KR100256827B1 - 요소부가체 상전이를 이용한 고순도 고도불포화지방산의 분리정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수분 1∼3% 정도를 함유한 고체요소와 헥산 그리고 어유, 보라지유(borage oil), 미생물 발효유 등의 지방산의 비율을 3∼5 : 3.5∼4.5 : 1 로 하여 상온에서 요소부가체를 형성시키고, 이 상태의 혼합물을 고도불포화지방산의 종류에 따라 -5℃∼4℃의 최종온도로 냉각하여 요소부가체의 등방정계 격자구조의 저온상전이로인한 새로운 활성표면을 형성시켜 이 표면에 고도불포화지방산을 이중결합의 차이를 이용하여 흡착시켜 고순도 고도불포화지방산을 선택적으로 분리정제하였다. 또한 이러한 표면들을 더욱 많이 형성시켜 주기위해 반응 중 올레인산 및 이를 포함한 지방산을 첨가하여 고순도 고도불포화지방산의 회수율을 증대시킬 수 있었다.

Description

요소부가체 상전이를 이용한 고순도 고도불포화지방산의 분리 정제방법

본 발명은 어유 및 미생물 발효유로부터 요소부가체의 상전이를 이용하여 고순도 고도불포화지방산을 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 어유 및 미생물 발효유에는 포화지방산 및 이중결합이 하나 또는 둘 정도의 불포화지방산 외에 GLA, ARA, EPA, DHA 등과 같은 고도불포화지방산을 포함한다. 그 중 감마리놀레닌산은 프로스타글란딘 시리즈 1의 전구체이며 피부질환을 개선하는 효과와 동맥경화 고혈압의 예방 및 치료효과가 있으며, 알파리놀레닌산은 EPA 합성의 전구체 및 혈중 콜레스테롤 저하, 심장병 예방효과, 성인병 예방의 효과가 있다. 또한 아라키돈산은 인간에 필요한 필수지방산으로 프로스타글란딘 시리즈 2의 전구체로서 면역성 개선및 유아들에게 성장을 촉진하는 효과가 있으며, EPA는 혈중 콜레스테롤, 트리글리세라이드(triglyceride) 저하효과, 항염증 효과, 동맥경화 예방, 프로스타글란딘 시리즈 3의 전구체로 사용된다. DHA는 뇌와 눈 세포막의 구성 지방산으로서 두뇌 개선 효과, 치매 및 알츠하이머 질환(Alzheimer disease)의 예방 및 개선효과, 프로스타글란딘 3의 전구체로 사용된다.

종래에 알려진 고도불포화지방산 등을 분리 정제하는 방법으로는 사이클로덱스트린(Cyclodextrin)을 이용하는 방법, 요소부가결정화와 같이 요소부가체를 형성시키는 방법, 고온으로 증류하는 분자증류법, 및 HPLC 방법 등이 알려져 있다. 그러나 분자증류법은 고온 열처리로 인한 산화 안정성 감소의 문제점이 있고, HPLC 방법은 대량생산에 불리하며, 사이클로덱스트린을 이용한 부가체형성방법은 사이클로덱스트린의 가격이 고가이기 때문에 상업적으로는 매우 불리하다.

따라서 본 발명에서는 이러한 단점들을 상쇄시킬수 있는 요소부가결정화법을 사용하였다. 일반적으로 요소는 사각형 격자구조를 갖고 있으며 포화지방산과 같은 직쇄상 유기화합물과 반응하여 육각형 격자구조를 갖는 상전이를 하게된다. 이러한 육각형 격자구조는 약 5Å의 공간을 갖고 있으며, 이 공간내에 직쇄상 유기화합물이 존재하는 부가 화합물을 형성할 수 있다. 따라서 이러한 원리를 이용한 종래의 연구들은 주로 지방산과 요소를 동시에 용해시키는 메탄올 액상냉각법 (Haagsma, JAOCS, 59, 117 (1982) ; Ratnayake, Fat Sci.Technol, 90, 381(1988)) 이 알려져 있는데, 이들은 주로 요소와 어유지방산을 동시에 용해시키는 메탄올을 이용하여 고온에서 상온까지 오랜 시간동안 냉각을 하고 이를 다시 4℃까지 냉각하는데 overnight이라는 개념을 도입하였다. 그러나 이러한 방법은 이들이 요소의 분자군 크기를 제어하지 못한 관계로 냉각시 요소와 요소부가체가 동시에 결정으로 석출되어 요소의 활용도가 크게 저하되어 불필요한 지방산을 제거할 수 없게 되는 단점이 있다. 따라서 종래의 발명들은 냉각시 그 냉각속도를 매우 느리게하여 이를 보완하려 하였다.

그러나 이러한 방법은 공정시간이 매우 느리기 때문에 대량생산이 어려우며 고도불포화지방산이 고온에서 체류하는 시간이 길어 산폐가 빠르게 진행되어 그 산화안정성이 저하되기때문에 공정으로서 응용이 어려운 단점이 있다. 따라서 이러한 단점을 보완하기위해 종래의 방법에서 고체요소를 파괴하거나 고체요소에 습윤제를 사용하여 지방산을 분리하려 하였으나, 요소부가체의 저온 상전이의 개념을 이해하지 못한 관계로 고도불포화지방산들을 선택적으로 분리할 수 없었다.

따라서 이러한 문제점을 개선하기 위하여 국내·외에서는 고체요소를 이용하여 습윤제 존재하에서 희석제인 유기용매를 변화시켜 고도불포화지방산을 선택적으로 분리하려 시도하였다. 그러나 이러한 방법은 용매에 따라 어느정도의 효과가 있을수는 있지만 고도불포화지방산의 선택적 분리는 어려웠으며, 이는 저온에서 요소부가체의 상전이로 인한 그 분자격자가 부피 팽창을 하여 형성된 매우 활성화된 새로운 표면에 이중결합의 차이에 따라 흡착의 정도에 따라 분리되기 때문이다.

본 발명에서는 종래의 방법을 개선하고, 고도불포화지방산의 선택적 분리를 가능케한 새로운 기술을 개발하였다. 즉, 형성된 요소부가체내의 지방산들은 포접되지 않은 상태의 지방산보다 낮은 용융점을 갖게된다. 따라서 이러한 부가체내에 존재하는 직쇄상 유기화합물은 고체상태가 아니고 액상 상태를 유지하며 그 내부에서 회전운동을 하게된다. 따라서 이러한 부가체를 저온으로 냉각하면 그 안에 존재하는 지방산들은 요소의 온도전달 저하능력 때문에 실제 용융점보다 낮은온도에서 고체상태가 되며 이러한 고형화는 부가체 자체를 등방정계 격자구조로 상전이시키며 부피를 팽창시키게된다.

한편, 본 발명에서는 이러한 포화지방산을 이용하지않고 올레인산을 이용하여 요소부가체를 형성시켰고 이를 다시 냉각하여 등방정계 격자구조로 상전이되는 현상을 새롭게 발견할 수 있었다.

도 1은 본 발명의 요소부가체 형성과정을 간단하게 표현한 그림이다.

따라서 본 발명은 수분 1∼3%를 함유한 활성요소 : 헥산 : 올레인산을 함유한 어유 원료 지방산 또는 미생물 발효유를 3∼5 : 3.5∼4.5 : 1 의 비율로 상온에서 반응시켜 요소부가체를 형성시키고, 이 상태의 혼합물을 -4∼5℃로 냉각시키고, 포화지방산을 여과 제거시킨 후, 잔류된 요소부가체 형태의 고순도 고도불포화지방산의 분리 정제방법을 제공하는 것이다. 이때 원료 지방산 중에 올레인산을 포함하는 원료 지방산이 고도불포화지방산 분리에 바람직하며, 원료 지방산 중에 올레인산을 첨가시키는 것이 바람직하다. 또한 본 발명에서 제조된 요소부가체 형태의 고순도 고도불포화지방산은 0.5∼5%의 염산수용액을 가하여 층분리시킨 후, 상등액인 고도불포화지방산만을 추출 분리시킴을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서는 분자구조가 직쇄상이 아니어서 요소내에 포접될 수 없는 지방산들을 앞에서 기술한 방법을 이용하였다. 먼저 수분 1∼3%를 함유한 활성요소 :헥산 : 올레인산을 함유한 어유 원료 지방산 또는 미생물 발효유를 3∼5 : 3.5∼4.5 : 1 의 비율로 상온에서 반응시켜 요소부가체를 형성시킨다. 그후 분리 정제하는 지방산의 분자구조에 따라 저온상태(-5℃∼4℃)를 달리하였다. 이러한 저온 상태가 유지되면 올레인산-요소부가체는 등방정계 격자구조로 상전이되어 그 분자 격자구조의 부피가 크게 증가하게되어, 매우 활성화된 새로운 표면들을 제공하게된다. 이러한 표면에 요소내 포접할 수 없는 고도불포화 지방산등이 흡착하게된다. 따라서 고도불포화지방산을 선택적으로 분리 정제할 수 있는 것이다. 도 1은 이와같은 고도불포화지방산을 선택적으로 흡착할 수 있는 요소부가체의 형성과정을 표현한 도면이다.

하기 표 1에서와 같이 포화지방산은 요소부가체 내에서 실제 상전이 온도보다 상당히 낮은 온도에서 상전이를 하지만, 본 발명에서 선택한 올레인산은 요소부가체내에서 실제상전이 온도와 거의 비슷한 온도에서 상전이를 하는데 이는 올레인산이 갖는 구조적인 이유이다. 올레인산은 이중결합을 갖고 있으며 이러한 이중결합은 요소부가체내에서 비회전성 및 고형성을 나타내게된다. 즉, 단일결합보다 이중결합은 그 결합자체가 비회전성을 띠기 때문에 하기 표 1과 같은 결과를 보여주는 것이다. 따라서 이러한 저온 상전이를 거치게되면 분자격자의 부피가 팽창되어 새로운 활성표면이 형성되어 여기에 이중결합의 차이에의해도 불포화지방산이 선택적으로 분리되는 것이다.

지방산 및 요소부가체내의 지방산 상전이온도

	실제상전이 온도(℃)	요소부가체 내에서의상전이 온도 (℃)
팔미틴산	55∼60	-80
스테아린산	65∼70	-40
에이코사노익산	75∼80	-20
올레인산	13∼16	4∼13

이하, 본 발명을 참고예 및 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

(참고예 1) 중성지질의 지방산전환

중성지질의 지방산전환은 AOAC방법에 준하여 실시했다. 먼저 물(1.6L)과 에 탄올(1.6L)혼합용액에 NaOH(480g), Na₂EDTA(5g)을 60℃에서 용해시킨후 중성 지질(1kg)을 넣고 30분간 비누화반응 시킨다. 이후 헥산(7L)와 물(0.8L)를 주입하여 1시간 혼합교반후 정치시킨다. 이후 상층부의 비비누화물질을 제거한 후 하층부의 용액에 진한염산을 주입하며 pH 1로 적정하여 상층부의 지방산층을 회수하고 회전 진공증발기로 헥산을 제거한다.

(참고예 2) 중성지질의 지방산에틸에스터전환

중성지질의 지방산에틸에스터전환은 AOAC방법에 준하여 실시했다. 먼저 무수 에탄올(300g)에 소디움 에톡사이드(sodium ethoxide)(10g)를 40℃에서 용해시킨후 중성지질(1kg) 을 넣고 2시간 반응시킨다. 반응을 정지시키기위해 물(1.5L)을 주입한다. 이 후 pH가 7이 될때까지 물로 세정한다. 여기서 지방산에틸에스터를 회수하기 위해 원심분리를 수행하여 상층부를 회수한다.

(참고예 3) 지방산의 지방산에틸에스터 전환

지방산의 지방산에틸에스터 전환은 AOAC 방법에 준하여 실시했다. 먼저 무수에탄올(1.5L)에 지방산(1kg)을 40℃에서 용해시킨후 지올라이트 5A(100g)과 진한황산(10ml)를 넣고 약 2시간 반응시킨다. 반응후 물(1L)와 헥산(2L)를 넣어 상분리 시킨다. 이후 상층부를 회수하여 물로 2∼3회 세정한다. 이후 상층액을 회전진공증발기로 헥산을 제거한다.

(참고예 4) 지방산 조성의 분석

지방산의 조성을 분석하기위해 AOAC 방법에 의해 지방산메틸에스터로 전환하 였다. 이때 사용되는 가스크로마토그래피 분석기는 휴렛패커드사의 HP5890 series II를 이용하고, 검출기는 휴렛패커드사의 FID이고, 이때 사용되는 칼럼은 휴렛패커드사의 supelcowax 로서 분석시 온도는 175℃ → 240℃(2.5℃/분)로 승온시켰고, 주입기온도는 250℃이고, 검출기온도는 260℃ 이다.

(실시예 1)

헥산 4L에 참고예 1의 방법에 의해 전환된 보라지유지방산(1kg)(지방산 조성 : 팔미틱산(15%), 스테아린산(3%), 올레인산(20%), 리놀렌산(40%), 감마리놀레닌산(20%), 알파리놀레닌산(2%))을 완전 용해시킨후 수분 1∼3% 정도 함유한 요소 (3kg)를 넣고 상온에서 반응시킨다. 반응후 그 반응물들을 4℃까지 냉각시킨후 2시간이상 정치시킨다. 그후 이 반응물들을 여과하여 고체분을 회수한다. 이 고체 입자에 물(3L)와 헥산(3L)넣고 소량의 염산을 넣고 분해하여 상층부액을 회수한 다. 이 상층부액에 시약급의 요소(4kg)를 넣고 20℃ 이상에서 반응시킨다. 반응후 여과를 하여 액상층을 회수하며 여기에 물로 2∼3회 세정한후 헥산을 제거시킨다.

이때 얻어지는 지방산의 조성은 참고예 5의 방법에 의하여 실시했다.

리놀렌산 0.2%, 감마리놀레닌산 99.2%, 알파리놀레닌산 0.6%이며 연황색의 농축물을 약 154g을 얻을수있다.

(실시예 2)

헥산 4L에 참고예 2의 방법에 의해 전환된 보라지유 지방산에틸에스터 (1kg)(지방산조성 : 팔미틱산(15%), 스테아린산(3%), 올레인산(20%), 리놀렌산(4 0%), 감마리놀레닌산(20%), 알파리놀레닌산(2%))을 완전 용해시킨후 수분1∼3% 정도 함유한 요소(4kg)를 넣고 상온에서 반응시킨다. 반응후 여과를 하여 액상층을 회수하며 여기에 물로 2∼3회 세정한 후 헥산을 제거시킨다.

이때 얻어지는 지방산의 조성은 리놀렌산 0.1%, 감마리놀레닌산 99.0%, 알파리놀레닌산 0.9% 이며 연황색의 농축물을 약 186g을 얻을수있다.

(실시예 3)

헥산 4L에 참고예 1의 방법에 의해 전환된 미생물발효유 지방산(1kg)(지 방산조성 : 팔미틱산(8%), 스테아린산(4%), 올레인산(20%), 리놀렌산(25%), 감마리놀레닌산(6%), eicosatrienoic acid(7%), 아라키돈산(30%))을 완전 용해시킨후 수분1∼3% 정도 함유한 요소(4kg)를 넣고 상온에서 반응시킨다. 반응 후 그 반응물들을 4℃까지 냉각시킨 후 2시간 이상 정치시킨다. 그후 이 반응물들을 여과하여 액상층을 회수하며 여기에 물로 2∼3회 세정한 후 헥산을 제거시킨다.

이때 얻어지는 지방산의 조성은 리놀렌산 0.5%, 감마리놀레닌산 3.2%, eicosatrienoic acid 1.1%, 아라키돈산 95.2% 이며 연황색의 농축물을 약 197g을 얻을수있다.

(실시예 4)

헥산 4L에 참고예 2의 방법에 의해 전환된 미생물발효유 지방산에틸에스터(1kg)(지방산조성 : 팔미틱산(8%), 스테아린산(4%), 올레인산(20%), 리놀렌산(25%), 감마리놀레닌산(6%), eicosatrienoic acid(7%), 아라키돈산(30%))을 완전용해시킨 후 수분 1∼3% 정도 함유한 요소(4kg)를 넣고 상온에서 반응시킨다. 반응후 여과를 하여 액상층을 회수하며 여기에 물로 2∼3회 세정한 후 헥산을 제거시킨다. 이때 얻어지는 지방산의 조성은 리놀렌산 3.4%, 감마리놀레닌산 1.6%, eicosatrienoic acid 1.6%, 아라키돈산 92% 이며 연황색의 농축물을 약 215g을 얻을수 있다.

(실시예 5)

헥산 4L에 참고예 1의 방법에 의해 전환된 대구간유지방산(1kg)(지 방산조성 : 팔미틱산(11.4%), 올레인산(25%), EPA(12%), DHA(11.7%))을 완전용해시킨 후 수분1∼3% 정도 함유한 요소(5kg)를 넣고 상온에서 반응시킨다. 반응 후 그 반응물들을 영하5℃ 까지 냉각시킨 후 2시간 이상 정치시킨다. 그후 이 반응물들을 여과하여 고체분을 회수한다. 이 고체입자에 물(5L)와 헥산(3L)넣고 소량의 염산 을 넣고 분해하여 상층부액을 회수한다. 이 상층부액에 요소(5kg)를 넣고 앞의 방법을 2∼3회 반복한다. 이렇게 얻어진 지방산층의 헥산을 제거하고 참고예 3의 방법에 의해 지방산에틸에스터로 전환한다. 전환된 이 액에 요소(3kg)를 넣고 상온에서 반응시킨다. 반응후 여과를 하여 액상층을 회수하며 여기에 물로 2∼3 회 세정한 후 헥산을 제거시킨다.

이때 얻어지는 지방산에틸에스터의 조성은 EPA 75.6%, DHA 0.2% 미만이며 연황색의 농축물을 약 67g을 얻을 수 있다.

(실시예 6)

실시예 1에서 얻어진 농축물(1kg)에 헥산(3L)를 넣고 용해시킨 후 요소 (1kg)를 넣고 -5℃에서 반응시키며 하루동안 방치시킨다. 그후 여과를 하여 액상층을 회수하며 여기에 물로 2∼3회 세정한 후 헥산을 제거시킨다.

이때 얻어지는 지방산에틸에스터의 조성은 EPA 95.3%, DHA 0.2% 미만이며 연황색의 농축물을 약 607g을 얻을수있다.

(실시예 7)

실시예 1에서 여과하고 남은 여액에 수분 1∼3% 정도 함유한 요소(2kg) 와 올레인산(300g)을 넣고 상온에서 반응시킨다. 반응 후 그 반응물들을 -5℃까지 냉각시킨후 2 시간 이상 정치시킨다. 그후 이 반응물들을 여과하여 액상층을 회수한다. 여기에 물로 2∼3회 세정한 후 헥산을 제거시킨다.

이때 얻어지는 지방산에틸에스터의 조성은 EPA 3.4%, DHA 90.2%, 스테아리돈산 5.5% 이며 연황색의 농축물을 약 73g을 얻을 수 있다.

본 발명의 효과는 수분 1∼3% 정도를 함유한 고체요소와 헥산 그리고 어유, 보라지유(borage oil), 미생물 발효유 등을 사용하여 상온에서 요소부가체를 형성시키고, 이 상태의 혼합물을 고도불포화지방산의 종류에 따라 -5℃∼4℃의 최종온도로 냉각하여 요소부가체의 등방정계 격자구조의 저온상전이로인한 새로운 활성표면을 형성시켜 이 표면에 고도불포화지방산을 이중결합의 차이를 이용하여 흡착시켜 고순도 고도불포화지방산을 선택적으로 분리정제하는 방법을 제공하는 것이다.

Claims (4)

1. 수분 1∼3%를 함유한 활성요소 : 헥산 : 올레인산을 함유한 어유 원료 지방산 또는 미생물 발효유를 3∼5 : 3.5∼4.5 : 1 의 비율로 상온에서 반응시켜 요소부가체를 형성시키고, 이 상태의 혼합물을 -4∼5℃로 냉각시키고, 포화지방산을 여과 제거시켜, 수득된 요소부가체 형태의 고순도 고도불포화지방산의 분리 정제 방법
2. 제 1항에 있어서, 상기 원료 지방산 중에 올레인산을 포함하거나, 올레인산을 첨가시킴을 특징으로 하는 고순도 고도불포화지방산의 분리 정제 방법
3. 제 1항에 있어서, 요소부가체 형태의 고순도 고도불포화지방산을 0.5∼5%의 염산수용액을 가하여 층분리시킨 후, 상등액인 고도불포화지방산만을 추출 분리시킴을 특징으로 하는 고순도 고도불포화지방산의 분리 정제 방법
4. 제 1항의 방법에 따라 분리 정제된 고순도 고도불포화지방산