KR100308361B1 - 길항 펩티드의 gnrh 제조를 위해 유용한 구아니디노또는변형된구아니디노기를함유하는페닐알라닌유도체또는동족체의제조방법 - Google Patents

길항 펩티드의 gnrh 제조를 위해 유용한 구아니디노또는변형된구아니디노기를함유하는페닐알라닌유도체또는동족체의제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100308361B1
KR100308361B1 KR1019950705738A KR19950705738A KR100308361B1 KR 100308361 B1 KR100308361 B1 KR 100308361B1 KR 1019950705738 A KR1019950705738 A KR 1019950705738A KR 19950705738 A KR19950705738 A KR 19950705738A KR 100308361 B1 KR100308361 B1 KR 100308361B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
amino
gnrh
acid
group
Prior art date
Application number
KR1019950705738A
Other languages
English (en)
Other versions
KR960703110A (ko
Inventor
에이. 호거 카알
이. 에프. 리비에르 진
에스. 포터 존
Original Assignee
더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 filed Critical 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈
Publication of KR960703110A publication Critical patent/KR960703110A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100308361B1 publication Critical patent/KR100308361B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/20—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups containing any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom, e.g. acylguanidines
    • C07C279/24—Y being a hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C277/00—Preparation of guanidine or its derivatives, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C277/08—Preparation of guanidine or its derivatives, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups of substituted guanidines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/28—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to cyano groups, e.g. cyanoguanidines, dicyandiamides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C313/00—Sulfinic acids; Sulfenic acids; Halides, esters or anhydrides thereof; Amides of sulfinic or sulfenic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfinic or sulfenic groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C313/08—Sulfenic acids; Derivatives thereof
    • C07C313/18—Sulfenamides
    • C07C313/26—Compounds containing any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • C07C313/30—Y being a hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/08—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles
    • C07D249/10—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D249/14—Nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/006—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length of peptides containing derivatised side chain amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 건조 전뇌하수체에 의해 고나도트로핀의 분비를 억제하거나 촉진하고, 생식선에 의해 스테로이드의 방출을 억제하는 펩티드내로 혼입될 수 있는 인공 아미노산을 제조하는 방법에 관한것으로 이 방법은, 식(i)를 갖는 α-아미노산을 :-(CH2)j - CHNH2COOH (여기서, j는 1,2, 또는 3) α-아미노산의 각 몰에 대해 적어도 약 2몰의 HNO3를 갖는 진한 질산, 진한 황산, 및 상기 아미노산을 포함하는 반응 혼합물을 형성하고, 약 5℃ 이하의 온도에서 이 반응 혼합물을 유지시키므로써 니트로화 조건에 적용시켜, 이 니트로화가 4-위치에서 주로 일어나게 하고, 적당한 약제와 상기 4NO2-치환 생성물을 반응시켜 상기 α-아미노산에 아미노-보호기를 첨가시키고, 상기 보호된 아미노산을 처리하여, 상기 치환된 니트로 부분을 수소첨가시키고, 그를 아미노 부분으로 변형시키며, 적합한 용매내에 상기 수소첨가된 아미노산을 용해시키고, 그를 디페닐시아노카르본이미데이트와 반응시켜, 친핵성 부분과 반응성인 시아노구아니디노 중간체를 형성하여, 구조식(a) 또는 구조식(b)를 갖는 원하는 인공 아미노산을 생성하는 것으로 구성된다.

Description

[발명의 명칭]
길항 펩티드의 GnRH 제조를 위해 유용한 구아니디노 또는 변형된 구아니디오기를 함유하는 페닐알라딘 유도체 또는 동족체의 제조 방법
본 발명은 NH2Phe 같은 디아미노 산으로 부터 유도된 신규한 인공 아미노산의 제조에 관한 것으로, 이 아미노산은 생물학적으로 활성인 펩티드의 합성에서 유용하다. 보다 특별히, 본 발명은 상기 인공 아미노산을 갖는 펩티드를 제조하는 것에 관한 것으로, 이 펩티드는 보호된 인공 아미노산을 생성하고나서, 표준 사슬 연장 합성 방법의 일부로서 상기 펩티드내로 그것을 혼입하므로써 제조된다.
이들 인공 아미노산은 생식 기능 및 스테로이드 호르몬, 프로게스테론 및 테스토스테론의 방출을 억제하는 GnRH 길항제 (antagonist) 및 또한 상기 스테로이드의 방출을 촉진하는 GnRH 작용제 (agonist)펩티드를 형성하는데 특히 유용하다.
[발명의 배경]
건조 전뇌하수체는 시상하부로서 공지된 뇌의 기저부 영역에 경(莖)(stalk)에 의해 부착된다. 특히, 때때로 고나도트로핀 또는 고나도트로핀 호르몬으로 언급되는 난포자극호르몬 (FSH) 및 황제화 호르몬 (LH)이 건조 전뇌하수체에 의해 방출된다. 이들 호르몬은 함께, 정소에서 테스토스테론을 생성하고 난소에서 프로게스테론 및 에스토로겐을 생성하는 생식선의 기능을 조절하고, 그들은 또한 생식체의 생식 및 성숙을 조절한다.
건조 전뇌하수체 전엽에 의해 호르몬이 방출되므로써, 일반적으로 시상하부에 의해 생성된 또다른 부류의 호르몬을 먼저 방출하게 한다. 시상하부 호르몬 중 하나는 고나도트로핀 호르몬, 특히 LH 의 방출을 일으키는 요인으로서 작용하고, 이 호르몬은, LH-RH 및 LRF 라고 언급되기도 하지만, 본원에서는 GnRH 로서 언급된다. GnRH 는 약 20년 전에 분리되어 아미노기 10개를 함유하는 펩티드로 밝혀졌고, 하기 식 :
pGly-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
을 갖는 [D-Ala6]-GnRH (미합중국 특허 제 4,072,668 호) 같은, 6-위치에서 Gly 대신에 D-이성질체를 갖는 GnRH 의 유사체는 시험관내 및 생체내 모두에서 천연 호르몬보다 더 큰 생물학적 효력 및 수용체에 대해 보다 큰 결합 강도를 갖는다고 알려졌다.
펩티드는 하나의 산의 카르복실기가 다른 산의 아미노기에 결합된 둘 이상의 아미노산을 함유하는 화합물이다. 상기 표현된 바와 같이, GnRH 에 대한 식은 아미노 말단이 왼쪽에 나타나고 카르복실 말단이 오른쪽에 나타나는 펩티드의 통상의 표현에 따른 것이다. 아미노산 잔기의 위치는 왼쪽으로부터 오른쪽까지 아미노산 잔기에 번호를 매기므로써 확인된다. GnRH 의 경우에, C-말단에서 글리신의 카르복실기의 히드록실 부분은 아미노기 (NH2)로 치환된다. 즉 C-말단은 아미노화 된다. 상기 개개의 아미노산 잔기에 대한 약자는 통상적인 것이고, 아미노산의 종명을 기준으로 한다. 예컨대 pGlu 는 피로글루탐산이고, Glu 는 글루탐산이고, His 는 히스티딘이고, Trp 은 트립토판이고, Ser 은 세린이고, Tyr 는 티로신이고, Gly 는 글리신이고, Leu 는 로이신이고, Nle 는 노르로이신이고, Orn 은 오르니틴이고, Arg 은 아르기닌이고, Har 는 호모아르기닌이고, Pro 는 프톨린이고, Sar 는 사르코신이고, Phe 는 페닐알라닌이고, Ala 는 알라닌이고, Val 은 발린이고, Nva 는 노르발린이고, Ile 는 이소로이신이고, Thr 은 트레오닌이고, Lys 는 리신이고, Asp 는 아스팔트산이고, Asn 은 아스파라긴이고, Gln 은 글루타민이고, Met 는 메티오닌이다. 글리신을 제외하고, 인용된 아미노산은 달리 지적되지 않는 한 L-배치를 가지는 것으로 이해되어야 한다.
포유동물 암컷에서 배란을 막고자 하는 이유가 있고, GnRH 의 정상 기능에 대한 길항제인 GnRH 유사체의 투여는 배란을 억제하거나 지연하는데 사용되어 왔다. 이 이유 때문에, GnRH 에 대한 길항제인 GnRH 의 유사체는 임신조절제로서 또는 수태 기간을 조절하기 위한 그들의 잠재적 사용에 대해 연구되고 있다. GnRH 길항제는 또한 조발청춘기 및 자궁내막증식증의 치료를 위해 사용될 수 있다. 상기 길항제는 또한 포유동물 수컷에서 고나도트로핀의 분비를 조절하는데 유용한 것으로 알려졌고, 정모세포발생을 정지시키는데, 예컨대 수컷 성 병원체 및 전립선 비대의 치료를 위해 수컷 임신조절제로서 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, GnRH 길항제는 스테로이드-의존 종양, 예컨대 전립선 및 유방 종양을 치료하는데, 및 시험관내 수정을 위한 배란 시기를 조절하는데 사용될 수 있다. 암컷에서, 그들은 또한 조모증, 자궁내막증식증, 월경전기 증후군 (PMS)등을 치료하는데 사용될 수 있다.
반면, LH 및 FSH 의 방출을 촉진하는데 있어서 GnRH 와 같은 방식으로 기능하는 GnRH 작용제 및 보다 큰 생효력 및/또는 보다 긴 작용 기간을 보이는 작용제가 가치있는 것으로 고려된다.
펩티드 유사체내로 인공 아미노산을 치환시키므로써, 생물학적 활성을 향상시키는 인공 아미노산을 제조하는 방법이 특히 흥미롭다. 내인성 GnRH 에 대해 강한 길항제이고 포유동물의 생식선에 의한 스테로이드 방출 및 LH 및 FSH 분비를 막는, 또는 GnRH 의 강한 작용제인 개선된 펩티드를 사슬 연장 방법에 의해 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이 또한 바람직하다.
[발명의 요약]
본 발명은 인공 아미노산을 제조하고 제조된 이 인공 아미노산을 사용하여 펩티드를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 이후에 서술된 바와 같이, 변형된 구아니디노기 또는 구아니디노 상등물, 또는 변형된 구아니디노기를 한층 더 정제(elucidation)하므로써 얻어진 유도체를 함유하고, 가장 바람직하게 트리아졸 또는 치환된 트리아졸기를 함유하는 측쇄를 갖는 α-아미노-보호된 아미노산이 합성된다.
이들 아미노산은 사람을 포함하는 포유동물에서 고나도트로핀의 방출을 억제하는 펩티드를 제조하고, 또한 GnRH 의 강한 작용제이고 포유동물의 재생산 과정을 촉진하는데 사용될 수 있는 개선된 GnRH 유사체를 제조하는데 유용하다.
본 발명은 하기 일반식 U＊:
를 갖는 보호된 인공 아미노산 또는 그의 헤테로시클릭 전위체를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 상기식에서, X1은 α-아미노 보호기이고; j 는 1,2 또는 3 이고; R1은 H, CH3또는 CH2CH3이고; R2는 알킬 (C1-C6), 시클로헥실, 또는 -(CH2)P-R3이다. 이때, p 는 0-6 사이의 정수이고, R3는 메틸, 에틸, 페닐, 피리디닐, 피리미디닐, 푸리닐, 이미다졸릴, 인돌릴, 나프틸, NHR4(이때, R4는 H 또는 CH3임) 또는 OH 이다.
바람직하게, 인공 아미노산을 생성하는 방법은 일어나는 임의 헤테로시클릭 전위를 포함하는 하기 일반식 (a)∼(d) 중 하나를 갖는다 :
상기식에서, X1은 α-아미노 보호기이고; j 는 1-3 사이의 정수이고; R1은 H, CH3또는 CH2CH3이고; R2는 알킬 (C1-C6), 시클로헥실, 나프틸, 피리딜, 피리미딜, 피라지닐, 인돌릴, 퀴놀리닐 또는 이미다졸릴이다 ;
상기식에서, X1은 α-아미노 보호기이고; j 는 1-3 사이의 정수이고; R5는 H, 메틸 또는 에틸이고; R6은 H 또는 아실 (C1-C6)이다;
상기식에서, X1은 α-아미노 보호기이고; j 는 1-3 사이의 정수이고; M1은 NR7또는 NH-(CH2)p-R8(여기서, p 는 0-3 사이의 정수이고, R7는 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고; R8은 0 또는 desR8임)이고; R9는 H 또는 알킬 (C1-C6)이다; 및
상기식에서, X1은 α-아미노 보호기이고; j 는 1-3 사이의 정수이고; M1은 NR7또는 NH-(CH2)p(여기서, p 는 0-3 의 정수이고, R7은 메틸, 에틸, 프로필, 또는 페닐임)이다.
보다 바람직하게, 방법은 하기 일반식을 가진 아미노산을 제조하기 위해 수행된다 :
상기식에서, X1및 p 는 앞서 정의된 바와 같다. 상기 아미노산은 표준 사슬 연장 방법에 의해 GnRH 유사체 및 매우 다양한 다른 펩티드를 합성하기 위해 L- 및 D- 이성질체 모든 형태로 사용될 수 있다.
초기에 아미노-변형된 Phe 또는 그의 동류체의 주요 아미노 기능은 적당한 약제로 적당히 보호된 아미노산을 처리함으로써 변형된다. 이들 아미노산은 광범위하게 시아노구아니딘으로서 언급되고, 하기 디페닐 시아노카르본이미데이트 (Ⅰ)와 아미노기를 반응시키므로써 제조된다 :
상기식에서, "Q" 는 식 U＊의 일부로서 상기 묘사된 아미노산같은 측쇄 주요 아미노기를 갖는, 적당히 보호된 α-아미노기를 갖는 아미노산의 주요 부분을 광범위하게 나타내는데 사용된다.
그리고나서, N-치환-N-시아노-O-페닐이소우레아 일부(Ⅱ)를 갖는 아미노산은 제 2 친핵체 HXR2와 반응하므로써 한층더 관능화되어, 하기 일반식(Ⅲ)을 갖는 시아노구아니딘-함유 아미노산을 생성한다 :
예컨대,
예컨대, HXR = H2N-CH2-피리딘일때, 결과는 :
이 기는 또한 (IUPAC 명명법으로) N-g-시아노-N-g'-3-메틸피리딜구아니디노로서 언급될 수 있다.
상기 화합물은 산성 조건하에 가수분해되어, 또한 생효력적인 화합물을 생성하는데 사용될 수 있는 아미노산을 생성할 수 있다.
예컨대 :
-XR 이 제 2의 친핵 자리를 함유하고, X 가 일반 형태 : M1-(OH2)p-M2(여기서, p 가 0, 1, 2, 또는 3 일때 M1은 NR' 이고, M2는 NH, O 또는 NR" 임)를 가질때 시클릭 부분이 생긴다. 상기 친핵체의 예는 H2NNH2, CH3HNNH2, CH3HNNHCH3, H2NOH, 및 H2N-CH2-CH2OH 를 포함한다. 이 경우에, 형성된 시아노구아니딘 부분은, 하기와 같은 시아노기와 오메가 아미노기를 반응시키므로써 초기의 중간체로 부터 형성된 상응하는 헤테로사이클 (V)로 전환된다 :
예컨대, -XR2= -HNNH2이면,
게다가, -XR = -CH3NNHCH3이면,
이후에 상기 지시된 바와 같이 가수분해될 수 있다.
일반적으로, 이들 인공 아미노산은 GnRH 의 길항제 또는 작용제인 펩티드를 합성하기 위해 사용된다. 즉 그들은 사람을 포함하는 포유동물의 건조 전뇌하수체에 의해 고나도트로핀의 분비를 강하게 억제하거나, 상기 분비 또는 방출을 강하게 촉진한다. 이들 펩티드는 3- 위치, 5-위치, 6-위치 및/또는 8-위치에서 식 U＊의 하나 이상의 인공 아미노산을 함유하는 GnRH 의 유사체이다. U＊가 3- 및/또는 6-위치에 존재할때, 그것은 항상 D-이성질체의 형태로 존재하는 반면; U＊가 5- 및/또는 8-위치에 존재할때, 그것은 항상 L-이성질체의 형태로 존재한다.
[바람직한 실시양태의 상세한 설명]
앞서 언급된 바와같이, 인공 아미노산 (L- 또는 D-이성질체일 수 있음)은 하기 식 U＊에 의해 표현된다 :
상기 식에서, X1, j, R1및 R2는 앞서 정의된 바와 같다. α-아미노기는 적합한 보호기, 예컨대 BOC에 의해 치환되어, 그것은 C-말단에서 시작하는 펩티드를 합성하기 위한 사슬-연장 방법의 일부로서 직접 사용된다. 본 발명에 의해 제조된 아미노산을 사용하여 생성된 전형적인 펩티드 각각에, 적어도 하나의 D-이성질체가 존재한다.
보다 특별하게, 생효력적인 GnRH 길항제가 하기 식(F1)에 의해 표현된다:
G-AA1-(A)D-Phe-AA3-Ser-AA5-AA6-AA7-AA8-Pro-AA10
상기 식에서, G는 수소 또는 7 이하의 탄소 원자를 갖는 아실기이고; AA1은 디히드로Pro, D-pGlu, (A) D-Phe, (B) D-Trp, Pro, 또는 β-D-NAL이고; A는 H, Cl, F, NO2, CH3, OCH3, CaMe/4Cl, Cl2또는 Br이고; B는 H, NO2, NH2, OCH3, F, Cl, Br, CH3, NinFor 또는 NinAc이고; AA3는 U＊, D-PAL, β-D-NAL 또는 (B) D-Trp 이고; AA5는 U＊, Tyr, (C) Arg, Lys(cpd), Orn (cpd), Dbu (cpd), Dpr (cpd), (A) Phe, (3I) Tyr 또는 His이고; AA6은 U＊, β-D-NAL, (B) D-Trp, (A') D-Phe, (D) D-Orn, (D) D-Lys, (D) D-Dbu, (D) D-Dpr, D-Har, D-Tyr, (E) D-His, D-PAL, (C) D-Arg 또는 적합한 지방친화성 D-이성질체이고; A'은 A, NH2, NHCH3또는 gua이고; C는 H 또는 저급 알킬이고; D는 G, cpd 또는 아릴기이고; E는 H, imBzl 또는 디니트로페놀이고; AA7은 Nle, Leu, NML, (A)Phe, Met, Nva, Tyr, (B) Trp 또는 PAL 이고; AA8은 U＊, (C')Arg, (C')Har 또는 ILys 이고; C'은 H 또는 디-저급 알킬이고; AA10은 D-Ala-NH2, Gly-NH2, AzaGly-NH2또는 NH(R) 이고; R은 저급 알킬, 바람직하게 CH2CH3이고; U＊은 상기 정의된 바와 같다. AA1이 β-D-NAL 이고, AA5가 Arg이 아닐 때, AA6은 바람직하게 U＊, 4-NH2-D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His, 4-gua-D-Phe, D-PAL 또는 D-Arg 이다.
디히드로Pro는 3,4-디히드로프롤린, C5H7O2N을 의미한다. β-D-NAL은 β-탄소 원자가 나프틸에 의해 치환된 아닐린의 D-이성질체, 즉 3-D-NAL을 의미한다. 바람직하게 고리 구조의 2-위치에서 나프탈렌에 부착되는 β-D-2NAL이 이용되나; β-D-1NAL이 또한 사용될 수 있다. 바람직한 1-위치 잔기는 β-D-NAL, 치환된 D-Phe, 및 임의로 치환된 D-Trp 이다. PAL은 β-탄소 원자가 피리딜에 의해 치환된 알라닌을 나타내고; 바람직하게 피리딘 고리의 3-위치에 결합된다. U＊가 5-위치에 존재하지 않을 때, 그것은 바람직하게 Tyr, Arg 또는 Lys (cpd) 이다. NML은 NαCH3-L-Leu을 의미한다. Dbu는 알파, 감마 디아미노 부티르산을 의미하고, Dpr은 α,β디아미노 프로피온산을 의미한다. Aph은 4- 또는 파라-아미노 Phe로 추정되어야 하는 NH2Phe를 의미한다. 4-gua-D-Phe는 파라-위치에 치환된 구아니딘을 갖는 D-Phe의 잔기를 의미한다. AzaGly-NH2는 NHNHCONH2를 의미한다. 5- 또는 6-위치에서 Arg 잔기의 구아니디노 기는 저급 알킬, 즉 1-4 탄소 원자, 예컨대 프로필(Pr)에 의해 치환될 수 있다. D-Lys, D-Dbu, D-Dpr 또는 D-Orn이 6-위치에 존재하고, 그것이 일반적이지 않는 아미노산 U＊의 일부가 아닐 때, 그의 측쇄-아미노기는 지방족, 헤테로시클릭 또는 방향족, 예컨대 니코틴산일 수 있는 아실기에 의해 아실화될 수 있거나, 또는 단지 하나의 페닐 고리를 갖는 아릴기에 의해 치환될 수 있다. U＊가 6-위치에서 존재하지 않을 때, 그것은 바람직하게 D-PAL 또는 D-Lys(cpd) 이다. 7-위치 잔기는 바람직하게, Leu, NML, Nle 또는 Phe 이다. 8-위치 잔기가 U＊가 아니라면, 그것은 바람직하게 ILys 이다.
본 발명의 생효력적인 GnRH 작용제는 하기 식(F2)에 의해 표현된다:
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-U＊-AA7-Arg-Pro-AA10
상기 식에서, AA7및 AA10은 앞서 정의된 바와 같고; 바람직하게 AA7은 Leu 또는 NML 이고, AA10은 NHCH2CH3이다.
합성된 보호 아미노산의 바람직한 아속(subgenus)은 하기 일반 구조식을 갖는다:
또는
상기 식에서, j는 1-3 사이의 정수이고; R2는 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, OH, NH2또는 헤테로사이클, 예컨대 메틸피리딜, 피리미디닐 또는 푸리닐이며; X1은 α-아미노 보호기이다.
하나의 바람직한 방법은 GnRH 길항제 및 다른 펩티드를 제조하기에 적합한 하기 일반식을 갖는 보호된 아미노산의 아속의 합성이다:
상기 식에서, X1은 상기 정의된 바와 같고, j는 1 또는 2이다.
본 방법에 의해 제조된 아미노산의 또 다른 아속은 하기 일반 구조식을 갖는다:
상기 식에서, j는 1, 2 또는 3이고; X1은 α-아미노 보호기이고, R2는 저급 알킬(C1-C6), 시클로헥실, 페닐, 피리딜, 메틸피리딜 또는 히스타미닐이다; 또는 합성된 아미노산의 또 다른 바람직한 아속은 하기 일반 구조식을 갖는다:
또는
상기 식에서, R2는 저급 알킬, 피리딜 또는 메틸 피리딜이고, X1은 α-아미노 보호기, 바람직하게 Boc 이다.
본 발명에 의해 제조된 보호된 아미노산은 고전적인 용액 사슬 연장 합성 또는 고체상 기술에 의해 펩티드를 합성하는데 사용될 수 있다. 클로로메틸화 수지 또는 히드록시메틸화 수지가 사용되나; 메틸벤즈히드릴아민(MBHA) 수지, 벤즈히드릴아민(BHA) 수지 또는 절단시 C-말단 아미드 또는 치환된 아미드를 직접 제공하는 그 분야에서 공지된 몇몇 다른 적합한 수지가 상기 C-말단이 필요할 때 바람직하게 사용된다. 예컨대, C-말단에서 치환된 아미드를 갖는 펩티드는 바람직하게 1986년 2월 11일에 특허된 미합중국 특허 제 4,569,967 호에서 지시된 바와 같이 N-알킬아미노 메틸수지를 사용하여 합성된다. 고체상 합성은 미합중국 특허 제 4,211,693 호에서 상세히 서술된 방식으로 사슬에 아미노산을 조금씩 첨가하는 방식으로 수행된다. 당 분야에서 잘 공지되는 바와 같이, 측쇄 보호기는 특히 반응성 측쇄를 갖는 임의 아미노산의 일부로서 바람직하게 포함되고, 이때 임의로 Trp 같은 다른 경우에, 아미노산은 수지를 만든 사슬에 커플링될 것이다. 상기 합성은 전체 보호된 중간 펩티도수지를 제공한다.
용해 또는 고체-상 합성에 의해 제조된, 5- 및 6-위치에서 인공 아미노산을 갖는 GnRH 길항제에 대한 화학 중간체는 하기 식에 의해 표현된다:
X1-AA-AA2(X5)-AA3(X2)-Ser(X3)-U*-U*-AA7(X2또는 X7)-AA8(X5또는 X6)-Pro-X8
상기 식에서, U*는 앞서 정의된 바와 같다.
X1은 폴리펩티드의 계단식 합성에서 당 분야에 유용하다고 공지된 유형의 α-아미노 보호기이고, 원하는 펩티드 조성물내 G가 특히 아실기일 때, 이 기는 보호기로서 사용될 수 있다. X1에 의해 망라된 α-아미노 보호기 부류중에, (1) 아실-유형 보호기, 예컨대 포르밀(For), 트리플루오로아세틸, 프탈릴, p-톨루엔설포닐(Tos), 벤조일(Bz), 벤젠설포닐, 디티아숙시노일(Dts), o-니트로페닐설페닐(Nps), 트리틸설페닐, o-니트로페녹시아세틸, 아크릴일(Acr), 클로로아세틸, 아세틸(Ac) 및 γ-클로로부티릴; (2) 방향족 우레탄-유형 보호기, 예컨대 벤질옥시카르보닐(Z), 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 및 치환 벤질옥시카르보닐, 예컨대 p-클로로벤질옥시카르보닐(CIZ), p-니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐, 및 p-메톡시벤질옥시카르보닐; (3) 지방족 우레탄 보호기, 예컨대 터트부틸옥시카르보닐(Boc), 디이소프로필메톡시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐 및 알릴옥시카르보닐; (4) 시클로알킬 우레탄-유형 보호기, 예컨대 시클로펜틸옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐 및 시클로헥실옥시카르보닐; (5) 티오우레탄-유형 보호기, 예컨대 페닐티오카르보닐; (6) 알킬-유형 보호기, 예컨대 알릴(Aly), 트리페닐메틸(트리틸) 및 벤질(Bzl); (7) 트리알킬실란기, 예컨대 트리메틸실란이 있다. 바람직한 α-아미노 보호기는 Boc 이다.
X2는 수소 또는 Trp의 인돌 질소에 대한 보호기, 예컨대 Bz, Ac 또는 For 이다. 많은 합성에서, Trp를 보호할 필요가 없고, 아실화된 D-Trp이 펩티드에서 어느 다른 곳에 존재하지 않는다면 보호될 필요가 없다.
X3는 Ser 또는 Thr의 히드록실 측쇄에 대한 보호기, 예컨대 Ac, Bz, 트리틸, DCB 또는 베질 에테르(Bzl)이고, 바람직하게 Bzl 이다.
X4는 수소 또는 테트라히드로피라닐, 터트-부틸, 트리틸, 벤질, Z, 2-브로모벤질옥시카르보닐(2BrZ) 및 2,6-디클로로벤질(DCB)로 구성된 군으로부터 선택되는 Tyr의 페놀계 히드록실기에 대한 보호기이다. 2BrZ가 바람직하다.
X5는 측쇄 구아니디노기에 대한 보호기, 예컨대, Arg 또는 Har에서, 또는 His의 이미다졸기에 대한 보호기, 예컨대 니트로, Tos, 트리틸, 아다만틸옥시카르보닐, Z 및 2,4-디니트로페놀(Dnp)이거나, X5는 수소일 수 있고, 이는 측쇄기 원자가 보호되지 않는 것을 의미한다. Tos가 일반적으로 바람직하다.
X6은 아미노 측쇄기, 1차 또는 2차 아미노에 대한 보호기, 예컨대 Z 또는 2CIZ 이다.
X7은 수소 또는 Met에 대한 보호기, 예컨대 산소이고; Met은 일반적으로 보호되지 않는 채 남아 있다.
X8은 Gly-NH-[수지 지지체], D-Ala-NH-[수지 지지체] 또는 N(A)-[수지 지지체]일 수 있고; X8은 또한 (용액 합성이 사용될 때) Gly 또는 D-Ala의 아미드 또는 에스테르 보호기등, 또는 Pro 또는 NHNHCONH2에 직접 부착된 치환된 아미드일 수 있다.
X2-X7에 대한 측쇄 보호기를 선택하기 위한 기준은, 보호기가 합성의 각 단계에서 α-아미노 보호기(바람직하게 Boc)를 제거하기 위해 선택된 반응 조건하에 약제에 대해 안정해야 한다는 것이다. 보호기는 일반적으로 커플링 조건하에 분리되나, 펩티드 사슬을 변경시키지 않을 반응 조건하에 원하는 아미노산 서열 합성의 완결시 제거할 수 있어야 한다.
X8기가 Gly-NH-[수지 지지체] 또는 D-Ala-NH-[수지 지지체]일 때, 아미드 결합은 BHA 수지 또는 MBHA 수지에 Gly 또는 D-Ala를 결합시킨다. X8기가 N(A)-[수지 지지체]일 때, 치환된 아미드 결합은 N-알킬아미노메틸(NAAM) 수지에 Pro를 결합시킨다. X8이 AzaGly-NH2일 때, 미합중국 특허 제 4,234,571 호에서 공개되는 바와 같이, 펩티드는 바람직하게 전통적 용액 합성에 의해 제조된다.
G가 예컨대 최종 식에서 아세틸일 때, 반응은 예컨대, 디이소프로필 또는 디시클로헥실 카르보디이미드(DIC 또는 DCC)의 존재하에 아세트산 또는 바람직하게 아세트산 무수물과 반응시키므로써, (측쇄기가 보호된채 남아 있으면서 α-아미노기에 대한 차단을 제거한 후에) 수지에 펩티드와 바람직하게 수행된다. 당 분야에서 공지된 다른 적합한 반응이 또한 사용될 수 있다.
CMC 컬럼상 이온 교환 크로마토그래피에 의해, 이어서 용리 시스템: Sephadex G-25로 채워진 컬럼상 n-부탄올; 0.1N 아세트산(1:1 부피비)를 사용하는 분배 크로마토그래피, 또는 당 분야에서 공지된 특별히 J. Rivier 일행 J. Chromatography, 288 (1984) 303-328에서 서술된 바와 같이 HPLC를 사용하므로써 펩티드를 정제한다.
암컷 시궁쥐(rat)의 배란을 막기 위해, 발정전기 일의 거의 정오에 피하로 투여할 때, GnRH 길항제는 체중의 kg 당 100㎍ 이하 수준에서 효과적이다. 배란을 더 오래 억제하기 위해, 체중 kg 당 약 0.1 - 약 2.5mg 범위의 투여량을 사용하는 것이 필요할 수 있다. 이들 유사체는 생리학적 pHs에서 특히 용해될 수 있어서, 투여용으로 비교적 진한 용액으로서 제조될 수 있다. 이들 길항제는 또한 상기 지시된 바와 같이 다른 목적을 위해 고나도트로핀 및 성 스테로이드의 생성을 조절하는데 사용될 수 있다.
하기 식에서, U*잔기는 측쇄 아미노기를 갖는 원래 아미노산 잔기 + 동반하는 괄호에서 서술된 당해 변형체에 의해 정의된다. 원래 잔기는 고리의 4- 또는 파라-위치에서 아미노 치환되는 아미노페닐알라닌(D- 또는 L-Aph), 또는 아미노호모Phe (Hph) 또는 아미노호모호모Phe 이다. 그것은 일반적 사슬 연장 방법의 일부로서 적합하게 보호된 인공 아미노산 U*를 첨가하므로써 성장하는 펩티드 사슬에 혼입된다.
변형된 측쇄 아미노기에 대해, 하기 생략형은 하기의 실시예에서 사용된다:
act = 3-아세틸아미노 1,2,4 트리아졸
atz = 3-아미노 1,2,4 트리아졸
bcg = 아미노부틸 시아노구아니디노
bzcg = 아미노벤질 시아노구아니디노
chcg = 아미노시클로헥실 시아노구아니디노
ecg = 아미노에틸 시아노구아니디노
icg = 아미노이소프로필 시아노구아니디노
hcg = 아미노헥실 시아노구아니디노
hicg = 히스타미닐 시아노구아니디노(에틸이미다졸)
mcg = 아미노메틸 시아노구아니디노
ncg = 아미노에틸(1 또는 2) 나프틸 시아노구아니디노
mncg = 아미노메틸(1 또는 2) 나프틸 시아노구아니디노
pcg = 아미노프로필 시아노구아니디노
trcg = 인돌 에틸아미노 시아노구아니디노(트립타미노시아노구아니디노)
mpcg = 아미노메틸 피리딜 시아노구아니디노(숫자는 피리딜 고리에서 아미노메틸기의 위치를 가리킨다)
[실시예 1]
D 및 L 페닐알라닌으로부터 D 및 L Nα-Boc-4-(5'-(3'-아미노-1H-1',2',4'-트리아졸릴))-아미노페닐알라닌의 제조
아미노산 3-(4-니트로페닐)알라닌의 제조를 위해, 페닐알라닌에 방향족 고리 니트로화 하기 위한 다양한 방법을 빈번하게 이용해 왔다. 가장 빈번하게 사용하는 니트로화 절차에서 황산내 용해된 질산 용액을 이용하고, 일반적으로 "혼합된 산"으로 언급된다. 종종 보고되는 고수율과 반대로, 이후에 실제의 니트로화는 아미노산의 방향족 부분의 모든 가능한 위치(오르토, 메타 및 파라)에서 일어나고, 반응 조건의 변형으로 이성질체 비가 단지 약간 변했다는 것을 알았다. 비등하게 물로부터 반복된 결정화로 원치 않은 o- 및 m-이성질체를 제거할 수 있었으나, 수율은 이론치의 단지 약 25% 였다. 질산 및 무수 아세트산 또는 여러 산으로의 질산염으로 본질적으로 구성되는 다른 니트로화 조성물을 또한 사용했더라도, 수율이 적절하고 이성질체 분포가 보고되지 않았기 때문에 니트로화의 이들 변형에 대한 이점은 없는 것으로 보였다.
문헌에서 인용된 여러가지 방법중에, 반응의 한가지 요인, 즉 반응물로서 사용된 Phe의 양에 대한 니트로화제의 비를 일정하게 유지시킨다. 값은 일반적으로 과량의 니트로화를 피하기위해 적당한 질산염의 1.1-1.3 당량이다. 90% 이상의 황산이 존재하는 시스템에서 니트로화가 가장 급속하다고 생각되기 때문에, 니트로화제 (NO+2)의 생성을 돕기위해 반응물에 일반적으로 과량의 황산을 첨가한다.
보다 다량의 황산의 사용으로 분리중에 황색 아미노산을 생성할 수 있으나; 아미노산의 몰당 적어도 약 2몰 (당량), 및 바람직하게 약 2 - 약 3.5 당량의 HNO3를 제공하기위해 질산의 양을 크게 증가시키므로써, 보다 깨끗한 생성물을 생성한다는것을 이제 알았다. 바람직하게, 황산을 질산의 당량당 약 2 - 약 3 당량의 양으로 제공한다. 더우기, 함께 작업을 계속하여 보다 높은 수율을 얻었다. 물로 부터 재결정시킨후에, 3-(4-니트로페닐)알라닌을 CZE의 사용에 의한 원치않는 메타 또는 오르토-치환 이성질체의 잠재적 오염에 대해 체크하고, 다른 이성질체를 용리하기 위해 공지된 조건하에, 파라-치환된 이성질체만을 발견했다. 그리고나서, α-아미노기를 지방족 우레탄 보호기, 바람직하게 Boc로 보호한다.
그리고나서, D- 및 L-Boc-4-Aph(atz) 아미노산 모두를 디페닐시아노카르본이미데이트와 파라-아미노기를 반응시키고나서, 히드라진 수화물로 처리하므로써 상응하는 Boc-4-Aph 아미노산으로 부터 쉽게 제조할 수 있다는 것을 알았다. 이 2-단계 반응은 본질적으로 1-포트 절차이고, 농도/용매 교환이 두 단계를 사이에 수행되더라도, 이소프로판을 같은 알콜성 용매내에서 반응된다면, 상기는 불필요하다. 디클로로메탄내 Boc-4-Aph(atz)의 제한된 용해도는 조-용매로서 N-메틸피롤리딘 (NMP)를 사용하므로써 극복된다.
이후에 서술된 실험적 조건은 이들 아미노산의 제조를 설명한다.
4-니트로페닐-D-알라닌 : 교반 막대가 장치되고 얼음 욕내에서 유지되는 600 mL 비이커내에, 차가운 진한(18 몰농도) 황산(200 mL)을 차가운 진한(16 몰농도) 질산(약 2.4 몰) 150 mL에 서서히 첨가했다. 3℃로 냉각시킨 후에, D-페닐알라닌(180g, 1.09 몰)을 1시간에 걸쳐 5-10g 분량으로 첨가하여, 온도를 약 5℃에 머무르게 했다. 반응을 4시간동안 얼음 욕 온도(2-5℃)에서 교반시켰다. 그리고나서, 반응물을 얼음 3kg에 붓고나서, 진한 수산화암모늄으로 반응물을 조심스럽게 중화시키므로써 켄칭시켰다. pH 5-6에서, 용액은 탁해지고, 4-니트로페닐-D-알라닌이 침전되었다. 침전물을 여과시키므로서 수집하고, 얼음물 (1L)로 세척했다. 그리고나서, 이 아미노산을 온수 700 mL로 부터 두번 재경정화시켰다. 재결정화된 생성물을 수집하고, 고도의 진공하에 건조시켜, 4-니트로페닐-D-알라닌 (0.75 몰; 68%) 157g을 얻었다. [α]D=-6.9°(C=1N HC1 내 0.86); 융점 = 238 - 244℃.
4-니트로페닐-D-알라닌 : 4-니트로페닐-D-알라닌에 대해 상기 서술된 반응을 L-이성질체에 대해 반복했다. L-Phe 약 125g을 상기 서술한 바와 같이 니트로화시켜, 4-니트로페닐-D-알라닌 약 124g을 생성했다 (약 77% 수율). [α]D=+6.8°(C=1N HC1 내 1.0).
Nα-Boc-4-니트로페닐-D-알라닌 : 4-니트로페닐-D-알라닌 (157g, 0.75몰)을 40% 수성 3차-부틸 알콜 500 mL 내 용해시키고, pH를 2N NaOH로 9.9로 조절했다. 디-터트-부틸디카르보네이트 (198g, 0.9 몰)를 35분에 걸쳐 교반시킨 반응물에 첨가하고나서, 혼합물을 2시간동안 주위 온도에서 교반시켰다. pH를 반응의 경로에 걸쳐 약 9.8에서 유지시켰다. 그리고나서, 반응 생성물을 석유 에테르(2 ×800 mL) 및 디에틸 에테르(1 ×500mL)로 먼저 추출하고나서, 수성상을 NaHSO4로 pH 2까지 조심스럽게 산성화시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트로 추출하고나서; 이를 MgSO4상 건조시키고, 진공하에 농축시켜, 석유 에테르로 배산시 고체화되는 점성 오일을 생성했다. Boc-아미노산을 여과에 의해 수집하고, 석유 에테르로 세척하고 건조시켜 Nα-Boc-4-니트로페닐-D-알라닌 210g (0.68 몰, 90%)을 얻었다. [α]D=-7.0°(C=MeOH 내 0.9); 융점=100-104℃.
Nα-Boc-4-니트로페닐-L-알라닌 : Nα-Boc-4-니트로페닐-L-알라닌에 대한 상기 서술된 반응을 L-이성질체에 대해 반복했다. 4-니트로페닐-L-알라닌 약 123g을 서술한 바와 같이 반복하고, Nα-Boc-4-니트로페닐-L-알라닌 약 155g (약 86% 수율)을 생성했다 : [α]D=+7.1°(C=MeOH 내 1.0).
Nα-Boc-4-아미노페닐-D-알라닌 : Nα-Boc-4-니트로페닐-D-알라닌 (209g, 0.68 몰)을 에틸 알콜 500 mL 내에 용해시키고, 아세트산 (10 mL)로 산성화시켰다. 이에 10% Pd/탄소 0.65g을 첨가하고, 수소의 소비가 멈출될 때까지 (6시간) 약 40 psi에서 H2를 사용하여 약 실온에서 혼합물을 수소첨가했다. 촉매를 여과에 의해 제거하고, 반응 생성물을 진공하에 농축시켜, 석유 에테르로 배산할때 고체화되는 점성 오일을 생성했다. 아미노산을 여과에 의해 수집하고, 석유 에테르로 세척하고, 건조시켜 [α]D=-40.2°(C=EtOAc 내 1.0) 및 -23.4°(C=MeOH 내 1.0); 융점 128-133℃를 갖는 Nα-Boc-4-아미노페닐-D-알라닌(0.659 몰, 97%) 184g을 얻었다.
Nα-Boc-4-아미노페닐-L-알라닌 : Nα-Boc-4-아미노페닐-D-알라닌에 대한 상기 서술된 반응을 L-이성질체에 대해 반복했다. Nα-Boc-4-니트로페닐-L-알라닌 약 153g을 상기 서술한 바와 같이 반응시키고, Nα-Boc-4-아미노페닐-L-알라닌 약 134g (약 96% 수율)을 생성했다. [α]D=+23.6°(C=MeOH 내 1.0).
Nα-Boc-4-(5'-(3'-아미노-1H-1',2',4'-트리아졸릴))-아미노페닐-L-알라닌[Boc-L-4Aph(atz)] : 기계적 교반기가 장치된 250 mL 둥근 바닥 플라스크내 Boc-L-4-아미노페닐알라닌(32 m몰) 9g에, 디클로로메탄 100 mL를 첨가하고, 모든 고체가 용해될 때까지 충분한 N-메틸피롤리돈(10 mL)를 첨가했다. 이 시간에서, 디페닐시아노카르본이미데이트 8.7g (36.6 m몰)을 첨가하고, 반응 혼합물을 약 17시간동안 주위 온도에서 교반시켰다. 그리고나서, 반응 혼합물을 진공하에 농축시키고, 시아노구아니디노 중간체를 함유하는 얻은 오일을 메탄올 125 mL 내에 용해시켰다. 히드라진 수화물 15 mL를 첨가하고, 반응 혼합물을 24시간동안 주위 온도에서 교반시켰다. 그리고나서, 반응 혼합물을 진공하에 약 50 mL로 농축시키고, 얻은 오일을 냉각수 350 mL 내로 희석시켰다. pH가 약 7이 될 때까지 묽은 황산을 첨가하고, 수성층을 에테르(1 ×150 mL)로 추출시켜 반응으로 생성된 페놀을 제거했다. 그리고나서, 수성층의 pH를 2-3으로 조절하고, 이때 침전물이 형성되었다. 그리고나서, 반응 생성물을 뜨거운 에틸 아세테이트(3 ×250 mL)로 추출하고, 유기층을 MgSO4상 건조시켰다. 그리고나서, 유기층을 농축시켜, 에테르로 세척시 고체화된 오일을 얻었다. 얻은 분말을 여과시키고, 석유 에테르로 세척하고나서, 건조시켜 Boc-L-Aph(atz) 9.2g을 갈색 분말로서 얻었고 (25.3 m몰, 79% 수율), 이는 또한 Boc-Aph (3-아미노, 1,2,4 트리아졸)로서 언급된다. [α]D=-16.4°(C=MeOH 내 1.0).
Nα-Boc-4-(5'-(3'-아미노-1H-1',2',4'-트리아졸릴))-아미노페닐-D-알라닌[Boc-D-4Aph(atz)] : Boc-L-Aph(atz)에 대해 상기 서술된 반응을 D-이성질체 대해 반복했다. Boc-D-Aph 10.1g을 디페닐시아노카르본이미데이트 10.8g, 이어서 히드라진 수화물 20 mL로 처리하고; 이로써 결과적으로 [α]D=-15.6°(C=MeOH 내 1.0)을 갖는 Boc-D-Aph(atz) 7.8g(61% 수율)을 생성했다.
[실시예 2]
데카펩티드 [Ac-β-D-2NAL', (4Cl)D-Phe2, D-3PAL3, Aph(atz)5, D-Aph(atz)6, ILys8, D-Ala10]-GnRH를 고체-상 합성에 의해 합성한다. 이 펩티드는 하기 식을 갖는다 : Ac-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-Aph(3-아미노, 1,2,4 트리아졸)-D-Aph(3-아미노, 1,2,4 트리아졸)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2.
MBHA 수지(0.76 mM/g)를 사용하고, Boc-보호된 D-Ala를 활성제로서 약 2배 과량의 Boc 유도체 및 DCC를 사용하여 CH2Cl2내 2-시간 기간에 걸쳐 수지에 커플링시킨다. D-Ala 잔기를 애리드 결합에 의해 MBHA 잔기에 부착시킨다.
수지 약 0.9g으로 시작하고, 자동 기계를 사용하여, 하기 스케쥴에 따라 각 아미노산 잔기를 커플링하고, 세척하고, 차단을 제거하고, 다음 아미노산 잔기를 커플링한다.
제 1 아미노산을 부착시킨후에, 본 발명의 펩티드의 아미노산 각각을 커플링시키기 위해 상기 스케쥴을 사용한다. 합성을 통해 남아있는 아미노산 각각에 대해 NαBoc 보호기를 사용한다. 1980년 11월 18일에 특허된 미합중국 특허 제 4,234,571 호에서 상세히 서술되는 바와 같이 당분야에서 공지된 방법에 의해 NαBoc-β-D-2NAL를 제조한다; 그것은 또한 SyntheTech, Oregon, U.S.A로 부터 구입가능하다. Bzl (벤질 에테르)를 Ser의 히드록실기에 대한 측쇄 보호기로서 사용한다. Boc-Lys (Ipr. Z)를 8-위치를 사용한다. 5-위치에서 4Aph(atz) 및 6-위치에서 D-4Aph(atz)의 측쇄기는 보호될 필요가 없다. 트리플루오로아세트산(TFA)를 사용하여 N-말단에서 α-아미노기의 차단을 제거한 후에, 디클로로메탄내 매우 과량의 아세트산 무수물을 사용하여 아세틸화를 성취한다.
펩티드의 조립을 완결시키고 N-말단을 아세틸화시킨후에, 하기 중간체 약 1.67g을 얻었다: Ac-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser(Bzl)-Aph(atz)-D-Aph(atz)-Leu-Lys(Ipr, Z)-Pro-D-Ala-NH-[MBHA 수지 지지체].
펩티도레신을 건조시키고나서, 수지로 부터 펩티드를 절단하고, Ser 및 Lys 측쇄의 0℃에서 HF로 보호를 제거한다. HF 처리전에 아니솔을 스캐벤저로서 첨가한다. 진공하에 HF를 제거한 후에, 수지를 에틸 에테르 100 ml로 2번 세척한다. 같은 부의 CH3CN 및 H2O로 방법을 반복하고 매번 150 ml를 사용하여 수지로 부터 절단된 펩티드를 추출한다. 추출물을 모으고, 동결건조시켜, 그들은 조 펩티드 분말 약 650 mg을 제공한다.
그리고나서, 당 분야에서 공지된, 특별히 J. Rivier 일행, J. Chromatography, 288, 303-328(1984)에서 서술된 바와 같이, 준비된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 펩티드를 정제한다. 제 1 준비된 RP-HPLC 분리에서 TEAP(트리에틸암모늄 포스페이트) 완충 시스템을 사용한다. 약간 다른 구배로 같은 완충 시스템을 사용하여 반복하여 분리하고, J. Chromatograph 논문에서 상세히 서술되는 바와 같이 0.1% TFA (트리플루오로아세트산) 구배를 사용하여 최종적으로 분리한다. 데카펩티드 약 80.7 mg을 얻고, 이를 펩티드 번호 1로서 언급한다.
모세관 영역 전기영동(CZE)를 사용할 뿐만 아니라 역-상 고성능 액체 크로마토그래피 및 수성 트리에틸암모늄 포스페이트 완충액 + 아세토니트릴을 사용하므로써 펩티드가 균일함을 판단한다. 순도는 약 97% 인것으로 추정된다. 결과로 얻어진 정제된 펩티드의 아미노산 분석은 제조된 구조에 대한 식과 일치하고, 사슬내 각 아미노산에 대해 실질적으로 정수-값을 보이고; 질량 스펙트럼 분석은 또한 일정하다. 선광은 [α]D 20=-2.8 ±0.5 (C=1, 50% 아세트산)으로서 광전기 편광계로 측정한다.
펩티드 번호 1을 생체내에서 검증하고, 또한 시험관내에서 테스트한다. 검증전 4일동안 배양액에서 유지시킨 해리된 시궁쥐 뇌하수체 세포를 사용하여 시험관내에서 테스트한다. 펩티드의 적용에 대해 조정된 LH의 수준을 시궁쥐 LH에 대한 특정 방사선 면역 검증법에 의해 검증한다.
대조군 디쉬의 세포만이 GnRH 내 3 nm인 측정값을 갖고; 실험 디쉬는 GnRH 내 3 nm 측정값 + 비교의 목적을 위해 본 발명의 표준 길항제, 즉 [Ac-디히드로 Pro1, (4F)D-Phe2, D-Trp3.6]-GnRH 또는 0.01-10nm 범위의 농도로 테스트 펩티드를 갖는 측정값을 갖는다. GnRH 로만 처리된 샘플에서 분비된 LH의 양을 펩티드 + GnRH로 처리된 샘플에 의해 분비된 양과 비교한다. 3nm GnRH에 의해 방출된 LH의 양을 감소시키는 테스트 펩티드의 능력을 본 발명의 표준 펩티드의 능력과 비교한다.
생체내 테스트로 시궁쥐 암컷에서 배란을 억제하는 효과를 결정한다. 이 테스트에서, 특정수, 예컨대 5-10 마리의 각각 225-250g의 체중을 갖는 성숙한 암컷 Sprague-Dawley 시궁쥐에 발정전기 약 정오에서 살린, 제균성 물 폴리에틸렌 글리콜, 옥수수유, 또는 에탄올과 이들의 혼합물내 특정 ㎍ 투여량의 펩티드를 주사한다. 발정전기는 배란일의 오후이다. 각각의 암컷 시궁쥐 그룹을 펩티드가 투여되지 않는 대조군으로서 사용한다. 각각의 대조군 암컷 시궁쥐는 발정전기의 저녁에 배란하고 ; 처리된 시궁쥐 중에, 배란한 수를 기록한다. 각각의 펩티드는 약 500㎍의 투여량에서 암컷 시궁쥐의 배란을 억제하는데 모두 효과적인 것으로 고려된다.
펩티드 번호 1로서 언급된 펩티드는 낮은 농도에서 시험관내 GnRH-유발된 LH분비를 차단하는데 효과적이다. 펩티드는 낮은 투여량에서 암컷 포유동물의 배란을 억제하는데 효과적인 것으로 고려된다. 하기 표 A는 ㎍으로 제공된 투여량으로 이 GnRH 길항제의 생체내 테스트의 결과를 보인다 :
모두가 적어도 한 D-이성질체 인공 아미노산 잔기를 포함하는 부가의 펩티드를 이후에 서술한다.
[실시예 3]
Ac-β-D-2NAL-(ACl)D-Phe-D-3PAL-Ser-AA5-AA6-Leu-AAB-Pro-D-Ala-NH2의 식을 갖는 표 B 에서 지시되는 펩티드를 실시예 2에서 언급한 고체-상 절차에 의해 제조한다. 실시예 1의 방법은 사용하나, 히드라진에 대한 적당한 약제를 치환하여 인공 아미노산을 합성한다. 예컨대, 실온에서 24 시간동안 DMF 내 이소프로필아민과 시아노구아니디노 중간체를 처리함므로써 제조한 보호된 아니노산을 사용하여 펩티드 제 11을 합성한다.
표 B에 수록된 모든 펩티드는 몇몇 타당한 농도에서 시험관내 GnRH-유발된 LH분비를 차단하는데 효과적인 것으로 고려된다. 모든 펩티드는 낮은 투여량에서 포유동물 암컷의 배란을 억제하는데 효과적인 것으로 고려된다.
[실시예 4]
Ac-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-AA5-AA6-AA7-ILys-Pro-AA10의 식을 갖는 표 C에서 지시되는 펩티드를 상기 언급한 고체-상 절차에 의해 제조한다.
표 C에서 수록된 펩티드는 타당한 농도에서 시험관내 GnRH-유발 LH 분비를 차단하는데 효과적인 것으로 고려된다. 모든 펩티드는 낮은 투여량에서 포유동물 암컷의 배란을 억제하는데 효과적인 것으로 고려된다.
[실시예 5]
pGlu-His-Trp-Ser-Arg-AA6-AA7-Arg-Pro-AA10의 식을 갖는 표 D에서 지시되는 펩티드를 상기 언급한 고체상 절차에 의해 제조한다.
표 D에서 서술된 펩트드는 암컷 시궁쥐에서 LH 및 FSH의 방출을 일으키는데 효과적인 것으로 고려된다. 그들 모두는 천연 GnRH보다 실질적으로 더 효과적인 것으로 고려된다.
본 발명의 펩티드는 산 부가 염같은 제약학적으로 허용가능한 비독성 염 또는 당분야에서 잘 공지된 금속 착물의 형태로 종종 투여된다. 예컨대, 펩티드 수용액을 1N 아세트산으로 반복적으로 처리하고 나서, 동결건조시켜 그의 아세트산 염을 생성한다.
제약학적 조성물은 일반적으로 통상의 제약학적으로-허용가능한 부형제와 함께 펩티드를 함유할 것이다. 일반적으로, 투여량은 정맥내로, 근육내로 또는 피하 내로 제공될 때 숙주의 체중의 kg당 약 10㎍-약 0.5㎍의 펩티드 일 것이다. 종합적으로, 펩티드가 용해될 수 있는 적합한 부형액을 사용하여 GnRH의 다른 길항제 또는 작용제를 사용하여 임상학적 처리와 같은 방식으로 일반적으로 이들 펩티드로 피검체를 처리한다.
본 발명이 그의 바람직한 실시양태에 관해서 서술되었더라도, 당업자에게 명백한 변화 및 변형은 여기에 첨부되는 청구범위에서 서술된 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 만들어 질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 아미노산에서, 아미노-치환된 Phe을 변형시키는 대신에, 적당한 아미노 치환을 갖는 호모 Phe 또는 호모호모 Phe를 D-또는 L-이성질체 형태로 유사한 특성을 갖는 인공 아미노산을 생성하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 특별한 특징은 하기 청구범위에서 강조한다.

Claims (8)

  1. 사슬 연장 방법에 의해 펩티드의 합성에 유용한 인공 아미노산을 제조하는 방법으로서, 하기 식을 갖는 α-아미노산을 : -(CH2)j-CHNH2COOH (여기서, j 는 1,2, 또는 3) α-아미노산의 각 몰에 대해 적어도 약 2 몰의 HNO3을 갖는 진한 질산, 진한 황산, 및 상기 아미노산을 포함하는 반응 혼합물을 형성하고, 약 5℃ 이하의 온도에서 이 반응 혼합물을 유지시키므로써 니트로화 조건에 적용시켜, 이 니트로화가 4-위치에서 주로 일어나게 하고, 적당한 약제와 상기 4NO2-치환 생성물을 반응시켜 상기 α-아미노산에 아미노-보호기를 첨가시키고, 상기 보호된 아미노산을 처리하여, 상기 치환된 니트로 부분을 수소첨가시키고, 그를 아미노 부분으로 변형시키며, 적합한 용매내에 상기 수소첨가된 아미노산을 용해시키고, 그를 디페닐시아노카르본이미데이트와 반응시켜, 친핵성 부분과 반응성인 시아노구아니디노 중간체를 형성하여, 원하는 인공 아미노산을 생성하는 것으로 구성되는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 진한 질산이 α-아미노산의 몰당 약 2-약 3.5 몰 HNO3양으로 상기 니트로화 단계에서 사용되는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 진한 황산이 NHO3의 각 당량당 약 2-약 3 당량의 양으로 사용되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 4NO2-치환 생성물이 지방족 우레탄 보호기에 의해 α-아미노기를 보호하는 약제와 반응되는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 디-터트-부틸디카르보네이트인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 보호된 α-아미노산이 알콜내에 용해되고, 팔라듐/탄소 촉매를 사용하여 수소첨가되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 수소첨가된 화합물이 상기 반응을 위해 디클로메탄 및 N-메틸피롤리딘의 혼합물내 용해되어 상기 시아노구아니디노 중간체를 생성하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 히드라진 수화물이 용액에 첨가되어, 상기 중간체의 상기 아미노산의 측쇄의 페닐 고리의 4-위치에 부착된 3-아미노, 1,2,4 트리아졸 부분을 생성하는 방법.
KR1019950705738A 1993-06-17 1994-06-13 길항 펩티드의 gnrh 제조를 위해 유용한 구아니디노또는변형된구아니디노기를함유하는페닐알라닌유도체또는동족체의제조방법 KR100308361B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/078,965 US5352796A (en) 1989-10-30 1993-06-17 Amino acids useful in making GnRH analogs
US08/078965 1993-06-17
US08/078,965 1993-06-17
PCT/US1994/006726 WO1995000474A1 (en) 1993-06-17 1994-06-13 PROCESS FOR THE PREPARATION OF PHENYLALANINE DERIVATIVES OR HOMOLOGUES CONTAINING A GUANIDINO OR MODIFIED GUANIDINO GROUP USEFUL FOR THE PREPARATION GnRH OF ANTAGONISTIC PEPTIDES

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR960703110A KR960703110A (ko) 1996-06-19
KR100308361B1 true KR100308361B1 (ko) 2001-11-30

Family

ID=22147289

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019950705738A KR100308361B1 (ko) 1993-06-17 1994-06-13 길항 펩티드의 gnrh 제조를 위해 유용한 구아니디노또는변형된구아니디노기를함유하는페닐알라닌유도체또는동족체의제조방법

Country Status (13)

Country Link
US (3) US5352796A (ko)
EP (1) EP0703900B1 (ko)
JP (1) JPH09500110A (ko)
KR (1) KR100308361B1 (ko)
AT (1) ATE176904T1 (ko)
AU (1) AU682702B2 (ko)
CA (1) CA2165469A1 (ko)
DE (1) DE69416676T2 (ko)
IL (1) IL110032A (ko)
NZ (1) NZ267921A (ko)
PH (1) PH31215A (ko)
WO (1) WO1995000474A1 (ko)
ZA (1) ZA944345B (ko)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5352796A (en) * 1989-10-30 1994-10-04 The Salk Institute For Biological Studies Amino acids useful in making GnRH analogs
US6469158B1 (en) * 1992-05-14 2002-10-22 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes
GB9312761D0 (en) * 1993-06-21 1993-08-04 Wellcome Found Amino acid derivatives
US5843901A (en) 1995-06-07 1998-12-01 Advanced Research & Technology Institute LHRH antagonist peptides
EP0859624A1 (en) * 1995-10-27 1998-08-26 Merck & Co., Inc. GnRH/REDUCED PSEUDOMONAS EXOTOXIN CONJUGATES
US5912872A (en) * 1996-09-27 1999-06-15 Digital Optics Corporation Integrated optical apparatus providing separated beams on a detector and associated methods
US5928727A (en) * 1997-06-02 1999-07-27 Lacks Industries, Inc. Method for electroplating elastomer-modified polyphthalamide articles
AU1590699A (en) * 1997-11-20 1999-06-15 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Liquid phase process for the preparation of gnrh peptides
CA2322444A1 (en) 1998-03-05 1999-09-10 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Non-peptide gnrh agents
US6455499B1 (en) 1999-02-23 2002-09-24 Indiana University Foundation Methods for treating disorders associated with LHRH activity
WO2001098268A2 (en) * 2000-06-21 2001-12-27 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Piperidine amides as modulators of chemokine receptor activity
US20040214829A1 (en) * 2000-07-14 2004-10-28 Allergan, Inc. Compositions containing alpha-2-adrenergic agonist components
EP2153819B1 (en) * 2000-07-14 2012-09-05 Allergan, Inc. Use of a solubility enhancing component in an aqueous composition comprising brimonidine tartrate
US8858961B2 (en) * 2000-07-14 2014-10-14 Allergan, Inc. Compositions containing alpha-2-adrenergic agonist components
US20050026924A1 (en) * 2000-07-14 2005-02-03 Allergan, Inc. Compositions containing alpha-2-adrenergic agonist components
CN101897704B (zh) * 2000-07-14 2014-10-29 阿勒根公司 含有α-2肾上腺素能激动剂的组合物
US6598784B2 (en) * 2000-12-20 2003-07-29 Meadwestvaco Packaging Syatens, Llc Beverage carton with strap type carrying handle
JP5274838B2 (ja) * 2004-11-12 2013-08-28 ユーシーエル ビジネス ピーエルシー 化合物
EP2118123B1 (en) 2007-01-31 2015-10-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Stabilized p53 peptides and uses thereof
WO2008121767A2 (en) 2007-03-28 2008-10-09 President And Fellows Of Harvard College Stitched polypeptides
WO2012021876A2 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles
AU2012326026B2 (en) 2011-10-18 2017-04-13 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocyles
KR102112373B1 (ko) 2012-02-15 2020-05-18 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티드모방체 마크로사이클
US8987414B2 (en) 2012-02-15 2015-03-24 Aileron Therapeutics, Inc. Triazole-crosslinked and thioether-crosslinked peptidomimetic macrocycles
SG11201503052RA (en) 2012-11-01 2015-05-28 Aileron Therapeutics Inc Disubstituted amino acids and methods of preparation and use thereof
ES2624961T3 (es) 2013-03-21 2017-07-18 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Síntesis de productos de péptido que contienen imida cíclica
US10087221B2 (en) 2013-03-21 2018-10-02 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Synthesis of hydantoin containing peptide products
WO2016049359A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
AU2016235424A1 (en) 2015-03-20 2017-10-05 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK558181A (da) * 1981-01-30 1982-07-31 Smithkline Corp Fremgangsmaade til fremstilling af 3,5-diamino-1,2,4-triazoler
EP0079522B1 (en) * 1981-11-09 1986-05-07 Merck & Co. Inc. N-carboxymethyl(amidino)lysyl-proline antihypertensive agents
US4935491A (en) * 1987-08-24 1990-06-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Effective antagonists of the luteinizing hormone releasing hormone which release negligible histamine
US5110904A (en) * 1989-08-07 1992-05-05 Abbott Laboratories Lhrh analogs
US5352796A (en) * 1989-10-30 1994-10-04 The Salk Institute For Biological Studies Amino acids useful in making GnRH analogs
IL101074A (en) * 1991-03-14 1997-09-30 Salk Inst For Biological Studi GnRH ANALOGS AND THEIR PREPARATION

Also Published As

Publication number Publication date
DE69416676T2 (de) 1999-09-16
US5710249A (en) 1998-01-20
US5352796A (en) 1994-10-04
IL110032A0 (en) 1994-10-07
EP0703900A1 (en) 1996-04-03
NZ267921A (en) 1997-12-19
KR960703110A (ko) 1996-06-19
US5565574A (en) 1996-10-15
CA2165469A1 (en) 1995-01-05
ATE176904T1 (de) 1999-03-15
DE69416676D1 (de) 1999-04-01
WO1995000474A1 (en) 1995-01-05
ZA944345B (en) 1995-04-03
JPH09500110A (ja) 1997-01-07
IL110032A (en) 1999-09-22
AU682702B2 (en) 1997-10-16
EP0703900B1 (en) 1999-02-24
PH31215A (en) 1998-05-05
AU7061194A (en) 1995-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100308361B1 (ko) 길항 펩티드의 gnrh 제조를 위해 유용한 구아니디노또는변형된구아니디노기를함유하는페닐알라닌유도체또는동족체의제조방법
EP0500695B1 (en) GnRH ANALOGS
US5296468A (en) GnRH analogs
US6747125B1 (en) Peptide intermediates for making GnRH antagonists
HU217552B (hu) GnRH-antagonista peptidek
HU224836B1 (en) Gnrh antagonists being modified in positions 5 and 6
KR0123009B1 (ko) 쥐이엔알에이취(GnRH) 유사체
HU199160B (en) Process for producing gnrh antagonist cyclic decapeptides
US5580957A (en) GnRH analogs
HU198089B (en) Process for producing hormone antagonist decapeptide derivatives releasing gonadotropin
CS228924B2 (en) Method of preparing peptides inhibiting the release of gonadotropine from mammalian hypophysis
PT78209B (en) Gnrh antagonists iii
WO1994019370A1 (en) Gnrh antagonists
AU633384C (en) GnRH analogs

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee