KR100381821B1 - 그룹B연쇄상구균의비-IgAFc결합형태의클로닝 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 베타 항원으로 알려진 GBS 표면 단백질을 코드화하는 유전자를 유전자 조작하는 것에 관계한다. 베타 항원은 IgA 면역글로부린의 Fe 부위에 비-면역적 방식으로 결합하는 것으로 알려져 있다. IgA 결합 기능을 코드화하는 베타 항원 유전자 부분은 동정되었고 유전공학기술을 이용함으로써 제거되었다. 변형된 베타 항원 유전자에 의해 코드화된 신규한 폴리펩타이드는 IgA에는 결합하지 않지만 야생형 베타 항원 단백질에 대해 발생된 단특이성 항-베타 항원 항혈청과는 면역반응한다. 이와같은 베타 항원의 비-IgA 결합 형태는 GBS 감염에 대해 보호하기 위한 사람 백신의 일성분으로 이용될 수 있다.

Description

그룹 B 연쇄상구균의 비-IgA Fc 결합형태의 클로닝
발명의 배경
그룹 B 연쇄상구균 (Group B streptococci:GBS)은 중요한 사람 병원균이다. 이들 세균들은 성인에 있어서, 특히 면역타협된 개체(immunocompromised individual)에 있어서 빌병 유발 병원체로 점점 더 강하게 인식되고 있다. 그러나, 그것은 미국에서 모든 경우의 신생아 패혈증의 40%를 초과하는 경우의 감염성 병원체인 바, 이로 인해 GBS는 1985년에 전미 과학 아카데미에 의해 미국내에서 예방가능한 감염성 이환상태의 SP 번째로 중요한 원인으로 인식되었다. 매년 미국에서는 12 000 케이스들을 초과하는 GBS 패혈증이 발생되는데, 이로 인해 25,000을 넘는 태아들이 사망하고 1,350 케이스들의 영구 신경계 손상이 초래된다. 매년 임신-관련 이환상태가 거의 50,000명의 여성들에게서 일어난다. 최근의 어느 리뷰 논문은 미국에서 GBS 질병에 직접적으로 투입되는 비용이 72억 6천만 달러를 초과하는 것으로 산정하였다. 현재까지는 이용할 수 있는 GBS 백신이 없는데, 그룹 B 연쇄상구균으로 인한 비용의 94%이상은 유효한 모성 백신의 개발에 의해 비용 발생을 막을 수 있는 것으로 평가되어 왔다.
다른 연쇄상구균 종들로부터 GBS를 특징지우는 그룹 B 특이성 탄수화물 항원 이외에, 이들 세균들은 그들의 표면상에 발현된 7 개의 공지의 타입-특이성 탄수화물 항원들중 하나의 존재에 기초하여 항원형이 결정된다. 이들은 Ia, Ib, II, III,Iv, V 및 VI으로 호칭된다. 또한 집합적으로 C 단백질로 알려진 다수의 단백질 항원들도 동정되었다. 이들은 알파, 베타, 감마 및 델타로 명명되었다. 알파 및 베타 항원들을 코드화하는 유전자들은 클로닝되었고(Cleat and Timmis, 1987; Michel et al., 1991) 서열결정되었으며 (Jerlstrom et al., 1991; Heden et al., 1991; Michel et al., 1992), 베타 항원은 다수의 연구원들에 의해 사람 IgA의 Fc 부위와 특이적이지만, 비-면역적인 방식으로 상호작용하는 것으로 입증되었다 (Russell-Joines and Gotschlich, 1984; Russell-Jones et al., 1984, Brady et al., 1989; Anthony et al., 1990; Lindahl et al., 1990; Kvam et al., 1992). 특정한 탄수화물 항원형들의 균주들 가운데 특수한 C 단백질 항원들의 분포는 부분적으로 문헌에 기술되어 있는데 복잡하다.
타입 III 유기체들은 건강한 유아 및 임신한 여성으로부터 분리되어 집락된 유기체들의 25% 미만을 차지하지만, 다수의 연구 그룹들은 모든 경우의 신생아 패혈증의 반 이상이 타입 III 유기체들에 의해 유발된다고 보고하였다. 어떠한 항원형도 양성으로 간주되지는 않지만, 항원형 III GBS에 대한 보호에 많은 관심이 집중되고 있다. 일반적으로 타입 III GBS와 관련된 C 단백질 항원만이 델타 항원 (Brady et al., 1989; Chun ET AL., 1991)이다.
GBS 항원형-특이성 탄수화물 항원에 대한 모성 IgA 항체들의 낮은 수준은 신생아에 있어서 질병 감수성과 관련되는 것으로 입증되었다.
(Baker et al., 1978; Fisher et al., 1983].불행하게도, 다수의 탄수화물 항원들은 사람에 있어서 면역원성에 약하다. 이러한 사실은 타입 II 다당류를 제외하고는 GBS 타입 특이성 탄수화물의 경우에도 사실인 것으로 알려져 있다. GBS의 많은 항원형들에 대해 유효한 백신의 개발은 질병 예방에 있어 가장 중요한 것으로 간주되고 있다. 전체 길이의 GBS 베타 항원은 약 130,000 달톤의 폴리펩타이드이다. 그것은 면역원성이고 동물 모델에 있어 보호 항체의 생성을 유도하는 것으로 보고되었다(Michel et al., 1991; Mandoff et al., 1992). 그러나, β 항원의 백신으로의 이용가능성은 그의 사람 IgA의 Fc 부위와 높은 친화성을 가지고 비면역적 방식으로 상호작용하는 바람직하지 못한 특성 때문에 상당히 낮다. 베타 항원의 끝이 잘린(truncated) 형태들은 항원의 세포표면 발현의 부재시에 특정 GBS 균주에 의해 분비되고, IgA Fc 결합 및 비결합 형태 양자 모두 관찰되었다 (Brady et al. 1989).
GBS에 대한 높은 수준의 모성 항체들이 태반을 통해서 신생아에게 전달될 수 있고 신생아를 보호할 수 있다는 증거가 있다. 따라서, 모성 GBS 백신의 개발에 막대한 관심이 집중되고 있다. 베타 항원이 토끼 및 마우스에 대해서 면역원성 (즉, 그것은 보호 항체의 생성을 유도한다)인 것으로 알려져 있지만, 사람 단백질과 결합할 수 있는 그것을 사람 백신 성분으로 포함시키는 것은 위험할 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 GBS의 배타 항원의 비-IgA Fc 결합 형태를 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 배타 항원으로 불리우는 GBS 표면 단백질을 코드화하는 유전자를 조작하여 상기 단백질이 더 이상 사람 IgA와 결합할 수 없도록 만드는 것이 관계한다. 더욱 상세하게, 코드화된 단백질에 의한 IgA 결합에 필수적인 베타 항원 유전자의 일부분은 동정 및 결실되었다. 변형된 베타 항원 유전자에 의해 코드화된 신규한 단백질을 IgA에 결합하지 않는 대신에 천연 베타 항원 단백질에 대해 발생된 단특이성(monospecific) 항-베타 항원 항혈청과 면역반응한다. 이것은 본 발명의 유전자 조작된 베타 항원이 GBS 감염들의 심각한 건강상의 위협으로 부터 보호하기 위한 사람 백신의 일성분으로 이용될 수 있도록 한다.
제 1A-1D도는 베타 항원 유전자의 DNA 서열을 도시한 것이다. 폴리메라제 연쇄 반응법에 이용된 정방향 (a 및 c) 및 역방향 (b 및 d) 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 위치가 표시되어 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머내에 유전자조작된 제한효소 서열들의 위치도 표시되었다(BamH I 및 SalI). 역방향 프라이머 b와 정방향 프라이며 c 사이의 DNA 부위는 텍스트 및 제 2도에 기술된 클로닝 방법에 의해 결실되었다.
제 2도는 끝이 잘린 베타 항원 유전자의 구성을 도시한 것이다. PCR 생성된 DNA들 (pJB2a 및 pAH10의 경우 952 염시쌍들 및 pAH5 및 pJB48의 경우 2,385 염기쌍들)은 3,932 염기쌍의 PCRTMII 벡터의 TA 클로닝 부위내에 연결되었다. GBS 서열들의 말단에 유전자조작된 Bam HI (B) 및 SalI (S) 제한효소 부위들의 위치들 및 클로닝된 삽입물 DNA들의 방향도 표시하였다. GBS-유래 DNA는 긁은 실선으로 나타내엇다.
제 3도는 클론 JB2a (레인 1), AH10 (레인 2), AH5 (레인 3), JB48 (레인 4), 및 806-2 (레인 5)로 부터의 플라스미드 DNA의 BstXI 제한효소 절단을 도시한 것이다. 표시된 DNA 표본의 대략적인 크기는 20, 5.0, 3.5, 2.0, 1.9, 1.6 및 1.3 킬로 베이스이다.
제 4A∼4E도는 플라스미드 pJB2a로 부터의 GBS 균주 HG806 유래 삽입물 DNA의 서열을 공표된 베타 항원 유전자 서열들(Jerlstron et al., 1991; Heden et al., 1991)의 대응하는 부위와 나란히 도시한 것이다.
제 5도는 항-베타 항혈청 (패널 A 및 C) 또는 바이오틴-표지된 골수종 IgA 카파로 프로빙된이.콜라이(E. coli)의 농축 LB 육즙 배양균 상청액 (패널 A 및 B)또는 세포 추출물 (패널 C 및 D)의 웨스턴 면역 블롯 분석을 도시한 것이다. 레인 1 내지 7들은 각각 플라스미드 pJB2a, pAH5, p806-2, pAH10, pJB48, p618-12 또는 pCRTMII를 포함하는이.콜라이INV αF' 에 해당한다. 클론 JB2a, 806-2, AH10, 618-12 및 618-18은 모두 베타 항원 유전자에 대한 GBS 프로모터 DNA를 포함하고 이들 클론들에서는 검출가능한 농도의 베타 항원 발현이 지속적으로 관찰되었다.
본 발명은 그룹 B 연쇄상구균 (GBS) 베타 항원의 IgA 결합부위의 동정 및 결실에 관계한다. GBS 베타 항원의 IgA Fc 결합 도메인은 두 개의 끝이 잘린 베타 항원 폴리펩타이드들의 활성의 비교에 의해 위치결정되었다. 균주 HG806에 의해 분비된38,000 달톤 폴리펩타이드는 사람 IgA의 Fc부위에 결합하지 않는 반면에, GBS균주 2AR에 의해 분비된55,000 달톤 폴리펩타이드는 사람 IgA의 Fc부위에 결합한다. 양자의 폴리펩타이드들은 토끼 항-베타 항혈청과 반응하고 성숙한 전체 길이의 야생형 베타 항원 단백질과 동일한 아미노-말단을 공유하는 것으로 입증되었다. 따라서, 베타 항원의 IgA Fc 결합 활성은 균주 2AR에 의해 발현된 폴리펩타이드의 17,000 달톤의 카르복시-말단내에 직접적으로 존재하거나 또는 이 부위가 분자의 아미노-말단 부분과 함께 IgA Fc 결합 활성의 부여에 필요한 것으로 추론되었다.
본 발명의 특수한 양상은 야생형 베타 항원 단백질의 IgA 결합 활성을 코드화하는 DNA 부분을 결여한 신규한 재조합 베타 항원 유전자의 구성에 관계한다. 사람 IgA의 비-면역 결합에 필요한 베타 항원 폴리펩타이드의 일부분을 코드화하는 것으로 생각되는 DNA의 분절이 결여된 유전자를 구성하기 위해 클로닝 방법이 개발되었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 폴리메라제 연쇄반응법 (PCR)을 이용하여 베타 항원 DNA의 두 개의 특수한 분절들을 증폭시키도록 설계되었다. 추정 IgA Fc 결합 도메인의 하류 2.4 킬로베이스의 DNA는 물론 상류의 0.95 킬로베이스 (kb)의 베타 항원 DMA도 증폭 및 클로닝되었다 (제 1도 참조). 두 GBS 균주들로 부터의 염색체 DNA들은 PCR용 주형으로 이용되었다.
균주 HG806은 끝이 잘린38,000 달톤의 비-IgA Fc 결합 베타 항원을 발현한다. SalI 제한효소 부위는 각각0.95 kb 및2.4. kb DNA 분절을 만들기 위해 이용된 역방향 및 정방향 프라이머내에 유전자 조작되었고, 일단 클로닝된 후, 이러한 두 개의 분절들은 베타 항원의 IgA Fc 결합 도메인에 매우 근접한 약 150 아미노산 잔기들이 결여된 최종 폴리펩타이드 생성물을 결과시키기 위해 하나의 인-프레임으로 연결될 수 있다. 각 균주에 대한 PCR 증폭 유전자 분절들은 시판중인 벡터 pCRTMII내에 클로닝되었다. 이러한 벡터는 PCR-생성 DNA를 수용하도록 특수하게 설계되었다. 끝으로, 각 균주에 대한 0.95 kb 및 2.4 kb 유전자 분절들을 포함하는 pCRTMII 플라스미드들은 SalI 및 TthIIIi 제한효소에 의해 2중으로 절단되었다. 적당한 크기의 단편들을 회수한후 연결시켜 베타 항원 유전자 분절들을 프레임으로 융합시킬 뿐만 아니라 단일 복사본의 pCRTMII 벡터를 재구성하였다 (제 2도 참조). BamHI 제한효소 서열들은 각각0.95 kb 및2.4 kb 유전자 분절을 만들기 위해 이용된 역방향 및 정방향 프라이머내에 유전자조작되었다. 따라서, 기능적인 IgA Fc 결합 도메인을 코드화하는데 필요한 DNA를 결여한 베타 항원 유전자 구조물들은 BamHI에 의한 절단에 의해 벡터로 부터 절제될 수 있다. 이것은 이들 유전자 구조물들을 그의 다수의 클로닝 부위들 중에 BamH I 서열을 갖는 임의의 벡터내에 전이할 수 있게 한다.0.95 kb 및2.4 kb 유전자 분절들은 Sal I 또는 BamH I에 의한 2중절단에 의하거나 또는 벡터 DNA내의 삽입물의 양쪽을 모두 절단하는 BstXI에 의한 절단에 의해 그들의 각자의 플라스미드로 부터 절제될 수 있다.
본 발명은 클로닝 방법에 의해 결실된 부위를 포함하는 재조합 베타 항원 유전자 구조물을 이용한 신규한 비-IgA 결합 폴리펩타이드의 발현에도 관계한다. 균주 HG806으로 부터의 0.95 kb 및 2.4 kb 베타 항원 유전자 단편 양자의 성공적인 PCR 증폭은 이러한 균주에 의한 같이 잘린 폴리펩타이드의 발현에도 불구하고, 관찰된 표현형을 담당하는 유전자 상에는 주요한 결실이 존재하지 않는다는 것을 나타낸다. 끝이 잘린 생성물의 발현에 대한 가능한 설명은 미성숙의 종결코돈를 결과시키는 이러한 특정 균주의 베타 항원 유전자에서의 넌센스 돌연변이의 존재이다. 예상대로, 추정 IgA 결합 도메인의 상류에 위치된 HG805-유래 DNA의 서열결정 중에 미성숙의 종결 코돈은 발견되지 않았다. HG806에 존재하는 유전자 손상은 상술한 클로닝 방법에 의해 제거된 그의 배타 항원 유전자의 부분에 존재할 가능성이 높다. 따라서 HG806에서의 이러한 결실은 카르복시 말단 베타 항원의 재발현을 허용할 것이다. 이것은 진실로3.3 kb 융합 유전자 구조물의 폴리펩타이드 생성물이 항-베타 항체들과 반응하고0.95 kb 유전자 분절의 생성물 보다 현저하게 큰 것과 같은 경우로 보인다.
IgA Fc 결합 도메인을 코드화하는 DNA를 제거하는 경우 균주 ss618C로부터 유래된 유전자 구조물에 의한 IgA Fc 결합 활성은 소멸된다. 적당한 크기의 유전자 구조물 (3.3 kb)들은 균주 HG806 및 ss618C 양자로부터 유래되었다. HG806 및 ss618C 양자로부터 유래된3.3 kb 융합 유전자 구조물에 의해 발현된 폴리펩타이드들은 GBS 베타 항원을 인식하는 다클론 토끼 항혈청을 이용한 웨스턴 면역블로팅에 의해 검출될 수 있는데, 이들 폴리펩타이드들과 바이오틴-표지된 사람 골수종 IgA 카파 단백질 사이의 상호작용은 증명되지 않았다. 이러한 결과는 IgA Fc 결합에 필요한 DNA 분절은 베타 항원의 이러한 특성을 제거할만큼 충분히 해체되었지만, 폴리펩타이드의 항원특성은 그의 특수한 항-베타 항체들과의 상호작용을 배제할만큼 충분히 해체된 것은 아님을 나타내준다. 면역글로부린 분자와 같은 일례의 숙주 단백질과 높은 친화성을 가지고 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 백신의 일성분으로 이용하는 것은 허용되지 않기 때문에, 이러한 바람직하지 못한 특성을 제거한 특수하게 유전자조작된 GBS 베타 항원 유전자들의 구성물은 그것을 GBS 백신 조제에서 담체 및 면역원으로 이용할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명은 본원에 개시된 비-IgA 결합 베타 항원을 면역반응을 증가시키기 위한 면역원성 조성물로 이용하는 것에도 관계한다.
유전 암호의 퇴행성(redundancy) 때문에, 여러 가지 상이한 폴리뉴클레오티드 서열들이 본원에 개시된 폴리펩타이드들을 코드화할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드와 동일하거나 본질적으로 동일한 폴리펩타이드들을 코드화하는 대용의 폴리뉴클레오티드 서열들을 만드는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련가들의 기술의 범위내에 포함되는 것이다. 이들 변이체 또는 대용의 폴리뉴클레오티드 서열들은 본 발명의 범위내에 포함된다. 본원에서 이용되는 경우에, "본질적으로 동일한" 서열이라 함은 코드화된 폴리펩타이드의 항-베타 항원 항혈청과의 면역 반응성을 현저하게 변형시키지 않는 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 삽입을 코드화하는 서열들을 말한다. 또한, 본 발명의 범위는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된 폴리펩타이드가 IgA에는 결합하지 않고 항-베타 항원 항혈청과는 면역반응한다면, 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열들의 전부 또는 일부를 포함한다.
IgA에는 결합하지 않고 항-베타 항원 항혈청과는 면역반응하는 특허청구된 폴리펩타이드들의 단편들 및 변이체들은 본 발명의 범위내에 포함된다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들이 이해할 수 있는 바와 같이, 폴리펩타이드 아미노산 서열내의 특정한 아미노산 치환들은 폴리펩타이드의 면역반응성을 변화시키지 않고도 만들어질 수 있다. 예를 들어, 아미노산들은 다음과 같은 클래스들로 분류될 수 있다: 비극성, 비하전극성, 염기성 및 산성, 하나의 클래스의 아미노산이 동일한 클래스내의 다른 아미노산으로 대체되는 보존적 치환은 그러한 치환이 그 폴리펩타이드의 면역반응성을 실질적으로 변화시키지 않는 한 본 발명의 범위내에 포함된다. 비-보존적 치환들도 그러한 치환들이 비-IgA 결합 폴리펩타이드의 면역반응성을 현저하게 변화시키지 않는한 예상된다.
본원에 구체적으로 예시된 폴리펩타이드는 단일의 융합 생성물로서 전체 길이의 야생형 GBS 베타 항원의 아미노산 1-209 및 353-1127을 포함한다. 당업자들에 의해 용이하게 이해될 수 있는 바와 같이, 베타 항원의 결실 부위는 본원에 예시된 것 보다 다소 작거나 클 수 있다. 그러한 폴리펩타이드가 IgA에는 결합하지 않고 항-베타 항원 항혈청과는 면역반응하는한 다양한 폴리펩타이드들이 본 발명의 범주내에 포함될 것이다. 예를 들어, 본원에 제공된 교시를 이용함으로써, 당업자들은 본원에 예시된 결실부위의 양말단에 부가되거나 그로부터 제거될 1 내지 60 아미노산들이 변화된, 폴리펩타이드를 용이하게 제조할 수 있을 것이다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에 있어서, 약 250에서 시작하는 아미노산들은 약 아미노산 350 까지 결실될 수 있다. 바람직하게, 임의의 부가된 아미노산들은 야생형 베타 항원 폴리펩타이드의 상응하는 아미노산들과 동일할 것이다. 본원에 구체적으로 예시된 폴리펩타이드의 아미노-말단 또는 카르복시-말단 중 하나에 부가되거나 그로부터 결실된 아미노산들을 갖는 폴리펩타이드들도 본 발명의 범위내에 속한다. 이러한 부가 또는 결실은 본 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에 의해 용이하게 이해될 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드들은 제조합 베타 항원을 발현시키는데 이용될 수 있다. 그들은 GBS 감염에 대한 분석을 위한 프로브로도 이용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드들은 DNA 크기에 따라 분류하기 위한 표준으로도 이용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드들은 GBS에 대한 면역원성 반응을 증가시키는데 이용될 수 있다. 그들은 분자량 표준으로 또는 분석방법에서의 불활성 단백질로 이용될 수도 있다. 상기 폴리펩타이드들은 GBS와 면역반응하는 항체들의 존재를 검출하기 위해 이용될 수도 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열들은 RNA 또는 DNA로 구성될 수 있다. 더욱 바람직하게, 폴리뉴클레오티드 서열들은 DNA로 구성된다.
재료 및 방법
세균 균주들 및 플라스미드들.본 연구에는 Shands Hospital, J. Hillis Miller Health Science Center, University of Florida, Gainesville, Florida의 임상실험실로 부터의 그룹 B 연쇄상구균(GBS)의 분리주들이 이용되었다. 균주 ss618C은 Centers for Disease Control (Atlanta, GA)로 부터 수득되었다. 균주 ss618C은 높은 수준의 전술한 GBS 베타 항원 및 IgA Fc 결합 활성의 발현을 위해 선택되었다 (Brady et al., 1989). 혈청학 시험에 사용하기 위해, GBS는 37℃에서 18-24 시간 동안 Todd-Hewitt 육즙 (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD)내에서 정지기로 배양되었다. 보존배양균들은 -70℃에서 글리세롤내에 보관되었다.플라스미드 벡터 pCRTMII (In Vitrogen Corp. San Diego, CA)는 폴리메라제 연쇄반응법을 이용하여 만들어진 GBS 베타 항원 유전과의 단편들을 클로닝하는데 이용되었다. 연결된 pCRTMII 및 PCR-생성 베타 항원 DNA들은 제조자의 지시에 따라이.콜라이INVαF' ("ONESHOT", In Vitrogen Corp.)을 형질전환시키는데 이용되었다.이. 콜라이는 50 ㎍/㎖ 암피실린 또는 카나마이신이 보충된 Luria-Bertani (LB) 육즙내에서 37℃하 통기하에서 배양되었다.
항체.C 단백질에 대한 토끼 항체들은 물론 타입 Ia, Ib, II, 및 III 탄수화물 항원들에 대한 토끼 항체는 알.패클램 박사 (Centers for Disease Control, Atlanta, GA)에 의해 제공되었다. GBS 베타 항원을 인식하는 단특이성 항혈청은 전술한 바와 같은 알파, 감마 및 델타 항원들을 발현하는 적당한 균주에 의한 항-C 단백질 혈청의 선택적 흡착(selective adsorption)에 의해 제조되었다 (Brady et al., 1989). 과산화효소 접합 염소 항-토끼 IgG (전체 분자)는 캐팰 (Organon Teknika Corp., Westchester, PA)로 부터 구매하였다.
제한효소.제한효소 AlwN I, BspH II, BstXI, DraIII, HindIII, Kpn I, Sal I (New England BioLabs, Beverly, MA), BamH I, Bgl I, Bgl II, EcoRV (Promega, Madison, WI), Cla I (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD), TthIIi (International Biotechnologies, Inc. New Haven, CT) 및 Xmn I (Stratagene, La Jolla, CA)은 제조자의 지시에 따라 사용되었다.
사람 IgA의 바이오틴화.크로마토그래피에 의해 정제된 사람 골수종 IgA 카파는 캐팰 (Westchester, PA)로 부터 구매하였다. 단백질은 0.01M 인산나트륨 완충액 (pH 7.3)에 5 mg/㎖ 농도로 재현탁되었다. 1 밀리그램된 IgA는 250 ㎍ (10 ㎎/㎖ 디메틸술폭시드내, Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)의 바이오틴-N-히드록시숙신이미드 에스테르(Sigma Chemical Co., St. Louis MO)와 반응되었다. 반응은 1.0 ㎖ 반응 체적으로 pH 8.8의 0.1M 붕산나트륨 완충액내에서 수행되었다. 혼합물은 4℃에서 4 시간 동안 회전교반되었다. 반응은 20 ㎕의 1.0 M NH4Cl의 첨가 및 주위온도하에서의 10분간의 인큐베이션에 의해 종결되었다. 결합되지 않은 NHS-바이오틴은 "SEPHADEX" G-25M (PD-10, Pharmacia, Piscataway, NJ)의 컬럼을 통과시킴으로써 접합 단백질로 부터 분리되었다. IgA-바이오틴 접합체는 PBS로 완충액 교체되었고 -20℃에서 분취량으로 보관되었다. 과산화효소-아비딘은 시그마 케미컬 컴퍼니로 부터 구매하였다.
그룹 B 연쇄상구균 표면 및 분비된 항원의 검출을 위한 도트 블롯 분석.본 연구를 위해 이용된 모든 분리주들은 "PHADEBACT" 연쇄상구균 시험 (Pharmacia Diagnostics, Piscataway, NJ)에 의해 스크리닝함으로써 GBS로 확인되었다. 세균들은 전술한 방법의 변형을 이용함으로써 유형별로 분류되었다 (Brady et al., 1988). 간략하게 설명하면, 세균들은 37℃ (18 시간) 하 10 ㎖ Todd-Hewitt 육즙내에서 정지기로 배양되었고, 원심분리 (100×g에서 8분간)에 의해 회수되고, 5 ㎖의 0.15 M PBS (Phosphate buffered saline; pH 7.4)로 1회 세정되고 2 ㎖의 PBS에 제현탁되었다. 이러한 세균 현탁액은 PBS로 1:40으로 희석되었다. 배양균 상청액은0.2 미크론 1회용 필터 ("ACRODISC", Gelman Seiences, Ann Arbor, MI)를 이용하여 여과되었고, "MINICON" Macrosolute Concentrators (Amicon, Beverly, MA)를 이용하여 약 20배 농축되었다. 각각의 GBS 세포 현탁액의 50 마이크로리터 시료 및 100 ㎕의 각각의 대응하는 배양한 상청액은 "MINIFOLDI" 현미시료 여과 매니폴드 (Schleicher & Schuell, Keene, NH)를 이용함으로써 니트로셀룰로오스 막 ("TRANSBLOT" 전이막 Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 상에 2개로 사본으로 도팅되었다. 웰들은 200 ㎕의 PBS로 2회 세정되었고 필터는 장치로 부터 제거되었다. 니트로셀룰로오스 필터들은 실온에서 0.25%의 젤라틴 및 0.25%의 "TWEEN-20"을 포함하는 PBS(PBS-Gel-Tw)로 4회 (1회 세정 마다 15분, 약 2 ㎖/㎠ 필터 면적) 세정함으로써 블로킹되었다. 이어서 필터들은 PBS-Gel-Tw에 의해 1:500으로 희석된 타입-특이성 항체 (0.1 ㎖/㎠)와 1-3시간 동안 반응되었고 다시 4회 전술한 바와 같이 PBS-Gel-Tw로 세정되었다. 필터들은 PBS-Gel-Tw에 의해 1:1000으로 희석된 과산화효소 접합 염소 항-토끼 IgG (0.1 ㎖/㎠)에 의해 밤새 프로빙되었다. 필터들은 현상 이전에 PBS-Gel-Tw에 의해 2회 (각각 15분씩) 세정되었고 PBS로 2회 세정되었다. 반응성은 실온에서 30분간 0.1 ㎖/㎠의 4-클로로-1-나프톨 용액 (7 ㎖의 PBS, 1 ㎖의 4-클로로-1-나프톨 [시그마 케미컬 컴퍼니; 얼음 냉각된 메탄올내 3 mg/㎖) 및 8 마이크로미터의 30% 과산화수소 [Fisher Scientificl)로 현상함으로써 가시화되었다. 세균 현탁액들 및 배양균 상청액들은 GBS 타입-특이성 항혈청 및 단특이성 항-베타 항혈청 각각에 대한 반응성에 대하여 시험되었다. 항-Ib 탄수화물 타입 항혈청 및/또는 항-베타 항혈청과의 반응성이 입증된 모든 균주들은 이어서 IgA Fc결합 활성에 대해 시험되었다.
사람 IgA Fc 결합 활성의 검출을 위한 도트 블롯 분석.GBS는 바이오틴-표지된 사람 골수종 IgA 카파 (1:500 희석)가 분석의 첫 번째 단계에서 일차 항체 대신에 치환되고 현상 이전에 과산화효소-아비딘(1:1000)이 과산화효소-접합 2차 항체 대신에 대체된 것을 제외하고는 전술한 것과 동일한 도트 블롯 방법을 이용하여 IgA Fc 결합 활성에 대해 스크리닝되었다.
끝이 절단된 베타 항원 폴리펩타이드들의 아미노-말단 서열결정.GBS 균주 2AR 및 HG806으로 부터의 끝이 잘린 베타 항원 폴리펩타이드들을 포함하는 농축된 Todd-Hewitt 육즙 배양균 상청액들은 후술하는 바와 같이 양극 완충액으로 0.2M Tris, pH 8.9를 이용하고 음극 완충액으로 0.1M Tris, 0.1M Tricine, 0.1% SDS를 이용함으로써 10% 소디움도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동되었다. 단백질들은 20% 메탄올, 10 mM MES 완충액, pH 6.0 (2-[N-모르폴리노]에탄술폰산, 시그마 케미컬 컴퍼니)를 이용함으로써 전기블로팅에 의해 PVDF 막("IMMOBILON-P", Millipore Corp., Bedford, MA)으로 전이되었다. 막은 코마시 브릴리언트 블루로 염색되었고 블로팅된 베타 항원 밴드는 절제되어 Applied Biosystems 470A 단백질 서열결정기 (Foster City, CA)를 이용함으로써 서열결정되었다.
염색체 DNS의 제조.GBS는 20 mN DL-트레오닌을 포함하는 5㎖의 Todd-Hewitt 육즙내에서 37℃에서 밤새 배양되었다. 다음날 아침, 10 ㎖의 새로운 육즙이 첨가되었고 배양균들은 45분간 추가로 배양되었다. 이어서 0.75 g의 글리신이 첨가되었고 배양균은 60분간 추가로 배양되었다. 세포들은 7,000×g에서 10분간 원심분리함으로써 회수되었고 1 ㎖의 멸균 증류수내에 재현탁되었다. 세포 현탁액은 에펜도르프 튜브로 옮겨졌고 세포들은 고속으로 3분간 에펜도르프 원심분리기에 의해 원심분리함으로써 펠렛화되었다. 세포들은 25% 슈크로오스를 함유하는 0.5 ㎖ 5 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.5내에 재현탁되었다. 6 마이크로틸터의 RNAse들(10 mg/㎖) 및 70 ㎕의 라이소자임 (15 ㎎/㎖이 첨가되었고 세포들은 37℃에서 1 시간 동안 배양되었다. 세포들은 40 ㎕의 10% SDS의 첨가에 의해 용해되었고 실온에서 20 분간 인큐베이션되었다. 혼합물은 짧게 보르텍싱된다음, 0.6 ㎖ 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 (25:24:1)에 의해 3 추출되었다. 에펜도르프 원심분리기에 의해 5분간 저속 회전시킴으로써 상들이 분리되었다. 잔류 페놀을 제거하기 위해 0.5 ㎖ 클로로포름/이소아밀 알콜 (24:1)에 의해 3 추가 추출들이 행해졌다. 수성 상(aqueous phase)을 포함하는 DNA는 4℃에서 10 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 8.0에 대해 밤새 투석되었다. DNA는 1/10 용적 3 M 소디움 아세테이트 및 2 용적의 95% 에탄올의 첨가에 의해 침전되었다. 펠렛은 70% 에탄올에 의해 세정되었고 DNA는 멸균 증류수내에 1 ㎎/㎖의 농도로 제현탁되었다.
폴리메라제 연쇄반응법.PCR을 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 GBS 베타 항원을 코드화하는 유전자의 이전에 공표된 서열들(Jerlstrom et al., 1991)의 염기 위치 121-139 (정방향 프라이머 a)및 1491-1509 (정방향 프라이머 c) 및 염기 위치 1039-1057 (역방향 프라이머 b) 및 3841-3859 (역방향 프라이머 d)에 상당하는 상보성 뉴클레오티드들이다. 정방향 프라이머 a 및 역방향 프라이머 d의 5' 말단에 부가된 것은 BamH I에 대한 제한서열인 반면에, Sal I 제한 서열들은 역방향 프라이머 b 및 정방향 프라이머 c의 5' 말단들에 부가되었다. 이들 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 위치들은 제 1도에 도식적으로 나타내었다. 밑줄 쳐진 제한 서열들을 갖는 PCR 프라이머 서열들 및 굵은 문자로 도시된 베타 항원 DNA는 다음과 같다:
PCR은 약 50 내지 100 ng의 주형 DNA, 1 ㎛의 각각의 프라이머, 및 "TA CLONING KIT" (In Vitrogen Corp.)에 포함된 시약들을 이용하여 제조자의 지시에 따라 수행되었다. 반응은 주형으로 GBS 균주 2AR 및 HG806 염색체 DNA를 이용하고 다음 파라미터에 따라 코이 "TEMPCYCLER" (Coy, Ann Arbor, MI)를 이용함으로써 33 사이클 동안 수행되었다 : (i) 96℃에서 30초간 변성; (ii) 56℃에서 1 분간 프라이머 결합; (iii) 72℃에서 2 분간 프라이머 연장. 최종 사이클 이후에 추가 5분간의 프라이머 연장 단계가 수행되었다. 새로운 BamH I 및 Sal I 제한부위를 포함하는 952 염기쌍 및 2,385 염기쌍들의 DNA 단편들이 이러한 방법으로 부터 생성될 것으로 예상되었다. PCR의 생성물들은 직접 후술하는 바와 같이 pCRTMII 벡터내에 클로닝하기 이전에 그들의 크기를 확인하기 위하여 0.7% 아가로스를 통해 전기영동되었다.
PCR-생성 DNA 단편들의 클로닝.주형으로 HG806및 ss618C 염색체 DNA를 이용한 PCR에 의해 생성된 952 염기쌍 및 2,385 염기쌍 베타 항원 유전자 단편들은 pCRTMII 벡터내에 연결되었다. 이러한 벡터는 PCR 과정으로 부터 결과된 DNA 단편들 상의 돌출 아데노신 잔기들에 연결되어 있는 중첩 티미딘 잔기들을 갖는 선형 형태로 제공된다. 연결된 DNA들은 제조자의 지시에 따라이. 콜라이INVαF' {"ONESHOT", In Vitrogen Corp.)를 형질전환시키는데 이용되었다. 클론들은 ㎖ 당 50 ㎍ 암피실린 또는 카나마이신 및 0.75 ㎍의 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토피라노사이드 (X-GAL)가 보층된 LB 아가 상에서 청색-백색 선택에 의해 스크리닝되었다. 백색 콜로니들은 선택되었고, 플라스미드 DNA는 후술하는 Mini-Prep 방법에 의해 제조되었다. 클론들은 Mini-Prep DNA를 BstXI로 절단함으로써 적정 크기의 삽입물의 통합 여부에 대해 스크리닝되었다. pCRTMII 벡터 상에는 TA 클로닝 부위의 약 20 염기 하류 및 상류에 두 개의 BstXI 제한효소 부위들이 존재한다. 서열결정된 베타 항원 유전자들내에서는 BstXI 부위가 발견되지 않았다(Jerlstrom et al., 1991; Heden et al., 1991). 벡터 DNA에 대한 삽입은 DNA의 방향은 제한효소 분석에 의해 결정되었다. BglII 및 EcoRV는 952 bp 삽입물을 갖는 클론들에 대해 이용된 반면에, DraIII, BspH I, 및 HindIII는 2,385 bp 삽입물을 갖는 클론들에 대해 이용되었다. 이하의 클론들은 베타 항원의 비-IgA Fc 결합 형태를 코드화하는 유전자의 구성에 이용하지 위해 선택되었다. JB2a, AH10, AH5, 및 JB48. pJB2a 및 pAH5는 각각 균주 HG806으로 부터 유래된 952 bp 및 2,385 bp 삽입물들을 포함하는 플라스미드들을 나타낸다; 반면에 pAH10, 및 pJB48은 각각 ss618C로 부터 유래된952 bp 및 2,385 bp 삽입물들을 포함하는 플라스미드들을 나타낸다. 각각의 연쇄상구균들로 부터 유래된 952 bp 삽입물들은 베타 항원 유전자에 대한 추정 프로모터 DNA를 포함할 것으로 예상된다. 추가의 작업을 위해 선택된 4 플라스미드들 각각에 대한 삽입물 DNA는 pCRTMII 벡터 DNA (5'3')에 대해 반대 방향 (3'5')이었다 (제 2도 참조).
4 플라스미드들의 각각의 대형 스케일 조제들은 후술하는 바와 같이 만들어졌고, 각 플라스미드는 Sal I 및 TthIIIi 제한효소들에 의해 절단되었다. Sal I 부위는 각각의 952 bp 및 2,385 bp 삽입물들의 일말단에 유전자조작된 반면에, pCRTMII 벡터내에는 하나의 TthIIIi 부위가 뉴클레오티드 위치 1567에 존재한다. 이것은 제 2도에 도식적으로 설명되어 있다. pJB2a 및 pAH10의 절단은 약 2.2 및 2.7 kb 크기의 단편을 결과시킬 것으로 예상되었고 pAH5, 및 pJB48의 절단은 약 1.2 및 5.1 kb 크기의 단편을 결과시킬 것으로 예상되었다. 2.2 및 5.1 kb 단편들의 연결은 pCRTMII 벡터의 1 사본의 재구성은 물론 베타 항원 유전자 분절의 인-프레임(in-frame) 융합을 초래한다. 약 20 ㎍의 각각의 플라스미드 DNA는 제조자의 지시에 따라 먼저 Sal I에 의해 절단된 다음 TthIIIi에 의해 절단되었다. 이중절단은 0.7% 아가로스 조제 겔 상에서 진행되었고, 적정 크기의 밴드들이 절제되었으며, DNA는 각 겔 슬라이스를 "MICROFILTERFUGE" 튜브 (Rainin, Woburn, MA)내에 넣고, -70℃에서 30분간 동결하고, 4℃에서 30분간 에펜도르프 원심분리기로 고속으로 회전시킨다음 DNA를 -70℃에서 1/10 용적 3 M 소디움 아세테이트 및 2용적의 95% 에탄올에 의해 침전시킴으로써 회수되었다. pJB2a로 부터의 2.2 kb 단편은 pJB48로 부터의 5.1 kb 단편에 연결되었다. 연결된 DNA들은 제조자의 지시에 따라이. 콜라이INVαF'를 형질전환시키는데 이용되었다. 클론들은 전술한 대로 스크리닝되었다. Mini-Prep DNA들은 3,337 bp 삽입물의 존재 여부를 점검하기 위해 BstXI에 의해 절단되었다. 이것은 각각의 내부에 유전자 조작된 Sal I 부위에 의한 952 bp 및 2,385 bp 단편들의 융합을 나타낸다. 이하의 클론들은 적정-크기의 DNA를 포함하였고 추가의 분석을 위해 선택되었다. p806-2는 pJB2a 및 pAH5 플라스미드 DNA들의 융합 산물인 반면에, p618-12 및 p618-18은 pAH10 및 pJB48 플라스미드 DNA들의 융합 산물이다. p806-2, p618-12 및 p618-18의 대형 스케일 플라스미드 조제들은 후술하는 바와 같이 준비되었고 각 플라스미드는 후술하는 바와 같은 제한효소 분석에 의해 예상 베타 항원 유전자 서열에 대해 점검되었다. 또한, pJB2a로 부터의 삽입 DNA는 M13 정방향 및 역방향 서열결정 프라이머를 이용하여 University of Florida ICBR DNA Sequencing Core Facility에 의해 DNA서열분석되었다.
플라스미드 DNA의 제조.대량의 플라스미드 DNA는 알칼리 용해/PEG 침전 방법에 의해 제조되었다. 간략하게, 재조합 플라스미드들을 포함하고 있는이. 콜라이는 50 ㎍/㎖ 암피실린 또는 카나마이신을 포함하는 30 ㎖의 Terrific 육즙 (12 g/l 박토-트립톤, 24 g/l 박토-효모 추출물, 4 ㎖/l 글리세롤, 17 mM KH2PO4, 72 mM K2HPO4)내에서 37℃하 통기하에서 밤새 배양되었다. 세균 세포들은 원심분리에 의해 회수되어 4 ㎖ GTE 완층액 (50 mM 글루코오스, 25 mM Tris, pH 8.0, 10 mM EDTA,pH 8.0)내에 재현탁되었다. 세포들은 1% SDS를 포함하는 6 ㎖의 새로 마련한 0.2 N NaOH의 첨가에 의해 용해되었고 5분간 얼음중에서 인큐베이션되었다. 용액은 6 ㎖의 3.0 M 초산칼륨, pH 4.8의 첨가에 의해 중화되었고 5분간 얼음 중에서 인큐베이션되었다. 세포 파편들은 실온하에서 12,000×g로 10분간 원심분리함으로써 제거되었고, 상청액은 깨끗한 튜브로 옮겨졌다. RNAse가 최종농도 20 ㎍/㎖로 첨가되고 37℃에서 20분간 인큐베이션되었다. 이어서 상청액은 1/2 용적 클로로포름/이소아밀 알콜 (24:1)에 의해 2회 추출되었고 수성 상은 새 튜브로 옮겨졌다. 전체 DNA는 동일한 용적의 100% 이소프로판올을 첨가하고 실온하에서 12,000×g로 10분간 원심분리함으로써 침전되었다. DNA 펠렛은 70% 에탄올에 의해 세정되었고, 진공건조되었으며 600 ㎕의 멸균 증류수내에 재현탁되었다. 플라스미드 DNA는 160 ㎕의 4 M Nacl을 일차로 첨가하고 이어서 800 ㎕의 13% PEG8000을 첨가함으로써 침전되었다. 완전한 혼합 후, 시료는 얼음 중에서 20분간 인큐베이션되었고 플라스미드 DNA는 4℃하에서 12,000×g로 15분간 원심분리함으로써 펠렛화되었다. 펠렛은 70% 에탄올에 의해 세정되었고, 진공건조되었으며 멸균 증류수내에 1 ㎎/㎖ 최종농도로 재현탁되었다.
Mini-Prep DNA는 백색 콜로니들로 부터 분리된 플라스미드 DNA를 스크리닝하기 위해 각 콜로니를 25 ㎍/㎖ 카나마이신을 포함하는 2 ㎖의 Terrifle 육즙내에 접종하여 37℃하 통기하에서 밤새 배양함으로써 제조되었다. 1과 ½ 밀리리터의 각각의 밤샘 배양균은 에펜도르프 튜브로 옮겨지고 세균들은 실온에서 1분간 에펜도르프 원심분리기로 고속으로 원심분리함으로써 회수되었다. 상청액은 버리고 세균들은 100 ㎕ 용해 완충액 (8% 수크로오스, 10 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0 및 0.5% Triton X-100)내에 재현탁되었다. 10 마이크로리터의 새로운 라이소자임 (10 ㎎/㎖) 및 2 ㎕의 RNAse (10 ㎎/㎖은 세포 현탁액에 첨가되고 혼합되었다. 세포들은 30초간 끓여지고 세균 파편들은 실온에서 고속으로 5 분간 원심분리함으로써 펠렛화되었다. 펠렛은 멸균 요지에 의해 제거되었고, DNA는 실온에서 100 ㎕의 이소프로판올을 첨가함으로써 침전되었다. DNA는 실온에서 고속으로 15분간 원심분리함으로써 펠렛화되었다. 상청액은 따라 버리고 펠렛은 진공건조하였다. DNA 펠렛은 10 ㎕ TE (10 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 8.0)내에 재현탁되었다.
클론들의 제한효소 절단.플라스미드들은 7가지의 목적 클론들로부터 정제되었다: JB2a, AH10, AH5, JB48, 806-2, 618-12 및 618-18. 각 플라스미드는 베타 항원 유전자의 공표된 서열 (Jerlstrom et al., 1991; Heden et al., 1991) 및 pCRTMII 벡터에 기초하여 예상된 절단 패턴을 확인하기 위해 이하에 열거된 호소들에 의해 제한효소 분석되었다. pJB2a 및 pAH10은 Kpn I, Bgl I, AlwN I, Xmn I 및 Cla I/BssH2에 의해 절단되었고; pAH5 및 pJB48은 Kpn I, DraIII, AlwN I, 및 HindIII에 의해 절단되었으며; P806-2, P618-12 및 p618-18은 Kpn I, Bgl I, Bgl II, AlwN I 및 Cla I/BssH2에 의해 절단되었다.
소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 웨스턴 면역블로팅.단백질 시료들은 5분간 2% (wt/vol)소디움 도데실 설페이트, 10% 글리세롤(wt/vol), 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.01% 브롬페놀 블루내에서 끓임으로써 변성되었다. 변성된 단백질들은 Laemmli의 방법 (1970)에 의해 25 mA/슬랩으로 1시간 동안 7.5% 또는 10% 폴리아크릴아마이드 겔 슬랩 상에서 전기영동되었다. 사전염색된 분자량 마커들 (시그마 케미컬 컴퍼니)은 측정 분자량을 구하기 위해 각 겔의 하나의 레인에서 주행되었다. 겔 상의 단백질들은 Towbin 등의 방법 (1979)에 의해 전기영동적으로 니트로셀룰로오스 ("TRANSBLOT" 전이막 Bio-Rad) 상에 전이되었다. 겔 및 니트로셀룰로오스 필터들은 "TRANSBLOT SD" Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad)에 집합된 25 mM Tris, 192 mM 글리신, 20% 메탄올 (pH 8.3)내에 예비침지되었고 15V에서 30분간 전기영동되었다. 블롯들은 도트 블롯 분석에 대해 전술한 바와 마찬가지로 토끼 항-베타 항혈청 및 과산화효소 염소 항-토끼 IgG 또는 바이오틴-표지된 사람 골수종 IgA 카파 및 과산화효소-아비딘에 의해 블로킹 및 프로빙되었다.
단백질 시료들은 다음과 같이 준비되었다: GBS 균주들로 부터의 상청액들은 도트 블롯 분석에 대해 전술한 바와 같이 준비되었다. 15 마이크로리터의 각각의 농축된 GBS 배양한 상청액은 레인 마다 로딩되었다.
이. 콜라이의 세포 추출물들은 10 ㎖의 세균들을 50 ㎍/㎖ 암피실린 또는 카나마이신을 포함하는 LB 육즙내에서 37℃하 통기하에서 배양함으로써 준비되었다. 세균들은 실온하에서 10분간 2,000×g로 원심분리함으로써 회수되었다. 세포들은 5 ㎖의 PBS로 1회 세정되었고 1 ㎖의 PBS로 1회 세정되었다. 세포들은 200 ㎕의 SDS-시료 완충액에 재현탁되고 5분간 끓여졌다. 세포 파편들은 10분간 에펜도르프 원심분리기에 의해 고속으로 원심분리함으로써 제거되었다. 50 마이크로리터의 각각의 세포 추출물은 레인 마다 로딩되었다. 잔류 LB 육즙 배양균 상청액은 GBS Todd-Hewitt 육즙 배양균 상청액에 대해 상술한 바와 같이 약 40배 농축되었고 50 ㎕의 각각의 농축된이. 콜라이배양균 상청액은 레인 마다 로딩되었다.
이하의 것들은 베스트 모드를 포함하는 본 발명을 실시하기 위한 방법을 설명하는 실시예들이다. 이러한 실시예들은 제한적으로 해석되어서는 안된다. 특별한 언급이 없는한, 모든 백분율은 중량%이고 모든 용매 혼합비는 체적비이다.
실시예 1 - GBS에 의한 베타 항원 발현/IgA Fc 결합 활성의 확인
그룹 B 연쇄상구균의 53 균주들은 도트 블롯 분석에 의해 시험될 때 그들의 표면상에 베타 항원 혹은 타입 Ib 탄수화물 중 하나를 발현하는지 확인되었다. 이들 균주들 모두는 배양균 상청액내에 베타 항원의 분비에 대해 시험되었고 표면 및/또는 분비된 IgA Fc 결합 활성에 대해 스크리닝 되었다. 이들 균주들은 IgA Fc 결합 활성의 부재시에 베타 항원을 발현하지 않는 것으로 입증되었다. 따라서, 표면 발현의 부재시에 각각 베타항원의 끝에 잘린 Mr 55,000 IgA Fc 결합 및 Mr 38,000 비-IgA Fc 결합 형태를 분비하는, 이전에 확인된 GBS 균주들 2AR 및 HG806는 추가의 특성화를 위해 선택되었다. 높은 수준의 전체 길이의 IgA Fc 결합 베타 항원 Mr 130,000을 발현하는 GBS 균주 ss618C도 클로닝 실험을 위한 후보 균주로 선택되었다.
실시예 2 - 베타 항원의 끝이 잘린 형태의 아미노-말단 서열결정
IgA Fc 결합 활성의 GBS 베타 항원 단백질내의 대략적인 위치를 결정하기 위해서, 아미노-말단 서열결정이 GBS 균주들 2AR 및 HG806에 의해 분비된 두 개의 끝이 잘린 베타 항원 폴리펩타이드들에 대해서 실시되었다. 균주 2AR에 의해 발현된 Mr 55,000 IgA Fc 결합 폴리펩타이드의 10 아미노-말단 잔기들은 37 아미노산 잔기 신호 서열의 절단에 이어지는 성숙한 전체-길이의 베타 항원 단백질에 대해 예상된 아미노-말단 서열들에 상당한다 (Jerlstron et al., 1991; Heden et al., 1991). 균주 HG806에 의해 발현된 Mr 38,000 비-IgA Fc 결합 폴리펩타이드의 아미노-말단 잔기들도 동일하다. 따라서, GBS 베타 항원의 IgA Fc 결합 도메인은 균주 2AR에 의해 발현된 폴리펩타이드의 카르복시 말단 17,000 달톤 폴리펩타이드내에 존재한다고 결론을 내리는 것이 합당하다. 그렇지 않으면, IgA Fc 결합 도메인은 HG806에 의해 발현된 38,000 달톤 폴리펩타이드내에 적어도 일부분 존재할 것이지만, 균주 2AR에 의해 발현된 추가의 17,000 달톤 폴리펩타이드는 IgA Fc 결합 활성을 부여하기 위한 정확한 배열을 달성하는데 요구될 수 있다.
실시예 3 - GBS 베타 항원의 비-IgA Fc 결합 형태를 코드화하는 유전자의 구성
올고뉴클레오티드 프라이머들은 추정 IgA Fc 결합 도메인의 상류 및 하류 DNA가 폴리메라제 연쇄반응법 (PCR)에 의해 증폭될 수 있도록 설계되었다. 이들 프라이머들의 위치는 제 1도에 도시되었다. 이러한 클로닝 방법에 의해 베타 항원 유전자로 부터 제거된 DNA 분절도 설명되어 있다. 정방향 프라이머 a 및 역방향 프라이머 d의 5' 말단들에 부가된 것은 BamH I에 대한 제한서열인 반면에, Sal I 제한서열들은 역방향 프라이머 b 및 정방향 프라이머 c의 5' 말단들에 부가되었다. 이들 유전자 조작된 제한부위들의 위치도 제 1도에 도시되어 있다.
GBS 균주들 HG806 및 ss618C로 부터의 염색체 DNA는 PCR 반응을 위한 주형 DNA로 이용되었다. BamH I 및 Sal I 제한부위를 포함하는 952 염기쌍들의 DNA 단편은 정방향 프라이머 a 및 역방향 프라이머 b의 이용으로 부터 결과된 것으로 예상되는 반면에, 2,385 염기쌍들을 포함하는 단편은 정방향 프라이머 c 및 역방향 프라이머 d의 이용으로 부터 결과된 것으로 예상되었다. 이들 두 단편들은 주형으로 양자의 GBS 균주로 부터의 염색체 DNA를 이용하여 PCR에 의해 성공적으로 만들어졌다. PCR의 생성물들은 pCRTMII 벡터내 직접 클로닝하기 이전에 그들의 크기를 확인하기 위하여 0.7% 아가로스 겔을 통해 전기영동되었다.
952 bp 및 2,385 bp PCR-생성 DNA들은 선형 pCRTMII 벡터내에 연결되어이. 콜라이INV αF'를 형질전환시키는데 이용되었다. 클론들은 청색-백색 선택에 의해 스크리닝되었다. 백색 콜로니들을 취하여 삽입물 DNA의 존재 여부에 대해 Mini-Prep에 의해 스크리닝하였다. 삽입물을 포함하는 클론들은 pCRTMII 벡터내에 있는 삽입물 DNA의 양쪽을 절단하는 BstXI에 의해 절단되었다. 약 0.95 kb 또는 2.4 kb의 적정-크기의 삽입물을 갖는 클론들은 추가로 제한효소 분석되었다. 약 0.95 kb의 삽입물을 갖는 클론들은 BglI 및 EcoR V 제한효소들에 의해 지도작성된 반면에, 약 2.4 kb의 삽입물을 갖는 클론들은 HindIII, DraIII 및 BspHI, 제한효소들에 의해 지도작성되었다. 이것은 각 클론에서 벡터 DNA에 대한 삽입물 DNA의 방향을 결정할 수 있게 해주었다.
4 클론들이 추가의 유전자 조작을 위해 선택되었다. JB2 및 AH10은 각각 GBS 군주 HG806 및 ss618C로 부터 유래된22.4 kb 클론들을 나타낸다. 이들 클론들 4개 모두에서의 삽입물 DNA는 벡터 DNA (5'3')에 비해 반대 방향 (3'5')인 것으로 밝혀졌다.
0.95 kb 및2.4 kb DNA 단편들의 연결 및 pCRTMII 벡터의 단일 사본의 재구성 방법은 제 2도에 도시되어 있다. 4 클론들 각각으로 부터 유래된 플라스미드 DNA들은 Sal I 및 TthIIIi 제한효소들에 의해 절단되었다. GBS 균주 HG806 및 ss618C로 부터 유래된 플라스미드로부터의 적정한 절단 단편들은 정제되었고0.95 kb 및2.4 kb 유전자 분절들은 각각의 일말단에 유전자조작된 Sal I 부위를 통해 인프레임으로 연결되었다. 제한단편의 타말단에 있는 TthIIIi 부위를 통한 연결은 완전한 pCRTMII 벡터의 재구성을 초래하였다. pJB2a (0.95 kb, HG806), 및 pAH10 (0.95 kb, ss618C)로 부터의 제한단편들은 각각 pAH5 (2.4 kb, HG806) 및 pJB48 (2.4 kb, ss618C)에 연결되었다. 연결된 DNA들은 다시이. 콜라이INVαF'를 형질전환시키는데 이용되었고, 백색 콜로니들은 취하여 적당한 크기의 삽입물(3,337 염기쌍)의 존재 여부에 대해 Mini-Prep 및 BstXI 절단에 의해 스크리닝하였다.3.3 kb 삽입물을 포함하는 3 클론들은 추가의 연구를 위해 선택되었다. 이들 pJB2a, 및 pAH10의 융합에 의해 구성된 806-2 및 pAH5 및 pJB48의 융합에 의해구성된 618-12 및 618-18을 포함하였다.
실시예 4 - 플라스미드 DNA의 제한효소 분석
플라스미드들은 알칼리 용해/PEG 침전 방법을 이용하여 7 개의 선택된 클론들로 부터 정제되었다. 제 3도는 각 플라스미드 (p618-12 및 p618-18 제외)가 벡터 DNA로 부터 삽입물 DNA를 분리하기 위해 BstXI에 의해 절단된 것을 보여준다. pCRTMII 벡터는 3,932 염기쌍들을 포함하고 TA 클로닝 부위의 약 20 염기쌍 상류 및 하류에 BstXI 부위를 갖는다. 두 개의 공표된 서열들 (Jerlstron et al., 1991; Heden et al., 1991)에 기초한 베타 항원 유전자내에는 BstXI 부위가 없다. 모든 플라스미드들은 선형 벡터인3.9 kb 단편 및 클로닝된 GBS DNA인0.95 kb,2.4 kb 또는3.3 kb 단편을 보여준다.
이러한 도면은 동일하고 적정한 크기의 단편들이 균주 HG806 (레인 1 및 3) 및 ss618C (레인 2 및 4)에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머 a 및 b (레인 1 및 2) 또는 c 및 d (레인 3 및 4)를 이용한 PCR에 의해 생성되고 pCRTMII 벡터내에 성공적으로 클로닝되었다는 것을 증명해준다.3.3 kb, 베타 항원 유전자 삽입물을 만들기 위한0.95 kb 및2.4 kb PCR 생성 DNA들의 성공적인 연결은 레인 5에서 균주 HG806 유래 클론, 806-2에 대해 입증되었다. 동일한 결과들이 p618-12 및 P618-18이 Bst XI에 의해 절단된 경우에도 관찰되었다.
클론내에 포함된 GBS DNA가 공표된 베타 항원 유전자 서열들의 대표적인 것이라는 것을 추가로 확증하기 위해서, 각 플라스미드는 제한효소들의 패널을 이용하여 분석되었다. pCRTMII 벡터 및 베타 항원 유전자의 공표된 서열에 기초하여 예상된 대략적인 단편 크기는 각 효소명 다음에 괄호 안에 열거하였다. pJB2a 및 pAH10은 Kpn I(4.9 kb), Bgl II(1.7 및3.2 kb), AlwN I(2.3 및2.5 kb), Xmn I(2.40.5 및2.0 kb) 및 Cla I/BssH2(1.7 및3.2 kb)에 의해 절단되었다. pAH5 및 pJB48은 Kpn I(6.3 kb), DraIII (1.9,0.07 및4.3 kb), AlwN I (2.3,2.5 및1.5 kb), 및 HindIII (0.02,0.02,0.08 및5.5 kb)에 의해 절단되었다. p806-12, p618-12 및 p618-18은 kpnI (7.3), BglI (2.3 및5.0 kb), BglII (1.7 및5.6 kb) AlwN I (2.3,1.5 및3.4 kb) 및 Cla I/BssH2(1.7 및5.5 kb)에 의해 절단되었다, 예상 절단 패턴은 각 경우에 입증되었다.
실시예 5 - 플라스미드 JB2a로 부터의 GBS 삽입물 DNA의 서열 결정
제한효소 분석 위에, GBS 균주 HG806으로부터 유래된 DNA를 포함하는 클론들 중 하나(JB2a)는 DNA 서열 분석되었다. 이들 서열들이 pCRTMII 클로닝 벡터내에 유전자조작될 때 정방향 및 역방향 M13 서열결정 프라이머들이 이용되었다. JB2a 삽입물 DNA의 DNA 서열들은 제 4A-4E도에 도시되었다. 이러한 서열은 두 가지의 이전에 공표된 베타 항원 유전자 서열들(Jerlstron et al., 1991;Heden et al., 1991)의 대응 부위와 나란히 도시되었다.
실시예 6 - 베타 항원 발현 및 IgA Fc 결합 활성에 대한 클론들의 분석
7가지의 클론들 각각으로 부터의 세포 추출물들 (끓인 조제) 및 농축된 배양균 상청액은 토끼 항-베타 항혈청 및 바이오틴 - 표지된 사람 골수종 IgA 카파와의 반응성에 대해 웨스턴 면역블로팅 분석법에 의해 시험되었다. pCRTMII 벡터 DNA만을 포함하는이. 콜라이를 이용하여 만들어진 시료들은 이 실험에 음성 대조표준으로 포함되었다. 결과 (p618-18을 제외하고)는 제 5도에 도시하였다. 항-베타 항체들과 반응하는 분자들은 클론 JB2 (레인 1) 및 806-2 (레인 3)의 배양균 상청액 (패널 A) 및 클론 JB2a (레인 1), AH10 (레인 4), 618-12 (레인 6)의 세포 추출물들에서 나타난다. 항-베타 항체들과 특이적으로 반응하는 폴리펩타이트들중 어느 것에서도 IgA Fc 결합 활성은 관찰되지 않았다 (패널 B 및 D). 비록 일부의 비-특이성 IgA 결합 활성이이. 콜라이배양균 상청액 및 세포 추출물에서 관찰되었지만, 하더라도, 반응성의 패턴은 pCRTMII 음성 대조표준(레인 7)에서의 시험 시료에서와 동일하였으므로, 베타 항원에 기인하는 것은 아니다. 클론 618-18에 대해 관찰된 반응성의 패턴은 618-12에 대해서 증명된 바와 유사하다.
실시예 7 - 백신들
본원에 기술된 신규한 베타 항원 폴리펩타이드는 백신과 같은 면역원성 조성물로 유리하게 이용될 수 있다. 이러한 조성물은, 사람 또는 동물에 투여될 때, 사람 또는 동물의 GBS 감염에 대한 감수성을 감소시키는 항체 또는 다른 면역반응들을 증가시킨다.
본 발명의 베타 항원 폴리펩타이드 및 그의 변이체들을 포함하는 항원성 또는 면역원성 특성을 갖는 백신들은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 따라 제조될수 있다. 예를 들어, 이러한 백신들은 액체 용액 또는 현탁액등과 같은 주사가능 약물로 제조될 수 있다. 용액 또는 현탁액에 넣기 위한 고체 형태로 주사 이전에 액체로도 만들어질 수 있다. 선택적으로, 조제는 유화될 수도 있다. 활성 항원 성분 또는 성분들은 약제학상 허용가능하고 활성 약물과 상용성이 있는 부형제들과 혼합될 수 있다. 적합한 부형제들의 예들은 물, 염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합이다. 또한, 바람직한 경우, 백신은 습윤제, 유화제, pH 완충제와 같은 미량의 기타 보조 제물질 또는 수산화알루미늄 또는 무라밀디펩타이드 또는 그의 변형물과 같은 아쥬반트들을 포함할 수 있다. 콜레라 독소 서브유닛 B 또는 점막 부위에서 항체 생산을 자극할 수 있는 다른 제제들이 이용될 수도 있다. 펩타이드의 경우에, KLH 또는 파상풍 톡소이드와 같은 큰 분자들로의 커플링은 때때로 면역원성을 증기시킬 수 있다. 백신들은 전통적으로 비경구적으로, 예컨대, 피하 또는 근육내 주사를 통해 투여된다. 투여를 위한 다른 방식에 적합한 다른 제형들은 좌약을 포함하고 때로는 경구용 제형들도 포함한다. 좌약의 경우, 전통적인 결합제 및 담체들은, 예를 들어, 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함한다. 좌약은 약 0.5 내지 약 10%, 바람직하게 약 1 % 내지 약 2 % 범위의 활성성분을 포함하는 혼합물로 부터 생성될 수 있다. 경구용 제형들은 약 등급의 만니톨 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 일례의 통상적으로 이용되는 부형제들을 포함할 수 있다. 이들 조성물들은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지속방출성 제형 또는 분말의 형태일 수 있고, 약 10% 내지 약 95%, 바람직하게 약 25 % 내지 약 70 % 범위의 활성성분을 포함한다.
화합물들은 중성 또는 염 형태로 백신내에 제형화될 수 있다. 약제학상 허용가능한 염들은 산 부가 염 (펩타이드의 유리 아미노기들에 의해 생성된)을 포함하고 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 초산, 옥살산, 타라타르산, 만델산 등과 같은 유기산들에 의해 생성된다. 유리카르복실 기들에 의해 생성된 염들도 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모니움, 칼슘 또는 수산화철과 같은 무기 염기들 및 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기들로 부터 유래될 수 있다.
백신들은 용량 제형과 상용성이 있는 방식으로 투여되고 치료상 효과적이고 면역원성인 양으로 투여된다. 투여량은 치료대상 및 목적으로 하는 보호 정도에 의존할 수 있다. 유리하게 점막 면역성을 증가시킬 수 있는 공지의 방법들은 GBS에 대한 보호를 최대화하기 위해 전신 면역성 프로모터들과 결합될 수 있다. 또한, 본 발명의 베타 항원 폴리펩타이드는 면역원성 반응을 증가시키기 위해 탄수화물 항원성 성분들과 결합되어 광범위한 보호를 제공할 수 있다. 결합은 예를 들어, 화학적 커플링을 통한 것일 수 있다. 투여되어야 하는 활성 성분의 정확한 양은 시술자의 판단에 의존하고 각 개인에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 적당한 용량 범위는 약 수백 미생물 활성 성분/개체 정도이다. 초기 투여를 위해 적합한 식이요법 및 효능촉진제도 다양하지만, 1주 또는 2주 간격내에 후속 주사 또는 다른 투여가 이어지는 초기 투여에 의해 유형화된다.
바람직하게, 본 발명의 백신들은 점막 면역을 유도하기 위해 특수하게 설계된 방식으로 제형화되고 투여될 수 있다.
본원에 기술된 실시예 및 실시양태들은 설명만을 위한 것이며, 더욱이 본 발명에 대한 다수의 변형 또는 변화들이 당업자들에게 제안될 것이며 본원의 정신과범위 및 첨부된 특허청구의 범위내에 포함되어야 한다.

Claims (9)

  1. 그룹 B 연쇄상구균으로부터의 정제된 돌연변이 베타 항원 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 항-베타 항원 항혈청과 면역반응성이고 야생형 베타 항원의 아미노 말단 및 카르복시 말단 영역을 포함하며 사람 IgA 면역글로블린의 Fc 영역에 결합하지 않는 베타 항원 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드가 서열 2에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 베타 항원 폴리펩타이드.
  3. 그룹 B 연쇄상구균으로부터의 정제된 돌연변이 베타 항원 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 항-베타 항원 항혈청과 면역반응성이고 야생형 베타 항원의 아미노 말단 영역을 포함하며 사람 IgA 면역글로블린의 Fc 영역에 결합하지 않되, 상기 폴리펩타이드가 그룹 B 연쇄상구균 균주 HG806에 의해 분비되는 약 38kDa 폴리펩타이드가 아닌 베타 항원 폴리펩타이드.
  4. 약제학상 허용가능한 비히클 내에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 베타 항원 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물.
  5. 그룹 B 연쇄상구균으로부터의 돌연변이 베타 항원 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정제된 폴리뉴클레오티드 분자로서, 상기 폴리펩타이드가 항-베타 항원 항혈청과 면역반응성이고 야생형 베타 항원의 아미노 말단 및 카르복시 말단 영역을 포함하며 사람 IgA 면역글로블린의 Fc 영역에 결합하지 않는 폴리뉴클레오티드 분자.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드 서열이 서열 2에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자.
  7. 그룹 B 연쇄상구균으로부터의 돌연변이 베타 항원 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정제된 폴리뉴클레오티드 분자로서, 상기 폴리펩타이드가 항-베타 항원 항혈청과 면역반응성이고 야생형 베타 항원의 아미노 말단 영역을 포함하며 사람 IgA 면역글로블린의 Fc 영역에 결합하지 않되, 상기 폴리펩타이드가 그룹 B 연쇄상구균 균주 HG806에 의해 분비되는 약 38kDa 폴리펩타이드가 아닌 폴리뉴클레오티드 분자.
  8. 폴리뉴클레오티드 클로닝 비히클 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 전이 벡터.
  9. 제8항의 재조합 폴리뉴클레오티드 전이 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포.
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