ES2312913T3 - Expresion genica de la proteina de la cadena neural y deteccion de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Abstract

Una proteína de la cadena neural (NTP) que carece sustancialmente de cualquier impureza natural y codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 presente en las células E. coli que están depositadas en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassass, Va., con el nº de acceso 69260.

Description

Expresión génica de la proteína de la cadena neural y detección de la enfermedad de Alzheimer.

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la ingeniería genética y la biología molecular. Esta invención se refiere a hospedadores recombinantes que expresan nuevas proteínas asociadas con la enfermedad de Alzheimer, tumores neuroectodérmicos, astrocitomas malignos y glioblastomas. Esta invención se refiere específicamente a los hospedadores y vectores recombinantes que contienen los genes que codifican las proteínas de la cadena neural. Esta invención también se refiere a proteínas de la cadena neural sustancialmente puras, a métodos de inmunodiagnóstico y de diagnóstico molecular para detectar la presencia de proteínas de la cadena neural y al uso de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de la cadena neural en terapia génica.

Antecedentes de la invención Enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer (AD) es la causa mas frecuente de demencia en los Estados Unidos, y afecta a más de dos millones de individuos cada año. Es un trastorno cerebral degenerativo caracterizado clínicamente por pérdida de memoria, confusión y deterioro físico gradual. Es la cuarta causa más común de muerte. Prácticamente se desconoce la etiología de la enfermedad, pero se ha atribuido a diversos virus, toxinas, metales pesados así como a defectos genéticos. En el momento actual esta enfermedad es incurable.

Hasta hace bastante poco, se pensaba que la AD representaba relativamente pocos de los casos clasificados generalmente como demencia senil. Otros factores pueden llevar a esta afección, incluyendo ictus leves repetidos, trastornos de tiroides, alcoholismo y deficiencias de ciertas vitaminas, siendo muchos de ellos potencialmente tratables. Entonces, puede apreciarse que un ensayo de diagnóstico específico para la AD sería muy útil para el diagnostico clínico y un tratamiento clínico apropiado de pacientes que presentan síntomas comunes para todas estas afecciones.

Los cerebros de individuos con AD muestran acumulaciones patológicas características de un material fibroso congófilo que se presenta como ovillos neurofibrilares dentro de los cuerpos de las células neuronales, y placas neuríticas (o seniles). También pueden encontrarse ovillos neurofibrilares en las paredes de ciertos vasos sanguíneos cerebrales. Los componentes estructurales organizados principales de los ovillos neurofibrilares son filamentos helicoidales emparejados. También aparecen depósitos de amiloide cualitativamente indistinguibles en cerebros normales envejecidos, pero en mucho menor número y con una distribución topográfica restringida.

Recientemente ha habido una actividad de investigación considerable en relación con la caracterización de proteínas encontradas en placas neuríticas y ovillos neurofibrilares asociados con la AD y otras enfermedades neurológicas. Se ha clonado y secuenciado una de las proteínas amiloides descritas inicialmente por Glenner et al. (Glenner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:1131-1135 (1984): Patente de Estados Unidos Nº 4.666.829). Se ha determinado que la proteína amiloide A4 encontrada en placas neuríticas y vasos sanguíneos es un componente de un precursor de 695 aminoácidos; una proteína que, según se ha postulado, funciona como receptor de la superficie celular glicosilado (Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4245-4249 (1985), Kang et al., Nature 325: 733-736 (1987). Además, se ha postulado que la proteína amiloide funciona como una molécula de adhesión celular y como una proteína de los canales de iones de calcio (Hooper, J. NIH Res. 4:48-54 (1992); Rensberger, Wayward Protein Molecule May Be Elusive Killer of Brains Cells, The Washington Post, 25 de enero de 1993, \NAK1, en A3 (1993)). El gen que codifica A4 está localizado en el cromosoma 21 (Kang et al. ibid.; Goldgaber et al., Science 235:877-880 (1987); Tanzi et al., Science 235:880-885 (1987); St. George-Hyslop et al., Science 235:885-889 (1987)) pero aparentemente no está asociado a la forma familiar de la enfermedad (Van Broekhoven et al., Nature 329: 153-155 (1987)). Parece haber muy poca, si hay alguna, homología de secuencias de proteínas entre la proteína amiloide A4 y \beta, su precursor de mayor peso molecular, y la proteína de la cadena pancreática (PTP) (Gross et al., J. Clin Invest. 76:2115-2126 (1985)).

Se han descrito otras proteínas que se consideran asociadas con la enfermedad, incluyendo la ubiquitina, ALZ-50, las proteínas \tau asociadas con los microtúbulos y MAP2, y la proteína del neurofilamento (véase, por ejemplo, Manetto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4502-4505 (1988): Wolozin et al., Science 232:648-651 (1986); Selkoe, Neurobiol, Aging 7:425-432 (1986); Perry et al., en: Alterations of the Neuronal Cytoskeleton in Alzheimer's Disease, Plenum, New York, páginas 137-149 (1987)). Más recientemente, se ha encontrado un inhibidor de serina proteasa denominado \alpha_{1} -anti-quimotripsina en depósitos de amiloide asociados con la AD (Abraham et al., Cell 52: 487-501 (1988)).

Actualmente no se dispone de ningún ensayo de diagnóstico útil para la AD que se esté poniendo en práctica clínicamente. Solamente es posible un diagnóstico definitivo post mórtem, o durante la vida por medio de una biopsia cerebral, para revelar la presencia de placas características, los ovillos, los filamentos helicoidales emparejados y otros depósitos cerebrovasculares que caracterizan el trastorno. Este procedimiento quirúrgico invasivo es intrínsecamente peligroso y, por lo tanto, rara vez se utiliza. Como resultado, se estima un diagnóstico clínico erróneo de AD de aproximadamente 20%-30%.

Proteínas de Cadena

El prototipo de molécula de proteína de cadena es la proteína de la cadena pancreática (PTP) que tiene la propiedad física poco habitual de formar fibrillas insolubles a pH neutro, pero es muy soluble a pH ácido o alcalino (Gross et al., supra). La PTP es muy abundante, se sintetiza por las células acinares pancreáticas y se secreta en el jugo pancreático en concentraciones superiores a 1 mg/ml (Id.). Se ha demostrado un aumento de inmunorreactividad de proteínas de cadena en cerebros con lesiones de AD, usando anticuerpos monoclonales contra PTP (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 419-423 (1989)). Además, se usó un ensayo inmunorradiométrico de tipo sándwich directo y muy sensible para demostrar que entre la PTP y la proteína relacionada presente en el cerebro se compartían al menos tres epítopos antigénicos distintos (Id.). A pesar de las similitudes, las formas pancreática y neuronal de la proteína de cadena son casi con toda certeza distintas, ya que las moléculas de ARNm y las proteínas difieren en tamaño y muchos de los epítopos antigénicos presentes en la proteína de la cadena pancreática no se pueden detectar en el tejido cerebral (de la Monte et al., J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990); de la Monte et. al., J. Neurol. Sci. 113:152-164 (1992); de la Monte et. al., Ann. Neurol. 32:733-742 (1992)).

La forma del sistema nervioso central de la proteína de la cadena, denominada en lo sucesivo "proteína de la cadena neural" (NTP), se ha identificado en tejido cerebral de casos con AD y Síndrome de Down (Wands et al., Publicación de Solicitud de Patente Internacional Nº WO 90/06993). Se ha encontrado NTP en todos los cerebros con AD estudiados en los que existen cambios neuropatológicos característicos de la enfermedad (Id.). La parte de inmunorreactividad soluble extraíble con solución salina tiene un peso molecular de aproximadamente 17 a 20 kD (Id.).

Las mediciones cuantitativas de la inmunorreactividad de NTP en diversas regiones de cerebros con AD revelaron niveles que variaban de 12 a 295 ng/g de tejido (Media = 116 ng/g de tejido) en comparación con 1-11 ng/g de tejido (Media = 5 ng/g de tejido) en áreas comparables de cerebros de control (Id.).

La inmunocitoquímica realizada con anticuerpos monoclonales dirigidos contra la forma pancreática de PTP demostró que la NTP se localiza dentro de las células, dentro de procesos finos en el interior del neuropilo o es extracelular tanto en cerebros con AD como en cerebros con Síndrome de Down (Id.). Dos tipos de células contienen NTP: las neuronas y los astrocitos (Id.). Las neuronas afectadas son del tipo piramidal grande que típicamente contiene los ovillos neurofibrilares bien conocidas en el cerebro con AD (Id.).

El hecho de que la acumulación de NTP dentro de las neuronas sea intrínsecamente importante o esté relacionada integralmente con la evolución de las lesiones de AD se corrobora por la presencia de patrones idénticos de inmunomarcaje para NTP en cerebros con Síndrome de Down, pero no en cerebros de control (Id.). Es importante tener en cuenta que estas mismas anomalías estructurales de AD aparecen en los cerebros de todos los individuos de mediana edad con Síndrome de Down, presenten o no demencia. También hay una mayor incidencia de AD entre los miembros de la familia de los pacientes con Síndrome de Down. Además, las diferencias regionales en las densidades de neuronas que contienen NTP tienen su paralelo en las distribuciones de densidad de los ovillos neurofibrilares tanto en la AD como en el Síndrome de Down. Esto proporciona pruebas adicionales de que la NTP es relevante para la patofisiología de la AD. Aún no se sabe si la NTP se acumula dentro del pericarion neuronal, como resultado de un metabolismo o transporte celular aberrante.

Compendio de la invención

Existe la necesidad de un ensayo de diagnóstico definitivo que pueda realizarse en individuos que se sospecha que tienen o con riesgo de padecer AD. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona ventajas adicionales.

La manera en la que estos y otros objetos se consiguen por medio de la presente invención serán evidentes tras el compendio y la descripción detallada presentada a continuación.

A menos que se definan de otra manera, varios elementos usados en la presente memoria tienen el mismo significado conocido en la técnica a la que pertenece la invención.

Esta invención se refiere a hospedadores recombinantes que expresan una nueva proteína asociada con la enfermedad de Alzheimer, tumores neuroectodérmicos, astrocitomas malignos y glioblastomas. Esta invención se refiere específicamente a los hospedadores y vectores recombinantes que contienen el gen que codifica la proteína de la cadena neural (NTP) que tiene un peso molecular de aproximadamente 42 kDa. En el primer aspecto, la presente invención se refiere a una proteína de la cadena neural (NTP) que carece sustancialmente de cualquier impureza natural y que se codifica por la molécula de ADN AD3-4DH1 presente en las células E. coli depositadas en la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection) Manassass, Va., con el número de acceso 69260. Esta invención también se refiere a las proteínas de la cadena neural sustancialmente puras, a métodos de inmunodiagnóstico y de diagnóstico molecular para detectar la presencia de proteínas de la cadena neural, y al uso de secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de la cadena neural en terapia génica.

En particular, la invención incluye un método in vitro para detectar la presencia de una NTP codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1, que comprende:

(a)

poner en contacto una muestra biológica de un sujeto humano que se sospecha que contiene NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 con al menos una molécula capaz de unirse a dicha NTP; y

(b)

detectar la molécula unida a dicha NTP.

La invención además incluye el método anterior, donde la molécula de unión se selecciona entre el grupo consistente en:

(a)

un anticuerpo que carece sustancialmente de impurezas naturales;

(b)

un anticuerpo monoclonal; y

(c)

un fragmento de (a) o (b).

La invención también incluye el método anterior, donde la molécula de detección está marcada de forma detectable y donde se usa una combinación de dichas moléculas de unión.

La invención también incluye un método in vitro para detectar la presencia de una secuencia genética que codifica una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 en una muestra biológica usando una sonda polinucleotídica derivada de una NTP humana recombinante de esta invención.

La invención también incluye un método para determinar la presencia de una afección en un sujeto humano, incluyendo dicha afección, pero sin limitación, el grupo consistente en la enfermedad de Alzheimer, la presencia de tumores neuroectodérmicos, la presencia de astrocitomas malignos y la presencia de gliomas.

La invención también incluye un método para diagnosticar la presencia de AD en un sujeto humano que se sospecha que tiene AD, que comprende:

(a)

incubar una muestra biológica de dicho sujeto que se sospecha que contiene una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 con una molécula capaz de identificar una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1; y

(b)

detectar la molécula que se une en la muestra, donde la detección indica que el sujeto tiene AD.

La invención también incluye un método para diagnosticar la presencia de tumores neuroectodérmicos en un sujeto humano que se sospecha que tiene tumores neuroectodérmicos, que comprende:

(a)

incubar una muestra biológica de dicho sujeto que se sospecha que contiene una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 con una molécula capaz de identificar una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1; y

(b)

detectar la molécula que se une en la muestra, donde la detección indica que el sujeto tiene tumores neuroectodérmicos.

La invención también incluye un método para diagnosticar la presencia de un astrocitoma maligno en un sujeto humano que se sospecha que tiene un astrocitoma maligno, que comprende:

(a)

incubar una muestra biológica de dicho sujeto que se sospecha que contiene una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1, en presencia de una molécula de unión capaz de identificar una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1; y

(b)

detectar la molécula que se une en la muestra, donde la detección indica que el sujeto tiene un astrocitoma maligno.

La invención también incluye un método para diagnosticar la presencia de un glioblastoma en un sujeto humano que se sospecha que tiene un glioblastoma, que comprende:

(a)

incubar una muestra biológica de dicho sujeto que se sospecha que contiene una NTP codificada por AD3-4DH1 en presencia de una molécula de unión capaz de identificar una NTP codificada por AD3-4DH1; y

(b)

detectar la molécula que se une en la muestra, donde la detección indica que el sujeto tiene un glioblastoma.

La invención también incluye los métodos anteriores, donde se extrae una muestra biológica de un sujeto humano antes de poner en contacto la muestra con la molécula.

La invención también incluye los métodos anteriores, donde la detección de cualquiera de las moléculas unidas a la proteína se realiza por medio de formación de imágenes in situ.

La invención también incluye los métodos anteriores, donde la detección de cualquiera de las moléculas unidas a la proteína se realiza por medio de formación de imágenes in vivo.

La invención también incluye los métodos anteriores, donde la muestra biológica se hace reaccionar con la molécula de unión de una manera y en condiciones suficientes para determinar la presencia y la distribución de la proteína.

La presente invención también se refiere particularmente a los métodos de diagnóstico indicados anteriormente, donde el inmunoensayo comprende dos anticuerpos diferentes unidos a un soporte en fase sólida, junto con un tercer anticuerpo marcado de forma detectable diferente en solución.

La invención también se refiere a un método para producir una NTP codificada por AD3-4DH1, comprendiendo dicho método:

(a)

cultivar un hospedador recombinante que comprende un gen humano que codifica dicha NTP codificada por AD3-4DH1; y

(b)

aislar dicha NTP de dicho hospedador.

Además, la invención se refiere a una NTP sustancialmente pura codificada por AD3-4DH1 obtenida por medio de dicho proceso.

La invención también se refiere a ribozimas que comprenden una secuencia diana que es complementaria a la secuencia de una NTP codificada por AD3-4DH1 y no homóloga a secuencias de ácido nucleico de PTP, así como a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas ribozimas y un vehículo farmacéutica mente aceptable.

La invención también se refiere a un método para conseguir la administración farmacéutica de NTP codificada por AD3-4DH1 en el cerebro a través de vehículos o vectores de expresión aceptables.

La invención también se refiere a oligodesoxinucleótidos que forman regiones de triple cadena con el gen de la NTP codificada por AD3-4DH1 (secuencias de ácidos nucleicos) y que no son homólogos a secuencias de ácido nucleico de PTP, así como a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos oligodesoxinucleótidos y un vehículo farmacéutica mente aceptable.

La invención también se refiere a métodos para el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Alzheimer esporádica y familiar.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1J muestran inmunorreactividad de la proteína de la cadena neural en tumores procedentes del SNC.

La Figura 2 representa un gráfico que muestra los niveles de proteína de la cadena neural en células de carcinoma hepatocelular PNET1, PNET2, A172, C6 y Huh7 medidos por un ensayo inmunorradiométrico basado en anticuerpos monoclonales de tipo sándwich directo (M-IRMA).

La Figura 3 muestra el tamaño molecular de proteínas de la cadena neural en células SH-Sy5y, A172 y C6 demostrado por inmunoprecipitación y análisis de transferencia de Western usando el anticuerpo monoclonal Th9.

La Figura 4 muestra los tamaños moleculares de proteínas de la cadena neural en células PNET1 (a) y en células de glioblastoma (b) demostrados por marcaje metabólico de pulso y persecución con ^{35}S-metionina, e inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal Th9 (Figura 4A). Los pesos moleculares son 8, 14, 17, 21, 26 y 42 kDa (flechas).

Las Figuras 5A-5E representan una serie de cinco gráficos que muestran las proteínas de la cadena neural de 21 kDa y 17 kDa en células SH-Sy5y, PNET1, A172 y C6 y su ausencia en células Huh7 por SDS-PAGE/M-IRMA.

La Figura 6 representa un gel que muestra que la proteína de la cadena neural de 21 kDa en células de gioblastoma C6 está fosforilada.

La Figura 7 representa un gráfico de barras que muestra la expresión de la proteína de la cadena neural alterada en células PNET1 en fase de crecimiento.

Las Figuras 8A-8F muestran el fenotipo alterado de células PNET1 con cese del crecimiento celular y privación de suero durante una noche.

La Figura 9 muestra la secuencia de ADNc parcial de 1-9a y la Figura 9A muestra una secuencia parcial del segundo producto de PCR de anclaje 5' correspondiente a la región 5' del ADNc de 1-9a (secuencia WP5').

La Figura 10 muestra el alineamiento de secuencias parciales entre 1-9a y la PTP humana y el gen Reg (la secuencia de ácido nucleico correspondiente al clon genómico de la PTP humana).

La Figura 10A muestra el alineamiento entre 1-9a y el Exón 2 del gen Reg humano, y entre el primer producto de PCR de anclaje 5' de 1-9a (WP03-417) y el Exón 2 y Reg.

La Figura 10B muestra el alineamiento entre 1-9a y su segundo producto de PCR de anclaje 5' (WP5') y los ADNc de AD 3-4 y AD 2-2.

La Figura 11A muestra las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos deducida parciales del ADNc de HB4. Las Figuras 11B y 11C muestran un gráfico de ventana de hidrofilia de proteína. Tamaño de ventana de hidrofilia = 7; escala = Kyte-Doolittle.

La Figura 11D muestra el alineamiento entre HB4 y la PTP humana.

La Figura 11E muestra el alineamiento entre HB4 y el gen Reg humano.

Las Figuras 12A-12C muestran la expresión de moléculas de ARNm que corresponden a la secuencia de ADNc de la proteína de la cadena neural del SNC 1-9a en líneas celulares de tumor neuroectodérmico y en páncreas de rata.

Las Figuras 13A y 13B muestran transcritos de ARNm que corresponden a la secuencia de ADNc de la proteína de la cadena neural del SNC 1-9a en cerebro humano. Esta figura también demuestra los mayores niveles de ARNm relacionados con proteínas de la cadena neural del SNC 1-9a en cerebros con AD en comparación con controles de edad similar (Figura 13A). La Figura 13B muestra cuatro transcritos diferentes con mayor abundancia de los ARNm de menor tamaño molecular en caso de AD en comparación con los controles de edad similar.

Las Figuras 14A-14C muestran un análisis de transferencia de Southern 1-9a de los ADNc derivados de RT/PCR en líneas de células neuroectodérmicas. Amplificación por PRC de A y B de secuencias de ARNm de 1-9a en líneas de células neuroectodérmicas, y usando ARNm de cerebro de rata recién nacida (NB), cerebro con AD y cerebro de control de edad similar. La Figura 14A es una exposición mas prolongada de la Figura 14B. La Figura 14C muestra hibridación de la misma mancha de transferencia usando la sonda de PTP de rata O18.

Las Figuras 15A y 15B (SE-RT/PCR) muestran hibridación de las sondas 1-9a y O18 con varios clones aislados a partir de células SH-Sy5y por transcripción inversa de ARNm y amplificación con cebadores que corresponden a la secuencia conocida del ADNc parcial de 1-9a.

Las Figuras 16A, 16D y 16E muestran las secuencias de ácido nucleico parciales de los ADNc de AD 2-2 aislados a partir de la biblioteca de cerebro con AD. Las Figuras 16B y 16C muestran un gráfico de ventana de hidrofilia de AD2-2 T7. Tamaño de ventana de hidrofilia = 7; escala = Kyte-Doolittle.

Las Figuras 16F, 16I, 16J y 16K muestran las secuencias de ácido nucleico parciales de los ADNc de AD 3-4 aislados a partir de la biblioteca de cerebro con AD. Las Figuras 16G y 16 H muestran un gráfico de ventana de hidrofilia de AD 3-4. Tamaño de ventana de hidrofilia = 7; escala = Kyte-Doolittle.

Las Figuras 16L, 16M y 16N muestran las secuencias de ácido nucleico parciales de los ADNc de AD 4-4 aislados a partir de la biblioteca de cerebro con AD.

La Figura 16O muestra las secuencias de ácido nucleico parciales de los ADNc de AD 16c (también denominados AD 10-7) aislados a partir de la biblioteca de cerebro con AD. Las Figuras 16P y 16Q muestran un gráfico de ventana de hidrofilia de AD 16c-T7. Tamaño de ventana de hidrofilia = 7; escala = Kyte-Doolittle.

La Figura 16R muestra la secuencia de nucleótidos completa del clon de ADNc de AD10-7 que se aisló a partir de una biblioteca AD.

La Figura 16S muestra la secuencia de nucleótidos completa del clon de ADNc de AD16c que se aisló a partir de una biblioteca AD.

La Figura 17 muestra el alineamiento de secuencias parciales entre AD 2-2 y el gen Reg humano.

La Figura 17A muestra el alineamiento de secuencias parciales entre AD 2-2 y el Exón 1 de Reg y la PTP de rata.

La Figura 17B muestra el alineamiento de secuencias parciales entre AD 2-2 y 1-9a.

La Figura 17C muestra el alineamiento de secuencias parciales entre AD 2-2 y AD 16c.

La Figura 18 muestra el alineamiento de secuencias parciales entre AD 3-4 (también denominado AD 5-3) y el gen Reg.

La Figura 18A muestra el alineamiento de secuencias parciales entre AD 3-4 y los productos de PCR de anclaje 5' del ARNm de 1-9a; denominados WPO3-5 y 18-4.

La Figura 18B muestra el alineamiento de secuencias parciales entre AD 3-4 y el clon genómico EcoRI/PstI de G2a-a.

La Figura 19 muestra el alineamiento de secuencias parciales entre AD 4-4 y AD 2-2 y 1-9a (también denominado SE-4 correspondiente al clon de PCR que es idéntico a 1-9a).

La Figura 20 muestra el alineamiento de secuencias parciales entre AD 16c y el gen Reg.

La Figura 20A muestra el alineamiento de secuencias parciales entre AD 16c y la PTP humana.

La Figura 20B muestra el alineamiento de secuencias parciales entre AD 16c y AD 2-2.

Las Figuras 21A-21D muestran un análisis de transferencia de Southern genómico usando AD 3-4 como sonda, la Figura 21B muestra un patrón similar de hibridación en una transferencia de Southern genómica usando AD 2-2 como sonda. Las Figuras 21A-21D muestran un análisis de transferencia de Northern de líneas celulares de tumor neuroectodérmico usando AD 3-4 como sonda. Las cuatro líneas celulares que presentan transcritos de AD 3-4 son de fenotipo neuronal; el ARNm de la célula de glioma C6 no hibrida con la sonda de AD 3-4. La Figura 21D muestra un análisis de Northern de tejido de lóbulo temporal de cerebro humano con AD y cerebro de control de edad similar usando la sonda de AD 3-4, y muestra una sobreexpresión del gen correspondiente en caso de AD (calles marcadas como A) en comparación con los cerebros de control de edad similar (calles marcadas
como C).

Las Figuras 22, 22A, 22B, 22C, 22D, 22E, 22F, 22G y 22H muestran secuencias parciales de cuatro clones genómicos (aislados usando tanto ADNc de 1-9a como ADNc de O-18 de PTP de rata como sondas).

Las Figuras 23 y 23A muestran el alineamiento de la secuencia parcial PstI de G2a-2 con el gen Reg.

La Figura 23B muestra el alineamiento de la secuencia PstI-EcoRI de G2a-2 y el gen Reg y la PTP de rata.

Las Figuras 23C y 23D muestran el alineamiento de la secuencia PstI de G5d-1 y el gen Reg.

Las Figuras 24A-24D muestran la expresión de la proteína de la cadena neural por el ADNc de 1-9a (Figura 24A) y el clon genómico PstI de G2a-2 (Figura 24B). Las Figuras 24C y 24D muestran la expresión negativa por el clon genómico EcoRI/PstI de G5d-1 y pBluescript que carece de un inserto clonado, respectivamente.

Las Figuras 25A y 25B representan un análisis de transferencia de Northern del ARNm de AD16c en cerebros con AD y cerebros de control de edad similar. Los datos muestran niveles elevados de expresión de ARNm de AD16c en 6 de 9 cerebros con AD en comparación con 1 de 6 cerebros de control de edad similar.

La Figura 26 representa un análisis de transferencia de Western de proteínas de fusión AD10-7 usando anticuerpos monoclonales contra la proteína marcadora expresada (anticuerpos monoclonales de ratón T7-marcador).

Las Figuras 27A y 27B representan análisis microscópicos de campo brillante y de campo oscuro de la hibridación in situ de sondas de ARNc con sentido y antisentido para secciones de tejido cerebral humano con AD en sus primeras fases.

Definiciones

En la descripción que se proporciona a continuación, se utilizan ampliamente varios términos usados en la tecnología de ADN recombinante. Para proporcionar una comprensión clara y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que se dará a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

Vector de clonación. Un ADN plasmídico o de fago u otra secuencia de ADN que es capaz de replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora y que se caracteriza por uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los que dichas secuencias de ADN pueden cortarse de una forma determinable sin perder la función biológica esencial del vector, y en los que puede insertarse un fragmento de ADN para llevar a cabo su replicación y clonación. El vector de clonación puede contener además un marcador adecuado para uso en la identificación de células transformadas con el vector de clonación. Los marcadores, por ejemplo, proporcionan resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina.

Vector de expresión. Un vector similar a un vector de clonación pero que puede aumentar la expresión de un gen que se ha clonado en su interior, después de la transformación de un hospedador. El gen clonado normalmente se coloca bajo el control (es decir, unido de forma funcional) de ciertas secuencias de control tales como secuencias promotoras. Las secuencias promotoras pueden ser constitutivas o inducibles.

Sustancialmente pura. Como se usa en la presente memoria, significa que la proteína purificada deseada carece esencialmente de componentes celulares contaminantes, estando asociados dichos componentes con la proteína deseada de forma natural, como se demuestra por una sola banda después de una electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico. Los componentes contaminantes celulares pueden incluir, pero sin limitación, impurezas proteicas, de carbohidratos o lipídicas.

La expresión "sustancialmente pura" se utiliza además para describir una molécula que es homogénea por una o más características de pureza u homogeneidad usadas por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, una NTP sustancialmente pura mostrará características constantes y reproducibles dentro de las desviaciones experimentales convencionales para parámetros tales como los siguientes: peso molecular, migración cromatográfica, composición de aminoácidos, secuencia de aminoácidos, extremo N bloqueado o no bloqueado, perfil de elución de HPLC, actividad biológica y otros parámetros similares. Sin embargo, la expresión no pretende excluir mezclas artificiales o sintéticas del factor con otros compuestos. Además, la expresión no pretende excluir tampoco proteínas de fusión de NTP aisladas a partir de un hospedador recombinante.

Hospedador recombinante. De acuerdo con la invención, un hospedador recombinante puede ser cualquier célula procariota o eucariota que contiene los genes clonados deseados en un vector de expresión o vector de clonación. Esta expresión también pretende incluir las células procariotas o eucariotas que se han modificado por ingeniería genética para contener el gen o los genes deseados en el cromosoma o genoma de ese organismo.

Vector recombinante. Cualquier vector de clonación o vector de expresión que contenga el gen o los genes clonados deseados.

Hospedador. Cualquier célula procariota o eucariota que sea el receptor de un vector de expresión o vector de clonación replicable. Un "hospedador", como se usa este término en la presente memoria, también incluye células procariotas o eucariotas que pueden modificarse por ingeniería genética mediante técnicas bien conocidas para contener el gen o los genes deseados en su cromosoma o genoma. Como ejemplo de estos hospedadores véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratoty Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Promotor. Una secuencia de ADN descrita generalmente como la región 5' de un gen, localizada próxima al codón de inicio. La transcripción de un gen o genes adyacentes se inicia en la región promotora. Si un promotor es un promotor inducible, la velocidad de transcripción aumenta en respuesta a un agente de inducción. Por el contrario, la velocidad de transcripción no se regula por un agente de inducción si el promotor es un promotor constitutivo.

Gen. Una secuencia de ADN que contiene la información necesaria para expresar un polipéptido o proteína.

Gen estructural. Una secuencia de ADN que se transcribe en un ARN mensajero (ARNm) que después se traduce en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.

Gen de ARN antisentido/ARN antisentido. En eucariotas, el ARNm se transcribe mediante la ARN polimerasa II. Sin embargo, también se sabe que se puede construir un gen que contenga una plantilla de la ARN polimerasa II donde se transcribe una secuencia de ARN que tiene una secuencia complementaria a la de un ARNm específico, pero normalmente no se traduce. Dicha construcción génica se denomina en la presente memoria "gen de ARN antisentido" y dicho transcrito de ARN se denomina "ARN antisentido". Los ARN antisentido normalmente no se pueden traducir debido a la presencia de codones de terminación de la traducción en la secuencia de ARN antisentido.

Oligonucleótido antisentido. Una molécula de ADN o ARN que contiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la de un ARNm específico. Un oligonucleótido antisentido se une a la secuencia complementaria de un ARNm específico e inhibe la traducción del ARNm.

Terapia antisentido. Un método de tratamiento donde se administran oligonucleótidos antisentido a un paciente para inhibir la expresión de la proteína correspondiente.

ADN complementario (ADNc). Un gen de "ADN complementario" o "ADNc" incluye genes recombinantes sintetizados mediante transcripción inversa de ARNm y de los que se han retirado las secuencias intermedias (intrones).

Expresión. Expresión es el proceso por medio del cual se produce un polipéptido a partir de un gen estructural. El proceso implica la transcripción del gen en ARNm y la traducción de dicho ARNm en uno o más polipéptidos.

Homólogo/no homólogo. Dos moléculas de ácido nucleico se consideran "homólogas" si sus secuencias de nucleótidos comparten una similitud mayor de 50%, determinada por algoritmos de codificación HASH (Wilber, W.J. y Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:726-730 (1983)). Dos moléculas de ácido nucleico se consideran "no homólogas" si sus secuencias de nucleótidos comparten una similitud menor de 50%.

Ribozima. Una ribozima es una molécula de ARN que contiene un centro catalítico. El término incluye enzimas de ARN, ARN de auto-corte y empalme, y ARN de autoescisión.

Terapia con ribozimas. Un método de tratamiento en el que se administra una ribozima a un paciente para inhibir la traducción del ARNm diana.

Fragmento. Un "fragmento" de una molécula tal como NTP pretende hacer referencia a cualquier subserie de polipéptidos de dicha molécula.

Derivado funcional. La expresión "derivados funcionales" pretende incluir "variantes", "análogos" o "derivados químicos" de la molécula. Una "variante" de una molécula tal como NTP pretende hacer referencia a una molécula natural sustancialmente similar a la molécula entera, o a un fragmento de la misma. Un "análogo" de una molécula tal como NTP pretende hacer referencia a una molécula no natural sustancialmente similar a la molécula entera o a un fragmento de la misma.

Se dice que una molécula es "sustancialmente similar" a otra molécula si la secuencia de aminoácidos de las dos moléculas es sustancialmente igual y si las dos moléculas poseen una actividad biológica similar. De esta manera, siempre que dos moléculas posean una actividad similar, se consideran variantes como se usa dicha expresión en la presente memoria aunque una de las moléculas contenga restos aminoacídicos adicionales no encontrados en la otra, o aunque la secuencia de restos aminoacídicos no sea idéntica.

Como se usa en la presente memoria, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando contiene restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la molécula. Estos restos pueden mejorar la solubilidad, absorción, vida media biológica, etc. de la molécula. Como alternativa, los restos pueden reducir la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula etc. En Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) se describen ejemplos de restos capaces de mediar dichos efectos y serán evidentes para los especialistas habituales en la técnica.

NTP. El término "NTP" se refiere a una proteína de la cadena neural codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 descrita en la presente memoria.

Inmunorreacción en Cadena de la Polimerasa. Un método para la detección de antígenos usando conjugados específicos de anticuerpo-ADN. De acuerdo con este método, se usa una molécula enlazadora con una afinidad de unión biespecífica por ADN y anticuerpos para unir una molécula de ADN específicamente a un complejo de antígeno-anticuerpo. Como resultado, se forma un conjugado de antígeno-anticuerpo-ADN específico. El ADN unido puede amplificarse por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleotídicos apropiados. La presencia de productos de PCR específicos demuestra que las moléculas de ADN se unen específicamente a complejos de antígeno-anticuerpo, indicando de esta manera la presencia del antígeno. (Sano et al., Science 258: 120-122 (1992)).

Por ejemplo, Sano et al., supra, construyeron una quimera de estreptavidina-proteína A que posee una afinidad de unión específica por la biotina y la inmunoglobulina G. Esta quimera (es decir, la "molécula enlazadora") se usó para unir un ADN biotinilado específicamente a complejos de antígeno-anticuerpo monoclonal que se habían inmovilizado en pocillos de placas de microtitulación. Posteriormente se amplificó mediante PCR un segmento del ADN unido.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere a una proteína de la cadena neural (NTP) codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1, a secuencias genéticas que codifican el ARNm de NTP o el ARNm antisentido, a vectores de expresión que contienen las secuencias genéticas, a hospedadores recombinantes transformados por dichos vectores y al ARN para la NTP codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 y el ARN antisentido producido por dicha expresión de hospedadores recombinantes transformados. Esta invención también se refiere a ribozimas de NTP y a moléculas de ADN recombinantes que codifican ribozimas para la NTP codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 y oligonucleótidos antisentido para la NTP codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1. Esta invención también se refiere a anticuerpos dirigidos contra una NTP, así como al uso de anticuerpos de NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 y secuencias de ácidos nucleico de la NTP codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 para la detección de la presencia de una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 en muestras biológicas. La invención también se refiere al uso de secuencias codificantes de la NTP codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 en terapia génica.

1. Aislamiento de Secuencias de ADN que Codifican Proteínas de la Cadena Neural

Las secuencias de ADN que codifican una NTP proceden de diversas fuentes. Estas fuentes incluyen ADN genómico, ADNc, ADN sintético y combinaciones de los mismos.

El ADN genómico de una NTP humana puede extraerse y purificarse a partir de cualquier célula o tejido humano, por medios bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). El ADN genómico de la NTP de la invención puede incluir o no intrones naturales. Además, dicho ADN genómico puede obtenerse en asociación con la región promotora 5' de las secuencias del gen de NTP y/o con la región de terminación de la traducción 3'. Además, dicho ADN genómico puede obtenerse en asociación con secuencias de ADN que codifican la región 5' no traducida del ARNm de la NTP y/o con las secuencias genéticas que codifican la región 3' no traducida. En la medida en la que una célula hospedadora puede reconocer las señales reguladoras de la transcripción y/o la traducción asociadas con la expresión del ARNm y la proteína, pueden retenerse las regiones 5' y/o 3' no transcritas del gen nativo, y/o las regiones 5' y/o 3' no traducidas del ARNm, y emplearse para la regulación de la transcripción y la
traducción.

Como alternativa, un ARNm de NTP puede aislarse a partir de cualquier célula que exprese una NTP y usarse para producir ADNc por medios bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook et al., supra). Preferiblemente, la preparación de ARNm usada estará enriquecida en ARNm que codifica una NTP de forma natural, por aislamiento a partir de células que producen grandes cantidades de una NTP, o in vitro, por técnicas usadas comúnmente para enriquecer preparaciones de ARNm con secuencias específicas, tales como centrifugación en gradiente de sacarosa, o de ambas maneras. Un ARNm de NTP puede obtenerse a partir de tejido neuronal de mamífero o a partir de líneas celulares procedentes de dicho tejido. Preferiblemente, se construyen bibliotecas de ADNc humanas a partir de cerebro fetal de 17-18 semanas, a partir de neocórtex de lóbulo temporal de dos años de edad, a partir del córtex cerebral de cerebro con AD en fase terminal o a partir de líneas celulares procedentes de tejido neuronal humano. Estas líneas celulares pueden incluir, pero sin limitación, células de tumores neuroectodérmicos primitivos del sistema nervioso central (tales como PNET1 o PNET2, como se describe en la presente memoria), células de neuroblastoma (tales como SH-Sy5y, como se describe en la presente memoria) ó células de glioma humano (tales como A172; ATCC CRL 1620). Como alternativa, puede prepararse una biblioteca de ADNc de rata a partir de ARNm aislado de células de glioma de rata, por ejemplo, células de glioma de rata C6 (ATCC CCL107).

Para la clonación en un vector, se rompen aleatoriamente o se escinden enzimáticamente preparaciones de ADN adecuadas (genómicas o de ADNc) respectivamente y se unen a vectores apropiados para formar una biblioteca de genes recombinantes (genómica o de ADNc). Una secuencia de ADN que codifica una NTP puede insertarse en un vector de acuerdo con técnicas convencionales, incluyendo la obtención de extremos romos o extremos escalonados para ligamiento, digestión con enzimas de restricción para proporcionar terminaciones apropiadas, relleno de extremos cohesivos cuando sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable y ligamiento con ligasas apropiadas. Se describen técnicas para estas manipulaciones por Sambrook et al., supra y son bien conocidas en la técnica.

Pueden explorarse bibliotecas de clones que contienen NTP y los clones de NTP pueden identificarse por cualquier medio que seleccione específicamente ADN de NTP tal como, por ejemplo: 1) por hibridación con una o más sondas de ácido nucleico apropiadas que contengan una secuencia específica para el ADN de esta proteína; o 2) por análisis de traducción seleccionado por hibridación en el que el ARNm nativo hibrida con el clon en cuestión, se traduce in vitro, y los productos de traducción se caracterizan adicionalmente; o 3) si las propias secuencias de ADN clonadas pueden expresar ARNm, por inmunoprecipitación de un producto de NTP traducido producido por el hospedador que contiene el clon.

Pueden diseñarse sondas oligonucleotídicas específicas para una NTP que pueden usarse para identificar clones para esta proteína a partir del conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la NTP correspondiente, o regiones homólogas de la PTP. Como alternativa, pueden diseñarse sondas oligonucleotídicas si se conoce la secuencia de nucleótidos de la PTP (de la Monde et al., J. Clin Invest. 86:1004-1013 (1990)).

El oligonucleótido o la serie de oligonucleótidos adecuada capaz de codificar un fragmento del gen de NTP (o uno que sea complementario a dicho oligonucleótido, o serie de oligonucleótidos) puede sintetizarse por medios bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook et al., supra). Sambrook et al., supra describen técnicas de hibridación de ácidos nucleicos y de identificación de clones. Después se analizan los miembros de la biblioteca de genes descrita anteriormente que se consideran capaces de realizar dicha hibridación para determinar el grado y la naturaleza de las secuencias codificantes de NTP que contienen.

Para facilitar la detección de la secuencia codificante de NTP deseada, la sonda de ADN descrita anteriormente se marca con un grupo detectable. Dicho grupo detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Estos materiales se han desarrollado bien en el campo de la hibridación de los ácidos nucleicos y, en general, puede aplicarse a la presente invención la mayoría de los marcadores útiles en dichos métodos. Son particularmente útiles los marcadores radiactivos incluyendo ^{32}P, ^{3}H, ^{14}C, ^{125}I o similares. Puede emplearse cualquier marcador radiactivo que proporcione una señal adecuada y que tenga una vida media suficiente. La sonda de ADN puede marcarse, por ejemplo, por traslado de mellas, por síntesis de reemplazo con ADN polimerasa de T4, o por cebado aleatorio, entre otros métodos bien conocidos en la técnica (véase Sambrook et al.,
supra).

Como alternativa, las sondas de ADN pueden marcarse con marcadores no radiactivos tales como biotina, una enzima o un grupo fluorescente.

En un método alternativo para clonar secuencias de ADN de NTP, se obtienen ADNc de NTP por clonación directa de ADNc de líneas celulares y tejido cerebral usando los métodos 3' y 5'-RACE, como se describe en la presente memoria. Preferiblemente, se usa como fuente de ARNm una línea celular de tumor neuroectodérmico humano o tejido de cerebro con AD.

II. Expresión del gen que codifica NTP

Por lo tanto, los métodos descritos anteriormente pueden identificar secuencias de ADN que codifican una NTP o fragmentos de la misma. Para caracterizar adicionalmente dichas secuencias de ADN y para producir la proteína recombinante, es deseable expresar las proteínas codificadas por la secuencia de ADN.

Para expresar una NTP, se necesitan señales de transcripción y traducción reconocibles por un hospedador apropiado. Las secuencias de ADN de NTP clonadas obtenidas por los métodos descritos anteriormente y preferiblemente en forma bicatenaria, pueden "unirse de forma funcional" a secuencias que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión e introducirse en una célula hospedadora, procariota o eucariota, para producir NTP recombinante. Dependiendo de la cadena de la secuencia codificante de NTP que se una de forma funcional a las secuencias que controlan la expresión transcripcional, también es posible expresar un ARN antisentido de NTP.

La expresión de NTP en diferentes hospedadores puede dar como resultado diferentes modificaciones post-traduccionales que pueden alterar las propiedades de la NTP. Preferiblemente, la presente invención incluye la expresión de una NTP en células eucariotas y, especialmente, en células de mamíferos, insectos y levaduras. Son hospedadores eucariotas especialmente preferidos las células de mamífero. Las células de mamífero proporcionan modificaciones post-traduccionales a la NTP recombinante que incluyen el plegamiento y/o fosforilación. Más preferiblemente, las células hospedadoras de mamífero incluyen células de tumores neuroectodérmicos primitivos del SNC humano, células de neuroblastoma humano, células de glioma humano o células de glioma de rata. Las células de tumores neuroectodérmicos primitivos especialmente preferidas incluyen PNET1 y PNET2, las células de gioblastoma humano especialmente preferidas incluyen Hg16 y Hg 17, las células de glioma humano especialmente preferidas incluyen A172 y las células de glioma de rata especialmente preferidas incluyen C6 (véase el Ejemplo 1).

Como alternativa, una NTP puede expresarse por células hospedadoras procariotas. Preferiblemente, una NTP recombinante se expresa por dichas células como una proteína de fusión, como se describe en la presente memoria. Un hospedador procariota especialmente preferido es E. coli. Las cepas preferidas de E. coli incluyen Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 y ER1647 (véase, por ejemplo, Molecular Biology LabFax. Brown T.A., Ed. Academic Press, New York (1991)). Un hospedador alternativo preferido es Bacillus subtilis, incluyendo cepas tales como BR151, YB886, MI119, MI120 y B170 (véase, por ejemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods" en DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)).

Se dice que una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de control de la expresión que a su vez contienen información reguladora de la transcripción y dichas secuencias están "unidas de forma funcional" a la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína.

Se dice que dos secuencias de una molécula de ácido nucleico están unidas de forma funcional cuando están unidas entre sí de tal manera que se permite que las dos secuencias se transcriban en el mismo transcrito de ARN o que se permita que un transcrito de ARN comience en una secuencia que se extenderá en la segunda secuencia. De esta forma dos secuencias, tales como una secuencia promotora y cualquier otra "segunda" secuencia de ADN o ARN están unidas de forma funcional si la transcripción que comienza en la secuencia promotora produce un transcrito de ARN de la segunda secuencia unida de forma funcional. Para que estén unidas de forma funcional no es necesario que las dos secuencias sean adyacentes entre sí.

Las secuencias promotoras de la presente invención pueden ser procariotas, eucariotas o virales. Los promotores adecuados son promotores de represión, constitutivos o inducibles. Los ejemplos de promotores procariotas adecuados incluyen promotores capaces de reconocer las polimerasas de T4 (Malik et al., J. Biol. Chem. 263:1174-1181 (1984); Rosenberg et al., Gene 59:191-200 (1987); Shinedling et al., J. Molec. Biol. 195:471-480 (1987); Hu et al., Gene 42:21-30 (1986)), T3, Sp6 y T7 (Chamberlin et al., Nature 228:227-231 (1970); Bailey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 80:2814-2818 (1983); Davanloo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:2035-2039 (1984); los promotores P_{R} y P_{L} del bacteriófago lambda (The Bacteriophage Lambda, Hershey, A.D., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1973); Lambda II, Hendrix, R.W., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1980)); los promotores trp, recA, de choque térmico y lacZ de E. coli; los promotores de la \alpha-amilasa (Ulmanen et al., Bacteriol. 162:176-182 (1985)) y específico delta-28 de B. subtilis (Gilman et al., Gene 32:11-20 (1984)); los promotores de los bacteriófagos de Bacillus (Gryczan, En: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)); promotores de Streptomyces (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203:468-478 (1986)); el promotor int del bacteriófago lambda; el promotor bla del gen de la \beta-lactamasa de pBR322 y el promotor CAT del gen de la cloranfenicol acetil transferasa de pBR325, etc. Los promotores procariotas se revisan por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277-282 (1987)); Cenatiempo, Biochimie 68:505-516 (1986); Watson et al., En: Molecular Biology of the Gene, Cuarta Edición, Benjamin Cummins, Menlo Park, CA (1987); Gottesman, Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (1984); y Sambrook et al., supra.

Los promotores procariotas preferidos incluyen el promotor del gen de la metalotioneína I de ratón (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288 (1982)); el promotor de TK del virus del Herpes (McKnight, Cell 31:355-365 (1982)); el promotor temprano de SV40 (Benoist, et al., Nature (London) 290: 304-310 (1981)); y el promotor del gen gal4 de levadura (Johnston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:6971-6975 (1982); Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951-5955 (1984)).

Los promotores mas preferidos de la presente invención son promotores fuertes. Son ejemplos de estos promotores preferidos los que reconocen los promotores de la polimerasa de T3, SP6 y T7; el promotor P_{L} del bacteriófago lambda; el promotor recA y el promotor del gen de la metalotioneína I de ratón. El promotor mas preferido para la expresión en células procariotas es uno que es capaz de reconocer el promotor de la polimerasa de T7. Las secuencias de dichas secuencias de reconocimiento de polimerasa se describen por Watson, et al. (En: Molecular Biology of the Gene, Cuarta Edición; Benjamin Cummins, Menlo Park, CA, (1987). El promotor mas preferido para la expresión en células de mamífero es SV40 (Gorman, "High Efficiency Gene Transfer into Mammalian cells", en DNA Cloning: A Practical Approach, Volume II, IRL Press, Washington, D.C. páginas 143-190 (1985)).

III. Métodos de detección de NTP

Esta invención se refiere a métodos de detección de enfermedades neurológicas en un sujeto humano, utilizando las sondas de ácidos nucleicos que pueden hibridar con genes de NTP o transcritos de una NTP codificada por moléculas de ADN AD3-4DH1, o anticuerpos específicos para una NTP codificada por moléculas de ADN AD3-4DH1. Por "enfermedad neurológica" se entiende la enfermedad de Alzheimer (AD) u otros trastornos neurodegenerativos con cambios patogénicos de tipo Alzheimer (por ejemplo, enfermedad de Parkinson con neurodegeneración de tipo AD), así como tumores neuroectodérmicos, astrocitomas malignos y glioblastomas. Por "sujeto humano" se entiende cualquier ser humano o cualquier forma del desarrollo del mismo tal como un embrión o feto humano, antes del nacimiento. Los métodos de diagnóstico de la presente invención no requieren la extracción invasiva de tejido neural.

La presente invención también se refiere a ensayos, tanto a ensayos de hibridación de ácidos nucleicos como a inmunoensayos, para detectar la presencia de una NTP codificada por moléculas de ADN AD3-4DH1 en células o en fluidos biológicos de un sujeto humano usando histología con microscopia óptica o electrónica, imágenes, ensayos radiactivos o basados en enzimas, y similares.

a. Ensayos de Hibridación de Ácidos Nucleicos

Para ensayar una muestra de tejido en relación con una NTP usando un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos, puede aislarse ARN a partir del tejido por sección en un criostato y lisis de las secciones con un detergente tal como SDS y un agente quelante tal como EDTA, opcionalmente con digestión durante una noche con proteinasa K (50 \mug/ml). Dicho tejido se obtiene por autopsia y biopsia. Una cantidad preferida de tejido está en el intervalo de 1-10 miligramos. Se retiran las proteínas mediante extracciones con fenol y cloroformo y los ácidos nucleicos se precipitan con etanol. El ARN se aísla por cromatografía en una columna de oligo dT y después se eluye de la misma. También puede realizarse un fraccionamiento adicional de acuerdo con métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica.

Para la detección de secuencias de ADN o ARN en tejidos se usan varias técnicas de hibridación molecular; de las que cada una tiene ciertas ventajas e inconvenientes. Cuando se dispone de grandes cantidades de tejido, el análisis de la cinética de hibridación proporciona la oportunidad de cuantificar de forma precisa la cantidad de ADN o ARN presente, así como de distinguir secuencias que están muy relacionadas pero no son idénticas a la sonda, y de determinar el porcentaje de homología.

Las reacciones se realizan en condiciones de hibridación (Tm-25ºC) en las que la velocidad de reasociación de la sonda es óptima (Wetmur et al., J. Mol. Biol. 31:349:370 (1968)). La cinética de la reacción es de segundo orden cuando las secuencias del tejido son idénticas a las de la sonda; sin embargo, la reacción presenta una cinética compleja cuando las secuencias de la sonda tienen una homología parcial con las del tejido (Sharp et al., J. Mol. Biol. 86:709-726 (1974)).

La relación entre la sonda y el ARN de la célula se determina por la sensibilidad deseada. Para detectar un transcrito por célula se requerirían aproximadamente 100 pg de sonda por \mug de ADN o ARN celular total. Los ácidos nucleicos se mezclan, se desnaturalizan, se llevan a la concentración de sal y a la temperatura apropiadas y se dejan hibridar durante diversos periodos de tiempo. La velocidad de reasociación puede determinarse cuantificando la cantidad de sonda hibridada por cromatografía en hidroxiapatita (Britten et al., Science 161:529-540 (1968) o digestión con nucleasa S1 (Sutton, Biochim. Biophys. Acta 240:522-531 (1971)).

Un método de hibridación más flexible es la técnica de transferencia de Northern. Esta técnica ofrece variabilidad en la rigurosidad de la reacción de hibridación, así como en la determinación del estado de las secuencias retrovirales en la muestra bajo análisis. El análisis de Northern puede realizarse como se describe en este documento.

Una consideración importante asociada con el análisis de hibridación de las secuencias de ADN o ARN es el grado de relación que tiene la sonda con las secuencias presentes en la muestra que se está estudiando. Esto es importante con la técnica de transferencia, ya que un grado moderado de homología de secuencia en condiciones no rigurosas de hibridación puede producir una señal fuerte aunque la sonda y las secuencias de la muestra representen genes no homólogos.

La técnica de hibridación particular no es esencial para la invención, estando dentro del alcance de la presente invención cualquier técnica usada comúnmente en este campo. Se describe una tecnología típica de sondas en la Patente de Estados Unidos 4.358.535 de Falkow et al. Por ejemplo, la hibridación puede realizarse en una solución que contiene SSC 6x (SSC 10 x: cloruro sódico 1,5 M, citrato sódico 0,15 M, pH 7,0), solución de Denhardt 5x (Denhardt 1x: albúmina de suero bovino al 0,2%, polivinilpirrolidona al 0,2% y Ficoll 400 al 0,02%), EDTA 10 Mm, SDS al 0,5% y aproximadamente 10^{7} cpm de ADN obtenido por traslado de mellas durante 16 horas a 65ºC.

Las sondas marcadas, como se ha descrito anteriormente, proporcionan un método de diagnóstico general para la detección de una NTP en un tejido. El método es razonablemente rápido, tiene un protocolo sencillo, tienen reactivos que pueden estandarizarse y proporcionarse como kits comerciales y permite una rápida exploración de un gran número de muestras.

En un método para realizar el procedimiento, un aislado clínico que contienen transcritos de ARN se fija a un soporte. El ácido nucleico fijado se pone en contacto con un polinucleótido marcado que tiene una secuencia de bases complementaria u homóloga a la cadena codificante del gen de NTP.

Los ensayos de hibridación de la presente invención son particularmente adecuados para la preparación y comercialización en forma de kit, comprendiendo el kit un medio de soporte compartimentalizado para contener uno o mas medios de recipiente (vial, tubo de ensayo, etc.) individuales pero próximos, comprendiendo cada uno de dichos medios de recipiente uno de los elementos separados a usar en el ensayo de hibridación.

Por ejemplo, puede haber un medio de recipiente que contenga moléculas de ADNc de NTP adecuadas para el marcaje por el "traslado de mellas" (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra, como metodología convencional) o moléculas de ADNc o ARN de NTP marcadas. Otros medios de recipiente pueden contener soluciones convencionales para el traslado de mellas de ADNc de NTP que comprenden ADN polimerasa I/DNasa I y desoxirribonucleótidos no marcados (es decir, dCTP, dTTP, dGTP y dATP).

La presencia de ARN de NTP se determina por la variación en el aspecto y/o cantidad de ARN relacionado con la sonda en el tejido ensayado.

Las sondas de ADN de esta invención también pueden usarse para el diagnóstico diferencial de una AD hereditaria o familiar y una AD no hereditaria o esporádica. La forma familiar de AD a menudo aparece en una edad anterior y está asociada con el síndrome de Down en la familia. De esta manera, un ensayo genético de AD familiar permite realizar un asesoramiento genético a las familias. Aunque se han dirigido muchos esfuerzos a la caracterización de un marcador genético para la AD familiar (Gusella, FASEB J 3:2036-2041 (1989); Hooper, J NIH Res. 4:48-54 (1992)), el análisis de asociación genética sólo identifica una secuencia marcadora genética sin proporcionar el conocimiento de la función de la secuencia genómica. Por el contrario, las sondas de ADNc descritas en la presente memoria y obtenidas a partir de individuos con AD esporádica codifican una proteína conocida de función conocida que se sobreexpresa en el tejido cerebral de pacientes con AD.

La mayoría de los casos de trastorno AD parecen ser de la forma esporádica, aunque existen casos familiares bien documentados (Gusella, supra; Harrison's Principles of Internal Medicine, Braunwald et al., Eds., Decimoprimera Edición, Mc Graw-Hill Book Company, New York, páginas 2012-2013 (1987)). Un paciente con AD familiar, a diferencia de un paciente con AD esporádica, heredó la mutación de predisposición a través de las células germinales. Se ha demostrado que algunos de los casos familiares siguen un patrón de herencia dominante autosómico (Id.). De esta manera, el ADN de un paciente con AD familiar contendrá la alteración genética heredada que está ausente en el ADN de un paciente con AD esporádica.

Un método de diferenciación entre la AD esporádica y familiar en un sujeto humano implica obtener una muestra biológica del sujeto humano que se sospecha que tiene la enfermedad de Alzheimer. Después, se purifica el ADN de la muestra biológica. Finalmente, el ADN se pone en contacto con una sonda de ADN de NTP en condiciones de hibridación. La AD familiar se indica por la detección de un híbrido de la sonda y el ADN, mientras que el AD esporádica se indica por la ausencia de detección de hibridación.

Por ejemplo, la muestra biológica puede ser una muestra de sangre que se somete a centrifugación diferencial para enriquecer la muestra en glóbulos blancos antes de que hayan transcurrido tres días desde la recolección (Park, "PCR in the Diagnosis of Retinoblastoma", en PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, Inc., New York; páginas 407-415 (1990)). La muestra de ADN puede prepararse usando el método de N-lauroilsarcosina sódica-Proteinasa K, fenol y RNasa (Sambrook et al., supra). El análisis de ADN puede realizarse mediante la digestión de la muestra de ADN, preferiblemente 5 microgramos, con una endonucleasa de restricción (tal como HindIII). Después, el ADN digerido se fracciona usando electroforesis en gel de agarosa, preferiblemente un gel de agarosa horizontal al 1%, durante 18 horas en un tampón que preferiblemente contiene Tris-HCl 89 mM (pH 8), borato sódico 89 mM y EDTA 2 mM (Gusella et al., Nature 306:234-238 (1983)). Se puede realizar un análisis de Southern usando técnicas convencionales (Sambrook et al., supra) y las sondas de ADNc de AD marcadas pueden hibridar en las condiciones descritas anteriormente. Las sondas de ADN preferidas para este método de diagnóstico diferencial incluyen 1-9a, AD3-4, AD4-4 y G2-2 PstI.

b. Inmunoensayos

Pueden usarse anticuerpos dirigidos contra una NTP, como se enseña en la presente invención, para detectar y diagnosticar AD. También pueden usarse diversos métodos de tinción histológica, incluyendo los métodos de tinción inmunohistoquímica, eficazmente de acuerdo con las enseñanzas de la invención. La tinción con plata es sólo un método de visualización de NTP. Para el especialista en la técnica serán evidentes otros métodos de tinción útiles en la presente invención, cuya determinación no implique una experimentación indebida (véase, en general, por ejemplo, A Textbook of Histology, Eds. Bloom and Fawcett, W. B. Saunders Co., Philadelphia (1964)).

Un método de exploración para determinar si un compuesto dado es un derivado funcional de NTP comprende, por ejemplo, inmunoensayos que emplean metodologías de radioinmunoensayo (RIA) o de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), basados en la producción de anticuerpos específicos (monoclonales o policlonales) contra una NTP. Para estos ensayos, se obtienen muestras biológicas por punción venosa (sangre), punción espinal (líquido cefalorraquídeo (CSF)), orina y otras secreciones corporales tales como sudor y lágrimas. Por ejemplo, en una forma de RIA, la sustancia de ensayo se mezcla con antisuero diluido en presencia de un antígeno radiomarcado. En este método, la concentración de la sustancia de ensayo será inversamente proporcional a la cantidad de antígeno marcado unido al anticuerpo específico y estará relacionada directamente con la cantidad de antígeno marcado libre. Para los especialistas en la técnica serán evidentes otros métodos de selección adecuados.

La presente invención también se refiere a métodos para detectar una molécula de NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 o derivados funcionales de la misma en una muestra o sujeto. Por ejemplo, pueden marcarse de forma detectable anticuerpos específicos para una NTP, o un derivado funcional, con cualquier marcador apropiado, por ejemplo un radioisótopo, una enzima, un marcador fluorescente, un marcador paramagnético o un radical libre.

Como alternativa, pueden marcarse de forma detectable anticuerpos específicos para una NTP, o un derivado funcional, con ADN por la técnica de inmunorreacción en cadena de la polimerasa (Sano et al., Science 258:120-122 (1992)). El procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica secuencias de ácido nucleico específicas por medio de una serie de manipulaciones que incluyen desnaturalización, hibridación de cebadores oligonucleotídicos y extensión de los cebadores con ADN polimerasa (véase, por ejemplo, Mullis et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202; Mullis et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.683.195; Loh et al., Science 243:217 (1988)). Las etapas pueden repetirse muchas veces, dando como resultado una gran amplificación del número de copias de la secuencia específica original. Es posible amplificar únicamente una sola copia de una secuencia de ADN para producir cientos de nanogramos de producto (Li et al., Nature 335:414 (1988)). Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos incluyen sistemas de amplificación basados en la transcripción (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989); Gingeras et al., documento WO 88/10315), y la "reacción en cadena de la ligasa" en la que dos (o mas) oligonucleótidos se unen en presencia de una diana de ácido nucleico que tiene la secuencia del "di-oligonucleótido" resultante, amplificándose de esta manera el dioligonucleótido (Wu et al., Genomics 4: 560 (1989); Backman et al., documento EP 320.308; Wallace, documento EP 336.731; Orgel, documento WO 89/09835). Por ejemplo, puede realizarse el ensayo de inmuno-PCR inmovilizando diversas cantidades del material de ensayo en la superficie de pocillos de microtitulación (véase Sanzo et al., supra, página 122, nota a pié de página 7). Posteriormente, los pocillos se incuban con un anticuerpo monoclonal contra NTP, se lavan y después se incuban con moléculas de ADN de NTP biotiniladas que se han conjugado con una quimera de estreptavidina-proteína (Id.). Esta quimera se une a la biotina (a través del resto de estreptavidina) y la parte Fc de una molécula de inmunoglobulina G (a través del resto de proteína A) (Id., en 120; Sanzo et al., Bio/Technology 9:1378 (1991)). Después, los pocillos se lavan para retirar los conjugados no unidos. Cualquier NTP presente en el material de ensayo se unirá al anticuerpo monoclonal contra NTP que, a su vez, está unido al resto de proteína A del conjugado de ADN de NTP biotinilado - estreptavidina-proteína A. Después, las secuencias de ADN de NTP se amplifican usando PCR. En resumen, los pocillos de microtitulación se incuban con desoxirribonucleósido trifosfatos, cebadores oligonucleotídicos de NTP y ADN polimerasa de Taq (véase Sanzo et al., supra, página 122, nota a pie de página 11). Puede usarse un aparato de ciclos térmicos automático (tal como el PTC-100-96 Thermal Cycler, MJ Research, Inc) para realizar la PCR en condiciones convencionales (Id.). Posteriormente, los productos de PCR se analizan por electroforesis en gel de agarosa después de tinción con bromuro de etidio.

Los especialistas habituales en la técnica conocen métodos para fabricar y detectar dichos anticuerpos marcados de manera detectable o sus derivados funcionales y se describen a continuación con más detalle. Los trabajos de referencia convencionales que establecen los principios generales de la inmunología incluyen el trabajo de Klein (Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982)); Kennet et al. (Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980)); Campbell ("Monoclonal Antibody Technology", En: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13 (Burdon, R., et al., eds.). Elsevier, Amsterdam (1984)); y Eisen (En: Microbiology, 3ª Ed. (Davis, et al., Harper & Row, Philadelphia (1980)).

El término "anticuerpo" se refiere tanto a anticuerpos monoclonales que son una población sustancialmente homogénea como a anticuerpos policlonales que son poblaciones heterogéneas. Los anticuerpos policlonales proceden de los sueros animales inmunizados con un antígeno. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales (mAb) contra antígenos específicos por métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256:495-497 (1975) y la Patente de Estados Unidos Nº 4.376.110. Estos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas.

Los anticuerpos monoclonales, particularmente los mAb Th7, Th9 y Th10 usados en la presente invención, pueden prepararse como se ha descrito previamente (Gross et al., J. Clin. Invest. 76:2115-2126 (1985); Ozturk et al., Proc. Natl. Acad: Sci. USA 86:419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci. 113:152-164 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol. 32:733-742 (1992). Los anticuerpos monoclonales Th se generaron contra la forma pancreática purificada de la proteína de la cadena (Id.). También pueden generarse anticuerpos monoclonales y policlonales específicos para NTP contra una NTP sustancialmente pura aislada a partir de hospedadores recombinantes (por ejemplo, véase, Carroll et al., "Production and Purification of Polyclonal Antibodies to the Foreign Segment of \beta-Galactosidase Fusion Proteins", en DNA Cloning: A Practical Approach, Volume III. IRL Press, Washington, D.C., páginas 89-111 (1987); Mole et al., "Production of Monoclonal Antibodies Against Fusion Proteins Produced in Escherichia coli", en DNA Cloning: A Practical Approach, Volume III, IRL Press, Washington, D.C., páginas 113-1139 (1987)). Como alternativa, pueden generarse anticuerpos policlonales y monoclonales específicos para NTP contra una NTP sustancialmente pura aislada a partir de un material biológico tal como tejido y líneas celulares cerebrales, usando técnicas bien conocidas.

Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos monoclonales específicos para las moléculas de NTP codificadas por la molécula de ADN AD3-4DH1 a partir de proteínas de origen recombinante, que se expresan, aíslan y purifican a partir del ADNc (es decir, 1-9a), clones genómicos (G2-2 PstI) y clones de ADNc de AD-NTP 3-4. Estas moléculas de NTP se obtienen a partir de los ADNc y clones genómicos anteriores, se insertan y se producen en vectores de expresión adecuados (véanse las Figuras 2A y 2B). Como hay regiones con una homología de 60-70% en los extremos 5' del ADNc de NTP 1-9a y PTP, se pueden obtener anticuerpos monoclonales que se unan específicamente a las proteínas recombinantes NTP y no a la forma pancreática realizando una exploración diferencial rutinaria (véase, por ejemplo, de la Monte et al., J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990)). Aunque habrá anticuerpos monoclonales que se unen tanto a NTP como a PTP, será posible generar anticuerpos monoclonales específicos para NTP porque hay una divergencia de secuencias sustancial entre las moléculas de NTP de diversas formas (por ejemplo, 8, 14, 17, 21 y 42 kDa) y porque un epítopo puede estar definido por tan sólo 6-8 aminoácidos.

También se entiende que el término "anticuerpo" incluye tanto moléculas intactas como fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab y F(ab')_{2},que pueden unirse a antígenos. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc de un anticuerpo intacto, se eliminan mas rápidamente de la circulación y puede tener menos unión tisular no específica que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).

Se apreciará que pueden usarse Fab y F(ab')_{2}y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención, para la detección y cuantificación de una NTP de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria, para detectar y diagnosticar AD de la misma manera que un anticuerpo intacto. Dichos fragmentos se producen típicamente por escisión proteolítica usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')_{2}).

Se dice que un anticuerpo es "capaz de unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula de tal forma que la molécula se una al anticuerpo. El término "epítopo" pretende hacer referencia a la parte de cualquier molécula capaz de unirse a un anticuerpo que también puede reconocerse por dicho anticuerpo. Los determinantes epitópicos normalmente consisten en agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activos tales como cadenas laterales de aminoácidos o de azúcares y tienen características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas.

Un "antígeno" es una molécula que puede unirse a un anticuerpo y que además es capaz de inducir en un animal la producción de anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más de un epítopo. Se entiende que la reacción específica mencionada anteriormente indica que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con los múltiples anticuerpos distintos que pueden inducirse por otros antígenos.

Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, útiles en la presente invención pueden usarse para detectar de forma cuantitativa o cualitativa la presencia de células que contienen los antígenos de NTP. De esta manera, los anticuerpos (o sus fragmentos) útiles en la presente invención pueden emplearse histológicamente para detectar o visualizar la presencia de una NTP.

Dicho ensayo para una NTP típicamente comprende incubar una muestra biológica de dicho sujeto que se sospecha que tiene dicha afección, en presencia de una molécula de unión marcada de forma detectable (por ejemplo, un anticuerpo) capaz de identificar una NTP, y detectar dicha molécula de unión unida en la muestra.

De esta manera, en este aspecto de la invención una muestra biológica puede tratarse con nitrocelulosa u otro soporte sólido capaz de inmovilizar a las células, partículas celulares o proteínas solubles. El soporte después puede lavarse con tampones adecuados seguido de tratamiento con el anticuerpo específico para NTP marcado de forma detectable. El soporte en fase sólida después puede lavarse con el tampón por segunda vez para retirar el anticuerpo no unido. Posteriormente puede detectarse la cantidad de marcador unido en dicho soporte sólido por medios convencionales.

Por "soporte en fase sólida" se entiende cualquier soporte capaz de unirse a antígenos o anticuerpos. Los soportes o vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del soporte puede ser soluble en alguna medida o insoluble para los fines de la presente invención. El material de soporte puede tener prácticamente cualquier configuración estructural posible siempre que la molécula acoplada pueda unirse a un antígeno o anticuerpo. De esta manera, la configuración del soporte puede ser esférica, como en el caso de una perla, o cilíndrica, como en el caso de la superficie interna de un tubo de ensayo o la superficie externa de una varilla. Como alternativa, la superficie puede ser plana, tal como una lámina, tira de ensayo, etc. Los soportes preferidos incluyen perlas de poliestireno. Los especialistas en la técnica conocerán muchos otros soportes adecuados para la unión de anticuerpos monoclonales o antígenos, o podrán determinarlos mediante el uso de una experimentación de rutina.

Una realización para realizar el ensayo de diagnostico de la presente invención en una muestra biológica que contiene una NTP, comprende:

(a)

poner en contacto un anticuerpo marcado de forma detectable específico para una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 con un soporte sólido para efectuar la inmovilización de dicho anticuerpo específico para NTP o un fragmento del mismo;

(b)

poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 con dicho soporte sólido;

(c)

incubar dicho anticuerpo marcado de forma detectable específico para una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 con dicho soporte durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el anticuerpo específico para NTP inmovilizado se una a la NTP;

(d)

separar el soporte en fase sólida de la mezcla de incubación obtenida en la etapa (c); y

(e)

detectar el marcador unido y de esta forma detectar y cuantificar la NTP.

Como alternativa, los complejos de anticuerpo específico para NTP marcado/NTP de una muestra pueden separarse de la mezcla de reacción poniendo en contacto el complejo con una proteína o anticuerpo inmovilizado que es específico para una inmunoglobulina, por ejemplo, la proteína A de Staphylococcus, la proteína G de Staphylococcus o anticuerpos anti-IgM o anti-IgG. Dichos anticuerpos anti-inmunoglobulina pueden ser policlonales, pero preferiblemente son monoclonales. El soporte sólido después puede lavarse con un tampón adecuado para dar un complejo inmovilizado de NTP/anticuerpo marcado específico para NTP. Después puede detectarse el marcador para dar una medida de una NTP.

Este aspecto de la invención se refiere a un método para detectar una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 o un fragmento de la misma en una muestra, que comprende:

(a)

poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene una NTP con un anticuerpo específico para NTP o un fragmento del mismo que se une a una NTP codificada por AD3-4DH1; y

(b)

detectar si se forma un complejo.

La invención también se refiere a un método para detectar una NTP codificada por AD3-4DH1 en una muestra, que comprende además:

(c)

poner en contacto la mezcla obtenida en la etapa (a) con una molécula de unión a Fc, tal como un anticuerpo, proteína A de Staphylococcus o proteína G de Staphylococcus, que está inmovilizada en un soporte en fase sólida y es específica para el anticuerpo específico para NTP, para proporcionar un complejo de NTP/anticuerpo específico para NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 inmovilizado;

(d)

lavar el soporte en fase sólida obtenido en la etapa (c) para retirar el complejo de NTP/anticuerpo específico para NTP no unido;

(e)

y detectar el marcador unido a dicho soporte sólido.

Por supuesto, las concentraciones específicas de anticuerpo marcado de forma detectable y NTP, la temperatura y el tiempo de incubación, así como otras condiciones de ensayo, pueden variarse dependiendo de diversos factores que incluyen la concentración de la NTP en la muestra, la naturaleza de la muestra y similares. La actividad de unión de un lote dado de anticuerpo anti-NTP puede determinarse de acuerdo con métodos bien conocidos. Los especialistas en la técnica podrán determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando una experimentación de rutina.

A los ensayos se les pueden añadir otras etapas tales como lavado, agitación, sacudida, filtración y similares cuando sea habitual o necesario para la situación particular.

Una de las maneras en las que puede marcarse de forma detectable el anticuerpo específico para NTP es por medio de su unión a una enzima. Esta enzima, a su vez, una vez expuesta a su sustrato, reaccionará con el sustrato de tal manera que producirá un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, por medios espectofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que pueden usarse para marcar de forma detectable el anticuerpo específico para NTP incluyen, pero sin limitación, malato deshidrogenasa, nucleasa de estafilococos, delta-V-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, \alpha-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, \beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa VI-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa.

La detección puede realizarse usando cualquiera de una diversidad de inmunoensayos. Por ejemplo, mediante marcaje radiactivo de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con especificidad para NTP, es posible detectar NTP mediante el uso de ensayos radioinmunes. Puede encontrarse una buena descripción de un ensayo radioinmune en Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, de Work, et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), haciendo referencia en particular al capítulo titulado "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" de Chard.

El isótopo radiactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o por autorradiografía. Son isótopos particularmente útiles para los fines de la presente invención: ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S, ^{14}C y preferiblemente ^{125}I.

También es posible marcar el anticuerpo con especificidad para NTP con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado de forma fluorescente se expone a luz de la longitud de onda apropiada, su presencia puede detectarse debido a la fluorescencia. Ente los compuestos marcadores fluorescentes usados más comúnmente se encuentran isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, \alpha-ftaldehído y fluorescamina.

El anticuerpo con especificidad para NTP también puede marcarse de forma detectable usando metales emisores de fluorescencia tales como ^{152}Eu, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden unirse al anticuerpo específico para NTP usando grupos quelantes de metales tales como ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminatetraacético (EDTA).

El anticuerpo con especificidad para NTP también puede marcarse de forma detectable por acoplamiento a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo con especificidad para NTP marcado con un compuesto quimioluminiscente después se determina detectando la presencia de luminiscencia que se produce durante el transcurso de una reacción química. Son ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes particularmente útiles luminol, isoluminol, éster de acridinio theromatic, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

El anticuerpo con especificidad para NTP también puede marcarse con biotina y después hacerse reaccionar con avidina. Un fragmento de ADN marcado con biotina se unirá al anticuerpo monoclonal biotinilado con NTP mediante un enlace de avidina. Después se detectan las moléculas de NTP por amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del fragmento de ADN con cebadores específicos (Sano et al., Science 258: 120-122 (1992)).

De forma similar, puede usarse un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo con especificidad para NTP de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que puede encontrarse en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Son compuestos bioluminiscentes importantes para los fines del marcaje luciferina, luciferasa y aecuorina.

La detección del anticuerpo con especificidad para NTP puede realizarse por un contador de centelleo, por ejemplo, si el marcador detectable es un emisor gamma radiactivo, o por medio de un fluorómetro, por ejemplo, si el marcador es un material fluorescente. En el caso de un marcador enzimático, la detección puede realizarse por métodos colorimétricos que emplean un sustrato para la enzima. La detección también puede realizarse por comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados de forma
similar.

La detección de focos de estos anticuerpos marcados de manera detectable es indicativa de una enfermedad o un estado disfuncional como se ha descrito previamente. Para los fines de la presente invención, la NTP que se detecta por este ensayo puede estar presente en una muestra biológica. Puede usarse cualquier muestra que contenga una NTP. Sin embargo, una de las ventajas del diagnóstico de la presente invención es que puede evitarse la extracción invasiva de un tejido. Por lo tanto, preferiblemente, la muestra es una solución biológica tal como, por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, sangre, suero, orina y similares. Sin embargo, la invención no se limita a ensayos que usan sólo estas muestras, siendo posible que un especialista en la técnica determine condiciones adecuadas que permitan el uso de otras muestras.

Por ejemplo, pueden usarse ensayos inmunorradiométricos basados en anticuerpos monoclonales de tres sitios (M-IRMA) para medir los niveles de NTP en un fluido biológico tal como CSF. Por medio de punción espinal, es posible obtener de forma rutinaria CSF a partir de individuos que se sospecha que tienen AD. De esta manera, el diagnóstico de AD puede establecerse por medio de un inmunoensayo sencillo no invasivo que revela niveles de NTP muy aumentados por encima de los niveles normales.

En una realización, como se ha descrito anteriormente, este examen de AD se realiza extrayendo muestras de fluido biológico e incubando dichas muestras en presencia de anticuerpos (o fragmentos de anticuerpos) marcados de forma detectable. En una realización preferida, esta técnica se realiza de manera no invasiva mediante el uso de imágenes magnéticas, fluorografía, etc.

Hay muchos marcadores diferentes in vivo y muchos métodos de marcaje conocidos por los especialistas habituales en la técnica. Los ejemplos de los tipos de marcadores que pueden usarse en la presente invención incluyen isótopos radiactivos e isótopos paramagnéticos. Los especialistas habituales en la técnica conocerán otros marcadores adecuados para unirse a los anticuerpos usados en la invención, o podrán determinarlos usando una experimentación rutinaria. Además, la unión de estos marcadores a los anticuerpos puede realizarse usando técnicas convencionales comunes para los especialistas habituales en la técnica.

Los anticuerpos (o sus fragmentos) útiles en la presente invención también son particularmente adecuados para uso en inmunoensayos in vitro para detectar la presencia de una NTP en un tejido corporal, fluidos (tales como CSF) o extractos celulares. En estos inmunoensayos, los anticuerpos (o fragmentos de anticuerpos) pueden utilizarse en fase líquida o, preferiblemente, unidos a un soporte en fase sólida, como se ha descrito anteriormente.

Los especialistas habituales en la técnica conocerán otros marcadores adecuados que pueden emplearse de acuerdo con la presente invención. La unión de estos marcadores a anticuerpos o sus fragmentos puede realizarse usando técnicas convencionales conocidas comúnmente por los especialista habituales en la técnica. Se describen técnicas típicas por Kennedy, et al., (Clin. Chim. Acta 70: 1-31 (1976) y Schurs et al. (Clin. Chim. Acta 81:1-40 (1977)). Las técnicas de acoplamiento mencionadas por el último son el método del glutaraldehído, el método de peryodato, el método de dimaleimida y el método de éster de maleimidobencil-N-hidroxi-succinimida.

Puede realizarse detección in situ extrayendo una muestra histológica de un paciente y proporcionando la combinación de anticuerpos marcados de la presente invención a dicha muestra. El anticuerpo (o fragmento) preferiblemente se proporciona aplicando o añadiendo el anticuerpo marcado (o su fragmento) a una muestra biológica. Por medio del uso de dicho procedimiento, es posible determinar no sólo la presencia de una NTP, sino también la distribución de una NTP en el tejido examinado. Usando la presente invención, los especialistas habituales percibirán fácilmente que puede modificarse cualquiera de una amplia diversidad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) para conseguir dicha detección in situ.

Las moléculas de unión de la presente invención pueden adaptarse para la utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como ensayo de "dos sitios" o de tipo "sandwich". En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo no marcado (o fragmento de anticuerpo) se une a un soporte sólido que es insoluble en el fluido que se está ensayando (es decir, CSF) y se añade una cantidad de anticuerpo soluble marcado de forma detectable para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo en fase sólida, el antígeno y el anticuerpo marcado.

Los ensayos inmunométricos típicos y preferidos incluyen ensayos "directos" en los que el anticuerpo unido a la fase sólida primero se pone en contacto con la muestra a ensayar para extraer el antígeno de la muestra por medio de la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno en fase sólida binario. Después de un periodo de incubación adecuado, se lava el soporte sólido para retirar el residuo de la muestra de fluido, incluyendo el antígeno que no ha reaccionado, si lo hay, y después se pone en contacto con una solución que contiene una cantidad desconocida de anticuerpo marcado (que funciona como "molécula indicadora"). Después de un segundo periodo de incubación para permitir que el anticuerpo marcado forme un complejo con el antígeno unido al soporte sólido por medio del anticuerpo no marcado, se lava el soporte sólido por segunda vez para retirar el anticuerpo marcado que no ha reaccionado. Este tipo de ensayo de tipo sandwich directo puede ser un ensayo sencillo de "sí/no" para determinar si el antígeno está presente o puede realizarse de forma cuantitativa comparando la medida del anticuerpo marcado con la obtenida para una muestra patrón que contiene cantidades conocidas de antígeno. Este ensayo de "dos sitios" o de tipo "sandwich" se describe por Wide en las páginas 199-206 de Radioimmune Assay Method, editado por Kirkham y Hunter, E & S. Livingstone, Edinburgh, 1970.

En otro tipo de ensayo de tipo "sandwich", que también puede ser útil con los antígenos de la presente invención, se usan los denominados ensayos "simultáneo" e "inverso". Un ensayo simultáneo implica una sola etapa de incubación, ya que el anticuerpo unido al soporte sólido y el anticuerpo marcado se añaden a la muestra a ensayar al mismo tiempo. Después de completarse la incubación, el soporte sólido se lava para retirar el residuo de muestra de fluido y el anticuerpo marcado no complejado. Después se determina la presencia de un anticuerpo marcado asociado al soporte sólido como si fuera un ensayo de tipo sandwich "directo" convencional.

En el ensayo "inverso" primero se utiliza la adición por etapas de una solución de anticuerpo marcado a la muestra de fluido, seguido de la adición de anticuerpo no marcado unido a un soporte sólido después de un periodo de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase sólida se lava de forma convencional para retirar el residuo de la muestra a ensayar y la solución de anticuerpo marcado que no ha reaccionado. Posteriormente se determina el anticuerpo marcado asociado con un soporte sólido como en los ensayos "simultáneo" y "directo".

Los métodos de detección in vivo o in vitro descritos anteriormente pueden usarse en la detección y diagnóstico de AD sin necesidad de extraer el tejido. Dichos métodos de detección pueden usarse para ayudar en la determinación del estadío de deterioro neurológico en caso de AD por medio de la evaluación y comparación de una NTP presente en la muestra biológica.

Como se usa en la presente memoria, una cantidad eficaz de un reactivo de diagnóstico (tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) es una cantidad capaz de conseguir la discriminación de diagnóstico deseada y variará dependiendo de factores tales como la edad, estado, sexo, el grado de enfermedad del sujeto, contraindicaciones, si las hay, y otras variables que deberán ajustarse por el médico. La cantidad de estos materiales que se usan típicamente en un ensayo de diagnóstico generalmente está comprendida entre 0,1 y 5 mg, y preferiblemente entre 0,1 y 0,5 mg.

El ensayo de la presente invención también es adecuado idealmente para la preparación de un kit. Dicho kit puede comprender un medio de soporte que está compartimentalizado para recibir uno o más medios de recipientes individuales asociados tales como viales, tubos, y similares, comprendiendo cada uno de dichos medios de recipiente los elementos separados del inmunoensayo.

Por ejemplo, puede haber un medio de recipiente que contiene un primer anticuerpo inmovilizado en un soporte en fase sólida, y un medio de recipiente adicional que contiene un segundo anticuerpo marcado de forma detectable en solución. Otros medios de recipiente adicionales pueden contener soluciones patrón que comprenden diluciones seriadas de la NTP a detectar. La soluciones patrón de una NTP pueden usarse para preparar una curva patrón con la concentración de NTP representada en el eje de las abscisas y la señal de detección en el eje de las ordenadas. Los resultados obtenidos a partir de una muestra que contiene una NTP pueden interpolarse a partir de dicho gráfico para proporcionar la concentración de la NTP.

IV. Aislamiento de NTP

Las proteínas de NTP codificadas por la molécula de ADN AD3-4DH1 o fragmentos de esta invención pueden obtenerse mediante la expresión de ADN recombinante como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, la NTP codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 puede purificarse a partir material biológico.

Para los fines de la presente invención, un método de purificación que es ilustrativo, sin ser limitante, consiste en las siguientes etapas.

Una primera etapa en la purificación de una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4DH1 incluye la extracción de la fracción de NTP de una muestra biológica, tal como tejido cerebral o CSF, en tampones, con o sin agentes solubilizantes tales como urea, ácido fórmico, detergente o tiocianato.

Una segunda etapa incluye someter el material solubilizado a cromatografía de intercambio iónico en columnas Mono-Q o Mono-S (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc; Piscataway, NJ). De forma similar, el material solubilizado puede separarse por cualquier otro proceso donde las moléculas pueden separarse, por ejemplo, de acuerdo con la densidad de carga, la distribución de carga y el tamaño molecular. La elución de la NTP de la resina de intercambio iónico se controla mediante un inmunoensayo, tal como M-IRMA, en cada fracción. Después se dializan los picos inmunorreactivos, se liofilizan y se someten a un tamiz molecular o cromatografía en gel.

El tamiz molecular o la cromatografía en gel es un tipo de cromatografía de reparto en la que la separación se basa en el tamaño molecular. Para este tipo de separación se usan comúnmente geles de dextrano, poliacrilamida y agarosa. Un gel útil para la presente invención es Sepharose 12 (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.). Sin embargo, pueden usarse otros métodos conocidos por los especialistas en la técnica para separar de forma eficaz moléculas basándose en el tamaño.

Una cuarta etapa en un protocolo de purificación para una NTP incluye el análisis de los picos inmunorreactivos por electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE), una etapa de purificación cromatográfica en gel adicional y tinción, tal como, por ejemplo, tinción con plata.

Una quinta etapa en un método de purificación incluye someter la NTP obtenida después de la SDS-PAGE a cromatografía de afinidad, o a cualquier otro procedimiento basado en la afinidad entre una sustancia a aislar y una molécula a la que puede unirse específicamente. Para la purificación adicional de una NTP puede usarse cromatografía de afinidad en Sepharose conjugada con mAb anti-NTP (tales como Th9 o mAb específicos generados contra la NTP sustancialmente pura). Son útiles métodos alternativos tales como HPLC de fase inversa o cualquier otro método caracterizado por una separación rápida con una buena resolución de los picos.

Otro método para purificar la NTP codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 es usar CSF concentrado obtenido a partir de pacientes con AD. Para este procedimiento se concentran 30-40 mililitros por liofilización o filtración con Amicon o similares, y se someten a una electroforesis bidimensional en gel. Las proteínas se separan en una dirección por carga en un gradiente de pH y después se someten a cromatografía de tamiz molecular en la otra dirección por electroforesis en gel de poliacrilamida. Las proteínas inmunorreactivas con NTP se identifican como manchas por los anticuerpos monoclonales Th (por ejemplo, Th9) usando análisis de transferencia de Western. El gel se corta y las proteínas NTP se eluyen del gel. Las NTP purificadas de esta manera pueden secuenciarse o usarse para obtener nuevos anticuerpos monoclonales.

Se apreciará que el método preferido descrito anteriormente puede sustituirse por otras etapas de purificación. Los especialistas en la técnica podrán idear esquemas de purificación alternativos sin experimentación indebida.

V. Terapia Génica Usando Ribozimas

Las ribozimas proporcionan un método para inhibir la función del ARNm. Las ribozimas pueden enzimas de ARN, ARN de auto-empalme y ARN de auto-escisión (Cech et al., Journal of Biological Chemistry 267: 17479-17482 (1992)).

Es posible construir ribozimas de novo que tengan una actividad endonucleasa dirigida en trans a una cierta secuencia diana. Como estas ribozimas pueden actuar sobre diversas secuencias, pueden diseñarse ribozimas para prácticamente cualquier sustrato de ARN. De esta manera, las ribozimas son herramientas muy flexibles para inhibir la expresión de genes específicos y proporcionar una alternativa a construcciones antisentido.

Se ha construido satisfactoriamente una ribozima contra el ARNm de la cloranfenicol acetiltransferasa (Haseloff et al., Nature 334:585-591 (1988); Uhlenbeck et al, Nature 328:596-600 (1987)). La ribozima contiene tres dominios estructurales: 1) una región muy conservada de nucleótidos que flanquea el sitio de escisión en la dirección 5'; 2) las secuencias muy conservadas contenidas en los dominios de escisión naturales de ribozimas, que forman un tallo de pares de bases; y 3) las regiones que flanquean el sitio de escisión en los dos lados y aseguran la disposición exacta de la ribozima en relación con el sitio de escisión y la cohesión del sustrato y la enzima. Las enzimas de ARN construidas de acuerdo con este modelo ya han demostrado ser adecuadas in vitro para la escisión específica de secuencias de ARN (Haseloff et al., supra).

Como alternativa, pueden usarse ribozimas de horquilla en las que el sitio activo procede de la cadena menos del ARN satélite del virus de las manchas anulares del tabaco (Hampel et al., Biochemistry 28: 4929-4933 (1989)). Recientemente se diseñó una ribozima de horquilla que escinde el ARN del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo I (Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10802-10806 (1992)). Otras actividades del ARN de auto-escisión están asociadas con el virus de la hepatitis delta (Kuo et al., J. Virol., 62:4429-4444 (1988)).

Son dianas preferidas para las ribozimas de NTP las secuencias de nucleótidos que no son homólogas a secuencias de PTP. Preferiblemente, la molécula de ribozima de NTP de la presente invención se diseña basándose en la ribozima de cloranfenicol acetiltransferasa o ribozimas de horquilla, descritas anteriormente. Como alternativa, se diseñan moléculas de ribozima NTP como se describe por Eckstein et al., (Publicación Internacional Nº WO 92/07065) que describen construcciones de ribozima catalíticamente activas que tienen mayor estabilidad contra la degradación química y enzimática, y que por lo tanto son útiles como agentes terapéuticos.

En una estrategia alternativa, puede construirse una secuencia guía externa (EGS) para dirigir la ribozima endógena, RNasa P, al ARNm de NTP intracelular, que posteriormente se escinde por la ribozima celular (Altman et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.168.053). Preferiblemente, la EGS de NTP comprende una secuencia de 10 a 15 nucleótidos complementaria a un ARNm de NTP y una secuencia de nucleótidos 3'-NCCA, donde N es preferiblemente una purina (Id.). Después de administrar a las células las moléculas EGS de NTP, como se describe más adelante, las moléculas se unen a las especies de ARNm de NTP diana formando pares de bases entre el ARNm de NTP y las secuencias de EGS de NTP complementarias, promoviendo de esta manera la escisión del ARNm de NTP por la RNasa P en el nucleótido en el lado 5' de la región que forma pares de bases (Id.).

Como alternativa, pueden codificarse moléculas de ARN antisentido de NTP, ribozimas de NTP y EGS de NTP por construcciones de ADN que se administran en forma de viriones, que preferiblemente son incapaces de replicar in vivo (véase, por ejemplo, Taylor, documento WO 92/06693). Por ejemplo, estas construcciones de ADN pueden administrarse usando virus basados en el virus del herpes (Gage et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.082.670). Como alternativa, pueden codificarse secuencias de ARN antisentido de NTP, ribozimas de NTP y EGS de NTP por construcciones de ARN que se administran en forma de viriones, tales como retrovirus. La preparación de vectores retrovirales es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Brown et al., "Retroviral Vectors", en DNA Cloning: A Practical Approach, Volumen 3, IRL Press, Washington, D.C. (1987)).

Puede conferirse especificidad para la expresión génica en el sistema nervioso central usado secuencias reguladoras específicas para células apropiadas tales como potenciadores y promotores con especificidad celular. Por ejemplo, estas secuencias incluye las secuencias que regulan la expresión específica de oligodendroglía del virus JC, la expresión específica de glía de la proteína proteolipídica y los genes de la proteína ácida fibrilar glial (Gage et al., supra). Como la fosforilación de proteínas es crítica para la regulación neuronal (Kennedy, "Second Messengers and Neuronal Function", en An Introduction to Molecular Neurobiology, Hall, Ed., Sinauer Associates, Inc. (1992)), pueden usarse secuencias promotoras de proteína quinasa para conseguir niveles suficientes de expresión génica de NTP.

De esta manera, puede usarse terapia génica para aliviar la AD por medio de la inhibición de la expresión inapropiada de la NTP codificada por la molécula de ADN AD3-4HD1. Además, puede usarse terapia génica para aliviar la AD proporcionando el nivel de expresión apropiado de una forma particular de una NTP codificada por una molécula de ADN AD3-4HD1. En este caso, pueden codificarse secuencias de ácido nucleico de NTP particulares por construcciones de ADN o ARN que se administran en forma de virus, como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, pueden modificarse "células donadoras" in vitro usando vectores virales o retrovirales que contienen secuencias de NTP, o usando otras técnicas bien conocidas para introducir ADN extraño en las células (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra). Estas células donadoras incluyen fibroblastos, células neuronales, células de glía y células de tejido conectivo (Gage et al., supra). Después de la manipulación genética, las células donadoras se injertan en el sistema nervioso central y, de esta manera, las células modificadas genéticamente proporcionan la forma terapéutica de NTP (Id.).

Además, estos viriones pueden introducirse en la corriente sanguínea para administrarse al cerebro. Esto se consigue por medio de la ruptura osmótica de la barrera hematoencefálica antes de la administración de los viriones (véase, por ejemplo, Neuwelt, Patente de Estados Unidos Nº 4.866.042). La barrera hematoencefálica puede romperse por medio de la administración de una solución hipertónica, no tóxica. farmacéuticamente eficaz tal como manitol, arabinosa o glicerol (Id.).

Los siguientes clones en E. coli se depositaron de acuerdo con el tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852); G2-2 Pstl-DH5 (ATCC Nº 69257); G5d-PstI-DH5 (ATCC Nº 69258); 1-9a-LX-1 blue (ATCC Nº 69259); AD3-4-DH1 (ATCC Nº 69260); HB4-XL-blue (ATCC Nº 69261); AD10-7-DH1 (ATCC Nº 69262); AD2-2-DH1- (ATCC Nº 69263); G5d-1PstI-EcoRI-DH5 (ATCC Nº 69264); y G2-2PstI-EcoRI-DH5 (ATCC Nº 69265).

Habiendo descrito la invención en general, se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención a menos que se especifique de otra manera.

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Ejemplo 1

Expresión de Inmunorreactividad de NTP en Líneas Celulares

Se identificaron siete líneas celulares procedentes del sistema nervioso central que expresan inmunorreactividad con proteínas de la cadena usando el anticuerpo monoclonal Th9 que se generó contra la forma pancreática de la proteína (Gross et al., J. Clin. Invest. 76:2115-2126 (1985)), pero presenta reacción cruzada con proteínas de la cadena presentes en tejido cerebral y líquido cefalorraquídeo (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci. 113:152-164 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol. 32:733-742 (1992)). Entre ellas se encontraban las siguientes: dos líneas celulares de tumor neuroectodérmico primitivo (PNET) denominadas PNET1 y PNET2; tres líneas celulares de glioblastoma Hg1 16, Hg1 17 y C6; la línea de células gliales A172; y la línea celular de neuroblastoma SH-Sy5y. Las líneas celulares de glioblastoma y las células A172 se obtuvieron a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Las células SH-Sy5y se obtuvieron a partir de Dr. Biedler en el Sloan-Kettering Memorial Hospital. Las líneas celulares PNET se han descrito previamente (The et al., Nature genetics 3:62-66 (1993)), y se obtuvieron a partir de Dr. Rene' Bernards en el MGH Cancer Center. Todas las líneas se mantuvieron en medio de Eagle Modificado por Earl suplementado con suero bovino fetal al 10% y sin antibióticos.

Para examinar las células con respecto a la proteína de la cadena y otras inmunorreactividades, los cultivos se recogieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 4,3 mM, KH_{2}PO_{4} 1,4 mM; pH 7,3) que contenía EDTA 2 mM, y se hicieron preparaciones de citocentrifugación usando 10^{5} células por portaobjetos. Las preparaciones de citocentrifugación se fijaron inmediatamente en metanol al 100% (-20ºC), se secaron al aire y después se almacenaron a -80ºC hasta que se usaron. Antes de la inmunotinción, los portaobjetos se equilibraron a temperatura ambiente y se hidrataron en PBS. La unión de anticuerpo no específica se bloqueó con suero de caballo no inmune al 3%. Se incubaron preparaciones de citocentrifugación repetidas procedentes de los mismos cultivos durante una noche a 4ºC con 5 ó 10 \mug/ml de anticuerpo primario. La inmunorreactividad se reveló por el método de peroxidasa de rábano picante con avidina-biotina usando el kit Vectastain Elite (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y con 3,3'-diaminobenzidina (0,5 mg/ml más peróxido de hidrógeno al 0,03%) como cromógeno. Las células después se tiñeron con hematoxilina como colorante de contraste, se deshidrataron en soluciones de alcohol graduadas, se aclararon en xilenos y se conservaron bajo cubreobjetos con Permount (Fisher Scientific).

Se inmunotiñeron preparaciones de citocentrifugación de cada línea celular con los anticuerpos monoclonales de la proteína de la cadena Th9, Th7, Th10, Th29, Th34, TH46, Th67 y Th90. Además, se inmunotiñeron portaobjetos de réplica con anticuerpos monoclonales de control positivos (neurofilamento, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y vimentina) y negativos (desmina, antígeno de superficie de hepatitis B-5C3). Con la excepción de 5C3, que se generó en el laboratorio del inventor (Fujita et al., Gastroenterology 91: 1357-1363 (1986)), los anticuerpos de control se compraron (Boehringer-Mannheim). Todos los reactivos serológicos se diluyeron en PBS que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 1% y todas las incubaciones excepto la que tenía anticuerpo primario se realizaron a temperatura ambiente en cámaras humidificadas. Los portaobjetos se lavaron en tres cambios de PBS entre cada etapa.

Tanto las células PNET1 como las células PNET2 expresaban proteínas de neurofilamento de peso molecular alto y medio y poca o ninguna proteína ácida fibrilar glial o vimentina. Las células PNET1, PNET2 y SH-Sy5y expresaban GAP-43, una fosfoproteína de unión a calmodulina abundante que está muy expresada en neuronas inmaduras y en neuronas que experimentan un crecimiento celular regenerativo (Benowitz et al., J. Neurosci. 3:2153-2163 (1983); DeGraan et al., Neurosci Lett 61:235-241 (1985); Kalil et al., J. Neurosci. 6:2563-2570 (1986)). Las células A172 y C6 expresaban GFAP y vimentina. Sin embargo, A172 también presentaba inmunorreactividad de neurofilamentos, lo cual suscitó dudas sobre su naturaleza puramente de células gliales. Ninguna de las líneas celulares manifestó inmunorreactividad con anticuerpos monoclonales contra desmina o antígeno de superficie de hepatitis B. Como línea celular de control negativo, se inmunotiñó de forma similar la línea celular de carcinoma hepatocelular Huh7 y se descubrió que no presentaba ninguna inmunorreactividad con los anticuerpos anteriores. Sin embargo, las células Huh fueron inmunorreactivas con anticuerpos monoclonales contra la proteína sustrato del receptor de insulina IRS-1 (datos no mostrados) que se usó como control positivo para esta línea celular (Sasaki et al., J. Biol. Chem. 268: 1-4 (1993)).

Usando el anticuerpo monoclonal Th9, se detectó inmunorreactividad de la proteína de la cadena en PNET primarias (A), glioblastoma primario (F), PNET1 (B) y células C6 (G), pero no en líneas de células de carcinoma hepatocelular (Figuras 1A-1J). Además, se detectó inmunorreactividad de Th9 en secciones histológicas de 8 de las 9 PNET de SNC humanas primarias, y de los 5 glioblastomas humanos primarios estudiados (Figuras 1A-1J). Aunque las 5 líneas celulares presentaron una inmunorreactividad intensa con el anticuerpo monoclonal Th9, diferían con respecto a la inmunorreactividad para otros anticuerpos monoclonales Th. La reacción de inmunotinción generada con los anticuerpos monoclonales Th10 (C, H), Th7 (D, I) o Th46 era de bajo nivel (C, D) o estaba ausente (H, I, E, J) en PNET1 (C-E) y C6 (H-J). Las células PNET2 presentaron únicamente bajos niveles de inmunorreactividad con Th7 y Th29 y no manifestaron ninguna inmunotinción con los otros anticuerpos monoclonales Th. Las células A172, C6 y SH-Sy5y presentaban una inmunorreactividad pequeña o nula con anticuerpos monoclonales Th distintos de Th9. Las células Huh7 no presentaban ninguna inmunorreactividad con ninguno de los anticuerpos monoclonales de la proteína de la cadena empleados, mientras que el tejido pancreático humano era inmunorreactivo con todos los anticuerpos Th que se habían generado contra la forma pancreática purificada de la proteína de la cadena (Gross et al., J. Clin. Invest. 76:2115-2126 (1985)).

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Ejemplo 2

Análisis de Proteínas de la Cadena por el Ensayo Inmunorradiométrico Basado en Anticuerpos Monoclonales (M-IRMA)

Se lavaron células cultivadas en PBS y se recuperaron en PBS que contenía EDTA 2 mM. Las células se sedimentaron por centrifugación a 1000 x g durante 15 minutos y después se resuspendieron en tampón de lisis que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), Tritón X-100 al 1%, EGTA 2 mM, EDTA 10 mM, NaF 100 mM, Na_{4}P_{2}O_{7} 1 mM, Na_{3}VO_{4} 2 mM, 100 \mug/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 \mug/ml de aprotinina, 1 \mug/ml de pepstatina A y 1 \mug/ml de leupeptina. Las fracciones de sobrenadante obtenidas por centrifugación de los lisados a 14.000 x g durante 10 minutos se usaron para el análisis de transferencia de Western, los estudios de inmunoprecipitación y M-IRMA. La concentración de proteínas se determinó por el ensayo colorimétrico de Lowry. Las muestras se almacenaron a -40ºC.

M-IRMA es un ensayo de tipo sándwich directo de dos o tres sitios muy sensible que permite la cuantificación de NTP picomolar en lisados celulares, medio de cultivo de tejidos, homogeneizados de tejidos y fluidos corporales (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci. 113:152-164 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol 32:733-742 (1992); Gross et al., J. Clin. Invest. 76:2115-2126 (1985)). Además, cuando se combina con SDS-PAGE, M-IRMA puede usarse para determinar el tamaño molecular de proteínas de la cadena y especies relacionadas (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci. 113:152-164 (1992), de la Monte et al., Ann. Neurol 32:733-742 (1992)). M-IRMA implica la captura de las proteínas de la cadena inmunorreactivas presentes en muestras biológicas usando anticuerpos monoclonales Th7 y Th10 fijados a una matriz en fase sólida, y la posterior detección del antígeno capturado con un tercer anticuerpo monoclonal indicador radiomarcado (Th9) contra la misma proteína. En resumen, se recubrieron perlas de poliestireno de 1/4 de pulgada (0,635 cm) (Precision Ball, Inc.) con uno o dos anticuerpos monoclonales contra proteínas de la cadena (normalmente Th7 + Th10). Se incubaron lisados celulares o fracciones del sobrenadante de homogeneizados de tejido (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci. 113:152-164 (1992), de la Monte et al., Ann. Neurol 32:733-742 (1992)) durante una noche con las perlas recubiertas para capturar proteínas de la cadena presentes en las muestras. Las perlas se lavaron 5 veces con PBS y después se incubaron con Th9 marcado con ^{125}I como indicador para detectar las proteínas de la cadena capturadas. La concentración de proteína de la cadena en el lisado u homogeneizado de tejidos se determinó a partir de una curva patrón generada con cantidades conocidas de proteína de la cadena purificada. Este ensayo de alta sensibilidad puede detectar una cantidad tan pequeña como 10 pmol de proteína de la cadena en solución. Para ensayar proteínas de la cadena fraccionadas por SDS-PAGE, los geles en húmedo se cortaron a intervalos de 2 mm y las proteínas se eluyeron de cada fracción en 0,5 ml de PBS por agitación durante 24 horas a temperatura ambiente. En los eluatos se ensayaron directamente las proteínas de la cadena por M-IRMA.

En correspondencia con la tinción inmunocitoquímica generalizada de células PNET1 con Th7, Th10, Th34 y Th29, se midió fácilmente la inmunorreactividad de proteínas de la cadena en estas células por M-IRMA. En otras palabras, con anticuerpos monoclonales (MoAb) Th7, Th10, Th34 y Th29 usados como anticuerpos de captura, de forma individual o con dos de ellos juntos, y Th9 marcado con ^{125}I usado como indicador, se midieron niveles similarmente elevados de proteína de la cadena (Figura 2). Por el contrario, en células PNET2, C6 y A172, que presentaron una inmunorreactividad intensa con Th9 pero una tinción inmunocitoquímica pequeña o nula con los anticuerpos monoclonales Th que se usaron para capturar el antígeno, los niveles de proteína de la cadena detectados por M-IRMA fueron mucho menores que los medidos en células PNET1 (Figura 2). De forma similar, las células Huh7, que no manifestaban ninguna tinción inmunocitoquímica con ninguno de los anticuerpos monoclonales de la proteína de la cadena, tuvieron niveles prácticamente indetectables de proteína de la cadena en los lisados celulares según M-IRMA. Las concentraciones de proteína de la cadena de los lisados celulares se calcularon a partir de una curva patrón generada con PTP purificada usando Th7 y Th10 como anticuerpos de captura. Los resultados se expresaron como media \pm S.D. Los pg/mg de proteína total fueron los siguientes: PNET1-13,1 \pm 0,39; PNET2-2,06 \pm 0,10; A172-3,38 \pm 0,37; C6-2,52 \pm 0,22; y Huh7-0,34 \pm 0,05.

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Ejemplo 3

Caracterización de Proteínas de la Cadena Neural en Líneas de Células Tumorales

En un análisis de transferencia de Western se fraccionaron muestras que contenían 100 \mug de proteína por SDS-PAGE, junto con patrones de peso molecular marcados previamente. Las proteínas se transfirieron a membranas de nylon (membrana de transferencia Immobilon-P, Millipore) usando un aparato de transferencia semiseco (Integrated Systems). Las membranas se lavaron en solución salina tamponada con Tris (TBS; Tris 10 mM, cloruro sódico al 0,85%, pH 7,5) y después se bloquearon con TBS que contenía BSA al 3%. Las manchas de transferencia se incubaron durante una noche a 4ºC con anticuerpo monoclonal Th9 marcado con ^{125}I. Se retiró la sonda unida de forma no específica lavando las membranas a temperatura ambiente en TBS-BSA 3 veces durante 15 minutos y una vez durante 30 minutos. Los resultados se analizaron por autorradiografía usando una película Kodak XAR.

Para preparar muestras para los estudios de inmunoprecipitación, se usaron muestras de 1 mililitro de lisado celular que contenía aproximadamente 1 mg/ml de proteína para los estudios de inmunoprecipitación. Los lisados inicialmente se preaclararon con anticuerpo no relevante (5C3 o antidesmina) y después con proteína A Sepharose. Se inmunoprecipitaron proteínas de la cadena usando 5-10 \mug de Th9 y Proteína A Sepharose (Sasaki et al., J. Biol. Chem. 268:1-4 (1993)). Los complejos inmunes recogidos por centrifugación se resuspendieron en tampón que contenía SDS al 2% y \beta-mercaptoetanol 10 mM y después se sometieron a SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes y reductoras (Id.). Simultáneamente se analizaron los lisados celulares brutos (100 \mug de proteína). Las proteínas se transfirieron a membranas Immobilon-P y se sondaron con Th9 marcado con ^{125}I (Id.) para detectar proteínas de la cadena y moléculas relacionadas. De forma simultánea se realizaron experimentos de control negativo usando anticuerpos monoclonales contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (5C3) o contra desmina.

Se realizaron experimentos de marcaje metabólico usando monocapas de células cultivadas en placas Petri de 100 mm^{2}. Antes del marcaje, las células se expusieron a medio sin metionina y sin cisteína durante 2 horas. El medio después se remplazó por 3 ml de DMEM que contenía 300 \muCi de [^{35}S] metionina o [^{35}S] cisteína. Después del marcaje durante 3 horas, las células se incubaron durante varios intervalos con medio completo carente de aminoácidos radiomarcados y suplementado con metionina 10 mM. Los lisados celulares se prepararon como se ha descrito anteriormente. Se inmunoprecipitaron proteínas de la cadena usando el anticuerpo monoclonal Th9 y proteína A Sepharose, y los productos de inmunoprecipitación se analizaron por SDS-PAGE y autorradiografía en película.

Para los estudios de fosforilación in vivo, se lavaron células cultivadas como se ha descrito para los estudios de marcaje metabólicos dos veces con TBS y se incubaron durante 2 horas con MEM de Dulbecco sin fosfato que contenía suero bovino fetal dializado al 10%. Después, las células se lavaron con TBS y se incubaron durante 3 horas con el mismo medio que contenía 400 \muCi/ml de ácido [^{32}P] ortofosfórico. Los lisados celulares se analizaron por inmunoprecipitación con proteína de la cadena y anticuerpos monoclonales de control tanto positivos (p36) como negativos (desmina), seguido de SDS-PAGE.

Para estudiar el estado de glicosilación de proteínas de la cadena neural, se sometieron lisados de cultivos celulares que contenían aproximadamente 100 \mug de proteína a SDS-PAGE y las proteínas fraccionadas se transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore). Se detectaron O- y N-glicanos por oxidación con peryodato seguido de biotinilación y después por análisis de transferencia de Western con una sonda de fosfatasa alcalina-estreptavidina y NBT/BCIP como sustrato colorimétrico. Los ensayos se realizaron usando el kit GlycoTrack (Oxford Glycosystems, Rosedale, NY) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante.

Se detectaron proteínas inmunorreactivas con Th9 en lisados de PNET1, PNET2, SH-Sy5y, C6 y células A172 por cuatro métodos diferentes: análisis de transferencia de Western, inmunoprecipitación seguido de análisis de transferencia de Western, marcaje metabólico seguido de inmunoprecipitación y SDS-PAGE combinada con M-IRMA. El análisis de transferencia de Western de lisados celulares brutos usando Th9 marcado con ^{125}I demostró bandas de \sim21 kDa en las líneas celulares anteriores (como se indica por la flecha en la Figura 3), pero la intensidad de la señal fue baja. Por el contrario, en lisados de tejido pancreático humano, las formas no escindida de 17 kDa y escindida de 14 kDa esperadas de la proteína de la cadena pancreática se detectaron fácilmente por análisis de transferencia de Western (Figura 3). No se detectaron proteínas de la cadena en lisados de líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano. Esta abundancia sorprendentemente mayor de proteínas de la cadena en tejido pancreático en comparación con líneas celulares gliales y neuronales es coherente con el descubrimiento previo de niveles 10 veces mayores de proteínas de la cadena en el páncreas y en el jugo pancreático en comparación con el tejido cerebral y el líquido cefalorraquídeo (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci. 113:152-164 (1992), de la Monte et al., Ann. Neurol 32:733-742 (1992). Aunque sería de esperar que las proteínas de la cadena sintetizadas por células PNET y células gliales se secretaran como ocurre en el caso de PTP y NTP, no se detectaron proteínas de la cadena en el medio de cultivo de tejidos por análisis de transferencia de Western, incluso después de la concentración del medio cuatro o cinco veces por
liofilización.

Se detectaron más fácilmente proteínas de la cadena inmunorreactivas con Th9 en PNET y líneas de células gliales primero por inmunoprecipitación de los lisados con Th7 + Th10 o Th9, y después realizando un análisis de transferencia de Western usando Th9 marcado con ^{125}I (directo) (Figura 3) o Th9 no marcado con Proteína A marcada con ^{125}I (indirecto). Los dos métodos demostraron la presencia de especies relacionadas con la proteína de la cadena de 21 kDa similares a las detectadas por análisis de transferencia de Western. Además, también se observaron bandas de \sim17 kDa en células PNET y células gliales, pero la señal fue incoherente y de bajo nivel, como se determinó por análisis de transferencia de Western. Como controles negativos se estudiaron simultáneamente las líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano Huh7, HepG2 y FOCUS (Lun et al., In Vitro (Rockville) 20:492-504 (1984)) en condiciones idénticas, y no se detectaron proteínas inmunorreactivas con Th9 en los lisados celulares.

Los tamaños moleculares de las proteínas de la cadena presentes en células PNET y gliales se demostraron de manera más prominente por marcaje metabólico con ^{35}S-metionina o ^{35}S-cisteína, seguido de inmunoprecipitación usando anticuerpo monoclonal Th9. Como controles negativos para la inmunoprecipitación se usaron anticuerpos monoclonales contra desmina o contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (5C3). Tanto en las líneas celulares PNET como en las gliales, se detectaron proteínas inmunorreactivas con Th9 de \sim26 y \sim21 kDa por análisis de SDS-PAGE de los productos inmunoprecipitados (Figura 4B). En células PNET1, la banda de 21 kDa parecía como un doblete (Figura 4A); las especies de peso molecular ligeramente mayor acompañantes parecían ser menos abundantes que la banda dominante a \sim21 kDa. Además, en las líneas celulares PNET y gliales, también había proteínas inmunorreactivas con Th9 de \sim17 kDa asociadas con bandas de casi la misma intensidad que las bandas de \sim21 kDa. En las células C6 también había proteínas inmunorreactivas con Th9 de \sim26 kDa, \sim14-15 kDa y \sim8 kDa que no se detectaron en células PNET (Figuras 4A y 4B, flechas).

También se demostró la presencia de las proteínas de la cadena de 21 kDa y 17 kDa en las células SH-Sy5y, PNET1, A172 y C6, y su ausencia en las células de carcinoma hepatocelular por SDS-PAGE/M-IRMA (Figuras 5A-5E). Se eluyeron proteínas celulares fraccionadas por SDS-PAGE de los geles cortados a intervalos de 2 mm, y se ensayaron directamente con respecto a la inmunorreactividad de la proteína de la cadena por M-IRMA usando Th7 + Th10 como anticuerpos de captura y Th9 marcado con ^{125}I como indicador. A pesar de los bajos niveles, fueron evidentes dos picos característicos en todas las líneas celulares neuroectodérmicas, pero no en las células de carcinoma hepatocelular Huh7 ensayadas simultáneamente y de la misma manera. La resolución de estos geles no permitió la distinción de las proteínas de \sim17 kDa de las proteínas de \sim14-15 kDa que podrían haber estado presentes.

Se marcaron metabólicamente células PNET1 y C6 con ^{32}P o ^{35}S-metionina, y se inmunoprecipitaron proteínas de la cadena a partir de los lisados usando anticuerpo monoclonal Th9 (Figura 6). Como control negativo se realizaron estudios de inmunoprecipitación usando una parte igual del lisado celular y anticuerpos monoclonales contra la proteína desmina (Figura 6, panel derecho). En las células marcadas con ^{35}S-metionina, se detectaron bandas inmunorreactivas con Th9 a \sim26 kDa y \sim21 kDa (flechas superiores), \sim17 kDa (flechas inferiores) y también a \sim14-15 kDa (Figura 6). Después del marcaje con ^{32}P, sólo se observó la banda de 21 kDa por inmunoprecipitación con anticuerpo monoclonal Th9, las otras especies de peso molecular no parecían estar fosforiladas (Figura 6). Se detectaron proteínas inmunorreactivas con Th9 fosforiladas en células C6, pero no en células PNET1, pero esto podría deberse al marcaje menos eficaz ya que las células PNET1 crecen más lentamente que las células C6. No se detectaron bandas en el intervalo de 14 kDa a 26 kDa usando anticuerpos monoclonales contra desmina para inmunoprecipitación (Figura 6). No se detectaron restos de carbohidrato en proteínas inmunoprecipitadas con Th9 (datos no mostrados).

Las mayores concentraciones de proteína de la cadena se midieron en cultivos subconfluentes de células PNET1, es decir durante la fase logarítmica de crecimiento, y las menores concentraciones en cultivos privados de suero durante una noche (crecimiento detenido) (Figura 7). Los cultivos que tuvieron una confluencia de 100% también tuvieron menores niveles de expresión de proteína de la cadena en comparación con los cultivos en proliferación. Simultáneamente se estudiaron células de carcinoma hepatocelular Huh7 (control negativo) usando condiciones de cultivo idénticas, pero los niveles de proteína de la cadena permanecieron bajos durante todo el tiempo.

Sorprendentemente, no hubo ningún cambio en el grado de tinción inmunocitoquímica de proteína de la cadena de células PNET cultivadas en estas diversas condiciones. Sin embargo, es posible que el grado en el que los niveles de proteínas de la cadena cambiaron por medición con M-IRMA no se detecte por inmunocitoquímica. No obstante, la reducción en el contenido de proteína de la cadena celular inducida por privación de suero se asoció con un cambio en el fenotipo de las células. Cuando las células alcanzaron una confluencia de 100% o después de haberse sometido a privación de suero durante una noche, los cuerpos celulares redujeron su tamaño y presentaron cambios sorprendentes en el grado y distribución de inmunorreactividad para la proteína de neurofilamento, GAP-43, y GFAP (Figura 8). En cultivos de PNET que tenían una confluencia de 50%, las células se presentaron una distribución punteada y a menudo polar del neurofilamento e inmunorreactividad con GAP-43, mientras que los cultivos con una confluencia de 100% y los cultivos de PNET privados de suero presentaron inmunorreactividad pericarial difusa tanto para el neurofilamento como para GAP-43. La inmunorreactividad punteada podría corresponder a la distribución del neurofilamento y GAP-43 en las neuritas. Por el contrario, los cultivos de PNET con una confluencia de 50% carecían de inmunorreactividad con GFAP, mientras que los cultivos con una confluencia de 100% y privados de suero contenían proporciones visibles de células positivas para GFAP. Además, la proporción de células inmunorreactivas con GFAP fue máxima en cultivos privados de suero con una confluencia de 100%, seguida de cultivos privados de suero con una confluencia de 50% y después de cultivos con una confluencia de 100% con medio que contenía suero bovino fetal al 10%. Por lo tanto, la reducción en los niveles de proteína de la cadena medidos en células PNET sometidas a una privación de suero durante una noche puede haberse debido a la diferenciación de las células hacia un fenotipo astrocítico. Las células C6 y otras líneas celulares de glioblastoma presentaron una inmunorreactividad intensa con el anticuerpo monoclonal Th9, pero los niveles de proteína de la cadena medidos por M-IRMA a menudo fueron bajos, posiblemente debido al bajo nivel de inmunorreactividad con otros anticuerpos de proteína de la cadena, incluyendo Th7 y Th10 (véanse las Figuras
1A-1J).

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Ejemplo 4

Clonación de Proteínas de la Cadena a partir de Bibliotecas de ADNc Humanas

Se seleccionaron bibliotecas de ADNc de cerebro humano preparadas a partir de cerebro fetal de 17-18 semanas de edad (Stratagene, Inc., La Jolla, CA), neocórtex de lóbulo temporal de 2 años de edad (Stratagene) y corteza cerebral con enfermedad de Alzheimer en fase terminal (In Vitrogen San Diego, CA) usando sondas generadas a partir de un fragmento de ADN de 416 pb correspondiente a los nucleótidos 235-650 del ADNc de PTP de rata. El ADNc de PTP de rata, denominado O18, se aisló a partir de una biblioteca de ADNc pancreático de rata usando sondas de ADN 60méricas sintéticas correspondientes a los nucleótidos 45-104 y 345-404 de la secuencia publicada (Terazono et al., J. Biol. Chem. 263:2111-2114 (1998); Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:7432-7439 (1990)). Se seleccionaron aproximadamente 2 x 10^{6} placas o colonias de cada biblioteca con hibridación de baja rigurosidad usando técnicas convencionales (véase Sambrook et al., supra). Los supuestos clones se purificaron en placa/colonias y los insertos de ADN se secuenciaron por el método de terminación de cadena didesoxinucleótido usando polimerasa de T7 (USB Sequense, United States Biochemical Corp., Cleveland, OH). Las secuencias se compararon con la base de datos Genebank y se alinearon con las secuencias de ácido nucleico de otros ADNc de proteínas de la
cadena.

1. ADNc de Proteína de Cadena Neural de SNC Aislado a Partir de una Biblioteca de Cerebro Fetal Humano

Se aisló un ADNc parcial de proteína de la cadena del SNC 1-9a de 1,3 kilobases (kb) en la que sólo un pequeño segmento corresponde a una fase de lectura abierta, y el resto a una región 3' no traducida (Figura 9A). La secuencia de 150 nucleótidos adicionales se obtuvo a partir de los productos de amplificación de PCR de anclaje 5'. Una segunda vuelta de amplificación por PCR de anclaje 5' produjo un producto adicional de 600 pb cadena arriba (Figura 9b). Una parte de la secuencia de ADNc de 1-9a comparte una homología significativa con el extremo 5' del ADNc de PTP humana y el gen Reg (Figura 10A). Además, el producto de PCR de anclaje 5' inicial tiene una homología de 60% con el extremo 5' del gen Reg, y una homología de 63% con el Exón 2 del gen Reg humano (Figura 10B). Además, las sondas generadas a partir del fragmento terminal 5' de 590 pb del ADNc de 1-9a hibridó con ARNm de cerebro y páncreas humanos (Figuras 12A-12C). La secuencia de 1-9a también es homóloga a los ADNc de AD2-2 y AD3-4, ya que los solapamientos son sustanciales en un extremo de sus secuencias completadas (Figura 10B).

2. ADNc de Proteína de la Cadena Neural del SNC Aislado a Partir de una Biblioteca de Corteza Temporal de Dos Años de Edad

El clon HB4 es un ADNc parcial de 593 pares de bases que se aisló a partir de una biblioteca de corteza temporal de dos años de edad. Este ADNc contiene una fase de lectura abierta en su extremo 5' y termina en el nucleótido 275. Hay una señal de poliadenilación que empieza en el nucleótido 475 y la secuencia termina con una cola de poli A (Figura 11D). La secuencia de aminoácidos deducida del clon HB4 parcial predice una proteína con un peso molecular de 10,4 kDa y un pI de 12,1. El ADNc de HB4 presenta una homología de ácido nucleico global de 50% con el ADNc de PTP humana (Figura 11E), un segmento del gen Reg humano (Figura 11E).

3. Aislamiento de ADNc de Proteína de la Cadena Neural a Partir de una Biblioteca de Enfermedad de Alzheimer

Usando la sonda de ADNc de PTP de rata O18, se aislaron cuatro ADNc relacionados a partir de una biblioteca de cerebro con AD. Estos clones se denominaron: AD 2-2, AD 3-4, AD 4-4 y AD 16c (también denominado AD 10-7) (Figuras 16D-16S).

El ADNc de AD 2-2 tiene aproximadamente 1,2 kb y comparte una homología significativa con el ADNc de 1-9a, AD 16c, ADNc de PTP de rata y el Exón 1 del gen Reg humano (Figura 17). La sonda de AD 2-2 genera un patrón de transferencia de Southern genómico similar al obtenido con la sonda AD 3-4. La Figura 16E representa la secuencia de nucleótidos completa del clon de ADNc de AD 2-2 que aisló a partir de una biblioteca de cerebro con AD. Las sondas generadas con cebador aleatorio basadas en esta secuencia hibridaron con muestras de cerebro humano y neuronales, pero no con líneas de células gliales con ARN pancreático.

Las Figuras 16F, 16I, 16J y 16K representan secuencias de nucleótidos parciales de los clones de ADNc de AD 3-4, que se aislaron a partir de una biblioteca de cerebro con AD. Las sondas de AD 3-4 generadas con cebadores aleatorios produjeron dos transcritos de ARNm de 1,6 kB y 3,4 kB. Estas especies de ARNm se sobreexpresan en cerebros con AD, con una elevación media al doble en comparación con controles de edad similar (N = 8).

El clon de 1,6 kb de ADNc de AD 3-4 es idéntico a otro clon aislado al mismo tiempo (AD 5-3) (Figura 18A). El ADNc de AD 3-4/AD 5-3 presenta una homología sustancial con productos de PCR de anclaje 5' 1-9a (Figura 18B), así como con el gen Reg humano y el clon genómico Gen2a-EP (Figura 18B). El análisis de transferencia de Southern del ADN genómico humano con la sonda AD 3-4 reveló un patrón similar al obtenido con la sonda de AD 2-2.

Las Figuras 16L y 16M representan la secuencia de nucleótidos parcial de AD 4-4 que es un clon de ADNc parcial de 0,8 kb que es idéntico a otro ADNc aislado al mismo tiempo (AD 3-5). Este clon de AD 4-4 comparte una homología de secuencia sustancial con los ADNc de AD 2-2 y 1-9a (Figura 19). La Figura 16N representa la secuencia de nucleótidos completa de un clon de ADNc parcial aislado a partir de una biblioteca de cerebro con AD. Este ADNc hibridaba con ARNm de líneas celulares de cerebro y neuronales, produciendo un solo transcrito de 1,4 kB.

La Figura 16O representa la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc parcial de 0,5 kb AD 16c (también denominado AD 10-7) que tiene una homología de 72% con AD 2-2 y también se alinea con las secuencias de PTP humana y del gen Reg humano (Figuras 20A y 20B).

La Figura 16R representa la secuencia de nucleótidos completa del clon AD10-7 que se aisló a partir de una biblioteca de cerebro con AD. La hibridación de transferencias de Northern usando sondas de ARNc antisentido o sondas de ADNc generadas con cebadores aleatorios detectó transcritos de ARNm 2,6, 1,9, 1,4 y 0,9 kB en células neuronales. Las líneas de células neuronales expresaban sólo los dos transcritos más grandes, mientras que los cerebros humanos adultos maduros expresaban predominantemente los dos transcritos más pequeños y niveles muy bajos o no detectables de los transcritos de 2,6 kB y 1,9 kB. Usando una sonda de AD10-7, el análisis de transferencia de Northern del ARN obtenido a partir de hígado, ovario, trompa de Falopio, colon, estómago, bazo, recto, tiroides, placenta de 12 semanas y riñón humanos fueron negativos.

En la Figura 16S se representa la secuencia de nucleótidos completa del clon de ADNc de AD 16c que se aisló a partir de una biblioteca de cerebro con AD. La hibridación de transferencias de Northern usando sondas de ADN generadas con cebadores aleatorios produjo los mismos resultados que se obtuvieron con el clon de ADNc de AD10-7. El clon AD 16c comparte un segmento de 650 pb casi idéntico con AD 10-7. Además, se detectaron niveles elevados de ARNm de AD 16c en cerebros con AD en comparación con los cerebros de control de edad por análisis de transferencia de Northern.

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Ejemplo 5

Análisis de Expresión del Gen de la Proteína de la Cadena de Cerebro

Se examinó la expresión de ARNm de proteína de la cadena en las siguientes líneas celulares derivadas de tumores neuroectodérmicos: células de tumor neuroectodérmico primitivo del sistema nervioso central denominadas PNET1 y PNET2; células de glioblastoma humano HGL-16 y HGL-17; células de glioma humano A172; células de glioma de rata C6; y células de neuroblastoma SH-Sy5y. Además, se ensayaron tejidos cerebrales humanos de pacientes con enfermedad de Alzheimer o sin enfermedad neurológica (controles de edad) y cerebro de rata embrionario y desarrollado después del nacimiento con respecto a la expresión de ARNm de proteína de la cadena. El ARN extraído a partir de páncreas humano y de rata sirvió como control positivo.

Se extrajo ARN en isotiocianato de guanidinio 5 M y después se aisló por centrifugación a través de un gradiente por etapas de cloruro de cesio (véase Sambrook et. al., supra). El ARN se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nm. Los tamaños de los transcritos de ARNm de la proteína de la cadena se evaluaron por análisis de transferencia de Northern y los niveles de expresión se evaluaron por hibridación dot blot del ARN. El análisis de transferencia de Northern se realizó sometiendo a electroforesis muestras que contenían 15 \mug de ARN celular total a través de geles de agarosa-formaldehído al 1%. El ARN se transfirió a una membrana de nylon, se sometió a reticulación con luz ultravioleta e hibridó con sondas generadas a partir de un fragmento de 600 pb del clon de ADNc de 1-9A. El fragmento usado para los estudios de hibridación contenía las regiones más homólogas con el ADNc de PTP humana. Las sondas se marcaron con [^{32}P] \alpha-dCTP por el método de cebador aleatorio (Amersham Corporation; Arlington Heights, IL). Las manchas de transferencia se hibridaron durante una noche a 42ºC con 2 x 10^{6} dpm/ml de sonda en tampón que contenía formamida al 50%, SSPE 5x, solución de Denhardt 10x (solución de Denhardt 100x es Ficoll al 2%, albúmina de suero bovino al 2% y polivinilpirrolidina al 2%), SDS al 0,5% (dodecil sulfato sódico) y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado. Las membranas se lavaron en SSPE que contenía SDS al 0,25% usando métodos convencionales. Se generaron autorradiogramas por exposición de las membranas a una película Kodak XAR a -80ºC. Las membranas posteriormente se separaron de la sonda y después se volvieron a hibridar con un 30mero sintético correspondiente a un ARN 18s para evaluar la carga de muestra.

El análisis de Northern del ARN celular total usando sondas preparadas a partir del ADNc de 1-9a reveló dos transcritos dominantes en líneas de células tumorales del sistema nervioso central (SNC): un transcrito tenía 1,6 kb y el otro tenía 0,9 kb (Figura 12A). Además, en las líneas celulares de neuroblastoma SH-Sy5y y PNET1, también se detectó un transcrito de ARNm mayor de 4,2 kb. El transcrito de 4,2 kb puede representar el ARNm preprocesado. Se detectaron transcritos del mismo tamaño en rata adulta (Cerebro R) y recién nacida (RN), pero el transcrito de 0,9 kb fue más abundante en el cerebro adulto mientras que el transcrito de 1,6 kb era más abundante en el cerebro de rata recién nacida. En páncreas de rata (Páncreas R), sólo se detectó un transcrito de 0,9 kB, correspondiente al tamaño del ARNm de PTP de rata (Terazono et al., J. Biol. Chem. 263:2111-2114 (1988); Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265:7432-7439 (1990)). No se detectaron transcritos de ARNm en hígado normal (Hígado N). Usando una sonda generada a partir de la región 3' del ADNc de 1-9a, se reveló el transcrito de 1,6 kb, pero no el de 0,9 kb (Figura 12B). Usando una sonda 30-mérica correspondiente al extremo más 5' del ADNc de 1-9a, se detectaron los transcritos de ARNm de mayor peso molecular (Figura 12C). También fue evidente el transcrito de 0,9 kb con una mayor exposición de la mancha de transferencia.

El análisis de Northern del ARN de cerebro humano reveló un transcrito dominante de 1,6 kb, pero también dos y algunas veces tres transcritos más pequeños de 1,2 kb, 0,9 kb y 0,8 kb (Figura 13B). A diferencia de los descubrimientos en las líneas celulares, el transcrito de ARNm de 4,2 kb casi nunca se observaba en cerebro humano adulto. La hibridación con páncreas humano reveló un transcrito de 0,8 kb, correspondiente al tamaño del ARNm de PTP. Los transcritos detectados en cerebro humano y en páncreas usando sondas de 1-9a fueron idénticos en tamaño a los transcritos observados usando sondas de ADNc de PTP.

La hibridación puntiforme (dot blot) del ARN con 5 \mug de ARN total usando el fragmento de 600 pb del ADNc de 1-9a (NTP) demostró mayores niveles de expresión en AD en comparación con cerebros de control de edad (Figura 13A). La rehibridación de la misma membrana con un ADNc correspondiente a la \beta-actina demostró una carga similar de ARN en cada punto. La observación de niveles elevados de ARNm relacionado con 1-9a en tejido de cerebro con AD es similar a la notificada previamente usando sondas 60méricas correspondientes al ADNc de PTP humana (de la Monte et al., J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990)). Las diferencias entre los cerebros con AD y de control parecían deberse a diferencias en los niveles de los transcritos de 1,6 kb, 0,9 kb y 0,8 kb, como se muestra en las Figuras 13A y 13B.

El ADNc de AD-NTP 3-4, aislado a partir de la biblioteca de AD, hibrida con el ARN de líneas celulares de tumor neuroectodérmico de origen neuronal y tejido cerebral humano. En las líneas celulares se detectaron transcritos de 1,6 kb y 0,9 kb como los observados con la sonda de 1-9a (Figura 21C). Sin embargo, en cerebro humano se detectaron transcritos de \sim4 kb, 1,6 kb y 0,9 kb y los niveles de expresión para los tres transcritos eran mayores en caso de AD en comparación con cerebros de control de edad (Figura 21D).

La sonda de ADNc de AD 4-4 hibridó sólo con un transcrito de 0,9 kb y sólo en líneas de células neuronales.

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Ejemplo 6

Clonación Directa y Secuenciación de ADNc de Proteína de la Cadena Procedentes de Líneas de Células de Tumores Neuroectodérmicos y Cerebro con Enfermedad de Alzheimer

Se clonaron directamente ADNc de proteínas de la cadena a partir de células PNET1, PNTE2, SH-Sy5y y A172, y a partir de ARN de cerebro de control de edad y con enfermedad de Alzheimer usando los métodos 3' y 5' RACE (Forman et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 8998 (1988); Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5673 (1989); Loh et al., Science 243: 217 (1989)). En resumen, se transcribió de forma inversa ARN usando cebadores oligo-dT. Para la reacción 5'-RACE, los ADNc se amplificaron por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando un 17-mero específico correspondiente a una región 5' de la secuencia de 1-9a, y un cebador 17 dT. Los productos de PCR resultantes se sometieron a otra vuelta de amplificación usando otro cebador de extremo 5' interno pero solapante, y un 17-mero 3' específico correspondiente a una región 3' de la secuencia de 1-9a. Para las reacciones 3'-RACE, primero se añadió una cola a los ADNc con dCTP usando desoxinucleótido transferasa terminal, y después se amplificaron usando un 17-mero específico correspondiente a los nucleótidos 781-797 del clon 1-9a y dG (17-mero). Se realizó una segunda amplificación por PCR anidada usando un 17-mero específico correspondiente a los nucleótidos 766-792 en el extremo 3' y dGTP (17-mero) para el extremo 5'. Los productos de PCR se sometieron al análisis de transferencia de Southern usando sondas generadas a partir de un fragmento de ADN interno del clon de ADNc de 1-9a, y del clon de ADNc de PTP de rata O18. Los productos de PCR se purificaron en gel y se unieron a vectores pAmpI usando uracilo desoxitransferasa. Los insertos de ADN subclonados se secuenciaron por el método de terminación de cadena con didesoxinucleótido usando la ADN polimerasa de T7.

Se detectaron transcritos de la proteína de la cadena del SNC en líneas celulares de tumor neuroectodérmico y en tejido cerebral humano con AD por transcripción inversa seguido de PCR usando cebadores específicos correspondientes a las regiones 5' y 3' de la secuencia de ADNc de 1-9a. El análisis de transferencia de Southern de los productos de PCR demostró dos especies de hibridación cruzada dominantes, de 0,8 kb y 1,0 kb (Figuras 14A y 14B). Además, en las células SH-Sy5y también se detectó un producto de PCR de 1,8 kb mayor. En las células PNET1, PNET2, Sh-Sy5y y A172, se observó un producto de PCR de 0,4 kb que hibridaba con la sonda de 1-9a. De forma correspondiente con los mayores niveles de ARNm de proteína de la cadena en cerebros con enfermedad de Alzheimer, la señal de hibridación fue más intensa en las muestras con AD que en las muestras de control de edad.

Los productos de PCR generados a partir de las células SH-Sy5y se subclonaron y secuenciaron. El análisis de Southern de los fragmentos clonados presentó una hibridación intensa con el ADNc de 1-9a y una hibridación menos intensa pero definida con el ADNc de O18 (PTP de rata) (Figura 14C). La secuencia de ácido nucleico del clon de PCR de SH-Sy5y (Sy-NTP) fue idéntica a la secuencia de ADNc de 1-9a.

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Ejemplo 7

Aislamiento de Clones Genómicos que Codifican Proteínas de la Cadena de Cerebro Humano

Se seleccionó una biblioteca de ADN genómico humano usando sondas preparadas con un fragmento de 600 pb del ADNc de la proteína de cadena de cerebro humano 1-9a que se aisló a partir de una biblioteca de corteza temporal de dos años de edad. El fragmento de ADNc de 1-9a contenía una región con una homología de secuencia de ácidos nucleicos de 60% con la PTP humana. Después de la purificación de colonias, se comprobó la hibridación cruzada de los supuestos clones genómicos con el fragmento de ADNc de PTP de rata O18. Se subclonaron fragmentos de restricción EcoRI, PstI y EcoRI/PstI que hibridaban tanto con la sondas de 1-9a como con la de O18 en vectores pBluescript II (Promega Inc., Madison, WI) y después se secuenciaron por el método de terminación de cadena con didesoxinucleótido usando la polimerasa de T7 (USB. Sequenase) o la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa y polimerasa Vent.

Se aislaron cuatro fragmentos genómicos denominados G2-2 PstI, G2-2 PstI-EcoRI, G5d-1 PstI y G5d-1 PstI-EcoRI a partir de una biblioteca de ADN genómico humano (Figuras 22A-22D). Todos estos fragmentos genómicos hibridaban con la sonda de ADNc de 1-9a y O18 y variaban en tamaño entre 1,5 kb y 3 kb. La información de secuencias parciales de ácidos nucleicos demostró una homología entre G2-2 PstI y los ADNc del gen Reg humano y de la PTP humano y de rata (Figura 23A); entre G2-2 PstI-EcoRI y los ADNc del gen Reg y de la PTP de rata (Figura 23B) y también con los ADNc de AD 2-2, AD 3-4 y 1-9a (datos no mostrados); entre G5d-1 PstI y el gen Reg y la PTP humana (Figura 23C); y entre G5d-1 PstI-EcoRI y el gen Reg, PTP humana, 1-9a y AD 4-4.

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Ejemplo 8

Expresión in vitro de la Proteína de Fusión LacZ y Demostración de su Relación con Proteínas de la Cadena

Se indujo la expresión de una proteína de fusión en bacterias que contenían el clon de ADNc 1-9a, o uno de los cuatro clones genómicos, con isopropiltio-\beta-D-galactósido (IPTG) usando técnicas convencionales (Sambrook et al., supra). Se sometieron lisados bacterianos brutos procedentes de cultivos inducidos y no inducidos a SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western usando el anticuerpo monoclonal Th9 para la proteína de la cadena (Sasaki et al., J. Biol. Chem. 268: 1-4 (1993)) y proteína A marcada con ^{125}I para detectar el anticuerpo unido. Además, se indujeron céspedes bacterianos que contenían ADN clonado para expresar la proteína de fusión con IPTG y se sondaron filtros de réplica directamente con el anticuerpo monoclonal Th9 seguido de proteína A marcada con ^{125}I.

La inmunorreactividad de la proteína de la cadena se demostró en las proteínas de fusión bacterianas por medio de la unión directa del anticuerpo a las colonias inducidas por IPTG (Figuras 24A-24D). La inmunorreactividad de la proteína de la cadena se detectó usando un cóctel de anticuerpos monoclonales Th9, Th7 y Th10 contra PTP (Sasaki et al., J. Biol. Chem. 268: 1-4 (1993)) y proteína A marcada con ^{125}I.

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Ejemplo 9

Niveles Relativos de ARNm de AD16c en Cerebros con AD y de Cerebros de Control de Edad

Se realizó un análisis de transferencia de Northern usando una sonda de ADNc de AD16. Las manchas de transferencia se volvieron a sondar para detectar ADN ribosómico 18s para evaluar la carga de ARN en cada calle. Los autorradiogramas insaturados se sometieron a un análisis densitométrico usando un Molecular Dynamics Image-Analyzer. Se trazaron las relaciones de las señales de hibridación de ARN 18s y AD16c para cada caso y los resultados se proporcionan gráficamente en las Figuras 25A y 25B. Las relaciones medias (niveles relativos de AD16c) con los errores típicos se representan en el gráfico más pequeño del lado derecho. Los descubrimientos confirman que hay niveles elevados de expresión de ARNm de AD16c en seis de nueve cerebros con AD en comparación con uno de seis controles de edad similar. La diferencia entre los niveles medios tiene un alto significado estadístico (P<0,005). Se obtuvieron resultados similares usando sondas AD10-7. Estos resultados demuestran que hay un aumento estadísticamente significativo en los niveles de expresión en cerebros AD en comparación con cerebros de control.

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Ejemplo 10

Preparación de Proteína de Fusión de AD10-7 Recombinante y su Detección con Anticuerpos Monoclonales

Se ligaron ADNc de AD10-7 a vectores pTrcHIS (Invitrogen, San Diego) en tres fases de lectura diferentes (dos incorrectas A y B y una correcta C). Las bacterias transformadas con uno de los tres plásmidos se indujeron con IPTG y los lisados bacterianos se examinaron con respecto a la expresión de proteínas 0, 1 y 5 horas después. Las proteínas se fraccionaron por SDS-PAGE y se realizó un análisis de transferencia de Western usando anticuerpos monoclonales contra la proteína marcadora expresada (anticuerpos monoclonales de ratón T7-tag; Novogen). Las manchas de transferencia se revelaron usando el método de peroxidasa de rábano picante con avidina-biotina, y con diaminobencidina como cromógeno (Figura 26). Se detectó una banda correspondiente a \sim45 kDa en bacterias que se habían transformado con ADN plasmídico que contenía AD10-7 ligado únicamente en la fase de lectura correcta (C) (flecha). Se observó la proteína del mismo tamaño por traducción in vitro del ADNc de AD10-7 en un sistema de ensayo de lisado de reticulocitos de conejo. En los dos sistemas, el péptido compañero de fusión tenía \sim3 kDa, indicando que el ADNc codifica una proteína de aproximadamente \sim42 kDa. Rutinariamente se detecta una especie de NTP de \sim42 kDa por análisis de transferencia de Western de líneas de células neuronales y de tejido cerebral humano.

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Ejemplo 11

Demostración de la Localización Neuronal de la Expresión de ARNm de AD10-7 por Hibridación In Situ

Se generaron sondas de ARNc con sentido y antisentido a partir de ADN plasmídico de AD10-7 linealizado usando ARN polimerasa dependiente de ADN de SP6 o T7 respectivamente. Las sondas antisentido hibridaron con ARNm de la línea de células neuronales como se ha descrito anteriormente para este clon. Por otra parte, las sondas con sentido de ARNc no pudieron hibridar con el ARN por análisis de transferencia de Northern. Las sondas de ARNc marcadas con digoxigenina-UTP se hibridaron con secciones de tejido cerebral humano de pacientes con AD en sus primeras fases. Después de lavar las secciones exhaustivamente (de la Monte et al., J. Clin. Invest. 86: 1004-1013 (1990)), las sondas hibridadas se detectaron usando anticuerpos monoclonales conjugados con fosfatasa alcalina o con peroxidasa contra digoxigenina, y las reacciones colorimétricas se revelaron usando métodos convencionales. El examen de las secciones por microscopía de campo brillante y campo oscuro demostró hibridación de AD10-7 únicamente en neuronas (Fig. 27; agregados densos de granos blancos sobre cuerpos celulares en la Fig. 27A). Por el contrario, de forma similar a los descubrimientos por análisis de transferencia de Northern, las sondas de ARNc de AD10-7 con sentido no pudieron hibridar con tejido cerebral (Fig. 27B).

Aunque lo anterior se refiere a realizaciones particulares preferidas, debe entenderse que la presente invención no se limita de esta manera. A los especialistas habituales en la técnica se les ocurrirán que pueden realizarse diversas modificaciones de las realizaciones descritas y que estas modificaciones se consideran dentro del alcance de la presente invención, que se define por las siguientes reivindicaciones.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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<110> The General Hospital Corporation de la Monte, Suzanne Wands, Jack R.

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<120> Expresión Génica de la Proteína de la Cadena Neural y Detección de la Enfermedad de Alzheimer

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<130> P19088EP-1/PWC

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<140> EP 04076254.4

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<141> 1994-04-20

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<150> US 08/050,559

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<151> 1993-04-20

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<160> 121

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<170> PatentIn, Versión 3.2

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<210> 1

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<210> 2

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Oligonucleótido formador de triple hélice

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<221> característica miscelánea

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<222> (1)..(21)

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<223> Esta región está en la orientación 3' a 5'

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<221> Característica miscelánea

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<222> (22)..(22)

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<223> Puede ser un enlace de nucleótidos entre nucleótidos de 0-10 bases

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<400> 7

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Oligonucleótido formador de triple hélice

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<221> Característica miscelánea

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<222> (22)..(22)

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<223> Puede ser un enlace de nucleótidos entre nucleótidos de 0-10 bases

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<221> Característica miscelánea

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<222> (23)..(43)

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<223> Esta región está en la orientación 3' a 5'

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<400> 8

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Oligonucleótido formador de triple hélice

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<221> Característica miscelánea

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<222> (1)..(21)

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<223> Esta región está en la orientación 3' a 5'

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<221> Característica miscelánea

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<222> (22)..(22)

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<223> Puede ser un enlace de nucleótidos entre nucleótidos de 0-10 bases

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<400> 9

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<210> 10

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Oligonucleótido formador de triple hélice

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<221> Característica miscelánea

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<222> (22)..(22)

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<223> Puede ser un enlace de nucleótidos entre nucleótidos de 0-10 bases

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<221> Característica miscelánea

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<222> (23)..(43)

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<223> Esta región está en la orientación 3' a 5'

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<400> 10

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Oligonucleótido formador de triple hélice

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<221> Característica miscelánea

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<222> (1)..(21)

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<223> Esta región está en la orientación 3' a 5'

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<221> Característica miscelánea

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<222> (22)..(22)

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<223> Puede ser un enlace de nucleótidos entre nucleótidos de 0-10 bases

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<400> 11

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<210> 12

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Oligonucleótido formador de triple hélice

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<221> Característica miscelánea

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<222> (22)..(22)

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<223> Puede ser un enlace de nucleótidos entre nucleótidos de 0-10 bases

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<221> Característica miscelánea

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<222> (23)..(43)

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<223> Esta región está en la orientación 3' a 5'

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<400> 12

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<210> 13

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<211> 1443

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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<210> 14

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<211> 213

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<210> 15

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<221> Característica miscelánea

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<222> (56)..(56)

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<223> n es a, c, g, o t

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<400> 15

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<221> Característica miscelánea

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<222> (242)..(242)

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<223> n es a, c, g, o t

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<400> 16

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<210> 17

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

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25

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<210> 18

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<211> 151

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 18

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26

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<210> 19

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<211> 75

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 19

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27

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<210> 20

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<211> 77

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<210> 23

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 26

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<210> 27

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<211> 112

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 27

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<210> 28

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<211> 120

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 28

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<210> 29

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 30

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 554

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (176) .. (176)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 590

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 466

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 501

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (123) .. (123)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 372

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 377

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (59) .. (59)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1480

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 381

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 420

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 381

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 629

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1381

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2520

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

59

60

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96)..(96)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

92

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 338

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (226)..(226)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (191)..(191)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..(40)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (99)..(99)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

117

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (85)..(86)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (89)..(89)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

129

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

130

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\hskip1cm

131

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\hskip1cm

132

Claims (29)

1. Una proteína de la cadena neural (NTP) que carece sustancialmente de cualquier impureza natural y codificada por la molécula de ADN AD3-4DH1 presente en las células E. coli que están depositadas en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassass, Va., con el nº de acceso 69260.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de la cadena neural (NTP) que comprende la molécula de ADN AD3-4DH1 presente en las células E. coli que están depositadas en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassass, Va., con el nº de acceso 69260.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, que comprende una secuencia genética que codifica una NTP donde dicha NTP es NTP humana.

4. Un plásmido que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.

5. Un hospedador no humano transformado con el plásmido de la reivindicación 4.

6. Un método in vitro para usar el plásmido de la reivindicación 4 para preparar una NTP, comprendiendo dicho método:

(a)

introducir dicho plásmido que comprende dicha secuencia genética que codifica dicha NTP en una célula hospedadora para producir una célula hospedadora recombinante;

(b)

cultivar dicha célula hospedadora recombinante; y

(c)

aislar dicha NTP.

7. El método de la reivindicación 6, donde dicha secuencia genética que codifica dicha NTP se obtiene a partir de tejido cerebral de un paciente con enfermedad de Alzheimer o de una línea celular de tumor neural humano.

8. El método de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, donde dicha célula hospedadora es E. coli.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde dicho gen está contenido en un vector.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, donde dicho gen está bajo el control de un promotor inducible.

11. El método de la reivindicación 10, donde dicho promotor es un promotor P_{1} lambda o un promotor tac.

12. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2.

13. Un virión que comprende el vector de expresión de la reivindicación 12.

14. Una ribozima que comprende una secuencia diana que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico que codifica la NTP de la reivindicación 1, y no homóloga a la secuencia de ácido nucleico de PTP.

15. Una molécula de ADN que codifica la ribozima de la reivindicación 14.

16. Una Secuencia Guía Externa de NTP de ribonucleótidos que comprende:

(a)

una secuencia de 10-15 nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico que codifica la NTP de la reivindicación 1, y que es no homóloga a la secuencia de ácido nucleico de PTP; y

(b)

una secuencia de nucleótidos 3'-NCCA donde N es purina.

17. La Secuencia Guía Externa de NTP de la reivindicación 16 que es ADN.

18. Un método in vitro para detectar la presencia de proteína de la cadena neural (NTP) codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 2, comprendiendo dicho método:

(a)

poner en contacto una muestra biológica de un sujeto humano que se sospecha que contiene una NTP codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 2 con al menos una molécula capaz de unirse a dicha NTP; y

(b)

detectar cualquiera de las moléculas unidas a dicha NTP.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, donde dicha molécula es:

(a)

un anticuerpo que carece sustancialmente de impurezas naturales;

(b)

un anticuerpo monoclonal; o

(c)

un fragmento de (a) o (b).

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 18 o la reivindicación 19, donde la detección de cualquiera de dichas moléculas unidas a dicha NTP se realiza por formación de imágenes in situ.

21. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, donde la detección de cualquiera de dichas moléculas unidas a dicha NTP se realiza por formación de imágenes in vitro.

22. Un método in vitro para diagnosticar la presencia de una afección relacionada con la proteína de la cadena neural (NTP) en un sujeto humano que se sospecha que tiene dicha afección, que comprende:

(a)

incubar una muestra biológica que se sospecha que contiene una NTP codificada por dicha molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, en presencia de al menos una molécula de unión capaz de identificar dicha NTP; y

(b)

detectar dicha molécula de unión que se une en dicha muestra, donde dicha detección indica que dicho sujeto tiene una afección relacionada con NTP;

siendo dicha afección relacionada con NTP la enfermedad de Alzheimer, la presencia de tumores neuroectodérmicos, la presencia de un astrocitoma maligno o la presencia de glioblastomas.

23. Un método de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 22, donde dicha detección es por un ensayo inmunométrico.

24. Un método de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 23, donde dicho ensayo inmunométrico es un ensayo inmunométrico basado en anticuerpos monoclonales.

25. Un método de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 24, donde dicho método comprende:

(a)

incubar dicha muestra biológica con dos anticuerpos monoclonales de NTP diferentes unidos a un soporte en fase sólida; y

(b)

detectar la NTP como se define en la reivindicación 1 unida a dichos anticuerpos monoclonales con una tercera solución diferente de anticuerpo monoclonal de NTP marcado de forma detectable, donde dichos anticuerpos monoclonales de NTP son específicos para la molécula de NTP de la reivindicación 1.

26. Un método de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, donde dicha etapa de incubación incluye además añadir una cantidad conocida de NTP marcada como se define en la reivindicación 1, con lo que se establece un inmunoensayo competitivo.

27. Un método de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 26, donde dicho marcador es capaz de emitir radiación.

28. Un método de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 27, donde dicho marcador es ^{125}I.

29. Un método de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, donde dicha detección es por inmunorreacción en cadena de la polimerasa.