KR100310499B1

KR100310499B1 - 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 비율에 영향을 치는 인자를 함유하는 세포소멸 조절 조성물

Info

Publication number: KR100310499B1
Application number: KR1019970703269A
Authority: KR
Inventors: 죠지 안토니 쿼시; 알렝 두토
Original assignee: 빌로 쟝 빠스깔; 갈데르마 리서치 앤 디벨로프먼트
Priority date: 1994-12-29
Filing date: 1995-12-22
Publication date: 2001-12-12
Also published as: AU704064B2; FI972780A0; PL320963A1; NO973034L; AU4451296A; HUT77490A; DK0723778T3; WO1996020701A1; CA2166243A1; MX9704491A; IL116586A0; NO973034D0; AR001783A1; RU2160103C2; PT723778E; ES2147272T3; DE69516107D1; ATE191339T1; PL182597B1; CA2166243C

Abstract

메티오날, 말론디알데히드 및, 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포내 수준에 영향을 미치는 임의의 인자로부터 선택되고, 약제로서 의도된 화합물. 상기 약제는 프로그래밍된 세포사 현상 (세포소멸)를 조절하기 위해 특별히 의도되어 졌다. 본 발명은 또한 세포소멸 조절용 약제학적 또는 화장 조성물에 관한 것으로, 약제학적으로 또는 화장학적으로 허용가능한 지지체와 함께 메티오날 말론디알데히드 및, 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 수준에 영향을 미치는 임의의 인자로부터 선택된 화합물로 이루어진 활성 성분을 함유함을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 광-유도성 또는 경시적인 피부 노화의 예방 및/또는 투항하기 위한 방법을 제공한다.

Description

메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 비율에 영향을 미치는 인자를 함유하는 세포소멸 조절 조성물 {APOPTOSIS-MODULATING COMPOSITION COMPRISING A FACTOR AFFECTING THE INTRACELLULAR RATE OF METHIONAL OR MALONDIALDEHYDE}

세포사에는 2 가지 형태의 메카니즘이 있다. 첫번째는 통상적인 형태인 괴사(necrosis)로 알려져 있다. 형태학적으로 괴사는 미토콘드리아 및 원형질의 팽윤 및 핵 손상을 특징으로 하고, 세포의 붕괴, 및 그의 자가분해가 잇따르고, 이는 염증 현상을 동반한다. 괴사는 수동적이고 우발적으로 일어난다. 조직 괴사는 일반적으로는 예로써 세포의 물리적 외상 또는 화학적 독성에 기인한다.

세포사의 다른 형태는 세포소멸 [Kerr, J.F.R. 및 Wylie, A.H., Br. J.Cancer,265, 239 (1972)] 로 알려져 있으나, 괴사와 대조적으로 세포소멸은 염증 현상을 낳지 않는다. 상기 문헌에는 다양한 생리학적 조건 하에 어떻게 세포소멸이 일어나는지가 기재되어 있다. 그것은 쉽게 관찰가능한 형태학적이고 생화학적 현상을 특징으로 하는 세포 자멸의 고도의 선택적 형태이다. 따라서, 엔도누클레아제 활성, 아포프틱 바디의 형성 및 디옥시리보핵산 (DNA) 의 분획화와 연관될 수도 또는 연관되지 않을 수도 있는 크로마틴이 엔도누클레아제의 활성에 의해 180 - 200 개 염기쌍의 DNA 분획 (이 분획들은 아가로스 겔상의 전기영동으로 관찰할 수 있음)으로 축합됨이 특히 관찰된다.

세포소멸은 조직 발육, 분화 및 생체항상성과 관련된 세포의 프로그래밍된 세포의 사멸로 간주될 수 있다. 따라서, 세포의 분화, 성장 및 성숙은 세포소멸과 밀접하게 연관되어 있다. 따라서, 건강한 사람에게는 모든 이러한 현상 사이에 평형 상태가 존재한다.

의학 분야에서, 일정한 수의 병리학적 상황은 변형된, 또는 심지어 불균형적인 세포소멸 메카니즘, 또는 평형 상태에 도달하는데 또다른 생물학적 현상의 불균형을 제공하지 않는 세포소멸 메카니즘을 나타낸다. 따라서, 세포소멸을 유도하거나 억제하므로써 세포소멸의 자발적 조절은, 많은 질병, 보다 특히 암, 자동면역 질병 또는 알레르기와 같은 세포 과증식과 관련된 질병, 또는 그 반대로, 인간 면역 결핍 비루스 (HIV), 신경퇴화 질병 (알쯔하이머병), 및 심근 경색 또는 대뇌 허혈 병변 중에 유도되는 과도의 손상의 경우와 같이, 세포 손실과 연관된 질병의 치료를 가능케할 수 있다는 것이 기재되어 있다.

종양학에서는 매우 명확한 방법으로, 아드리아마이신 및 시클로포스프아미드와 같은 많은 항암제가 세포소멸을 유도할 수 있음이 관찰되었다.

화장 분야에 있어서, 피부 노화의 표시는 특히 세포소멸 메카니즘을 포함하여 세포의 주요 생물학적 메카니즘의 기능 장애로부터 주로 기인된다. 따라서, 세포소멸 메카니즘을 조절하는 어떠한 생성물도 노화의 시작, 및 주름과 미세한 선과 같은 노화의 존재 표시를 예방 및/또는 투항할 수 있는 생성물인 것으로 생각될 수 있다.

그러나, 세포에 대해 외인성 또는 내인성인 생성물과, 세포소멸을 유도하거나 억제하는 그들의 반응사이의 연관성은 알려져 있지 않다.

본 출원인은 자연 대사물인, 메티오날 (3-메틸티오프로판알) 또는 말론디알데히드의 세포 내 수준을 증가시킴으로써 세포소멸을 유도할 수 있음을 밝혀 내었다. 또한, 본 출원인은 메티오날의 말론디알데히드로의 생체내 전환이 bcl₂유전자와 같은 종양 유전자의 발현에 의해 불균형화될 수 있다는 것을 발견하였다. 상기 bcl₂유전자가 특히 세포내, 보다 특히 신경세포내의 반응성 산소-함유 종에 의해 유도된 세포소멸을 억제할 수 있는 것으로 기재되어 있다 [Kane, D.J. 등, 1993, Science 262, 1274 - 1277].

본 발명은 의약품으로 사용하기 위한, 메티오날, 말론디알데히드, 및 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 수준에 영향을 미치는 임의의 인자로부터 선택된 화합물에 관한 것이다. 상기 의약품은 보다 특히 세포의 프로그래밍된 세포사 현상 (세포소멸 ; apoptosis) 를 조절하기 위한 것이다.

본 발명은 또한 세포소멸을 조절하는 조성물에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 피부의 광-유도 또는 경시적인 노화를 예방 및/또는 투항하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 의약품으로서 사용하기 위한, 메티오날, 말론디알데히드, 및 메티오날이나 말론디알데히드의 세포 내 수준에 영향을 미치는 임의의 인자로부터 선택된 화합물에 관한 것이다. 상기 의약품은 보다 특히 프로그래밍된 세포사 현상을 조절하기 위한 것이다.

본 발명의 목적은 또한 세포소멸을 조절하는 약제학적 또는 화장 조성물이고, 그것은 활성제로서 메티오날, 말론디알데히드, 및 메티오날이나 말론디알데히드의 세포 내 수준에 영향을 미치는 임의의 인자로부터 선택된 화합물을 약제학적으로 또는 화장학적으로 허용가능한 지지체와 조합하여 함유함을 특징으로 한다.

메티오날, 말론디알데히드, 및 메티오날의 세포 내 수준에 영향을 미치는 임의의 인자는 본 발명에서 단독으로, 또는 바람직하게는 혼합물로서 사용될 수 있다. 분명하게, 생성물의 선택은 의도된 목적, 특히 세포소멸을 유도하거나 세포소멸을 억제하려는 목적에 근거를 둔다.

따라서, 본 발명의 한 특정 구현예에 따르면, 세포소멸을 유도하는 조성물은 그것이 활성제로서 메티오날, 말론디알데히드, 및 메티오날이나 말론디알데히드의 세포 내 수준을 증가시키는 임의의 인자로부터 선택된 화합물을 약제학적으로 또는 화장학적으로 허용가능한 지지체와 조합하여 함유함을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 세포소멸 억제 조성물은 활성제로서 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 수준을 감소시키는 임의의 인자를 약제학적으로 또는 화장학적으로 허용가능한 지지체와 조합하여 함유함을 특징으로 한다.

메티오날의 대사에 있어서, 4-메틸티오-2-옥소부탄산이 간, 심장 및 골격근 세포의 미토콘드리아 안에 존재하는 측쇄 옥소-산 탈수소효소 착물에 의해 메티오날을 경유하여 생체내 대사되어 메틸티오프로피오닐CoA를 생성할 수 있다는 것이 공지되어 있다 [참고 : Wu, G. & Yeaman, S. J. (1989) Biochem. J. 257, 281 - 284 ; Haussinger, D., Stehle, T. & Gerok, W. (1985) J. Biol. Chem. 366, 527 - 536 ; Jones, S.M.A. & Yeaman, S.J. (1986) Biochem. J. 237, 621 - 623]. 또한, 4-메틸티오-2-옥소부탄산이 아민교환반응에 의해 메티오닌으로 생체내 대사될 수 있다는 것이 기재되어 있다 [참조 : Ogier, G., Chantepie, J., Deshayes, C., Chantegrel, B., Charlot, C., Doutheau, A. & Quash, G. (1993) Biochem. Pharmacol. 45, 1631 - 1644]. 메티오날은 또한 알데히드 환원효소에 의해 메티오놀로, 또는 알데히드 탈수소효소에 의해 메틸티오프로피온산으로 각기 환원 또는 산화될 수 있다. HO·라디칼과 조합하여, 메티오날은 β-히드록실화 반응에 의해 최종적으로 말론디알데히드 및 메탄티올을 생성할 수 있다.

따라서, 메티오날, 말론디알데히드 및 그들의 세포 내 수준에 영향을 미치는 인자를 잘 정리하여 표시하기 위해서, 도 1 은, 본 발명의 범위를 국한하지 않으면서, 메티오날의 대사를 예시한다.

도 1 에서 ;

- MTOB는 4-메틸티오-2-옥소부탄산을 나타내고 ;

- MTPA는 메틸티오프로피온산을 나타내며 ;

- E1은 조인자가 티아민 피로포스페이트 (TPP) 인 측쇄 옥소-산 탈수소 효소 착물의 디카르복실라제를 나타내고 ;

- E2는 조인자가 티옥트산 (TA) 인 측쇄 옥소-산 탈수소효소 착물의 트랜스아실라제를 나타내며 ;

- ALDR은 알데히드 환원효소를 나타내고 ;

- ALDH는 알데히드 탈수소효소를 나타낸다.

본 발명에 있어서, 표현 "메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 수준에 영향을 미치는 인자" 는 메티오날 또는 말론디알데히드의 전구체 및 생성물, 및 메티오날 또는 말론디알데히드의 대사와 관련된 효소의 억제제 및 활성제로 부터 선택된 화합물을 일컫는 것으로 이해되어진다. 그러므로, 도 1 에 예시된 메티오날 또는 말론디알데히드의 대사적 측면에서, 상기 화합물인, 메티오날 또는 말론디알데히드가, 세포계로 도입되는 경우, 일시적 또는 장기적 방법으로 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포내 수준을 조절한다는 것을 용이하게 알 수 있다.

메티오날 또는 말론디알데히드 전구체 또는 생성물은, 4-메틸티오-2-옥소부탄산, 메티오닌, 메티오놀, 메틸티오프로피온산 및 메틸티오프로피오닐CoA와 같은, 메티오날의 세포내 대사의 전구체 또는 생성물일 수 있다.

메티오날 또는 말론디알데히드 전구체 또는 생성물은 또한, 메티오날 또는 말론디알데히드 그 자체, 또는 4-메틸티오-2-옥소부탄산으로 대사되어질 4-메틸티오-2-히드록시-부탄산을 유리시키는 메티오날 또는 말론디알데히드의 에스테르 및 티오에스테르와 같은, 메티오날 또는 말론디알데히드를 유리시키거나 또는 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포내 수준에 영향을 미치는 인자를 유리시키는 성능을 가지는 생성물일 수 있다. 약제학적 분야에서, 상기 생성물은 집합적으로 "프로드러그 (prodrug)" 로 알려져 있다.

세포소멸을 유도하고자 하는 경우, 메티오날, 말론디알데히드, 또는 메티오날이나 말론디알데히드의 전구체나 생성물은, 상기 β-히드록실화 반응 (메티오날을 말론디알데히드로 전환) 외에 메티오날의 제거를 촉진하는 대사 반응과 관련된 효소 억제제와 조합하여, 또는 메티오날을 말론디알데히드로 전환하는 것과 관련된 효소인 β-히드록실라제의 활성제와 조합하여 유리하게 사용된다. 따라서, 4-메틸티오-2-옥소-부탄산과, 하기 나타낸 억제제와 같은 4-메틸티오-2-옥소부탄산의 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제의 조합을 언급할 수 있다.

또한, 메티오날 또는 메티오날의 세포내 수준을 증가시키는 인자와 유리 라디칼 HO·의 수준을 증가시키는 화합물을 조합하는 것을 들 수 있다. 따라서, 글루타티온 환원 효소 억제제인, BCNU (N,N-비스(2-클로로에틸)-N-니트로스우레아)를 들 수 있는데, 이에 의해 β-히드록실화 반응의 기질 중 하나인 HO·라디칼과 같은 반응성 산소-함유 종의 세포내 수준을 증가시킬 수 있다.

상기 조합은 bcl2 유전자의 과발현을 특징으로 하는 병리의 경우에 특히 유리하다. 이러한 병리는 특히 유방암, B-세포 임파종, 백혈병, 네오로블라스토마 (neoroblastoma), 전립선암, 프로랙틴종 및 기타 하수체 선종이다. bcl2 유전자의 과발현은 세포에 화학적 내성을 부여한다. 따라서, 상기 조합은 상기 화학적 내성을 부분적으로, 또는 심지어 전적으로 억제시킬 수 있게 한다.

유리하게는, 하기 기재된 것들 및 보다 특히 화학식 9의 화합물과 같은, 4-메틸티오-2-옥소부탄산의 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제를 하나 이상 상기 조합에 첨가할 수 있다.

메티오날의 대사와 관련된 효소의 억제제 또는 활성제 중에서, 특히 4-메틸티오-2-옥소부탄산의 메티오날을 경유한 메틸티오프로피오닐CoA 로의 전환과 관련된 측쇄 옥소-산 탈수소효소 착물의 억제제 또는 활성제, 4-메틸티오-2-옥소부탄산의 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제 또는 활성제, 또는 메티오날을 메티오놀로 환원시키는 알데히드 환원효소 또는 메티오날을 메틸티오프로피온산으로 산화시키는 알데히드 탈수소효소의 억제제 또는 활성제, 또는 선택적으로는 메티오날의 말론디알데히드로의 전환과 관련된 효소인 β-히드록실라제의 활성제 또는 억제제를 들 수 있다.

따라서, 측쇄 옥소-산 탈수소효소 착물의 억제제로서, 및 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포내 수준을 감소시키는 인자로는, 상기 착물의 공지된 기질인 2-옥소부티레이트 [참조 : Jones, S,M.A. & Cederbaum, A. I. (1980) Arch. of Biochem. and Biophys., 199, 438 - 447] 뿐 아니라 상기 착물의 다른 기질인 케토루이신, 케토이소루이신 및 케토발린을 들 수 있다.

4-메틸티오-2-옥소부탄산의 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제로서, 및 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포내 수준을 증가시키는 인자로는, 문헌 [Ogier, G., Chantepie, J., Deshayes, C., Chantegrel, B., Charlot, C., Doutheau, A & Quash, G. (1993) Biochem. Pharmacol., 45, 1631 - 1644] 에 기재된 생성물을 들 수 있다.

보다 구체적으로, 4-메틸티오-2-옥소부탄산의 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제는 하기 화학식 1 내지 9 의 화합물로부터 선택된다 :

[상기 식 중에서, X는 -OH 라디칼 또는 -OPO₃H₂라디칼을 나타낸다].

화학식 9 의 화합물(식중, X 가 -OH 라디칼을 나타낸다)이 특히 바람직하다.

4-메틸티오-2-옥소부탄산의 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제로서, 및 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포내 수준을 증가시키는 인자로는, 화학식 CONHOHCH₂CHNH₂COOH 의 D-아스파라긴 히드록사메이트, 및 화학식 CONHOHCH₂CH₂CHNH₂COOH 의 L-글루타민 히드록사메이트와 같은 아미도 아미노산의 히드록사메이트를 또한 언급할 수 있다.

세포소멸을 유도하고자 하는 경우, 본 발명에 따라 메티오날, 말론디알데히드, 메티오날 또는 말론디알데히드의 에스테르 또는 티오에스테르와 같은 메티오날 또는 말론디알데히드를 그 자체로 유리시키는 성능을 갖는 생성물, 또는 메티오날의 말론디알데히드로의 전환과 관련된 효소의 활성제로부터 선택된 화합물을 사용하는 것이 바람직하다.

세포소멸을 유도하는데 특히 유리한 혼합물 중에서, 4-메틸티오-2-옥소부탄산의 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 하나 이상의 억제제, 바람직하게는 화학식 9의 혼합물과 메티오날의 조합을 들 수 있다.

세포소멸을 억제하고자 하는 경우, 본 발명에 따라 2-옥소부티레이트와 같은 메티오날 또는 말론디알데히드의 생성과 관련된 효소의 억제제 및/또는 상기 언급된 β-히드록실화 반응 이외에 메티오날 제거와 관련된 효소의 활성제를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 조성물은 보다 특히 하기 치료를 목적으로 한다 :

1) 분화 및 과증식으로 인한 케라틴화 장애와 관련된 피부 질환의 치료, 특히 일반 좌창, 여드름, 다형핵 백혈구, 주사비, 결절낭 좌창, 중한 담낭 좌창, 노인성 좌창 및, 태양, 치료 관련 또는 전문적 좌창과 같은 이차적 좌창의 치료,

2) 다른 형태의 케라틴화 장애, 특히 어린선, 어린선상 상태, 다리에병, 쌍족저 각피증, 류코플라시아 (leucoplasia) 및 류코플라시아스상 상태, 및 피부나 점액질 (협측) 의 태선 치료,

3) 염증 및/또는 면역알레르기성 성분으로 인한 케라틴화 장애, 특히 피부, 점액질 또는 조의 건선이든지 상관없이 모든 형태의 건선, 특히 건선 류마티즘, 또는 선택적으로는 습진과 같은 피부 아토피 또는 호흡기 아토피 또는 선택적으로는 치은 이상비대과 관련괸 피부 질환의 치료 ;

4) 양성이든지 악성이든지 간에, 또한 비루스성이든 간에 구강 또는 개화성 유두종증 및 자외선에 의해 유발되는 과증식, 특히 염시성 세포 및 유극세포의 상피종증에 또한 원인이 될 수 있는 일반 우, 편평 우 및 우상 표피이형성과 같은 모든 피부 또는 표피 과증식의 치료,

5) 수포증 및 콜라겐 질병과 같은 다른 피부학적 질병의 치료,

6) 특정한 안과학적 질병, 특히 각상병의 치료,

7) 광-유도성 또는 경시적인 노화에 상관없이 피부의 노화 치료 또는 투항, 또는 방사선성 각질과 착색, 또는 경시적 또는 방사산성 노화와 관계된 모든 병리의 감소,

8) 국부 또는 전신적 부신피질 스테로이드에 의해 유도된 표피 및/또는 피부 위축, 또는 모든 다른 형태의 피부 위축의 징후의 예방 또는 치료,

9) 반흔화 장애의 예방 또는 치료, 또는 비비스(vibice) 의 예방 또는 치료,

10) 좌창의 피지 과잉분비 또는 단순 지루와 같은 피지 기능의 장애의 투항,

11) 암 또는 전암 상태의 치료 또는 예방,

12) 관절염과 같은 염증성 질환의 치료,

13) 간염과 같은 비루스성의 모든 일반적 또는 피부 질환의 치료,

14) 탈모증의 예방 또는 치료,

15) 면역학적 성분을 가진 피부학적 또는 일반적 질환의 치료,

16) 동맥경화증 및 혈소판 감소증과 같은 심혈관 질환의 치료,

17) 알쯔하이머병과 같은 신경퇴화 질병의 치료.

상기 치료 분야에 있어서, 본 발명에 따른 조성물은 유리하게 레티노이드, 항-유리-라디칼 제제, 비타민 D 유도체, 부신피질스테로이드 또는 오에스토로겐, 항산화제, α-히드록시이나 α-케토산 또는 그것들의 유도체와 같은 기타 활성 제제, 또는 선택적으로는 칼슘-채널 블록커를 함유할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 세포소멸을 조절하기 위한, 보다 특히 상기 기재된예방 및/또는 치료적 처치를 위한 화장학적 또는 약제학적 조성물의 제조에 있어서 또는 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물의 용도이다.

레티노이드는 천연 또는 합성 원일 수 있다. 언급될 수 있는 레티노이드 중에는 9-시스-레티노산 및 all-트랜스-레티노산이 있다.

언급될 수 있는 비타민 D 또는 그의 유도체 중에는 특히 비타민 D₂또는 D₃, 및 특히 1,25-디히드록시비타민 D₃이 있다.

특히 언급될 수 있는 항-유리-라디칼 제제 중에는 α-토코페롤, 수퍼옥시드 디스무타제, 유비퀴놀 및 특정한 금속-킬레이트화제가 있다.

언급될 수 있는 α-히드록시 또는 α-케토산, 또는 그들의 유도체 중에는 특히 케노루이신, 케토이소루이신, 케토발린, 2-옥소부티레이트, 4-메틸티오-2-옥소부탄산, 락트산, 말산, 시트르산, 글리콜산, 만델산, 타르타르산, 글리세르산, 아스코르브산 또는 살리실산 유도체 또는 그들의 염, 아미드 또는 에스테르가 있다.

특히 언급될 수 있는 칼륨-채널 블록커 중에는 미녹시딜 (2,4-디아미노-6-피페리디노피리미딘-3-옥시드) 및 그의 유도체가 있다.

본 발명에 따른 조성물은 장내로, 비경구로, 국소적으로 또는 눈에 투여할 수 있다. 바람직하게는 조성물은 전신적인 용도에 적합한 형태 (주사용 또는 주입용)로 포장된다.

장내 경로를 통해서는, 조성물, 보다 특히 약제학적 조성물은 정제, 젤라틴 캡슐, 당-코팅 정제, 시럽, 현탁제, 용액, 분제, 과립, 유탁제, 마이크로구 또는나노구, 또는 방출 조절 가능한 중합 또는 지질 부형제의 형태일 수 있다. 비경구적 경로를 통해서는, 조성물은 주사용 또는 주입용 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 의약품은 일반적으로 1 내지 3 회 분량하여, 약 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg/체중 kg의 일일 투여량으로 투여된다.

국소 경로를 통하여는, 본 발명에 따른 조성물은 보다 특히 피부 및 점막의 치료를 위한 것으로, 연고, 크림, 유제, 살브 (salve), 분제, 함침 패드, 용액제, 겔, 분무제, 로션 또는 현탁제의 형태일 수 있다. 또한, 그것은 마이크로구 또는 나노구 또는 중합 또는 지질 부형제 또는 방출 조절 가능한 중합성 및 히드로겔의 형태일 수 있다. 상기 국소-경로 조성물은 무수 형태 또는 수성 형태일 수 있다.

눈을 통한 경로에는, 그것들은 주로 점안제이다.

국소적 또는 안구용 약제학적 조성물은 메티오날, 말론디알데히드, 또는 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 수준에 영향을 주는 임의의 인자를 바람직하게는 조성물의 총 중량에 대해 0.001 내지 5 % 의 농도로 함유한다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 화장 분야, 특히 바디 및 헤어위생에 있어서, 특히 좌창으로의 경향을 가진 피부 타입의 처리, 모발 재생의 촉진, 탈모 방지, 태양의 해로운 영향으로부터의 보호, 또는 생리적으로 건조한 피부 타입의 처리 및 광-유도성 또는 경시적인 노화의 예방 및/또는 투항을 위해 이용된다.

마지막으로, 본 발명의 목적은 피부의 광-유도성 또는 경시적인 피부 노화의 예방 및/또는 투항하는 방법으로, 상기 기재된 바와 같은 세포소멸을 유도하는 화장 조성물을 피부에 사용함을 특징으로 한다.

화장 분야에서, 본 발명에 따른 조성물은 유리하게 레티노이드, 비타민 D 나 그의 유도체, 부신피질스테로이드, 항-유리-라디칼 제제, α-히드록시 또는 α-케토산 또는 그의 유도체, 또는 선택적으로는 이온-채널 블록커를 함유할 수 있고, 본 발명의 조성물에 이용되는 상기 다양한 생성물은 상기 정의된 바와 같다.

본 발명에 따른 화장 조성물은 특히 크림, 유제, 로션, 겔, 마이크로구나 나노구 또는 중합이나 지질 부형제, 비누 또는 삼푸의 형태일 수 있다.

화장 조성물 내의 메티오날, 말론디알데히드, 또는 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 수준에 영향을 주는 임의의 인자의 농도는 바람직하게 조성물의 0.0001 내지 3 중량 % 이다.

또한 본 발명에 따른 약제학적 또는 화장 조성물은 비활성 첨가제 또는 심지어 약역학적 또는 화장학적 활성 첨가제, 또는 상기 첨가제들의 조합, 및 특히 : 습윤제 ; 히드로퀴논, 아젤라산, 카페인산 또는 코지산과 같은 탈안료제 ; 유연화제; 글리세롤, PEG 400, 티아모르폴리논 및 그의 유도체, 또는 우레아제와 같은 보습제 ; S-카르복시메틸시스테인, S-벤질시스테아민, 그의 염과 유도체 또는 벤조일 퍼옥시드와 같은 항-지루 또는 항-좌창 제제 ; 에리트로마이신과 그의 에스테르, 네오마이신, 클린다마이신과 그의 에스테르 및 테트라시클란과 같은 항생제 ; 케토코나졸 또는 4,5-폴리메틸렌-3-이소티아졸리논과 같은 항균제 ; 미녹시딜 (2,4-디아미노-6-피페리디노피리미딘 3-옥시드)와 그의 유도체, 디아족시드 (7-클로로-3-메틸-1,2,4-벤조티아디아진 1,1-디옥시드) 및 페니토인 (5,4-디페닐이미다졸리딘-2,4-디온)과 같은 모발의 재생 촉진용 제제 ; 비-스테로이드계 항염증제 ; 카로테노이드 및, 특히 β-카로틴 ; 아트랄린과 그의 유도체와 같은 항건선제 ; 및 마지막으로 에이코사-5,8-11,14-테트라이노산 및 에이코사-5,8,11-트리이노산과 그의 에스테르 및 아미드를 함유할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 조성물은 풍미증진제, 파라-히드록시벤조산 에스테르와 같은 보존제, 안정화제, 수분 조절제, pH 조절제, 삼투압 조절제, 유화제, UV-A 와 UV-B 차단제, 및 α-토코페롤, 부틸히드록시아니졸 또는 부틸히드록시톨루엔과 같은 항산화제를 함유할 수 있다.

하기 실시예는 예시를 위한 것으로, 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

HeLa 세포의 성장에 대한 대사산물의 효과

HeLa 세포 (페트리디쉬 당 0.5 x 10⁶) 를 10 중량 % 의 투석된 소 태아 혈청을 함유하는 3 ml 의 이글 최소 필수 배지에서 배양한다. 4 시간 후에, 메티오날 (10 μM∼1 mM), 메티오놀 (10 μM∼20 mM), 메틸티오프로피온산 (MTPA) (1μM∼20 mM), L-메티오닌 (1 μM∼20 mM) 또는 4-메틸티오-2-옥소부탄산 (MTOB) (1 μM∼20 mM) 을 세 개의 디쉬에 각기 첨가한다. 37℃에서 3일 후에, 세포들을 pH 7.5 의 포스페이트-완충염액 배지 (PBS 배지) 에서 2회 세척하고, 동일한 형태의 완충액으로 회수한다.

비스벤즈이미드 트리히드로클로라이드 (Hoechst 33258)의 용액을 이용하여 용균액 중의 단백질 함량 (참조 : Lowry, O.H., Rosebrouh, N.J., Farr, A.L. & Randall, R.J. (1951) J. Biol. Chem., 193, 265 - 275) 또는 DNA 함량 (참조 : Jarvis, W.D. Kolesnick, R.N., Fornari, F.A., Traylor, R. S., Gewirtz, D.A. & Grant, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 91, 73-77)을 측정하거나, 또는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 (MTT)를 사용하여 락테이트 탈수소효소 활성을 결정함으로써 (참조 : Mosmann, T. (1983) J. of Immunology. Methods 65, 55 - 63), 세포 증식을 평가한다.

그 결과가 표 1 에 대조되어 있다. 주어진 각 수치는 단백질 함량에 의해 평가된 3 또는 4 회 실험의 평균치이다.

IC50 은 세포 증식의 50 % 억제하는데 필요한 생성물의 농도에 상응한다.

DNA 함량을 측정하거나 락테이트 탈수소효소의 활성을 결정함으로써 평가된 결과는 상기 표에서 수득된 것들에 필적한다.

상기 표는 메티오날의 생성물 또는 전구체의 IC50 값에 대한 메티오날의IC50 의 차이를 나타낸다.

실시예 2

HeLa 세포 (페트리디쉬 당 0.5 x 10⁶) 를 10 중량 % 의 투석된 소 태아 혈청을 함유하는 3 ml 의 메티오닌 비함유 (Met^-) 이글 최소 필수 배지에서 배양한다. 4 시간 후에, 2 mM 의 4-메틸티오-2-옥소부탄산 (MTOB) 의 존재하에 2-옥소부티레이트 (10 μM ∼ 40 mM)를 첨가한다. 37℃에서 3 일 후에, 그 세포들을 pH 7.5 의 포스페이트-완충염액 배지 (PBS 배지) 에서 2 회 세척하고, 동일한 형태의 완충액으로 회수한다. 세포 증식을 상기 실시예와 동일한 방법으로 측정한다.

2-옥소부티레이트는 측쇄 옥소-산 탈수소효소 착물 (BCOADC) (Km 18 μM)에 대한 공지된 기질이다. MTOB 는 2 mM에서 단독으로 증식의 72 % 억제를 유도한다. 이 결과는 2-옥소부티레이트가 상기 증식 억제를 제거하는 성능을 가짐을 보여준다. 10 mM의 2-옥소부티레이트 농도로부터, 억제는 2배에서 3배 감소된다. 따라서, MTOB 의 메티오날로의 전환을 위한 BCOADC 의 활성이 2-옥소부티레이트와 같은 다른 기질로 옮겨하므로써 증식 억제가 감소됨이 관찰된다.

실시예 3

BAF3 세포 내의 DNA 단편에 대한 메티오날의 효과

사용되는 세포는 성장하기 위해 인터류킨 3 (IL3)을 필요로 하고, 16 시간 동안 IL3 부재 시에 세포소멸 (세포의 80 % 초과) 을 수행하는 BAF3 쥐의 임파구 세포선에 해당한다 (참조 : Collins, M.K.L., Marvel, J., Malde. P. & Lopez-Rivas, A. (1992) J. Exp. Med., 176, 1043 - 1052).

3 x 10⁶BAF3 세포를 알데히드 탈수소효소의 기질인 여러 가지 농도 (200 - 800 μM)의 메티오날 또는 프로판알 존재 하에 페트리디쉬에 IL3을 함유하는 6 ml 의 배양 배지 내에 배양한다. 8 시간의 접촉 시간 후에, 세포를 pH 7.5 의 포스페이트-완충염액 배지 (PBS 배지) 에서 3 회 세척한다. 상기 세포를 2 ml 의 0.1 % Triton X-100, 200 mM 의 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), 5 mM 의 트리스 pH 8에서 용해시킨 후, 4℃에서 30 분간 30,000 g 에 원심분리한다. 상청액을 따라 내어 하기 분석을 실시한다.

비교를 위해, IL3 만을 함유하거나 (-IL3) 또는 IL3이 없는 (-IL3) 배지에서 동일한 배양액을 제조한다.

- 수득된 DNA 단편의 정성분석은 특히 문헌 [Jarvis. W.D., Kolesnick, R.N., Fornari, F.A., Traylor, R.S., Gewirtz, D.A. & Grant, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 91, 73-77] 에 기재된 방법에 따라 수행한다. 상청액을 37℃에서 1 시간 동안 리보누클레아제 A (20 ㎍/ml) 및 단백질분해효소 K (100 ㎍/ml)로 처리한다. DNA 를 페놀로 추출하여 정제하고, 에탄올로 침전시킨다.

최종 추출에서, DNA 저분자량 단편을 1 % 아가로스 겔상에서 전기영동하므로써 분석한다. 전기영동 (60 V, 3 시간) 후에 겔을 에티디움 브로마이드로 염색한다.

그 결과는 세포소멸이 메티오날로 유도되고 ; 수득된 겔이 세포소멸 유도의전형인 180 내지 200 개 염기쌍의 DNA 다중 단편 규모상을 가짐을 보여준다. 프로판알의 경우에는, 겔이 상기 특성을 갖지 않는다.

- 분광형광 분석을 수행하여, 수득된 DNA 단편 (< 3 킬로염기)의 양을 측정한다. 3 mM 의 염화나트륨중의 1 ml 의 비스벤즈이미드 트리히드로클로라이드 (Hoechst 33258) (1 ㎍/ml), 1 mM 의 EDTA 및 10 mM 의 트리스 pH 8을 2 ml 의 상청액에 첨가한다. 수득된 용액을 형광기로 분석한다 (여기 λ = 365 nm, 방출 λ= 460 nm). DNA 의 양을 고도로 정제된 DNA (2 ml 의 용해 완충액 중에 0.1 내지 1 ㎍)에 상대적으로 계산하고, 상기 나타낸 바와 같이 처리하여 3 x 10⁶세포로부터 회수된 10^-9g 의 DNA 로 나타낸다.

하기 표 2 에 대조된 결과가 수득된다.

따라서, IL3 및 메티오날로 처리된 세포내에서 발견된 DNA 단편의 양 증가는 세포가 IL3-비함유 매질에 있는 경우에 확인된 바와 유사하다.

실시예 4

반응성 산소-함유 종 (H ₂ O ₂ 및 HO·)의 생성에 대한 BCNU 및 4-메틸티오-2-옥소-부탄산의 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제의 효과

IL3 [6 % 의 소 태아 혈청이 함유된 Dulbecco 의 변형된 이글 매질 및 IL3 원으로서 사용된 Wehi-3B 세포로 컨디셔닝한 5 % 매질 (이 매질은 문헌 (Collins 등, (1992) J. Exp. Med., 176, 1043 - 1051) 에 기재되어 있음)]을 함유하는 3 ml 의 배지에 접종된 1.5 x 10⁵BAF3 세포 (상기 기재된 세포선) 를 10 μM의 2',7-디클로로플루오레세인 디아세테이트 (하기 DCFH-DA 로 칭함, Molecular Probes Inc. 로부터 수득)로 처리한다. 37℃ 에서 1 시간동안 항온배양한 후, 세포를 PBS 완충액으로 세척한다. 유동 시토미트리에 의한 디클로로플루오레세인 (DCF) 의 형광 분석하기 10분 전에, 3 ㎍/ml 의 프로피듐 브로마이드를 첨가한다. 여러가지 농도의 BCNU 의 존재 하, 및 50 μM의 화합물 A (이는 X 가 -OH 라디칼을 나타내는 화학식 9의 화합물에 대응함)의 존재 또는 부재 하에 항온배양을 수행한다. 이 방법으로써 반응성 산소-함유 종 (H₂O₂및 HO·)과 DCFH-DA 와 반응시킴으로써 수득되는 형광 % 를 수득할 수 있다. 유동 시토미트리는 FACScan 유동 시토미터 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 로 수행한다.

결과가 하기 표 3 에 대조되어 있다.

따라서, 상기 결과는 메티오날의 수준을 증가시킬 수 있는 화합물 A 가 BCNU 의 농도 증가로 인해, HO·의 증가를 억제한다는 것을 보여준다. 따라서, 메티오날이 존재하는 HO·라디칼과 반응하여 말론디알데히드를 생성하므로써 세포소멸이 유도되는 개연성이 크다.

실시예 5

세포소멸에 대한 BCNU 및 4-메틸티오-2-옥소-산 부탄산의 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제의 효과

DNA 가닥 절단을 문헌 [Gorczyca 등, (1993) Cancer Res., 53, 1945 - 1951] 에 기재된 바와 같이 말단 디옥시누클레오티딜 DNA 트랜스퍼라제 (TdT) 시험을 이용하여, 투과성화되고 고정된 세포에 바이오틴-처리된 dUTP (아비딘 플루오레신으로 검출) 그 자체로 처리한다.

1.5 x 10⁶BAF3 세포 (상기된 대로의 세포선)를 IL3 을 함유하는 3 ml 의 배지 [6% 의 소 태아 혈청이 함유된 Dulbecco 의 변형된 이글 배지 및 IL3 원으로서사용된 Wehi-3B 세포로 컨디셔닝한 5 % 매질] 에 접종한다. 50 μM 의 화합물 A, 40 ㎍/ml 의 BCNU, 상기 두 생성물의 혼합물 (50 μM 의 화합물 A + 40 ㎍/ml 의 BCNU)의 존재 하에 또는 상기 두 화합물의 부재하에 (대조군), 세포를 항온배양한다. 24 시간 동안 항온배양한 후, 세포를 PBS 완충액으로 세척하고, 포름알데히드 및 에탄올로 차례로 고정하고, -20℃에서 3 일 동안 방치한다. 이어서, 세포를 0.1 μM 의 나트륨 카코딜레이트, pH 7.5, 1 mM COCl₂, 0.1 mM 의 디티오트레이톨, 0.05 mg/ml 의 BSA (소 혈청 알부민), 10 유니트의 TdT (송아지 흉선 유래 ; Boehringer), 0.5 nmol 의 비오틴-16dUTP (송아지 흉선 유래 ; Boehringer), 0.5 nmol 의 dATP, 0.5 nmol 의 dCTP 및 0.5 nmol 의 dGTP 를 함유하는 50 ㎕의 용액에 37℃에서 1 시간 동안 재현탁시킨다. PBS 로 세척한 후, 세포를 실온의 어두운 곳에서 30 분간 2.5 ㎍/ml 의 아비딘-플루오레세인 이소티오시아나이트 (Sigma), 0.1 % (w/v) 의 RNA아제 A, 0.1 % 의 Triton X-100 및 5 % (w/v) 의 탈지유를 함유하는 100 ㎕ 의 4 x SSC 완충액 (0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨) 에 재현탁시킨다. 이 세포들을 세척한 후, 3 ㎍/ml 의 프로피듐 요오드를 함유하는 1 ml 의 PBS 에 현탁시킨다. 유동 시토미트리를 FACScan 유동 시토미터 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 로 수행한다.

결과가 하기 표 4에 대조되어 있다.

이 투여량에서, 단독으로 사용되는 생성물들은 약하게 세포소멸을 유도하는 반면, 그것들의 혼합물은 강하게 세포소멸을 유도한다 (시너지 효과).

이 결과는 표 3 의 결과 및 그에 대한 결론을 확증해 준다.

실시예 6

흑색종 세포를 이식한 쥐를 치료하는데 가장 효과적인 치료 조합의 결정

t = 0 일인 때, 10⁵B16 F1 쥐 흑색종 세포를 B6D2F1 쥐 (프랑스 IFFA Credo 사 유래) 로 주사한다. t = 1 일, 및 15 일 동안 연속적으로, 쥐들에게 하루에 한 번 하기 표 3 에 명시된 다양한 치료 양생법으로 주사한다. 대조군은 치료 양생법을 따르지 않는 쥐에 해당한다.

표 5 는 3 마리의 처리된 쥐에 대한 결과의 평균에 해당하는 결과를 대조하고 있다.

다중-화합물 양생법을 위해, 사용되는 각 화합물의 투여량은 화합물을 단독으로 사용하는 양생법의 경우와 동일하다.

생존 시간을 상기 나타낸 t = 0 일로부터 계산하고, 60일을 초과 생존하지 않는 쥐들의 평균에 상응한다.

BCNU 는 N,N-비스(2-클로로에틸)-N-니트로소우레아에 해당한다.

화합물 A 는 X 가 -OH 라디칼을 나타낼 때의 화학식 9의 화합물에 해당한다.

따라서, 마지막 두 양생법이 실질적으로 그 쥐들의 생존 시간을 늘리므로 특히 효과적이다. 상기 두 양생법 중에서, 맨 나중의 양생법 (메티오날이 추가공급된 것) 은 쥐들중 1/3 이 60 일 초과하여 생존할 수 있도록 하였다.

실시예 7

이 방법은 양생법 및 처리되는 쥐의 수를 변화시키면서, 상기 실시예에서와 같이 수행된다. 표 6 은 수득된 데이터 및 결과를 대조하였다.

생존 시간을 상기 나타낸 t = 0 일로부터 계산하고, 60 일을 초과 생존하지 않는 쥐의 평균에 상응한다.

마지막 양생법의 경우, 투여량은 단독으로 사용되는 화합물의 양에 해당한다.

장기간 생존 동물의 % 는 60 일 초과 생존하는 쥐의 % 에 상응한다.

따라서 마지막 두 양생법, 특히 맨 나중 양생법이 특히 효과적이라는 것을 알았다.

실시예 8

BAF3-bO 및 BAF3-bcl2 세포에서의 세포소멸의 유도에 대한 메티오날의 효과

사용된 세포는 상기 기재된 BAF3 임파구 세포선에 해당한다. BAF3-bcl2 세포는 bcl2 유전자로 트랜스팩션된 BAF3 세포에 해당하고, BAF3-b0 세포는 bcl2 유전자로 트랜스팩션되지 않은 BAF3 세포에 해당한다. 상기 명시된 바와 같이, BAF3-b0 세포는 16 시간 동안 IL3 의 부재 하에 세포소멸을 겪는다 (세포의 80 % 이상). 한편, bcl2 유전자로 트랜스팩션되지 않은 bcl2 세포는 IL3 의 부재 하에세포소멸의 표시를 보이지 않는다. 따라서, 그것들은 이 세포들에서 제지된 세포소멸 단계 및 그의 말론디알데히드의 합성 억제와의 가능한 상관 관계를 결정하기 위한 좋은 모댈을 구성한다.

2.5 x 10⁵세포/ml 를 0.5 μCi [3H]-티미딘과 함께 37℃에서 40 시간 동안 배양함으로써 BAF3-b0 또는 BAF3-bcl2 세포를 문헌 [Wright, S. 등, (1992) J. of Cell. Biochem, 48, 344 - 355] 에 기재된 방법을 이용하여 표지시킨다. 배양 배지로 2 회 세척한 후, 2.5 x 10⁶세포를 메티오날 존재 하에 배양한다. 8 시간 동안 항온배양한 후, 그 세포들을 5 분 동안 400 g 에서 원심분리하고, PBS 완충액에서 3 회 세척한다. 펠렛에서 회수된 세포를 2 ml 의 0.1 % Triton X-100, 20 mM EDTA, 5 mM 트리스 pH 8 에서 용균시키고, 4℃에서 30 분간 30,000 g 로 원심분리한다. 상청액을 회수하고, 펠렛을 0.3 ml 의 0.5 N NaOH 에 용해시킨다. 배지 (1 ml), 상청액 (0.3 ml) 및 가용화된 펠렛 (0.1 ml) 의 분주를 검정용 신틸레이션 계수기에 위치시킨다. DNA 단편의 % 를 하기 방법으로 계산한다 :

DNA 단편의 % = (배양배지 dpm + 상청액의 dpm) / (배양배지의 dpm + 상청액의 dpm + 가용화된 펠렛의 dpm)

결과 : 배양 배지에 첨가되는 메티오날 농도의 증가 (0 ; 50 ; 100 ; 200 ; 300 ; 400 μM)는, 메티오날로 처리되지 않은 BAF3-b0 세포 (대조군) 의 경우 7 % 에 비해 400 μM 의 메티오날에 대해서는 DNA 단편의 퍼센트를 최대 26 % 까지 증가시킨다. 동일 농도의 메티오날로 처리된 BAF3-bcl2 세포의 경우, DNA 단편은,대조군의 경우의 3 % 에 비해 메티오날의 경우 최대 400 μM 까지 도달한다.

이 결과는 메티오날의 첨가로써, BAF3-bc12 세포 내의 bcl2 유전자로 인한 세포소멸 억제가 제거됨이 가능해지는 것이 아님을 명확히 보여준다.

IL3 결핍에 의한 세포소멸 유도 중에, HO·의 보조로 β-히드록실화 반응에 의해 메티오날이 말론디알데히드로 전환됨이 밝혀졌다. 따라서, BAF3-bo 및 BAF3-bcl2 세포내의 H₂O₂및 HO·의 검정을 수행하였다.

실시예 9

유동 시토미트리 방법에 의한 반응성 산소 -함유 종 (H ₂ O ₂ 및 HO·) 의 측정

사용된 세포는 상기 BAF3 임파구 세포선에 해당한다. BAF3-bcl2 세포는 bcl2 유전자로 트랜스팩션된 BAF3 세포에 상응하고, BAF3-b0 세포는 bcl2 유전자로 트랜스팩션되지 않은 BAF3 세포에 상응한다.

IL3 을 함유하는 3 ml 의 배양 배지에 접종된 1.5 x 10⁶BAF3-b0 또는 bcl2 세포를 10 μM 의 디클로로플루오레세인 디아세테이트 (DCFH-DA) 로 처리한다. 37℃에서 1 시간 동안 항온배양한 후, 세포를 PBS 완충액으로 세척한다. 유동 시토미트리에 의한 디클로로플루오레세인 (DCF)을 형광 분석하기 10 분 전에, 실시예 4 에서와 같이, 3 ㎍/ml 의 프로피듐 요오드를 첨가한다. 유동 시토미트리는 FACScan 유동 시토미터 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 로 수행한다.

결과가 하기 표 7 에 나와 있다.

결과적으로 BAF3-bc12 세포가 BAF3-b0 세포보다 더 강한 반응성 산소-함유 종을 가지고 있는 경향이 있으나, 이 차이는 상당하지 않다.

따라서, BAF3-bcl2 세포는 메티오날 및/또는 말론디알데히드의 합성에 결점을 가질 수 있다.

실시예 10

BAF3-b0 및 BAF3-bcl2 세포에서의 [ ¹⁴ C]MTOB 유래의 ¹⁴ C-라벨 생성물의 분석

이에 사용되는 세포는 상기 실시예의 것과 동일하다.

문헌 [Ogier G. 등, (1993) Biochem. Pharmacol., 45, 1631 - 1644] 에 기재된 대로 [¹⁴C]MTOB 를 [¹⁴C]-메티오닌의 산화 탈아민화에 의해 제조한다. 6 % 의 소 태아 혈청 및 5 % 의 IL3 을 함유하는 DMEM 중의 BAF3-b0 세포 및 BAF3-bcl2 의 세포 현탁액 (2.4 x 10⁵세포/ml) 에 [¹⁴C]MTOB (38.2 nmol 에 상응하는 5 x 10⁶dpm) 을 첨가한다. 39 시간 후에, 세포를 PBS 에 2 회 세척하고, 9 x 10⁵세포/ml 의 농도 재현탁한다. [U¹⁴C]MTOB (14.5 nmol 에 상응하는 1.9 x 10⁶dpm]을 10⁸개 세포에 첨가하고, 8 시간 후에 그 세포를 5 분 동안 400 g 에서 원심분리하여 회수한다. 세포 펠릿을 60℃에서 30 분 동안 1.5 ml 의 0.5 N NaOH 로 가용화한다. 세포 내에 존재하는 총 방사능을 10 ㎕ 분량에 대해 측정한다. 그 다음, 과염소산을 최종 농도가 0.5 N 가 되도록 수득된 알칼리성 가수분해물에 첨가하고, 이어서 200 μmol 의 2,4-DNPH (2,4-디니트로페닐히드라진 ; Merck 사제) 를 첨가한다. 그 혼합물을 70℃에서 30 분간 가열한 후, 5 분 동안 400 g 로 원심분리한다. 침전물을 1 ml 의 0.5 N NaOH 중에 가용화하고, 방사능 및 단백질 함량을 결정한다. pH 10 의 NaOH 를 상청액에 첨가한다. 표지된 대사산물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기층을 건조하고, 산성화하여, 디클로로메탄으로 추출한다. 유기층 내의 표지된 대사산물을 분리해내고, HPTLC (고성능 박층 크로마토그래피) 로 관측하여, 참조 화합물인 2,4-DNPH 유도체와 비교한 후, 광범위한 방사선크로마토그래피로 정량한다.

결과가 하기 표 8 에 나와 있다 :

- Radio. 는 세포 중에 존재하는 총 방사능을 의미한다.

- MDA 는 말론디알데히드를 의미한다.

따라서, 동량의 DNA 에 관한 총 방사능은 47 시간 동안 항온배양한 후의 두 가지 형태의 세포 내에서와 유사함을 알 수 있다. 세포 단백질의 메티오닌 활성의 경우와 동일하다. 유리 메티오닌에 있어서는, BAF3-b0 세포와 비교할 때, BAF3-bc12 세포에서 방사능의 40 % 증가가 관찰된다. 메티오날에 존재하는 방사능은 BAF3-bc12 세포에서보다 BAF3-b0) 세포에서 80 % 더 높다. 이로써, BAF3-bc12 세포에서, MTOB 로부터의 메티오날의 형성의 감소가 메티오닌의 형성의 부수적 증가를 동반함이 증명가능하다. 표지된 MDA 의 형성을 측정할 때, 이는 BAF3-b0 세포 내의 800 dpm/DNA mg 에 상응하는 반면, BAF3-bc12 세포 추출물에서는 MDA 의 어떠한 방사능도 검출되지 않았다. 따라서 BAF3-bc12 세포도 또한 메티오날로부터의 MDA 형성의 감소를 보인다. 실시예 8은 이러한 감소가 BAF3-b0 세포에 비해 BAF3-bc12 세포에서 반응성 산소-함유 종의 감소에 기인하지 않음을 명백히 보여준다.

이에 MTOB 의 메티오날로의 전환 감소와 더불어, bc12 유전자 또한 메티오날이 말론디알데히드로 전환하기 위한 β-히드록실화 반응에 네가티브하게 작용하는 것으로 결론내릴 수 있다. 따라서, 메티오날 또는 그의 대사 생성물인 말론디알데히드이 세포 내 수준을 조절하는 임의의 생성물을 세포소멸 조절물질로 간주할 수 있다.

Claims

약제학적으로 허용가능한 지지체와 조합하여,

- 메티오날;

- 말론디알데히드; 및

- 4-메틸티오-2-옥소부탄산, 메티오닌, 메티오놀, 메틸티오프로피온산 및 메틸티오프로피오닐 CoA, 또는 메티오날, 말론디알데히드 또는 상기 인자를 유리시킬 수 있는 메티오날 또는 말론디알데히드의 에스테르 및 티오에스테르 와 같은 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포내 대사산물; 및 i) 4-메틸티오-2-옥소부탄산으로부터 메티오날을 경유한 메틸티오프로피오닐CoA 로의 전환과 관련된 측쇄 옥소-산 탈수소효소 콤플렉스의 억제제 또는 활성제, ii) 4-메틸티오-2-옥소부탄산에서 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제, iii) 메티오날에서 메티오놀로의 환원을 이행하는 알데히드 환원효소 또는 메티오날에서 메틸티오프로피온산으로의 산화를 이행하는 알데히드 탈수소효소의 억제제, 및 iv) β-히드록실라제의 활성제 또는 억제제로부터 선택되는 메티오날 또는 말론디알데히드의 대사에 관련된 효소의 억제제 또는 활성제로부터 선택되는 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 수준을 증가시키는 인자

로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 활성성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 세포소멸(apoptosis)을 유도하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 활성성분인 메티오날, 말론디알데히드 또는, 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 수준을 증가시키는 인자가 혼합물 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 수준을 증가시키는 인자가 하기 화학식 1 내지 9 의 화합물로부터 선택되는 4-메틸티오-2-옥소부탄산에서 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제임을 특징으로 하는 약제학적 조성물 :

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[식들 중에서, 식 X 는 -OH 또는 -OPO₃H₂을 나타낸다].
제 3 항에 있어서, 4-메틸티오-2-옥소부탄산에서 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제가 화학식 9 (식중, X 는 -OH 라디칼을 나타낸다) 의 화합물인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 수준을 증가시키는 인자가, 아미도 아미노산의 히드록사메이트로부터 선택된, 4-메틸티오-2-옥소부탄산에서 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 메티오날, 말론디알데히드 및, 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포내 대사산물로부터 선택된 화합물과 β-히드록실라제 활성제와의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 4-메틸티오-2-옥소부탄산과 제 3 항 내지 제 5 항중 어느 한 항의 4-메틸티오-2-옥소부탄산에서 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제와의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 제 3 항 내지 제 5 항중 어느 한 항의 4-메틸티오-2-옥소부탄산에서 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제와, BCNU 와 같은 유리 라디칼 HO·의 수준을 증가시키는 하나 이상의 화합물과의 조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 메티오날, 및 제 3 항 내지 제 5 항중 어느 한 항의 4-메틸티오-2-옥소부탄산에서 메티오닌으로의 전환과 관련된 트랜스아미나제의 억제제와, BCNU 와 같은 유리 라디칼 HO·의 수준을 증가시키는 하나 이상의 화합물과의조합으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 지지체와 조합하여, 2-옥소부티레이트, 케토루이신, 케토이소루이신 및 케토발린과 같은 측쇄 옥소-산 탈수소효소 착물의 억제제, 또는 메티오날의 생성과 관련된 효소의 억제제 및/또는 메티오날의 제거와 관련된 효소의 활성제와 같은 메티오날 또는 말론디알데히드의 세포 내 수준을 감소시키는 인자를 활성성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 세포소멸을 억제하는 약제학적 조성물.