KR100354577B1 - 미생물에서의 시그날 전달을 사용한, 리간드 결합가능 단백질의 유전적 선별방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 리간드 결합할 수 있는 단백질이 세포질 외에 존재하고 리간드 결합의 시그날이 검출할 수 있고/거나 선별할 수 있는 기능을 발현할 목적으로 미생물의 생합성기로 시그날 형질 도입에 의해 전달됨을 특징으로 하여, 리간드 결합할 수 있는 단백질을 미생물에서 유전적으로 선별하는 방법에 관한 것이다.
상기 이외에, 본 발명은 상기 방법에서 사용하기에 적합한 미생물 및 레플리콘, 및 이들의 제조방법에 대해 기술하고 있다.

Description

미생물에서의 시그날 전달을 사용한, 리간드 결합가능 단백질의 유전적 선별 방법
본 발명은 미생물에서 단백질을 유전적으로 선별하는 방법, 이러한 방법에 적합한 미생물 및 레플리콘(replicon), 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.
면역화 단계 없이 항체를 수득하기 위한 선행 기술의 근거는 필라멘트성 파아지 M13 또는 f1의 단백질 외막(coat)에 Fab 단편을 제공하고, 고정화 합텐에 흡착시켜 강하게 결합된 변이체를 복합(complex) 집단중에서 집적(enrichment)시키고이어서 합텐 매트릭스상에 선택적으로 보유된 파아지를 탈착시키고 생물학적으로 증식시키는데 있다. 이러한 생화학적/유전적 집적 방법은 주로 알. 레르너(R. Lerner) 및 지 윈터(G. Winter)에 의해 대중화되었다.
이외에, 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae)의 toxR 유전자(Mr=32,527)의 생성물이 다수의 바이러스 독성 결정인자, 주로 콜레라 독소 자체(ctxAB 오페론에서 암호화됨) 및 일련의 기타 단백질의 발현을 조절하는데 관여한다는 것이 문헌 [참조: Parsott and Mekalanos, J. Bakt., 173, 2842 (1991)]에 공지되어 있다. 밀러(Miller)등 [참조: Miller et al., Cell, 48, 271 (1987)]에 의해 기술된 모델에 따르면, ToxR은 주변세포질에 위치하는 카복시말단 도메인(domain)(AA 202/294), 트랜스막 나선구조(transmembrane helix) 및 세포질에 위치하며 기타 세균성 전사활성인자(예: OmpR, PhoM 또는 PhoG)와 동종(homology)인 아미노말단 도메인(AA1-182)을 지니는 트랜스막 단백질이다. 상기 기능을 수행함에 있어서, ToxR은 막-고정된 단백질로서 ctx 오페론의 프로모터/오퍼레이터 영역에 직접 결합하여 전사 활성화 인자로서 작용한다. 8개의 반복 서열을 가지며 -50 내지 -112의 영역(제1도)에 존재하는 오퍼레이터 서열인 TTTGAT는 결합에 필수적이다. 밀러등은 β -갈락토시다제에 대한 유전자(lacz)가 ctx 프로모터의 조절하에 위치하는, 염색체로 통합된 ctxlacZ 유전자 융합을 포함하는 이.콜라이 균주를 사용하여, ToxR-중재된 시그날 전달이 이.콜라이에서 나타날 수 있음을 입증할 수 있었다. 이러한 작제물에서, lacZ 유전자는 ctxA 유전자의 처음 28개 코돈의 하부에 연속 판독 프레임에 위치한다. ToxR 및 phoA를 포함하는 융합 유전자가 플라스미드로부터 세포로 이전되는 경우, β -갈락토시다제 발현을 통한 ctx 프로모터의 전사 활성화를 입증할 수 있다.
밀러에 의해 기술된 모델에 따라, ToxR 주변세포질 도메인의 이량체화는 필수적이고 충분한 활성화 시그날을 나타낸다. 이 모델은 시그날 전달이, 주변세포질 도메인이 제거되고 주변세포질에 존재하는 이량체 단백질인 알칼린 포스파타제에 의해 대체된 ToxR 유도체에 의해(영구적으로 "온(on)" 상황으로) 중재된다는 사실에 근거한다.
본 발명의 목적은 세균 집단에서 단백질의 직접적인 유전적 선별을 위해 시그날 전달의 사용을 가능하게 하는 선별 방법을 개발하고 동시에, 추가로 사용되는 미생물과 직접적인 기능적 관련이 있는 어떠한 특성도 가지지 않는 기타 단백질 부류로 선별 원리를 확장시키고자 하는 것이다.
이러한 상황에서, 놀랍게도, 리간드 결합할 수 있는 단백질의 유전적 선별이 미생물에서 가능하는 것을 밝혀내었다.
그러므로, 본 발명은 리간드 결합할 수 있는 단백질을 미생물에서 유전적 선별하는 방법에 관한 것이며, 이 방법에서 리간드 결합할 수 있는 단백질은 세포질외(extra-cytoplasmic)적으로 제공되며 리간드 결합의 시그날은 시그날 전달에 의해 미생물의 생합성기로 전달되어 검출할 수 있고/있거나 선별할 수 있는 기능이 발현된다.
본 발명의 목적을 위해, 세포질외는 "미생물의 내부막 또는 외부막의 외부 표면에 있음"을 의미하며 내부 막의 외부 표면 즉, 주변세포질에 단백질이 위치하는 경우가 바람직하다. 본 발명에 따라, 활성화 시그날은 단백질과 세포외 리간드와의 상호 작용에 의하거나 주변세포질 단백질의 동종이량체화(homodimerization) 또는 이종이량체화(heterodimerization)에 의해 개시될 수 있다. 이러한 상황에서, 상기 이량체화는 2개의 단백질 사이에서 직접 발생할 수 있거나 적합한 2가 합텐의 도움으로 유도될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기와 같은 방식으로 생성된 활성화 시그날은 트랜스막 나선구조 및 세포질에 존재하는 조절성 도메인, 특히 전사 활성화인자 또는 전사 억제인자에 의해 미생물의 생합성기로 전달된다.
본 발명에 따른 방법에서, 시그날 전달의 유전적 선별을 위해 적합하게 사용될 수 있고 유전적으로 안정하게 검출할 수 있고/있거나 선별할 수 있는 기능을 함유한 미생물이 리간드 결합할 수 있는 단백질, 트랜스막 나선구조 및 조절성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 레플리콘, 특히 플라스미드, 파아지 게놈 또는 파즈미드(phasmid)를 사용하여 형질전환되며 시그날 전달에 의해 생성된 기능이 결정되고/되거나 선별된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 검출할 수 있고 선별할 수 있는 기능은 조절 가능한 프로모터의 조절하에 있으며 검출할 수 있고 선별할 수 있는 기능을 암호화하는 유전자의 발현, 특히 ctx 조절하에 있는 염색체로 통합된 β-갈락토시다제 유전자의 발현이다. 본 발명에 따라, 미생물은 바람직하게는 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli) 균주, 특히 FHK11 또는 FHK12이다.
본 발명의 목적을 위해, 리간드 결합할 수 있는 단백질은 면역글로불린, 항원, 수용체 도메인, 리간드 수용체, 특히 호르몬, 효소 및 억제 인자 중에서 선택된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 양태에 따라, 이러한 관점에서의 단백질은 면역글로불린, 특히 Fab 단편, Fv 단편, 단일쇄 Fv 단편, 또는 경쇄의 단량체 또는 동종이량체이다. 더우기 트랜스막 나선 구조는 비브리오 콜레라에의 ToxR 유전자, 프로토종양원성 유전자(protooncogene) C-new, P-new 종양원성 유전자 및 막 결합된 IgM의 트랜스 막 나선구조 중에서 선택된다. 방법의 바람직한 전사 활성화인자는 ToxR 단백질의 N-종결 말단, 즉 아미노산 1 내지 182이다.
또한, 본 발명은 시그날 전달에 의한 유전적 선별을 위해 적합하게 사용될 수 있고 유전학적으로 안정한 검출가능한 기능을 함유하는 미생물에 관한 것이다. 이러한 관점에서, 상기 검출가능한 기능은 바람직하게는 ctx 조절하에 있는 염색체로 통합된 β -갈락토시다제이다. 에스케리챠 콜라이 균주 FHK11 및 FHK12가 특히 바람직하다.
상기 기술된 것 이외에, 상기 언급된 미생물을 제조하는 방법이 기술되어 있으며, 이 방법에서는 검출할 수 있는 기능이 통합 벡터의 도움으로 미생물로 도입된다.
본 발명은 또한 상기 정의된 레플리콘 및, 트랜스막 나선구조, 조절성 도메인 및 리간드 결합할 수 있는 단백질을 암호화하는 DNA 단편의 융합을 포함하는, 이의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 하기 도면에 의해 더 상세히 설명된다.
제1도는 이량체 형성에 의한 시그날 전달을 나타내는 도식이다. a) 리간드-유도되지 않은 동종이량체 형성, b) 리간드-유도되지 않은 이종이량체 형성, c) 리간드-유도된 동종이량체 형성 및 d) 리간드-유도된 이종이량체 형성.
제2도는 벡터 pHKToxREI을 작제하기 위한 클로닝 단계를 도식적으로 나타낸 것이다.
제3도는 pHKToxREI의 물리적 및 유전적 지도를 나타낸 것이다. cat: 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제에 대한 유전자; colE1-ori: ColE1 복제 오리진; f1-ori: 박테리오파아지 f1 복제 오리진; fdT: 박테리오파아지 fd 전사 종결인자; toxR: ToxR 유전자의 프로모터에 근접한 분절(코돈 1-210을 포함하는 프로모터); rei: 면역글로불린 도메인 REI에 대한 유전자; phoA: 알칼린 포스파타제에 대한 암호화 서열.
제4도는 작제물 VLphoAVH를 제조하기 위한 PCR 도식에 관한 것이다.
본 발명은 고등 척추 동물의 면역시스템의 중요한 특징을 미생물에서 고안한 실험 시스템에 대해 기술하고 있다. 이 시스템은 항원 결합에 의해 유도된 클로날 확장 및 돌연변이 및 선별에 의한 항원 인지의 미세한 조정을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예로 더 상세히 밝혀질 것이다.
실시예
실시예 I (균주 작제)
1. FHK11의 작제
FHK11: F_, ara, △(lac-proAB), rpsL,8O d△(lacZM15), attHB::ctxDsiglacZ
ctx 프로모터는 올리고뉴클레오타이드 CtxUp 및 ctxLo를 이용한 PCR에 의해 병원성 비브리오 콜레라에 균주의 염색체로부터 증폭시킨다. PCR 생성물은 7개 반복 서열을 갖는 ToxR 인지 서열을 포함한 ctx 프로모터 영역을 함유한다[참조 문헌: Miller et al., Cell 48, 271 (1987)]. 염색체로 통합된 ctxlacZ 유전자 융합을 포함한 상기 문헌에 기술된 에스케리챠 콜라이 균주는 유전적 불안정성을 나타내기 때문에, 상기 밀러등의 경우와는 달리 코돈 5 내지 28의 추정적 CtxA 시그날 서열을 제거한다. 이러한 제거는 올리고뉴클레오타이드 CtxUp 및 Ctx△Sig를 이용하여 ctx 프로모터를 재증폭시킴으로써 수행한다.
상기 서열식에서, Ctx 프로모터에 상보적인 서열이 굵은 글자체로 강조되어 있다.
이어서 lacZ 유전자는 SOE PCR에 의해 ctx 프로모터로 융합시킨다. 생성된생성물을 BamHI 단편으로서 BamHI- 선형화된 벡터 pLDR10[참조: Diederich et al., Plasmid, 28, 14-24 (1992)]로 ctx 프로모터가 bla 유전자의 프로모터에 대해 반대 방향으로 배향되도록 클로닝시켜 상기 문헌에 기술된 방법에 따라 이.콜라이 균주 JM 83의 염색체로 통합시킨다.
2. FHK12의 작제
PHK12: F' lacZ△M15, lacY+, ProA+B+ara, △(lac-proAB), rpsl,80 d△(lacZM15), attB::ctxDsiglacZ
균주CSH22의 F 에피좀(episome)(trpR, △lac-pro, thi, F'lacZ△M15, lacY+, ProA+B+)은 상기 균주로부터 균주 FHK11로 접합에 의해 이전시킨다. F 에피좀은 Lac 퍼미아제에 대한 유전자(lacY)를 함유하고 염색체성 pro 결실을 보충한다. 그러므로, 암피실린을 함유하는 M9 평판 상에서 접합체를 선별하는 것이 용이하다. 이러한 조건하에서 FHK12는 M9 락토오즈 배지 중에서 그리고 M9 락토오즈 최소 평판 배지상에서 ctx 프로모터의 활성화없이도 성장한다.
실시예 II (레플리콘의 작제)
1. pHKToxREI의 작제
toxR프로모터 및 첫번째 210개 아미노산에 대한 서열 부위를 함유하는 toxR 유전자의 프로모터에 근접한 잔기(참조: 제9도)[참조: V.L. Miller at al.: Cholera toxin transcriptional activator ToxR is a transmembrane DNA binding protein; Cell 48, 271-279 (1987)]를 병원성 비브리오 콜레라에 균주의 세포 용균물로부터 PCR 프라이머 IMG212 및 IMG142를 사용하여 증폭시킨다. 이 반응 생성물은 MluI 및 PstI으로 절단하여 BamHI, MluI 및 PstI(순서대로 표현)에 대한 유일한 제한 절단 부위를 나타내고 있는, MluI/PstI-제한된 pBluescript 유도체 [pBluescript II-pms1'; source, B. Fartmann, Inst. fur Molekulare Genetik der Universitat Gottingen(Gottingen University Institute of Molecular Genetics)]내에 삽입시킨다. 이 작제물로부터 toxR 유전자 서열의 분절(segment)을 함유하는 2kbp의 BamHI/PstI 단편을 분리한다. 병행하여, rei-phoA 융합 유전자(즉, 면역글로불린 도메인 REI에 대한 유전자, 및 알칼린 포스파타제에 대한 유전자)를 함유하는, SalI/XbaI 단편을 벡터 pHKREI[참조: H. Kolmar et al., J. Mol. Biol. 228, 359-365 (1992)]로부터 제거하여 SalI/XbaI-절단된 벡터 pMC△bla[참조. H. Kolmar: On the folding stability of a variant immunoglobulin domain. Eberhard-Karls University, Tbingen, dissertation (1992)] 내에 삽입한다. 수득되는 작제물(pMc△bla-reiphoA)을 BamHI 및 XbaI으로 분해하여, 수득되는 벡터 단편을 ToxR 유전자 서열의 분절을 함유하는 상술한 BamHI/XbaI 단편에 연결시킨다. 수득되는 벡터를 절단하여 말단을 충전시키고 재연결시킴으로써 동시에 도입된 pms 1' 서열의 분절을 제거한다. 면역글로불린 도메인 REI에 대한 유전자를 함유하는, pMc△bla-lacbla-REI로부터의 HindIII 단편(참조: H. Kolmar: 상기 인용)을 수득되는 벡터의 phoA 유전자 하부에 위치하는, 유일한 HindIII 절단 부위내로 삽입한다. 연속해서, rei 유전자의 암호화 서열(참조: Kolmar et al., 1992)을 toxR 유전자의 암호화 서열(코돈 1 내지 210)에 융합시키고, 올리고뉴클레오타이드 IMG166(pHKTox-REI)을 사용하는 부위-지시된 돌연변이유발 방법에 의해, 유전자내 EcoRV 절단 부위를 도입시킨다.
관련된 제한 절단 부위는 밑줄친 부위이며, 한편 비브리오 콜레라에로부터의 toxR 영역에 대해 상보적인 서열의 부위는 굵은 글자체로 강조한다.
벡터 pHKToxREI를 작제하는데 사용된 상기 클로닝 단계의 대략적인 도식은 제3도에 도시된 pHK-Tox-REI의 물리적 및 유전적 지도와 같이 제2도에 나타낸다.
2. pHKToxscFv의 작제
VH도메인의 C 말단이 짧은 펩타이드 링커[(Gly4Ser)3]를 경유하여 VL도메인의 N 말단에 공유적으로 결합되어 있는 페닐 옥사졸론-결합 항체 NQ 10.12.5의 단일쇄 Fv단편(scFv)(참조: Berek et al., 1985; Berek and Milstein, 1987; Sequence: 제4도 참조)은, 그레그 윈터 그룹(Greg Winter's group MRC. Cambridge)에 의해 벡터 pHEN 1 내에 클론된 SfiI/NotI 단편[참조: H.R. Hoogenboom et al.: Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody(Fab) heavy and light chains: Nucl. Acids Res. 19, 4133-4137(1991)] 으로서, 플라스미드 pHEN1::NQ910.12.5scFv 단편의 형태로 유용하게 제조되었다. 초기에 이것은 이의 앞쪽에 위치한 pelB 리더 서열을 포함하는, HindIII/NotI 단편으로서 Bluescript 벡터 pBSK(-) 내에 재클로닝되어, 뉴클레오타이드 서열 분석에 적용된다. 클로닝된 scFv 유전자의 일부 영역은 NQ 10.12.5 서열(참조: Berek et al., 1985)로 공개된 서열과는 현저하게 다르다. 특히 VH및 VL을 암호화하는 영역의 개시부 및 말단의 경우 다르다. 이 영역내에서의 이탈(deviation)은 NQ 10.12.5 세포주로부터 상기 유전자의 증폭시 축퇴성 프라이머를 사용함으로써 가능하다. 이 부위상 및 이 부위에 걸쳐서, 아미노산 교환(VH: 157 → L, T77 → N; VL:K18 → R, T48 → I)이 유발되는 2개의 점 돌연변이 역시 각각의 VH및 VL-암호화 서열내 서열분석에 의해 발견된다[일부 사일런트 염기 교환(silent base change)도 발견됨].
하기 방법은 scFv 유전자를 복구하는데 사용된다:
* VH및 VL을 암호화하는 영역은 우선 PCR을 사용하여 독립적으로 재증폭시킨다. 하기 PCR 프라이머들을 사용함으로써 이들 영역의 개시부 및 말단에서의 서열을 복구시킴으로써 이들이 NQ 10.12.5 서열을 지닌 세포주가 되게 한다.
VHUPC(IMG 258) 66머
VHLO(IMG 256) 83머
VLUP(IMG 257) 37머
VLLO(IMG 259) 49머
VHUP 프라이머를 사용하여, SalI 절단 부위를 VH유전자의 상부에 도입시키고, VHLO 프라이머를 사용하여 BamHI 절단 부위를 일본쇄 링커를 암호화하고 있는 서열의 영역내에 도입시킨다. 또한 VLUP 프라이머를 사용하여 BamHI 절단 부위를 도입시킨다. 최종적으로, VLLO 프라이머를 사용하여 XbaI 절단 부위를 VL유전자의 말단에 도입시킨다.
* 다음, 이들 절단 부위를 사용하여, 증폭된 단편을 독립적으로 pBSK(-) 벡터내에 클로닝시킨다[VH유전자의 개시부에 도입된 SnaBI(평활말단) 절단 부위는, 말단에 EcoRV 절단 부위 (평활 말단)을 지니고 있는 toxR 유전자의 scFV 유전자 하부의 연속적인 클로닝에 필요하다].
* 다음 4개의 잔류하는 점 돌연변이의 복구는 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이유발을 사용하여 독립적으로 클로닝된 단편에서 수행한다. 개개의 돌연변이가 서로 각각으로부터 거리를 두고 있기때문에, 독립적인 복구 올리고뉴클레오타이드가 각 돌연변이유발에 대해 한정되어 있어야 한다. 올리고뉴클레오타이드가 한정되어 있어 돌연변이유발 복구에 영향을 주는 것외에, 제한 절단 부위를 도입시키거나 파괴함으로써 선별을 용이하게 한다.
복구 돌연변이유발에 대한 올리고뉴클레오타이드
VHL571(IMG 260) 32머
VHN77T(IMG 261) 34머
VLR18K(IMG 262) 26머
VL148T(IMG 263) 34머
도입된 점 돌연변이는 굵은 글자체로 강조한다.
* 최종적으로, 이 단편을 일단 일본쇄 링커를 암호화하는 서열내에 위치한 BamHI 절단 부위를 사용하여 함께 다시 클로닝한다.
SnaBi/XbaI 단편(참조, 제4도의 서열)으로서, NQ 10.12.5 scFv 유전자는 EcoRV 및 XbaI으로 분해시킨, 벡터 pHKToxREI 내로 클로닝한다. EcoRV 및 XbaI을 사용하여, REI 및 PhoA를 암호화하는 서열을 이 플라스미드로부터 제거한다. EcoRV 및 XbaI으로 분해한 벡터 pHKToxRei 내에 scFv 유전자의 클로닝은 toxR-scFv 융합 유전자를 생성시킨다.
3. pHKToxVHLphoAVL의 작제
또한, ToxR, 및 항체 NQ 10.12.5의 이중쇄 Fv 단편을 포함하는 융합체를 작제하는데 이 공정에서 VH도메인은 TOXR 단백질의 카복실 말단에 위치하게되는 반면 VL은 가용성 형태로 공발현된다. VL단백질이 주변세포질내로 분비되는 것이 가능케 하기 위해서는, VL유전자가 pelB 리더 서열과 함께 제공되어야 한다[참조: S.-P. Lei et al., (1987): Characterization of the Erwinia carotovora pelB Gene and its product pectate lyase; J. Bacteriol. 169, 4379-4383]. 일본쇄 링커의 제거 및 리더의 삽입은 2개의 연속된 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이 유발의 방법으로써 올리고뉴클레오타이드 pelB1 및 pelB2를 사용하여 수행한다.
PelB1(IMG 306)
PelB2(IMG 307)
제2의 돌연변이유발에 이어서, 정확한 제한 패턴을 나타내는 클론이 수득된다. 그러나, 이 클론의 뉴클레오타이드 서열의 분석은 시그날 펩타이드를 암호화하는 서열중에 2개(각각 1 및 8개의 뉴클레오타이드) 및 VH및 pelBVL사이의 유전자내 영역중 1개(1개의 뉴클레오타이드) 즉, 3개의 결실이 있음을 나타낸다(참조:제5도).
다음 VL유전자 상부의 잘못된 pelB 리더 서열을 알칼린 포스파타제의 리더 서열로써 대체한다[참조: H. Inouye et al.: Signal sequence of alkaline phosphatase of Escherichia coli; S. Bacteriol. 149, 434-439 (1982)]. PCR 프라이머 PhoASigUP 및 PhoASigLO는 이. 콜라이 염색체로부터 phoA 시그날 서열을 증폭시키는데 사용한다.
PhoASigUP(IMG 400), 38머
PhoASigLO(IMG399), 42머
VL와 동종
PhoASi gLO 프라이머의 5' 말단은 VL유전자의 프로모터에 근접한 영역과 동종이므로, phoA 단편은 SOE OPCR의 방법으로써 VL 유전자에 연결할 수 있다. PhoASigUP 프라이머의 5' 말단에서, EcoRI 절단 부위가 phoA-VL SOE PCR 생성물이 VH유전자의 하부로 클로닝되어 생성된다. VHphoAVL작제물의 서열은 제6도에 나타낸다.
4. pHKToxVLphoAVH의 작제
올리고뉴클레오타이드 IMG409-IMG412를 사용하는 PCR을 이용함으로써, VL유전자가 toxR 서열에 융합되어 있고 VH가 phoA 리더 서열과 함께 제공되어 있는 pHKToxVLphoAVH를 작제한다(참조: 제7도).
PhoAUP2(IMG409), 36머
PhoALO2(IMG411), 39머
VHLO2(IMG412), 28머
VLUP2(IMG410), 32머
초기에 phoA 시그날 서열을 암호화하는 영역[참조: H. Inouye et al.: Signal sequence of alkaline phosphatase of Escherichia coli; J. Bacteriol. 149, 434-439(1982)]을 프라이머 PhoAUP2 및 PhoALO2를 사용하여 증폭시킨다. 프라이머 PhoAsigUP 및 PhoASigLO를 사용하여 이.콜라이 염색체로부터 증폭시킨 PCR 산물을 이 공정의 주형으로서 사용한다(참조: 실시예 II.3 "Construction of pHKToxVHPhoAVL"). 프라이머 PhoAUP2의 5' 말단은 VL서열의 말단과 상보적인 반면, 프라이머 PhoALO2의 5' 말단은 VH서열의 첫번째 20개 뉴클레오타이드와 상보적이다. 상보적인 말단은 다음 단계에서 VH및 VL단편을 사용하는 SOE PCR에 필요하다. 더우기, 실제적인 고려(제한 절단 부위에 대한 요구사항)에 기인하여 먼저의 작제물에서 상실된, NQ 10.12.5 VH서열의 N-말단 아스파르테이트 잔기[참조: P.M. Alzari et al.: Three-dimensional structure determination of an anti-2-phenyloxazolone antibody: the role of somatic mutation and heavy/light chain pairing in the maturation of an immune response; EMBO J., 9, 3807-3814 (1990)]는 PhoALO2 프라이머에 의해 재도입된다.
VH및 VL유전자는 프라이머 VHUP와 VHLO2, 및 VLUP2와 VLLO 각각을 사용하여 VHPhoAVL작제물로부터 증폭시킨다. 절단 부위가 도입된 프라이머 VLUP2 및 VHLO2는 클로닝에 필요하다[SalI 및 XbaI은 Bluescript 벡터 pBSK(-) 내에 클로닝하는데 필요하고, EcoRV 및 XbaI은 pHKToxREI 내로 클로닝하는데 필요하다]. 평활-말단 절단 부위는 VL서열의 개시부에서 요구되므로, 동시에 제1 코돈(Gln)을 증폭시키는 것이 가능하지는 않다. ATT 코돈 #2를 ATC(둘다 Ile를 암호화한다)로 교체시킴으로써, EcoRV 절단 부위를 생성시키는 것도 가능하다. 3개의 PCR 산물은 SOE PCR에 의해 각각 서로에 연속적으로 연결시킨다. VLphoAVH작제물의 서열은 제8도에 나타낸다. EcoRV/XbaI 단편으로서, SOE PCR 산물은 벡터 pHKToxREI 내에 클로닝한다. 이 방법에서는 REI 및 PhoA를 암호화하는 서열이 제거되며, VL은 ToxR-암호화 서열과 함께 프레임 내(in-frame)에 융합된다.
실시예 III
ToxR의 전사-활성 도메인 및 면역글로불린 가변성 경쇄를 포함하는 동종이량체 융합 단백질(homodimeric fusion protein)에 의한 시그날 전달
벡터 pHKToxREI를 실시예 II 요점 1에 기술한 바와 같이 작제한다. 이 벡터는 ToxR의 전사-활성 도메인 및 벤스-존스 단백질(Bence-Jones protein) REI의 가변성 면역글로불린 도메인에 대한 유전자를 포함하는 융합 유전자를 함유한다[참조: H. Kolmar et al.: J. Mol. Biol. 228, 359-365 (1992)]. 이 REI 도메인은 동종이량체이다[참조: Epp et al., Eur. J. Biochem. 45, 513-524 (1974)]. 대조군으로서, 벡터 pHKTox-TAG는, 정지 코돈이 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 올리고뉴클레오타이드 IMG167을 사용하여 toxR 및 rei 사이에 삽입되도록 작제함으로써, 이 벡터내에는 REI 도메인을 제외한, 전사-활성 도메인만이 발현된다.
IMG167:
이 벡터를 사용하여 균주 FHK11을 형질전환한 후, 세포질외 REI 도메인의 이량체화(dimerization)에 의해 중재되는 염색체적으로 통합된 ctx 프로모터의 활성화는, 37℃에서 밤새 배양시킨, 연관된 형질전환체내의 β-갈락토시다제 활성을 측정함으로써 결정한다. pHKToxTAG(세포질외 도메인은 상실함)에 대한 효소 활성은 130밀러 단위(Miller unit)인 반면, pHKTox REI에 대해서는 400밀러 단위이며, 이는 전사의 활성화의 대략 3-배에 상응한다. 이 사실은 세포질외성 면역글로불린 도메인의 이량체화가 ToxR-중재된 시그날 전달의 수단에 의해 직접 검출될 수 있음을 입증한다.
상기 이.콜라이 균주 FHK12/pHKToxVLphoAVH는 DSM 8345하에 기탁기관[참조: the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroder Weg 1b, W3300 Braunschweig]에 기탁되었다.
표 1. 페닐옥사졸론-결합 항체 NQ 10.12.5의 단일쇄 Fv 단편(scFv)의 서열.
표 2: 작제물 poxRVHpelBVL의 뉴클레오타이드 서열의 일부: SD:샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열; PelB1 올리고뉴클레오타이드에 의해 삽입된 +++++ 서열; PelB2 올리고뉴클레오타이드에 의해 삽입된 ***** 서열.
표 3: VHphoAVL작제물의 서열.
표 4: VLphoAVH작제물의 서열.
표 5: toxR 유전자의 프로모터에 근접한 분절의 뉴클레오타이드 서열; 추정적 트랜스막 나선 구조는 밑줄이 그어져 있다.
표 6: 사용된 올리고뉴클레오타이드.
표 1
표 1(계속)
표 2
표 3
표 3(계속)
표 4
표 4(계속)
표 5
표 5(계속)
표 6
표 6(계속)
제1도는 이량체 형성에 의한 시그날 전달(signal transduction)에 대한 도식이다.
제2도는 벡터 pHKToxREI을 작제하기 위한 클로닝 단계를 도식적으로 나타낸 것이다.
제3도는 pHKToxREI의 물리적 및 유전적 지도를 나타낸 것이다.
제4도는 작제물 VLphoAVH를 제조하기 위한 PCR 도식을 나타낸 것이다.

Claims (15)

  1. 리간드 결합할 수 있는 단백질이 세포질외에 존재하고 리간드 결합의 시그날이 시그날 전달(signal transduction)에 의해 미생물의 생합성기로 전달되어 이의 기능이 검출 가능하고/하거나 선별 가능하게 발현됨을 특징으로 하는, 리간드 결합할 수 있는 단백질을 미생물내에서 유전적으로 선별하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단백질이 주변세포질(periplasm)에 위치하고, 활성화 시그날이 세포외 리간드와 단백질과의 상호작용에 의해서, 또는 직접 또는 2가 합텐의 도움으로 생성되는 2개 단백질 사이의 상호작용인 주변세포질 단백질의 동종이량체화(homodimerization) 또는 이종이량체화(heterodimerization)에 의해 개시되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시그날 전달이 트랜스막 나선구조(transmembrane helix) 및 세포질에 위치하는 조절성 도메인(domain), 특히 전사 활성화인자 또는 전사 억제인자에 의해 미생물의 생합성기로 전달되는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시그날 전달에 의한 유전적 선별을 위해 적합하게 사용될 수 있고 유전적으로 안정하게 검출 가능하고/하거나 선별 가능한 기능을갖는 미생물이 리간드 결합할 수 있는 단백질, 트랜스막 나선구조 및 조절성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 레플리콘(replicon), 특히 플라스미드, 파아지 게놈 또는 파스미드(phasmid)로 형질전환되고 시그날 전달에 의해 발현되는 기능이 결정되고/되거나 선별되는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 미생물이 이. 콜라이(E. coli)이고, 검출할 수 있고 선별할 수 있는 기능이, 조절가능한 프로모터의 조절하에 있고 검출할 수 있고 선별할 수 있는 기능을 암호화하는 유전자의 발현, 특히 ctx 조절하에 있는 염색체에 통합된 β -갈락토시다제의 발현에 의해 나타나는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 미생물이 FHK11 균주 및 FHK12 균주로부터 선택되는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 리간드 결합할 수 있는 단백질이 면역글로불린, 항원, 수용체 도메인, 리간드 수용체, 특히 호르몬, 효소 및 억제인자로부터 선택되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 단백질이 특히 Fab 단편, Fv 단편, 단일쇄 Fv 단편, 및 경쇄의 단량체 및 동종이량체로부터 선택된 면역글로불린인 방법.
  9. 제4항에 있어서, 트랜스막 나선구조가 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae)의 ToxR 유전자, 프로토종양원성 유전자(protooncogene) C-new, P-new 종양원성 유전자 및 막 결합된 IgM의 트랜스막 나선구조로부터 선택되는 방법.
  10. 제4항에 있어서, 조절성 도메인이 ToxR 단백질의 1 내지 182번 아미노산을 갖는 전사활성화 인자인 방법.
  11. 리간드 결합할 수 있는 단백질, 트랜스막 나선구조 및 조절성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 유전자에 의해 발현될 수 있는 검출 가능하고 선별 가능한 기능을 갖는 이. 콜라이 균주.
  12. 검출 가능하고/하거나 선별 가능한 기능을 통합 벡터의 보조하에 이. 콜라이 균주내로 도입시킴을 포함하는, 제11항에 따르는 이. 콜라이 균주의 제조 방법.
  13. 리간드 결합할 수 있는 단백질, 트랜스막 나선구조 및 조절성 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 레플리콘.
  14. 리간드 결합할 수 있는 단백질, 트랜스막 나선구조 및 조절성 도메인을 암호화하는 DNA 단편들을 융합시킴을 포함하여, 제13항에 따르는 레플리콘을 제조하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, FHK 11 균주 및 FHK 12 균주로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이. 콜라이 균주.
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