clin. Invest. 76:2115-2126
(1985)). Además, cuando se combina con SDS-PAGE,
M-IRMA puede usarse para determinar el tamaño
molecular de proteínas de la cadena y especies relacionadas (Ozturk
et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA
86:419-423 (1989); de la Monte et al.,
J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990); de la
Monte et al., J. Neurol. Sci.
113:152-164 (1992), de la Monte et al.,
Ann. Neurol 32:733-742 (1992)).
M-IRMA implica la captura de las proteínas de la
cadena inmunorreactivas presentes en muestras biológicas usando
anticuerpos monoclonales Th7 y Th10 fijados a una matriz en fase
sólida, y la posterior detección del antígeno capturado con un
tercer anticuerpo monoclonal indicador radiomarcado (Th9) contra la
misma proteína. En resumen, se recubrieron perlas de poliestireno
de 1/4 de pulgada (0,635 cm) (Precision Ball, Inc.) con uno o dos
anticuerpos monoclonales contra proteínas de la cadena (normalmente
Th7 + Th10). Se incubaron lisados celulares o fracciones del
sobrenadante de homogeneizados de tejido (Ozturk et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:419-423 (1989);
de la Monte et al., J. Clin. Invest.
86:1004-1013 (1990); de la Monte et al.,
J. Neurol. Sci. 113:152-164 (1992), de la
Monte et al., Ann. Neurol 32:733-742
(1992)) durante una noche con las perlas recubiertas para capturar
proteínas de la cadena presentes en las muestras. Las perlas se
lavaron 5 veces con PBS y después se incubaron con Th9 marcado con
^{125}I como indicador para detectar las proteínas de la cadena
capturadas. La concentración de proteína de la cadena en el lisado u
homogeneizado de tejidos se determinó a partir de una curva patrón
generada con cantidades conocidas de proteína de la cadena
purificada. Este ensayo de alta sensibilidad puede detectar una
cantidad tan pequeña como 10 pmol de proteína de la cadena en
solución. Para ensayar proteínas de la cadena fraccionadas por
SDS-PAGE, los geles en húmedo se cortaron a
intervalos de 2 mm y las proteínas se eluyeron de cada fracción en
0,5 ml de PBS por agitación durante 24 horas a temperatura
ambiente. En los eluatos se ensayaron directamente las proteínas de
la cadena por M-IRMA.
En correspondencia con la tinción
inmunocitoquímica generalizada de células PNET1 con Th7, Th10, Th34
y Th29, se midió fácilmente la inmunorreactividad de proteínas de
la cadena en estas células por M-IRMA. En otras
palabras, con anticuerpos monoclonales (MoAb) Th7, Th10, Th34 y Th29
usados como anticuerpos de captura, de forma individual o con dos
de ellos juntos, y Th9 marcado con ^{125}I usado como indicador,
se midieron niveles similarmente elevados de proteína de la cadena
(Figura 2). Por el contrario, en células PNET2, C6 y A172, que
presentaron una inmunorreactividad intensa con Th9 pero una tinción
inmunocitoquímica pequeña o nula con los anticuerpos monoclonales
Th que se usaron para capturar el antígeno, los niveles de proteína
de la cadena detectados por M-IRMA fueron mucho
menores que los medidos en células PNET1 (Figura 2). De forma
similar, las células Huh7, que no manifestaban ninguna tinción
inmunocitoquímica con ninguno de los anticuerpos monoclonales de la
proteína de la cadena, tuvieron niveles prácticamente indetectables
de proteína de la cadena en los lisados celulares según
M-IRMA. Las concentraciones de proteína de la cadena
de los lisados celulares se calcularon a partir de una curva patrón
generada con PTP purificada usando Th7 y Th10 como anticuerpos de
captura. Los resultados se expresaron como media \pm S.D. Los
pg/mg de proteína total fueron los siguientes:
PNET1-13,1 \pm 0,39; PNET2-2,06
\pm 0,10; A172-3,38 \pm 0,37;
C6-2,52 \pm 0,22; y Huh7-0,34
\pm 0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
En un análisis de transferencia de Western se
fraccionaron muestras que contenían 100 \mug de proteína por
SDS-PAGE, junto con patrones de peso molecular
marcados previamente. Las proteínas se transfirieron a membranas de
nylon (membrana de transferencia Immobilon-P,
Millipore) usando un aparato de transferencia semiseco (Integrated
Systems). Las membranas se lavaron en solución salina tamponada con
Tris (TBS; Tris 10 mM, cloruro sódico al 0,85%, pH 7,5) y después
se bloquearon con TBS que contenía BSA al 3%. Las manchas de
transferencia se incubaron durante una noche a 4ºC con anticuerpo
monoclonal Th9 marcado con ^{125}I. Se retiró la sonda unida de
forma no específica lavando las membranas a temperatura ambiente en
TBS-BSA 3 veces durante 15 minutos y una vez
durante 30 minutos. Los resultados se analizaron por
autorradiografía usando una película Kodak XAR.
Para preparar muestras para los estudios de
inmunoprecipitación, se usaron muestras de 1 mililitro de lisado
celular que contenía aproximadamente 1 mg/ml de proteína para los
estudios de inmunoprecipitación. Los lisados inicialmente se
preaclararon con anticuerpo no relevante (5C3 o antidesmina) y
después con proteína A Sepharose. Se inmunoprecipitaron proteínas
de la cadena usando 5-10 \mug de Th9 y Proteína A
Sepharose (Sasaki et al., J. Biol. Chem.
268:1-4 (1993)). Los complejos inmunes recogidos
por centrifugación se resuspendieron en tampón que contenía SDS al
2% y \beta-mercaptoetanol 10 mM y después se
sometieron a SDS-PAGE en condiciones
desnaturalizantes y reductoras (Id.). Simultáneamente se
analizaron los lisados celulares brutos (100 \mug de proteína).
Las proteínas se transfirieron a membranas
Immobilon-P y se sondaron con Th9 marcado con
^{125}I (Id.) para detectar proteínas de la cadena y
moléculas relacionadas. De forma simultánea se realizaron
experimentos de control negativo usando anticuerpos monoclonales
contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (5C3) o contra
desmina.
Se realizaron experimentos de marcaje metabólico
usando monocapas de células cultivadas en placas Petri de 100
mm^{2}. Antes del marcaje, las células se expusieron a medio sin
metionina y sin cisteína durante 2 horas. El medio después se
remplazó por 3 ml de DMEM que contenía 300 \muCi de [^{35}S]
metionina o [^{35}S] cisteína. Después del marcaje durante 3
horas, las células se incubaron durante varios intervalos con medio
completo carente de aminoácidos radiomarcados y suplementado con
metionina 10 mM. Los lisados celulares se prepararon como se ha
descrito anteriormente. Se inmunoprecipitaron proteínas de la cadena
usando el anticuerpo monoclonal Th9 y proteína A Sepharose, y los
productos de inmunoprecipitación se analizaron por
SDS-PAGE y autorradiografía en película.
Para los estudios de fosforilación in
vivo, se lavaron células cultivadas como se ha descrito para los
estudios de marcaje metabólicos dos veces con TBS y se incubaron
durante 2 horas con MEM de Dulbecco sin fosfato que contenía suero
bovino fetal dializado al 10%. Después, las células se lavaron con
TBS y se incubaron durante 3 horas con el mismo medio que contenía
400 \muCi/ml de ácido [^{32}P] ortofosfórico. Los lisados
celulares se analizaron por inmunoprecipitación con proteína de la
cadena y anticuerpos monoclonales de control tanto positivos (p36)
como negativos (desmina), seguido de SDS-PAGE.
Para estudiar el estado de glicosilación de
proteínas de la cadena neural, se sometieron lisados de cultivos
celulares que contenían aproximadamente 100 \mug de proteína a
SDS-PAGE y las proteínas fraccionadas se
transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore).
Se detectaron O- y N-glicanos por oxidación con
peryodato seguido de biotinilación y después por análisis de
transferencia de Western con una sonda de fosfatasa
alcalina-estreptavidina y NBT/BCIP como sustrato
colorimétrico. Los ensayos se realizaron usando el kit GlycoTrack
(Oxford Glycosystems, Rosedale, NY) de acuerdo con el protocolo
proporcionado por el fabricante.
Se detectaron proteínas inmunorreactivas con Th9
en lisados de PNET1, PNET2, SH-Sy5y, C6 y células
A172 por cuatro métodos diferentes: análisis de transferencia de
Western, inmunoprecipitación seguido de análisis de transferencia
de Western, marcaje metabólico seguido de inmunoprecipitación y
SDS-PAGE combinada con M-IRMA. El
análisis de transferencia de Western de lisados celulares brutos
usando Th9 marcado con ^{125}I demostró bandas de \sim21 kDa en
las líneas celulares anteriores (como se indica por la flecha en la
Figura 3), pero la intensidad de la señal fue baja. Por el
contrario, en lisados de tejido pancreático humano, las formas no
escindida de 17 kDa y escindida de 14 kDa esperadas de la proteína
de la cadena pancreática se detectaron fácilmente por análisis de
transferencia de Western (Figura 3). No se detectaron proteínas de
la cadena en lisados de líneas celulares de carcinoma hepatocelular
humano. Esta abundancia sorprendentemente mayor de proteínas de la
cadena en tejido pancreático en comparación con líneas celulares
gliales y neuronales es coherente con el descubrimiento previo de
niveles 10 veces mayores de proteínas de la cadena en el páncreas y
en el jugo pancreático en comparación con el tejido cerebral y el
líquido cefalorraquídeo (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad.
Sci USA 86:419-423 (1989); de la Monte et
al., J. Clin. Invest. 86:1004-1013
(1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci.
113:152-164 (1992), de la Monte et al.,
Ann. Neurol 32:733-742 (1992). Aunque sería
de esperar que las proteínas de la cadena sintetizadas por células
PNET y células gliales se secretaran como ocurre en el caso de PTP
y NTP, no se detectaron proteínas de la cadena en el medio de
cultivo de tejidos por análisis de transferencia de Western,
incluso después de la concentración del medio cuatro o cinco veces
por
liofilización.
liofilización.
Se detectaron más fácilmente proteínas de la
cadena inmunorreactivas con Th9 en PNET y líneas de células gliales
primero por inmunoprecipitación de los lisados con Th7 + Th10 o Th9,
y después realizando un análisis de transferencia de Western usando
Th9 marcado con ^{125}I (directo) (Figura 3) o Th9 no marcado con
Proteína A marcada con ^{125}I (indirecto). Los dos métodos
demostraron la presencia de especies relacionadas con la proteína de
la cadena de 21 kDa similares a las detectadas por análisis de
transferencia de Western. Además, también se observaron bandas de
\sim17 kDa en células PNET y células gliales, pero la señal fue
incoherente y de bajo nivel, como se determinó por análisis de
transferencia de Western. Como controles negativos se estudiaron
simultáneamente las líneas celulares de carcinoma hepatocelular
humano Huh7, HepG2 y FOCUS (Lun et al., In Vitro
(Rockville) 20:492-504 (1984)) en condiciones
idénticas, y no se detectaron proteínas inmunorreactivas con Th9 en
los lisados celulares.
Los tamaños moleculares de las proteínas de la
cadena presentes en células PNET y gliales se demostraron de manera
más prominente por marcaje metabólico con
^{35}S-metionina o
^{35}S-cisteína, seguido de inmunoprecipitación
usando anticuerpo monoclonal Th9. Como controles negativos para la
inmunoprecipitación se usaron anticuerpos monoclonales contra
desmina o contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (5C3).
Tanto en las líneas celulares PNET como en las gliales, se
detectaron proteínas inmunorreactivas con Th9 de \sim26 y \sim21
kDa por análisis de SDS-PAGE de los productos
inmunoprecipitados (Figura 4B). En células PNET1, la banda de 21 kDa
parecía como un doblete (Figura 4A); las especies de peso
molecular ligeramente mayor acompañantes parecían ser menos
abundantes que la banda dominante a \sim21 kDa. Además, en las
líneas celulares PNET y gliales, también había proteínas
inmunorreactivas con Th9 de \sim17 kDa asociadas con bandas de
casi la misma intensidad que las bandas de \sim21 kDa. En las
células C6 también había proteínas inmunorreactivas con Th9 de
\sim26 kDa, \sim14-15 kDa y \sim8 kDa que no
se detectaron en células PNET (Figuras 4A y 4B, flechas).
También se demostró la presencia de las
proteínas de la cadena de 21 kDa y 17 kDa en las células
SH-Sy5y, PNET1, A172 y C6, y su ausencia en las
células de carcinoma hepatocelular por
SDS-PAGE/M-IRMA (Figuras
5A-5E). Se eluyeron proteínas celulares
fraccionadas por SDS-PAGE de los geles cortados a
intervalos de 2 mm, y se ensayaron directamente con respecto a la
inmunorreactividad de la proteína de la cadena por
M-IRMA usando Th7 + Th10 como anticuerpos de
captura y Th9 marcado con ^{125}I como indicador. A pesar de los
bajos niveles, fueron evidentes dos picos característicos en todas
las líneas celulares neuroectodérmicas, pero no en las células de
carcinoma hepatocelular Huh7 ensayadas simultáneamente y de la misma
manera. La resolución de estos geles no permitió la distinción de
las proteínas de \sim17 kDa de las proteínas de
\sim14-15 kDa que podrían haber estado
presentes.
Se marcaron metabólicamente células PNET1 y C6
con ^{32}P o ^{35}S-metionina, y se
inmunoprecipitaron proteínas de la cadena a partir de los lisados
usando anticuerpo monoclonal Th9 (Figura 6). Como control negativo
se realizaron estudios de inmunoprecipitación usando una parte igual
del lisado celular y anticuerpos monoclonales contra la proteína
desmina (Figura 6, panel derecho). En las células marcadas con
^{35}S-metionina, se detectaron bandas
inmunorreactivas con Th9 a \sim26 kDa y \sim21 kDa (flechas
superiores), \sim17 kDa (flechas inferiores) y también a
\sim14-15 kDa (Figura 6). Después del marcaje con
^{32}P, sólo se observó la banda de 21 kDa por
inmunoprecipitación con anticuerpo monoclonal Th9, las otras
especies de peso molecular no parecían estar fosforiladas (Figura
6). Se detectaron proteínas inmunorreactivas con Th9 fosforiladas en
células C6, pero no en células PNET1, pero esto podría deberse al
marcaje menos eficaz ya que las células PNET1 crecen más lentamente
que las células C6. No se detectaron bandas en el intervalo de 14
kDa a 26 kDa usando anticuerpos monoclonales contra desmina para
inmunoprecipitación (Figura 6). No se detectaron restos de
carbohidrato en proteínas inmunoprecipitadas con Th9 (datos no
mostrados).
Las mayores concentraciones de proteína de la
cadena se midieron en cultivos subconfluentes de células PNET1, es
decir durante la fase logarítmica de crecimiento, y las menores
concentraciones en cultivos privados de suero durante una noche
(crecimiento detenido) (Figura 7). Los cultivos que tuvieron una
confluencia de 100% también tuvieron menores niveles de expresión
de proteína de la cadena en comparación con los cultivos en
proliferación. Simultáneamente se estudiaron células de carcinoma
hepatocelular Huh7 (control negativo) usando condiciones de cultivo
idénticas, pero los niveles de proteína de la cadena permanecieron
bajos durante todo el tiempo.
Sorprendentemente, no hubo ningún cambio en el
grado de tinción inmunocitoquímica de proteína de la cadena de
células PNET cultivadas en estas diversas condiciones. Sin embargo,
es posible que el grado en el que los niveles de proteínas de la
cadena cambiaron por medición con M-IRMA no se
detecte por inmunocitoquímica. No obstante, la reducción en el
contenido de proteína de la cadena celular inducida por privación de
suero se asoció con un cambio en el fenotipo de las células. Cuando
las células alcanzaron una confluencia de 100% o después de haberse
sometido a privación de suero durante una noche, los cuerpos
celulares redujeron su tamaño y presentaron cambios sorprendentes
en el grado y distribución de inmunorreactividad para la proteína de
neurofilamento, GAP-43, y GFAP (Figura 8). En
cultivos de PNET que tenían una confluencia de 50%, las células se
presentaron una distribución punteada y a menudo polar del
neurofilamento e inmunorreactividad con GAP-43,
mientras que los cultivos con una confluencia de 100% y los
cultivos de PNET privados de suero presentaron inmunorreactividad
pericarial difusa tanto para el neurofilamento como para
GAP-43. La inmunorreactividad punteada podría
corresponder a la distribución del neurofilamento y
GAP-43 en las neuritas. Por el contrario, los
cultivos de PNET con una confluencia de 50% carecían de
inmunorreactividad con GFAP, mientras que los cultivos con una
confluencia de 100% y privados de suero contenían proporciones
visibles de células positivas para GFAP. Además, la proporción de
células inmunorreactivas con GFAP fue máxima en cultivos privados de
suero con una confluencia de 100%, seguida de cultivos privados de
suero con una confluencia de 50% y después de cultivos con una
confluencia de 100% con medio que contenía suero bovino fetal al
10%. Por lo tanto, la reducción en los niveles de proteína de la
cadena medidos en células PNET sometidas a una privación de suero
durante una noche puede haberse debido a la diferenciación de las
células hacia un fenotipo astrocítico. Las células C6 y otras líneas
celulares de glioblastoma presentaron una inmunorreactividad
intensa con el anticuerpo monoclonal Th9, pero los niveles de
proteína de la cadena medidos por M-IRMA a menudo
fueron bajos, posiblemente debido al bajo nivel de
inmunorreactividad con otros anticuerpos de proteína de la cadena,
incluyendo Th7 y Th10 (véanse las Figuras
1A-1J).
1A-1J).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se seleccionaron bibliotecas de ADNc de cerebro
humano preparadas a partir de cerebro fetal de 17-18
semanas de edad (Stratagene, Inc., La Jolla, CA), neocórtex de
lóbulo temporal de 2 años de edad (Stratagene) y corteza cerebral
con enfermedad de Alzheimer en fase terminal (In Vitrogen San Diego,
CA) usando sondas generadas a partir de un fragmento de ADN de 416
pb correspondiente a los nucleótidos 235-650 del
ADNc de PTP de rata. El ADNc de PTP de rata, denominado O18, se
aisló a partir de una biblioteca de ADNc pancreático de rata usando
sondas de ADN 60méricas sintéticas correspondientes a los
nucleótidos 45-104 y 345-404 de la
secuencia publicada (Terazono et al., J. Biol. Chem.
263:2111-2114 (1998); Watanabe et al.,
J. Biol. Chem. 265:7432-7439 (1990)). Se
seleccionaron aproximadamente 2 x 10^{6} placas o colonias de cada
biblioteca con hibridación de baja rigurosidad usando técnicas
convencionales (véase Sambrook et al., supra). Los
supuestos clones se purificaron en placa/colonias y los insertos de
ADN se secuenciaron por el método de terminación de cadena
didesoxinucleótido usando polimerasa de T7 (USB Sequense, United
States Biochemical Corp., Cleveland, OH). Las secuencias se
compararon con la base de datos Genebank y se alinearon con las
secuencias de ácido nucleico de otros ADNc de proteínas de
la
cadena.
cadena.
Se aisló un ADNc parcial de proteína de la
cadena del SNC 1-9a de 1,3 kilobases (kb) en la que
sólo un pequeño segmento corresponde a una fase de lectura abierta,
y el resto a una región 3' no traducida (Figura 9A). La secuencia
de 150 nucleótidos adicionales se obtuvo a partir de los productos
de amplificación de PCR de anclaje 5'. Una segunda vuelta de
amplificación por PCR de anclaje 5' produjo un producto adicional de
600 pb cadena arriba (Figura 9b). Una parte de la secuencia de ADNc
de 1-9a comparte una homología significativa con el
extremo 5' del ADNc de PTP humana y el gen Reg (Figura 10A). Además,
el producto de PCR de anclaje 5' inicial tiene una homología de 60%
con el extremo 5' del gen Reg, y una homología de 63% con el Exón 2
del gen Reg humano (Figura 10B). Además, las sondas generadas a
partir del fragmento terminal 5' de 590 pb del ADNc de
1-9a hibridó con ARNm de cerebro y páncreas humanos
(Figuras 12A-12C). La secuencia de
1-9a también es homóloga a los ADNc de
AD2-2 y AD3-4, ya que los
solapamientos son sustanciales en un extremo de sus secuencias
completadas (Figura 10B).
El clon HB4 es un ADNc parcial de 593 pares de
bases que se aisló a partir de una biblioteca de corteza temporal
de dos años de edad. Este ADNc contiene una fase de lectura abierta
en su extremo 5' y termina en el nucleótido 275. Hay una señal de
poliadenilación que empieza en el nucleótido 475 y la secuencia
termina con una cola de poli A (Figura 11D). La secuencia de
aminoácidos deducida del clon HB4 parcial predice una proteína con
un peso molecular de 10,4 kDa y un pI de 12,1. El ADNc de HB4
presenta una homología de ácido nucleico global de 50% con el ADNc
de PTP humana (Figura 11E), un segmento del gen Reg humano (Figura
11E).
Usando la sonda de ADNc de PTP de rata O18, se
aislaron cuatro ADNc relacionados a partir de una biblioteca de
cerebro con AD. Estos clones se denominaron: AD 2-2,
AD 3-4, AD 4-4 y AD 16c (también
denominado AD 10-7) (Figuras
16D-16S).
El ADNc de AD 2-2 tiene
aproximadamente 1,2 kb y comparte una homología significativa con el
ADNc de 1-9a, AD 16c, ADNc de PTP de rata y el Exón
1 del gen Reg humano (Figura 17). La sonda de AD 2-2
genera un patrón de transferencia de Southern genómico similar al
obtenido con la sonda AD 3-4. La Figura 16E
representa la secuencia de nucleótidos completa del clon de ADNc de
AD 2-2 que aisló a partir de una biblioteca de
cerebro con AD. Las sondas generadas con cebador aleatorio basadas
en esta secuencia hibridaron con muestras de cerebro humano y
neuronales, pero no con líneas de células gliales con ARN
pancreático.
Las Figuras 16F, 16I, 16J y 16K representan
secuencias de nucleótidos parciales de los clones de ADNc de AD
3-4, que se aislaron a partir de una biblioteca de
cerebro con AD. Las sondas de AD 3-4 generadas con
cebadores aleatorios produjeron dos transcritos de ARNm de 1,6 kB y
3,4 kB. Estas especies de ARNm se sobreexpresan en cerebros con AD,
con una elevación media al doble en comparación con controles de
edad similar (N = 8).
El clon de 1,6 kb de ADNc de AD
3-4 es idéntico a otro clon aislado al mismo tiempo
(AD 5-3) (Figura 18A). El ADNc de AD
3-4/AD 5-3 presenta una homología
sustancial con productos de PCR de anclaje 5' 1-9a
(Figura 18B), así como con el gen Reg humano y el clon genómico
Gen2a-EP (Figura 18B). El análisis de transferencia
de Southern del ADN genómico humano con la sonda AD
3-4 reveló un patrón similar al obtenido con la
sonda de AD 2-2.
Las Figuras 16L y 16M representan la secuencia
de nucleótidos parcial de AD 4-4 que es un clon de
ADNc parcial de 0,8 kb que es idéntico a otro ADNc aislado al mismo
tiempo (AD 3-5). Este clon de AD 4-4
comparte una homología de secuencia sustancial con los ADNc de AD
2-2 y 1-9a (Figura 19). La Figura
16N representa la secuencia de nucleótidos completa de un clon de
ADNc parcial aislado a partir de una biblioteca de cerebro con AD.
Este ADNc hibridaba con ARNm de líneas celulares de cerebro y
neuronales, produciendo un solo transcrito de 1,4 kB.
La Figura 16O representa la secuencia de
nucleótidos del clon de ADNc parcial de 0,5 kb AD 16c (también
denominado AD 10-7) que tiene una homología de 72%
con AD 2-2 y también se alinea con las secuencias de
PTP humana y del gen Reg humano (Figuras 20A y 20B).
La Figura 16R representa la secuencia de
nucleótidos completa del clon AD10-7 que se aisló a
partir de una biblioteca de cerebro con AD. La hibridación de
transferencias de Northern usando sondas de ARNc antisentido o
sondas de ADNc generadas con cebadores aleatorios detectó
transcritos de ARNm 2,6, 1,9, 1,4 y 0,9 kB en células neuronales.
Las líneas de células neuronales expresaban sólo los dos transcritos
más grandes, mientras que los cerebros humanos adultos maduros
expresaban predominantemente los dos transcritos más pequeños y
niveles muy bajos o no detectables de los transcritos de 2,6 kB y
1,9 kB. Usando una sonda de AD10-7, el análisis de
transferencia de Northern del ARN obtenido a partir de hígado,
ovario, trompa de Falopio, colon, estómago, bazo, recto, tiroides,
placenta de 12 semanas y riñón humanos fueron negativos.
En la Figura 16S se representa la secuencia de
nucleótidos completa del clon de ADNc de AD 16c que se aisló a
partir de una biblioteca de cerebro con AD. La hibridación de
transferencias de Northern usando sondas de ADN generadas con
cebadores aleatorios produjo los mismos resultados que se obtuvieron
con el clon de ADNc de AD10-7. El clon AD 16c
comparte un segmento de 650 pb casi idéntico con AD
10-7. Además, se detectaron niveles elevados de
ARNm de AD 16c en cerebros con AD en comparación con los cerebros de
control de edad por análisis de transferencia de Northern.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se examinó la expresión de ARNm de proteína de
la cadena en las siguientes líneas celulares derivadas de tumores
neuroectodérmicos: células de tumor neuroectodérmico primitivo del
sistema nervioso central denominadas PNET1 y PNET2; células de
glioblastoma humano HGL-16 y HGL-17;
células de glioma humano A172; células de glioma de rata C6; y
células de neuroblastoma SH-Sy5y. Además, se
ensayaron tejidos cerebrales humanos de pacientes con enfermedad de
Alzheimer o sin enfermedad neurológica (controles de edad) y cerebro
de rata embrionario y desarrollado después del nacimiento con
respecto a la expresión de ARNm de proteína de la cadena. El ARN
extraído a partir de páncreas humano y de rata sirvió como control
positivo.
Se extrajo ARN en isotiocianato de guanidinio 5
M y después se aisló por centrifugación a través de un gradiente
por etapas de cloruro de cesio (véase Sambrook et. al.,
supra). El ARN se cuantificó midiendo la absorbancia a 260
nm y 280 nm. Los tamaños de los transcritos de ARNm de la proteína
de la cadena se evaluaron por análisis de transferencia de Northern
y los niveles de expresión se evaluaron por hibridación dot blot del
ARN. El análisis de transferencia de Northern se realizó sometiendo
a electroforesis muestras que contenían 15 \mug de ARN celular
total a través de geles de agarosa-formaldehído al
1%. El ARN se transfirió a una membrana de nylon, se sometió a
reticulación con luz ultravioleta e hibridó con sondas generadas a
partir de un fragmento de 600 pb del clon de ADNc de
1-9A. El fragmento usado para los estudios de
hibridación contenía las regiones más homólogas con el ADNc de PTP
humana. Las sondas se marcaron con [^{32}P]
\alpha-dCTP por el método de cebador aleatorio
(Amersham Corporation; Arlington Heights, IL). Las manchas de
transferencia se hibridaron durante una noche a 42ºC con 2 x
10^{6} dpm/ml de sonda en tampón que contenía formamida al 50%,
SSPE 5x, solución de Denhardt 10x (solución de Denhardt 100x es
Ficoll al 2%, albúmina de suero bovino al 2% y polivinilpirrolidina
al 2%), SDS al 0,5% (dodecil sulfato sódico) y 100 \mug/ml de ADN
de esperma de salmón cortado desnaturalizado. Las membranas se
lavaron en SSPE que contenía SDS al 0,25% usando métodos
convencionales. Se generaron autorradiogramas por exposición de las
membranas a una película Kodak XAR a -80ºC. Las membranas
posteriormente se separaron de la sonda y después se volvieron a
hibridar con un 30mero sintético correspondiente a un ARN 18s para
evaluar la carga de muestra.
El análisis de Northern del ARN celular total
usando sondas preparadas a partir del ADNc de 1-9a
reveló dos transcritos dominantes en líneas de células tumorales
del sistema nervioso central (SNC): un transcrito tenía 1,6 kb y el
otro tenía 0,9 kb (Figura 12A). Además, en las líneas celulares de
neuroblastoma SH-Sy5y y PNET1, también se detectó
un transcrito de ARNm mayor de 4,2 kb. El transcrito de 4,2 kb puede
representar el ARNm preprocesado. Se detectaron transcritos del
mismo tamaño en rata adulta (Cerebro R) y recién nacida (RN), pero
el transcrito de 0,9 kb fue más abundante en el cerebro adulto
mientras que el transcrito de 1,6 kb era más abundante en el
cerebro de rata recién nacida. En páncreas de rata (Páncreas R),
sólo se detectó un transcrito de 0,9 kB, correspondiente al tamaño
del ARNm de PTP de rata (Terazono et al., J. Biol. Chem.
263:2111-2114 (1988); Watanabe et al.,
J. Biol. Chem. 265:7432-7439 (1990)). No se
detectaron transcritos de ARNm en hígado normal (Hígado N). Usando
una sonda generada a partir de la región 3' del ADNc de
1-9a, se reveló el transcrito de 1,6 kb, pero no el
de 0,9 kb (Figura 12B). Usando una sonda 30-mérica
correspondiente al extremo más 5' del ADNc de 1-9a,
se detectaron los transcritos de ARNm de mayor peso molecular
(Figura 12C). También fue evidente el transcrito de 0,9 kb con una
mayor exposición de la mancha de transferencia.
El análisis de Northern del ARN de cerebro
humano reveló un transcrito dominante de 1,6 kb, pero también dos y
algunas veces tres transcritos más pequeños de 1,2 kb, 0,9 kb y 0,8
kb (Figura 13B). A diferencia de los descubrimientos en las líneas
celulares, el transcrito de ARNm de 4,2 kb casi nunca se observaba
en cerebro humano adulto. La hibridación con páncreas humano reveló
un transcrito de 0,8 kb, correspondiente al tamaño del ARNm de PTP.
Los transcritos detectados en cerebro humano y en páncreas usando
sondas de 1-9a fueron idénticos en tamaño a los
transcritos observados usando sondas de ADNc de PTP.
La hibridación puntiforme (dot blot) del ARN con
5 \mug de ARN total usando el fragmento de 600 pb del ADNc de
1-9a (NTP) demostró mayores niveles de expresión en
AD en comparación con cerebros de control de edad (Figura 13A). La
rehibridación de la misma membrana con un ADNc correspondiente a la
\beta-actina demostró una carga similar de ARN en
cada punto. La observación de niveles elevados de ARNm relacionado
con 1-9a en tejido de cerebro con AD es similar a
la notificada previamente usando sondas 60méricas correspondientes
al ADNc de PTP humana (de la Monte et al., J. Clin.
Invest. 86:1004-1013 (1990)). Las diferencias
entre los cerebros con AD y de control parecían deberse a
diferencias en los niveles de los transcritos de 1,6 kb, 0,9 kb y
0,8 kb, como se muestra en las Figuras 13A y 13B.
El ADNc de AD-NTP
3-4, aislado a partir de la biblioteca de AD,
hibrida con el ARN de líneas celulares de tumor neuroectodérmico de
origen neuronal y tejido cerebral humano. En las líneas celulares se
detectaron transcritos de 1,6 kb y 0,9 kb como los observados con
la sonda de 1-9a (Figura 21C). Sin embargo, en
cerebro humano se detectaron transcritos de \sim4 kb, 1,6 kb y
0,9 kb y los niveles de expresión para los tres transcritos eran
mayores en caso de AD en comparación con cerebros de control de edad
(Figura 21D).
La sonda de ADNc de AD 4-4
hibridó sólo con un transcrito de 0,9 kb y sólo en líneas de células
neuronales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se clonaron directamente ADNc de proteínas de la
cadena a partir de células PNET1, PNTE2, SH-Sy5y y
A172, y a partir de ARN de cerebro de control de edad y con
enfermedad de Alzheimer usando los métodos 3' y 5' RACE (Forman
et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 8998 (1988);
Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5673
(1989); Loh et al., Science 243: 217 (1989)). En
resumen, se transcribió de forma inversa ARN usando cebadores
oligo-dT. Para la reacción 5'-RACE,
los ADNc se amplificaron por reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) usando un 17-mero específico correspondiente
a una región 5' de la secuencia de 1-9a, y un
cebador 17 dT. Los productos de PCR resultantes se sometieron a
otra vuelta de amplificación usando otro cebador de extremo 5'
interno pero solapante, y un 17-mero 3' específico
correspondiente a una región 3' de la secuencia de
1-9a. Para las reacciones 3'-RACE,
primero se añadió una cola a los ADNc con dCTP usando
desoxinucleótido transferasa terminal, y después se amplificaron
usando un 17-mero específico correspondiente a los
nucleótidos 781-797 del clon 1-9a y
dG (17-mero). Se realizó una segunda amplificación
por PCR anidada usando un 17-mero específico
correspondiente a los nucleótidos 766-792 en el
extremo 3' y dGTP (17-mero) para el extremo 5'. Los
productos de PCR se sometieron al análisis de transferencia de
Southern usando sondas generadas a partir de un fragmento de ADN
interno del clon de ADNc de 1-9a, y del clon de ADNc
de PTP de rata O18. Los productos de PCR se purificaron en gel y se
unieron a vectores pAmpI usando uracilo desoxitransferasa. Los
insertos de ADN subclonados se secuenciaron por el método de
terminación de cadena con didesoxinucleótido usando la ADN
polimerasa de T7.
Se detectaron transcritos de la proteína de la
cadena del SNC en líneas celulares de tumor neuroectodérmico y en
tejido cerebral humano con AD por transcripción inversa seguido de
PCR usando cebadores específicos correspondientes a las regiones 5'
y 3' de la secuencia de ADNc de 1-9a. El análisis de
transferencia de Southern de los productos de PCR demostró dos
especies de hibridación cruzada dominantes, de 0,8 kb y 1,0 kb
(Figuras 14A y 14B). Además, en las células SH-Sy5y
también se detectó un producto de PCR de 1,8 kb mayor. En las
células PNET1, PNET2, Sh-Sy5y y A172, se observó un
producto de PCR de 0,4 kb que hibridaba con la sonda de
1-9a. De forma correspondiente con los mayores
niveles de ARNm de proteína de la cadena en cerebros con enfermedad
de Alzheimer, la señal de hibridación fue más intensa en las
muestras con AD que en las muestras de control de edad.
Los productos de PCR generados a partir de las
células SH-Sy5y se subclonaron y secuenciaron. El
análisis de Southern de los fragmentos clonados presentó una
hibridación intensa con el ADNc de 1-9a y una
hibridación menos intensa pero definida con el ADNc de O18 (PTP de
rata) (Figura 14C). La secuencia de ácido nucleico del clon de PCR
de SH-Sy5y (Sy-NTP) fue idéntica a
la secuencia de ADNc de 1-9a.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se seleccionó una biblioteca de ADN genómico
humano usando sondas preparadas con un fragmento de 600 pb del ADNc
de la proteína de cadena de cerebro humano 1-9a que
se aisló a partir de una biblioteca de corteza temporal de dos años
de edad. El fragmento de ADNc de 1-9a contenía una
región con una homología de secuencia de ácidos nucleicos de 60%
con la PTP humana. Después de la purificación de colonias, se
comprobó la hibridación cruzada de los supuestos clones genómicos
con el fragmento de ADNc de PTP de rata O18. Se subclonaron
fragmentos de restricción EcoRI, PstI y
EcoRI/PstI que hibridaban tanto con la sondas de
1-9a como con la de O18 en vectores pBluescript II
(Promega Inc., Madison, WI) y después se secuenciaron por el método
de terminación de cadena con didesoxinucleótido usando la
polimerasa de T7 (USB. Sequenase) o la amplificación por reacción en
cadena de la polimerasa y polimerasa Vent.
Se aislaron cuatro fragmentos genómicos
denominados G2-2 PstI, G2-2
PstI-EcoRI, G5d-1 PstI y
G5d-1 PstI-EcoRI a partir de una
biblioteca de ADN genómico humano (Figuras 22A-22D).
Todos estos fragmentos genómicos hibridaban con la sonda de ADNc de
1-9a y O18 y variaban en tamaño entre 1,5 kb y 3 kb.
La información de secuencias parciales de ácidos nucleicos demostró
una homología entre G2-2 PstI y los ADNc del
gen Reg humano y de la PTP humano y de rata (Figura 23A); entre
G2-2 PstI-EcoRI y los ADNc del gen Reg
y de la PTP de rata (Figura 23B) y también con los ADNc de AD
2-2, AD 3-4 y 1-9a
(datos no mostrados); entre G5d-1 PstI y el
gen Reg y la PTP humana (Figura 23C); y entre G5d-1
PstI-EcoRI y el gen Reg, PTP humana,
1-9a y AD 4-4.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se indujo la expresión de una proteína de fusión
en bacterias que contenían el clon de ADNc 1-9a, o
uno de los cuatro clones genómicos, con
isopropiltio-\beta-D-galactósido
(IPTG) usando técnicas convencionales (Sambrook et al.,
supra). Se sometieron lisados bacterianos brutos procedentes
de cultivos inducidos y no inducidos a SDS-PAGE y
análisis de transferencia de Western usando el anticuerpo monoclonal
Th9 para la proteína de la cadena (Sasaki et al., J.
Biol. Chem. 268: 1-4 (1993)) y proteína A
marcada con ^{125}I para detectar el anticuerpo unido. Además, se
indujeron céspedes bacterianos que contenían ADN clonado para
expresar la proteína de fusión con IPTG y se sondaron filtros de
réplica directamente con el anticuerpo monoclonal Th9 seguido de
proteína A marcada con ^{125}I.
La inmunorreactividad de la proteína de la
cadena se demostró en las proteínas de fusión bacterianas por medio
de la unión directa del anticuerpo a las colonias inducidas por IPTG
(Figuras 24A-24D). La inmunorreactividad de la
proteína de la cadena se detectó usando un cóctel de anticuerpos
monoclonales Th9, Th7 y Th10 contra PTP (Sasaki et al.,
J. Biol. Chem. 268: 1-4 (1993)) y proteína A
marcada con ^{125}I.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se realizó un análisis de transferencia de
Northern usando una sonda de ADNc de AD16. Las manchas de
transferencia se volvieron a sondar para detectar ADN ribosómico
18s para evaluar la carga de ARN en cada calle. Los autorradiogramas
insaturados se sometieron a un análisis densitométrico usando un
Molecular Dynamics Image-Analyzer. Se trazaron las
relaciones de las señales de hibridación de ARN 18s y AD16c para
cada caso y los resultados se proporcionan gráficamente en las
Figuras 25A y 25B. Las relaciones medias (niveles relativos de
AD16c) con los errores típicos se representan en el gráfico más
pequeño del lado derecho. Los descubrimientos confirman que hay
niveles elevados de expresión de ARNm de AD16c en seis de nueve
cerebros con AD en comparación con uno de seis controles de edad
similar. La diferencia entre los niveles medios tiene un alto
significado estadístico (P<0,005). Se obtuvieron resultados
similares usando sondas AD10-7. Estos resultados
demuestran que hay un aumento estadísticamente significativo en los
niveles de expresión en cerebros AD en comparación con cerebros de
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se ligaron ADNc de AD10-7 a
vectores pTrcHIS (Invitrogen, San Diego) en tres fases de lectura
diferentes (dos incorrectas A y B y una correcta C). Las bacterias
transformadas con uno de los tres plásmidos se indujeron con IPTG y
los lisados bacterianos se examinaron con respecto a la expresión de
proteínas 0, 1 y 5 horas después. Las proteínas se fraccionaron por
SDS-PAGE y se realizó un análisis de transferencia
de Western usando anticuerpos monoclonales contra la proteína
marcadora expresada (anticuerpos monoclonales de ratón
T7-tag; Novogen). Las manchas de transferencia se
revelaron usando el método de peroxidasa de rábano picante con
avidina-biotina, y con diaminobencidina como
cromógeno (Figura 26). Se detectó una banda correspondiente a
\sim45 kDa en bacterias que se habían transformado con ADN
plasmídico que contenía AD10-7 ligado únicamente en
la fase de lectura correcta (C) (flecha). Se observó la proteína
del mismo tamaño por traducción in vitro del ADNc de
AD10-7 en un sistema de ensayo de lisado de
reticulocitos de conejo. En los dos sistemas, el péptido compañero
de fusión tenía \sim3 kDa, indicando que el ADNc codifica una
proteína de aproximadamente \sim42 kDa. Rutinariamente se detecta
una especie de NTP de \sim42 kDa por análisis de transferencia de
Western de líneas de células neuronales y de tejido cerebral
humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Se generaron sondas de ARNc con sentido y
antisentido a partir de ADN plasmídico de AD10-7
linealizado usando ARN polimerasa dependiente de ADN de SP6 o T7
respectivamente. Las sondas antisentido hibridaron con ARNm de la
línea de células neuronales como se ha descrito anteriormente para
este clon. Por otra parte, las sondas con sentido de ARNc no
pudieron hibridar con el ARN por análisis de transferencia de
Northern. Las sondas de ARNc marcadas con
digoxigenina-UTP se hibridaron con secciones de
tejido cerebral humano de pacientes con AD en sus primeras fases.
Después de lavar las secciones exhaustivamente (de la Monte et
al., J. Clin. Invest. 86: 1004-1013
(1990)), las sondas hibridadas se detectaron usando anticuerpos
monoclonales conjugados con fosfatasa alcalina o con peroxidasa
contra digoxigenina, y las reacciones colorimétricas se revelaron
usando métodos convencionales. El examen de las secciones por
microscopía de campo brillante y campo oscuro demostró hibridación
de AD10-7 únicamente en neuronas (Fig. 27; agregados
densos de granos blancos sobre cuerpos celulares en la Fig. 27A).
Por el contrario, de forma similar a los descubrimientos por
análisis de transferencia de Northern, las sondas de ARNc de
AD10-7 con sentido no pudieron hibridar con tejido
cerebral (Fig. 27B).
Aunque lo anterior se refiere a realizaciones
particulares preferidas, debe entenderse que la presente invención
no se limita de esta manera. A los especialistas habituales en la
técnica se les ocurrirán que pueden realizarse diversas
modificaciones de las realizaciones descritas y que estas
modificaciones se consideran dentro del alcance de la presente
invención, que se define por las siguientes reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
<110> The General Hospital Corporation de
la Monte, Suzanne Wands, Jack R.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Expresión Génica de la Proteína de
la Cadena Neural y Detección de la Enfermedad de Alzheimer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P19088EP-1/PWC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 04076254.4
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1994-04-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 08/050,559
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1993-04-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn, Versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 21
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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<210> 4
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido formador de triple
hélice
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Esta región está en la orientación
3' a 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede ser un enlace de nucleótidos
entre nucleótidos de 0-10 bases
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido formador de triple
hélice
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede ser un enlace de nucleótidos
entre nucleótidos de 0-10 bases
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(43)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Esta región está en la orientación
3' a 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido formador de triple
hélice
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<220>
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<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Esta región está en la orientación
3' a 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede ser un enlace de nucleótidos
entre nucleótidos de 0-10 bases
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<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 10
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<211> 43
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido formador de triple
hélice
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede ser un enlace de nucleótidos
entre nucleótidos de 0-10 bases
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(43)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Esta región está en la orientación
3' a 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido formador de triple
hélice
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Esta región está en la orientación
3' a 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede ser un enlace de nucleótidos
entre nucleótidos de 0-10 bases
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 12
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<211> 43
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido formador de triple
hélice
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Puede ser un enlace de nucleótidos
entre nucleótidos de 0-10 bases
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(43)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Esta región está en la orientación
3' a 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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<211> 1443
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\newpage
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\newpage
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (56)..(56)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (242)..(242)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 17
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 20
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\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 24
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 215
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 25
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 594
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 554
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (176) .. (176)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 590
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 466
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 501
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (123) .. (123)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 377
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (59) .. (59)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 39
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 629
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 256
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2520
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 50
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<210> 51
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<211> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
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<222> (96)..(96)
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<223> n es a, c, g, o t
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> Característica miscelánea
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<222> (226)..(226)
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<223> n es a, c, g, o t
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<212> ADN
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<220>
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<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (191)..(191)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (99)..(99)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
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<211> 110
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 110
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<210> 111
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<211> 95
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 111
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<210> 112
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<211> 90
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (85)..(86)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (89)..(89)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 113
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 114
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<211> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 114
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<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 115
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<210> 116
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<211> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 155
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 118
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<210> 119
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<211> 116
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 119
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<210> 120
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<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido desconocido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Desconocido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\hskip1cm
Claims (29)
1. Una proteína de la cadena neural (NTP) que
carece sustancialmente de cualquier impureza natural y codificada
por la molécula de ADN AD3-4DH1 presente en las
células E. coli que están depositadas en la Colección
Americana de Cultivos Tipo, Manassass, Va., con el nº de acceso
69260.
2. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una proteína de la cadena neural (NTP) que comprende la
molécula de ADN AD3-4DH1 presente en las células
E. coli que están depositadas en la Colección Americana de
Cultivos Tipo, Manassass, Va., con el nº de acceso 69260.
3. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 2, que comprende una secuencia genética que codifica
una NTP donde dicha NTP es NTP humana.
4. Un plásmido que comprende la molécula de
ácido nucleico de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.
5. Un hospedador no humano transformado con el
plásmido de la reivindicación 4.
6. Un método in vitro para usar el
plásmido de la reivindicación 4 para preparar una NTP, comprendiendo
dicho método:
- (a)
- introducir dicho plásmido que comprende dicha secuencia genética que codifica dicha NTP en una célula hospedadora para producir una célula hospedadora recombinante;
- (b)
- cultivar dicha célula hospedadora recombinante; y
- (c)
- aislar dicha NTP.
7. El método de la reivindicación 6, donde dicha
secuencia genética que codifica dicha NTP se obtiene a partir de
tejido cerebral de un paciente con enfermedad de Alzheimer o de una
línea celular de tumor neural humano.
8. El método de la reivindicación 6 o la
reivindicación 7, donde dicha célula hospedadora es E.
coli.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 8, donde dicho gen está contenido en un
vector.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 9, donde dicho gen está bajo el control de
un promotor inducible.
11. El método de la reivindicación 10, donde
dicho promotor es un promotor P_{1} lambda o un promotor
tac.
12. Un vector de expresión que comprende la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2.
13. Un virión que comprende el vector de
expresión de la reivindicación 12.
14. Una ribozima que comprende una secuencia
diana que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico que
codifica la NTP de la reivindicación 1, y no homóloga a la secuencia
de ácido nucleico de PTP.
15. Una molécula de ADN que codifica la ribozima
de la reivindicación 14.
16. Una Secuencia Guía Externa de NTP de
ribonucleótidos que comprende:
- (a)
- una secuencia de 10-15 nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico que codifica la NTP de la reivindicación 1, y que es no homóloga a la secuencia de ácido nucleico de PTP; y
- (b)
- una secuencia de nucleótidos 3'-NCCA donde N es purina.
17. La Secuencia Guía Externa de NTP de la
reivindicación 16 que es ADN.
18. Un método in vitro para detectar la
presencia de proteína de la cadena neural (NTP) codificada por el
ácido nucleico de la reivindicación 2, comprendiendo dicho
método:
- (a)
- poner en contacto una muestra biológica de un sujeto humano que se sospecha que contiene una NTP codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 2 con al menos una molécula capaz de unirse a dicha NTP; y
- (b)
- detectar cualquiera de las moléculas unidas a dicha NTP.
19. Un método de acuerdo con la reivindicación
18, donde dicha molécula es:
- (a)
- un anticuerpo que carece sustancialmente de impurezas naturales;
- (b)
- un anticuerpo monoclonal; o
- (c)
- un fragmento de (a) o (b).
20. Un método de acuerdo con la reivindicación
18 o la reivindicación 19, donde la detección de cualquiera de
dichas moléculas unidas a dicha NTP se realiza por formación de
imágenes in situ.
21. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 20, donde la detección de cualquiera de
dichas moléculas unidas a dicha NTP se realiza por formación de
imágenes in vitro.
22. Un método in vitro para diagnosticar
la presencia de una afección relacionada con la proteína de la
cadena neural (NTP) en un sujeto humano que se sospecha que tiene
dicha afección, que comprende:
- (a)
- incubar una muestra biológica que se sospecha que contiene una NTP codificada por dicha molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, en presencia de al menos una molécula de unión capaz de identificar dicha NTP; y
- (b)
- detectar dicha molécula de unión que se une en dicha muestra, donde dicha detección indica que dicho sujeto tiene una afección relacionada con NTP;
siendo dicha afección relacionada con NTP la
enfermedad de Alzheimer, la presencia de tumores neuroectodérmicos,
la presencia de un astrocitoma maligno o la presencia de
glioblastomas.
23. Un método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 22, donde dicha detección es por un ensayo
inmunométrico.
24. Un método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 23, donde dicho ensayo inmunométrico es un ensayo
inmunométrico basado en anticuerpos monoclonales.
25. Un método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 24, donde dicho método comprende:
- (a)
- incubar dicha muestra biológica con dos anticuerpos monoclonales de NTP diferentes unidos a un soporte en fase sólida; y
- (b)
- detectar la NTP como se define en la reivindicación 1 unida a dichos anticuerpos monoclonales con una tercera solución diferente de anticuerpo monoclonal de NTP marcado de forma detectable, donde dichos anticuerpos monoclonales de NTP son específicos para la molécula de NTP de la reivindicación 1.
26. Un método de diagnóstico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, donde dicha etapa de
incubación incluye además añadir una cantidad conocida de NTP
marcada como se define en la reivindicación 1, con lo que se
establece un inmunoensayo competitivo.
27. Un método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 26, donde dicho marcador es capaz de emitir
radiación.
28. Un método de diagnóstico de acuerdo con la
reivindicación 27, donde dicho marcador es ^{125}I.
29. Un método de diagnóstico de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, donde dicha detección
es por inmunorreacción en cadena de la polimerasa.
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