KR100254650B1 - 폴리에틸렌 글리콜 하이드라존 및 폴리에틸렌 글리콜 옥심 결합 형성제 및 이들의 단백질 유도체 - Google Patents

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KR100254650B1 KR1019930027329A KR930027329A KR100254650B1 KR 100254650 B1 KR100254650 B1 KR 100254650B1 KR 1019930027329 A KR1019930027329 A KR 1019930027329A KR 930027329 A KR930027329 A KR 930027329A KR 100254650 B1 KR100254650 B1 KR 100254650B1
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Abstract

본 발명은 폴리펩티드를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 다른 수용성 유기 중합체로 변형시키기 위한 방법 및 화합물을 제공한다. 이를 위한 신규한 수용성 중합체 제제가 제공된다.
본 발명의 수용성 중합체 제제에는 수용성 유기 중합체의 하이드라진, 하이드라진 카복실레이트, 세미카바지드, 티오세미카바지드, 카본산 디하이드라지드, 카바지드, 티오카바지드, 및 아릴하이드라지드 유도체 및 옥실아민 유도체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 프래그먼트, 덱스트란, 폴리사카라이드, 폴리아미노산 및 폴리비닐 알콜이 포함된다.
또한, 본 발명의 수용성 중합체 제제에 의해 유도된, 유익한 폴리펩티드가 제공된다.
또한, 본 발명의 수용성 중합체 제제로 폴리펩티드를 변형시키기 위한 키트가 제공된다.

Description

폴리에틸렌 글리콜 하이드라존 및 폴리에틸렌 글리콜 옥심 결합 형성제, 및 이들의 단백질 유도체
제1a도는 EPO(erythropoietin)의 HPLC 크로마토그램을 도시한 것이고,
제1b도는 mPEG5000의 하이드라진 유도체로 변형시킨 EPO의 HPLC 크로마토그램을 도시한 것이며,
제1c도는 mPEG5000의 석신이미드 에스테르로 변형시킨 EPO의 HPLC 크로마토 그램을 도시한 것이고,
제2도는 상이한 양의 결합된 mPEG를 함유(28, 18 및 12mPEG/EPO 분자)하는 mPEG5000-EPO로 처리한 마우스의 헤마토크릿 수준을 나타내는 그래프이며,
제3도는 ELISA 검정에서 EPO에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 결합시키는 EPO, 하이드라지드 mPEG5000 EPO(12 PEG/EPO), 하이드라지드 mPEG12000-EPO (6 PEG/EPO), 티오세미카바지드 mPEG5000-EPO (25 PEG/EPO), 세미카바지드 mPEG12000-EPO (14 PEG/EPO) 및 세미카바지드 mPEG12000-EPO(29 PEG/EPO)의 능력을 나타내는 그래프이고,
제4도는 mPEG-하이드라지드(HY) 또는 mPEG-세미카바지드(SC)로 변형시키는 경우의, EPO의 생물학적 활성에 대한 비교결과를 나타내는 그래프이며,
제5도는 상이한 양의 결합된 mPEG(34, 20 및 12mPEG)를 함유하는 mPEG8500-EPO로 처리한 마우스의 헤마토크릿 수준을 나타내는 도면이고,
제6도는 클리니겐EPO EIA 시험 키트를 사용하여 mPEG 변형된 EPO에 대한 ELISA 검정 결과를 나타내는 그래프이며,
제7도는 혈장내 EPO의 순환 반감기를 나타내는 그래프이고,
제8도, 제9도, 제10도, 제11도 및 제12도는 EPO 주사에 반응하는 헤마토크릿 수준의 변화를 나타내는 그래프이며,
제13도는 EPO 및 EPO 유도체를 피하내 또는 정맥내 주사한 마우스의 헤마토크릿 수준의 변화를 나타내는 그래프이고,
제14도는 마우스에서 EPO를 1㎍의 단일 용량으로 주사한 경우에 대한 수회 주사한 경우의 헤마토크릿 수준을 나타내는 그래프이며,
제15도는 종양 괴사인자 α(TNFα)-유도된 빈혈증에 걸린, EPO 및 EPO 유도체를 주사한 마우스의 헤마토크릿 수준을 나타내는 그래프이고,
제16도 및 제17도는 EPO 주사에 반응하는 헤마토크릿의 변화를 나타내는 그래프이며,
제18도는 ELISA 검정에 있어 EPO에 특이적인 모노클로날 항체에 결합하는
의 능력을 나타내는 그래프이고,
제19도는 mPEG-EPO를 사용한 EPO 의존적 세포 증식을 나타내는 그래프이며,
제20도는 EPO 주사에 반응하는 헤마토크릿의 변화를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 단백질의 알데하이드 그룹과 하이드라존 결합을 형성하도록 개질된 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 수용성 중합체에 관한 것이며, 본 발명은 당해 수용성 중합체에 의해 변형된 단백질 분자에 관한 것이다.
추가로 본 발명은 옥심 결합을 형성하도록 개질된 수용성 중합체 및 이에 의해 변형된 단백질 분자에 관한 것이다.
단백질 및 기타의 유사한 유기 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 수용성 유기 중합체에 공유 포함(covalent conjugation)시켜 화학적으로 변형시킬 수 있다. 이러한 단백질 포합체의 제조는 수용성 중합체의 결합에 의해 바람직한 특성들이 폴리펩티드에 부여되기 때문에 유익하다. 이러한 바람직한 특성들은 수용액중에서의 용해도 향상, 저장중의 안정성 향상, 면역원성의 감소, 효소 분해에 대한 내성 증가, 보다 다양한 약물 투여 시스템과의 상용성 및 생체내 반감기 향상을 포함한다. PEG 또는 다른 수용성 중합체를 사용하여 폴리 펩티드를 유도화시켜 발생되는 이들 특성들은 폴리펩티드가 인체내에 주사되는 치료제로서 사용되거나 폴리펩티드가 관심의 대상인 화합물의 검출 및/또는 정량을 위한 검정, 통상적으로는 면역검정에 사용되는 경우 특히 유익하다.
당단백질의 카보하이드레이트 잔기를 통해 단백질에 리포트(reporter) 그룹을 결합시키는 것이 문헌에 공지되어 있다[참조 : Weber, P. and Hof, L.
비오틴, 형광 프로브, 항암 화합물 및 고체 지지체를 포함하는 다수의 그룹이 이러한 방식으로 공유결합된다.
미합중국 특허 제4,847,325호에는 PEG-아민, PEG-하이드라지드 또는 PEG-하이드라진을 합성할 수 있으며, 이들을 당단백질에 결합시킬 수 있다고 기술되어 있다. 그러나, 이들 PEG-유도체가 합성되었다는 실험적 증거, 이들 PEG-유도체가 산화 당단백질을 변형시킬 수 있다는 실험적 증거 및 이들 상상적인 PEG-단백질의 생물학적 특성들이 어떠한지에 대한 실험적 증거는 기술되어 있지 않다.
코간(Kogan T.P.)에 의한 간행물[참조 : Synthetic Communications, 22(16), 2417-2424(1992)]에는 모노메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)하이드라지드의 합성에 대해 기술되어 있다. 효소 퍼옥시다제는 이의 카보하이드레이트 그룹을 통해 PEG를 변형시킨다[참조 : Urrutigoity, M. and Souppe, J. (1989) Biocatalysis 2, 145-149]. 상기 변형에 있어서, PEG-디아민을 산화 퍼옥시다제와 반응시키고, 생성된 이민을 수소화봉소로 환원시켜 PEG와 단백질의 카보하이드레이트 그룹 사이에 안정한 결합을 형성시킨다. 3개의 PEG-20,000 분자를 효소에 결합시킨다. 이러한 방식으로 PEG-디아민을 사용하는 경우에 발생할 수 있는 문제는 가교결합자(cross-linker)로서 작용하는 PEG 디아민과 단백질 분자들 사이에서 발생하는 분자간 가교결합이다. PEG-디아민을 사용함으로 인한 다른 단점은 단백질에 결합하는 PEG-디아민 각각에 대한 2개의 유용한 알데하이드 그룹의 소모, 즉 PEG 혼입을 위한 잠정적 자리수의 감소이다.
하이드라존 형성 mPEG 유도체 및 일련의 옥심 형성 mPEG 유도체를 합성한다. 옥심은 하이드록실아민 또는 옥실아민 유도체와 알데하이드 또는 케톤 그룹을 반응시켜 제조한다. 폴리스티렌 치환된 벤조페논 옥심은 고상 펩티드 합성을 위한 지지체로서 사용되고 있다[참조 : DeGrado W.F., and Kaiser, E.T. (1980) J. Org. Chem. 45, 1295-1300]. 상기 문헌에서는 성장 펩티드 쇄가 에스테르 결합을 통해 옥심 그룹에 커플링된다. 치환된 옥심 결합은 매우 안정되며, 치환되지 않은 알드옥심도, 반응을 위해 실리카 겔의 존재하에 100℃에서 60시간을 요하는 벡크만(Beckmar) 재배열 반응[참조 : March, J. (1985) Advanced Organic Chemistry, New York-John Wiley ＆ Sons, pp 987-989]에 대해 우수한 안정성을 나타낸다. 옥심 결합은 항체에 모르폴리노독소루비신을 커플링시키는데 사용되어오고 있다[참조 : Mueller, B.M., Wrasidlo, W.A., and Reisfeld, R.A. (1990) Bioconjugate Chem. 1, 325-330]. 상기 문헌에서는, 모르폴리노독소루비신의 케톤 그룹을 아미노옥시아세트산과 반응시킨다. 새로 커플링된 유리 산 그룹은 활성화되고 모르폴리노독소루비산은 모노클로날 항체상의 리신중 유리 아미노 그룹에 결합된다.
다수의 단백질은 PEG에 의해 변형되었다[참조 : Inada, Y., Yoshimoto, T. Matsushima, A., and Saito, Y. (1986) Trends Biotechnol. 4:68-73]. 당해 분야에서 다음과 같이 다수의 특허가 허여되었으며 다수의 특허원이 공개되었다: 미합중국 특허 제4,179,337호; 미합중국 특허 제4,609,546호; 미합중국 특허 제4,261,973호; 미합중국 특허 제4,055,635호; 미합중국 특허 제3,960,830호; 미합중국 특허 제4,415,665호; 미합중국 특허 제4,412,989호; 미합중국 특허 제4,002,531호; 미합중국 특허 제4,414,147호; 미합중국 특허 제3,788,948호; 미합중국 특허 제4,732,863; 미합중국 특허 제4,745,180호; 유럽 특허 제152,847호; 유럽 특허 제98,110호(1984년 1월 11일 공개). 위와 같은 특허공보는 이에 한정되지 않지만 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리옥시에틸화 폴리올(POP), 헤파린, 헤파린 단편, 덱스트란, 폴리사카라이드, 프롤린을 함유하는 폴리아미노산, 폴리비닐 알콜(PVA) 및 기타 수용성 유기 중합체를 포함하는 기타 수용성 중합체 단백질 변형제를 사용하는 것으로 기술하고 있다.
최근의 특허공보(WO90/12874)는 EPO가 유전공학에 의해 도입된 시스테인 잔기를 함유하는 mPEG-EPO의 제조를 기술하고 있다. 시스테인 특이 mPEG-제제를 유전공학적으로 처리된 유리 설프하이드릴 그룹에 공유결합시킨다. 오직 하나의 mPEG 분자만 EPO에 혼입시킬 수 있으며 이 혼입에 대한 증거는 전혀 나타나지 않는다. 또한, 생성되는 mPEG-EPO의 생물학적 또는 생물리학적 특성이 기술되어 있다.
에리트로포이에틴은 적혈구 생성을 조절하는 당단백질이다. 에리트로포이에틴은 에리트로이드 전구체에 대한 수용체에 결합함으로써 생물학적 효과를 발휘한다[참조 : Krantz, S.B., Blood 77:419-434 (1991)]. 수용체에 대한 에리트로포이에틴의 결합은 에리트로이드 전구체를 증식시키고 성숙한 적혈구로 분리시킨다 인터류킨 3 또는 과립구-대식세포군체-자극 인자와 같은 기타 성장 인자도 철, 폴산 및 비타민 B12와 같은 조이자와 함께 적혈구 조혈작용에 관련된다. 현재 에리트로포이에틴은 만성 신장질환에 있어서 투석 및 예비투석 환자 둘다에 대해 사용되고 빈혈 및 HIV 감염에 의한 빈혈에 대해서는 지도부딘(Zidovudine) 치료와 함께 사용되고 있는 것으로 알려져왔다. 최근 연구중인 에리트로포이에틴에 대한 용도는 암에 의한 빈혈, 수술전(presurgical) 자체 혈액 공급, 수술하기 진전(perisurgical) 보조 치료를 포함한다.
에리트로피이에틴은 2개의 디설파이드 가교를 포함하는 165개의 아미노산으로 이루어진다. 에리트로포이에틴은 단백질 주쇄로부터 나온 4개의 카보하이드레이트 쇄를 포함한다. 이 카보하이드레이트 그룹중 3개는 N-결합되고 아스파라긴 24, 38 및 83에 결합된다. 또한 세린 126에 결합된 1개의 O-결합된 탄수화물 그룹이 있다. 탄수화물 쇄들은 가교되고 푸코스, 칼락토스, N-아세틸갈락토스 아민, N-아세틸글루코스아민, 만노스 및 시알산으로 이루어져 있다. 에리트로포이에틴의 탄수화물 조성은 문헌[참조 : Sasaki, H., Bothner, B., Dell, A., and Fukuda, M. (1987) J. Biol. Chem. 262, 12059-12076]에 의해 조사된 바와 같이 불균일하다. 카보하이드레이트 그룹은 단백질 중량의 약 40%에 기여한다. 에리트로포이에틴의 카보하이드레이트 그룹은 에리트로포이에틴의 용해도를 증가시켜 혈청의 반감기를 연장시키는 것으로 믿어진다.
어떤 폴리펩티드가 수용성 중합체에 공유 포함될 수 있는 가에 대해 그리고 폴리펩티드를 변형시킬 수 있는 정도에 대해 약간의 제한이 존재한다. 상이한 수용성 중합체 제제는 관심의 대상인 폴리펩티드의 아미노산 잔기에 커플링되는 작용 그룹에 따라 변한다. 특정 작용 그룹이 특정 아미노산 잔기에 수용성 중합체를 커플링시킨다.
석신이미딜 카보네이트 -PEG, 석신이미딜 석시네이트-PEG, 이미데이트-PEG, 시아누르산 클로라이드-PEG, 카보닐디이미다졸-PEG 및 PEG-페닐카보네이트 유도체(4-니트로페놀 및 2,4,5-트리클로로페놀)와 같은 상이한 특성을 갖는 상이한 mPEG-제제를 사용하는 리신 잔기의 변형은 기술되어 있다. 각각의 제제는 고유의 특이한 성질을 갖는다. 본 출원은 상이한 리신을 변형시키는 PEG 유도체와 유사한 산화 카보하이드레이트 그룹에 대해 상이한 특이성을 갖는 신규한 카보하이드레이트 PEG 변형제를 포함한다.
당단백질, 즉 탄수화물 분자 또는 분자들에 공유결합된 폴리펩티드는 폴리펩티드에 탄수화물 잔기가 존재하기 때문에 폴리펩티드의 수용성 중합체 유도화에 대한 상이한 방법을 제고할 추가의 기회를 부여한다. 수용성 중합체 제제는 당단백질의 아미노산 폴리펩티드 주쇄의 반대방향에 존재하는 당단백질의 카보하이드레이트 잔기에, 즉 폴리펩티드에 존재하는 각종 작용성 그룹에 직접 커플링될 수 있다. 폴리펩티드 주쇄의 아미노산 보다는 당단백질의 카보하이드레이트 잔기에 수용성 제제를 커플링시키는 것이 유리한 이유는 전하 이동의 차이, 입체 장애, 활성 위치에서의 아미노산 잔기 및 수용성 중합체 변형된 당단백질의 폴리펩티드 성분의 구조 및 작용을 방해할 수 있는 기타의 요인때문이다.
당단백질의 탄수화물 잔기에 커플링시킬 수 있는 수용성 중합체 제제를 제공함에 따라 다른 아미노산 잔기에서의 커플링을 통해 악영향을 받을 수 있는 단백질의 생물학적 활성에 사실상 역효과를 미치지 않고 수용성 중합체를 단백질에 공유 포함시킬 수 있다.
본 발명은 수용성 유기 중합체의 유도체, 즉 알데하이드 그룹 또는 화학적 반응성이 유사한 그룹(예 : 케톤, 락톨, 폴리펩타이드상의 활성화 카복실산 또는 활성화 카복실산 유도체)과 하이드라존 그룹을 형성하는 수용성 중합체 제제로 폴리펩티드를 변형시키는 방법 및 이를 위한 조성물을 제공한다. 신규한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 다른 수용성 중합체의 하이드라지드, 세미카바지드, 아릴 하이드라지드, 티오세미카바지드, 하이드라지드 카복실레이트 카본산 디하이드라지드, 카바지드 및 티오카바지드 유도체가 제공된다. 개개의 폴리펩티드 또는 유사한 유기 분자에 하나 이상의 수용성 중합체 제제를 커플링시켜 수용성 중합체에 폴리펩티드를 결합시키는 하이드라존을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 하이드라존 결합 수용성 중합체 유도체의 공유 결합에 의해 변형된 단백질, 특히 당단백질을 제공하는 것이다.
또한, 상술한 알데하이드 또는 유사한 반응성 그룹과 옥심 결합을 형성하는 수용성 유기 중합체의 유도체로 폴리펩티드를 변형시키는 방법 및 이를 위한 조성물도 기술되어 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 기타 수용성 중합체의 후술하는 바와 같은 신규한 옥실아민 유도체가 제공되며, 이때, 하나 이상의 수용성 중합체 제제를 각각의 폴리펩티드 또는 유사한 유기 분자에 커플링시켜 폴리펩티드를 수용성 중합체에 결합시키는 옥심을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 옥실아민 수용성 중합체 유도체의 공유 결합에 의해 변형된 단백질, 특히 당단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 수용성 중합체 제제에는 폴리에틸렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(이때, 단독중합체 및 공중합체는 비치환 되거나 한쪽 말단이 알킬 그룹에 의해 치환된다), 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐 에틸 에테르, α,β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파트아미드] 및 기타 수용성 유기 중합체의 하이드라존 결합 및 옥심 결합 형성 유도체가 포함된다. 폴리에틸렌 글리콜 수용성 중합체에는 하나의 말단 하이드록실 그룹이 R 그룹, 즉 RO-PEG(여기서, R은 알킬, 아릴, 알킬아릴, 아로일, 알카노일, 벤조일, 아릴알킬에테르, 사이클로알킬 또는 사이클로알킬아릴 등일 수 있다)에 의해 개질된 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 열거된 수용성 중합체는 P로서 나타내는 수용성 중합체의 예에 불과하다, 또한, 특징적으로 언급된 수용성 중합체의 다양한 유도체도 이들이 수용성인 한고려될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 수용성 중합체(P)는 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 유도체, 특히 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜의 모노메틸 에테르(mPEG)(단백질 사이의 가교결합을 피하기 위해)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 수용성 중합체에 의한 수용성 중합체 유도에 유리한 폴리펩티드에는 호르몬, 림포킨, 시토킨, 성장 인자, 효소, 백신 항원 및 항체가 포함된다. 에리트로포이에틴(EPO), 특히 재조합 에리트로포이에틴, 및 이의 전구체, 중간체 및 유사체의 수용성 중합체 유도가 특히 유리하다.
본 발명의 또 다른 측면은 부분적으로 산화시킨 다음, 후속적으로 (i) 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜)(mPEG)의 세미카바지드 유도체와 결합시켜 에리트로포이에틴 1분자당 17 내지 25개의 mPEG 분자를 함유하는 mPEG 유도된 에리트로포이에틴 분자(하이드라존 결합을 통해 결합됨)를 생성시키거나, (ii) mPEG의 카복실레이트 하이드라지드 유도체와 결합시켜 EPO 당 약 22 내지 32개의 mPEG를 함유하는 유도된 EPO(하이드라존 결합을 통해 결합됨)를 생성시키거나, (iii) mPEG의 옥실아민 유도체와 결합시켜 EPO당 약 3 내지 36개의 mPEG를 함유하는 유도된 EPO(옥심 결합을 통해 결합됨)을 생성시키며 상기의 모든 경우 겔 여과 체류 시간에 의해 관찰하여 에리트로포이에틴을 제공하는 것이다.
제 2도에서, 18 또는 28 mPEG5000/분자로 유도된 EPO는 본 발명의 세미카바지드 화합물을 사용하여 유도한다. 12mPEG5000/분자로 유도되는 EPO는 본 발명의 하이드라지드 화합물을 사용하여 유도한다.
제 4도에서, 비교를 위해 분자량(8,500 및 5,000)이 상이한 2종의 mPEG를 사용한다. 대조 표본으로서 마우스의 알부민을 사용한다.
제 5도에서 34 또는 20mPEG85000/분자로 유도되는 EPO는 본 발명의 세미카바지드 화합물을 사용하여 유도체화한다. 12mPEG85000/ 분자로 유도되는 EPO는 본 발명의 하이드라지드 화합물을 사용하여 유도한다. 대조표본으로서 마우스 알부민을 사용한다.
제 6도에서 SC5-24는 EPO 분자당 24개의 mPEG 분자를 갖는 세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO를, SC5-18은 EPO 분자당 18개의 mPEG 세미카바지드를 갖는 세미카바지드 MPEG5000 변형된 EPO를 나타낸다.
제 7도에서, SC5-18-iv는 EPO 분자당 18개의 mPEG 분자를 갖는 정맥내 주사되는 세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO를 나타내고 EPO-iv는 정맥내 주사되어짐을 나타낸다.
제 8도에서, SC5-18은 EPO 분자당 18개의 mPEG 분자를 갖는 세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO를 SC5-22는 EPO 분자당 22개의 mPEG5000 분자를 갖는 세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO를, HY5-8은 EPO 분자당 8개의 mPEG5000 분자를 갖는 하이드라지드 mPEG5000 변형된 EPO를 나타낸다.
제 9도에서, SC5-24는 EPO 분자당 24개의 mPEG 분자를 갖는 세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO를 TS5-22는 EPO 분자당 25개의 mPEG5000 분자를 갖는 티오세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO를, DH5-22은 EPO 분자당 22개의 mPEG5000 분자를 갖는 디하이드라지드 mPEG5000 개질된 EPO를, M.A.는 마우스 알부민 대조 표본을 나타낸다.
제 10도에서, TS5-17은 EPO 분자당 17개의 mPEG5000 분자를 갖는 티오세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO를 SC8.5-12는 EPO 분자당 12개의 mPEG5000 분자로 변형된 세미하이드라지드 mPEG8500 변형된 EPO를, SC2-15은 EPO 분자당 15개의 mPEG2000 분자를 갖는 세미바지드 mPEG2000 변형된 EPO를, M.A는 마우스 알부민 대조 표본을 의미한다.
제 11도에서, SC5-18는 EPO 분자당 18개의 mPEG5000 분자를 갖는 세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO를, SC12-14는 EPO 분자당 14개의 mPEG12,000 분자를 갖는 세미바지드 mPEG12,000 변형된 EPO를, SC5-28은 EPO 분자당 28개의 mPEG5000 분자를 갖는 세미하이드라지드 mPEG5000 개질된 EPO를, HY12-6은 EPO 분자당 6개의 mPEG12,000분자를 갖는 하이드라지드 mPEG12,000 변형된 EPO를, M.A.는 마우스 알부민대조 표본을 나타낸다.
제 12도에서, SC8.5-34는 EPO 분자당 34개의 mPEG8500 분자를 갖는 세미카바지드 mPEG8500 변형된 EPO를, SC12-29는 EPO 분자당 29개의 mPEG12,000 분자를 갖는 세미카바지드 mPEG12,000 변형된 EPO를, M.A.는 마우스 알부민대조 표본을 의미한다.
제 13도에서 EPO-SC는 피하내 주사된 EPO를, EPO-iv는 정맥내 주사된 EPO를, SC5-28-SC는 피하내 주사된 EPO 분자당 28개의 mPEG5000 분자를 갖는 세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO를, SC5-28iv는 정맥내 주사된 EPO 분자당 28개의 mPEG5000 분자를 갖는 세미바지드 mPEG5000 변형된 EPO를, HY-12-6-SC는 피하내 주사된 EPO 분자당 6개의 mPEG12,000 분자를 갖는 하이드라지드 mPEG12,000 변형된 EPO를, HY12-6-iv는 정맥내 주사된 EPO 분자당 6개의 mPEG12,000 분자를 갖는 하이드라지드 mPEG12,000 변형된 EPO를, M.A.-sc는 피하내 주사된 마우스 알부민 대조 표본을 M.A.-iv는 정맥내 주사된 마우스 알부민 대조 표본을 나타낸다.
제 14도에서, EPOx3sc는 EPO를 1주일에 3회 피하내 주사함을, EPOx3iv는 EPO를 1주일에 3회 정맥내 주사함을 SC5-22x1sc는 EPO 분자당 22개의 mPEG5000 분자를 갖는 세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO를 주 1회 피하내 주사함을, SG5-22x1iv는 EPO 분자당 22개의 mPEG5000 분자를 갖는 세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO를 주 1회 정맥내 주사함을, M.A.x3는 대조 표본 마우스 알부민을 주 3회 정맥내 주사함을 나타낸다.
제 15도에서, TNF(5)는 TNF를 5일에 걸쳐 주사함을, T+EPO(5)는 TNF 및 EPO를 동시에 5일에 걸쳐 주사함을, T+EPO(2)는 TNF를 5일에 걸쳐 주사하고 EPO를 제 1 및 제 4일에 주사함을, T+SC5-18(5)는 TNF를 EPO 분자당 18개의 mPEG5000 분자를 갖는 세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO와 동시에 5일에 걸쳐 주사함을, T+SC5-18(2)는 TNF를 5일에 걸쳐 주사하고 동시에 제 1일 및 4일에 EPO 분자당 18개의 mPEG5000 분자를 갖는 세미카바지드 mPEG5000 변형된 EPO를 주사함을, M-A는 마우스 알부민 대조 표본을 나타낸다.
제 16도에서, 18PEG-A는 EPO는 분자당 18개의 mPEG 분자를 갖는 mPEG-O-CH2CH2-NH-CO-ONH2변형된 EPO를 (본 발명의 화합물 XXI); 31PEG-C는 31mPEG/EPO를 가는 mPEG-O-CH2CH2-NH-CO- CH2-ONH2변형된 EPO(본 발명의 일반식 XXIV)를; 25PEG-C는 EPO 분자당 25개의 mPEG 분자를 갖는 mPEG-O-CH2-CH2-NH-CO-CH2-ONH2변형된 EPO(본 발명의 일반식 XXIV)를 나타낸다.
제 17도에서, 22PEG-B는 EPO 분자당 22개의 mPEG 분자를 갖는 옥심-유도된 mPEG-O-CH2CH2-ONH2변형된 EPO(본 발명의 일반식 XXIII)를; 17 PEG-B는 EPO 분자당 17개의 mPEG 분자를 갖는 동일 옥심 링커로 변형된 EPO를, 12 PEG-B는 EPO 분자당 12개의 mPEG 분자를 갖는 동일 옥심 링커로 변형된 EPO를 의미한다.
제 19도에서, 18PEG-A는, 18PEG/EPO인 mPEG-O-CH2CH2-NH-CO-ONH2변형된 EPO(일반식 XXI)를, 22PEG-B는 22PEG/EPO인 mPEG-O-CH2CH2-ONH2(일반식 XXIIII) 변형된 EPO를, 17PEG-B는 17PEG/EPO인 일반식(XXIII)를, 12PEG-B는 12PEG/EPO인 일반식(XXIII)를, 31PEG-C는 31PEG/EPO인 mPEG-O-CH2CH2-NH-CO-CH2-ONH2(일반식 XXIV) 변형된 EPO를, 22PEG-C는 25PEG/EOP인 일반식(XXIV)를 의미한다.
제 20도에서, 31mPEG는 EPO 분자당 31개의 mPEG 분자를 갖는 옥심-유도된 mPEG-O-CO-NHNH2(본 발명의 일반식 II)로 변형된 EPO를 의미한다.
용어 "수용성 중합체 시약"이란 폴리펩타이드에 수용성 중합체의 공유 결합된 제공하는 작용기를 함유하도록 변형된 수용성 중합체를 의미한다
용어 "폴리펩티드"란 보다 큰 폴리펩티드(종종 단백질로 언급), 소형 펩티드 및 당단백질을 포함하여, 다양한 크기의 폴리펩티드를 의미한다.
용어 "산화 활성화 그룹"은, 작용 그룹을 산화 조건에 노출시킨 후 본 발명의 화합물의 하이드라지드 부분 또는 옥실아민 부분과 반응하는 알콜, 폴리올, 락톨, 아민, 페놀, 카복실산 또는 카복실산 유도체와 같은 작용 그룹을 의미한다. 당단백질인 폴리펩티드상에 존재하는 산화 활성화 그룹은 당단백질의 카보하이드레이트 부위상에 또는 당단백질의 아미노산 잔기 부위상에 존재할 수 있다. 산화 활성 그룹의 예(이로써 제한하는 것은 아님)로는 당단백질의 카보하이드레이트 부위상에 존재하는 하이드록실 그룹이 있다. 하이드록실 그룹은 사용된 유도체에 따라 하이드라지드 반응성 알데하이드 또는 옥실아민 반응성 알데하이드로 산화될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "부분적 산화"란 산화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 완전히 제거하지 않는 정도로 진행되는 산화 공정을 의미한다.
본원에서 폴리펩티드에 대해 사용된 용어 "포합시키기 위해 활성화된"이란 폴리펩티드의 부분적 산화를 의미하는 것으로서, 산화 정도는 본 발명의 수용성 중합체 제제중 하나의 하이드라지드 부분 또는 옥실아민 부분(또는 유사한 작용 그룹 부분)과 화학적으로 반응할 수 있는 작용 그룹으로 하나 이상의 산화 활성화 그룹이 전환되기에 충분한 정도의 산화를 의미한다.
용어 "생물학적 활성"이란, 효소 활성, 수용체(항체포함) 결합능, 리간드 결합능, 변역 반응 유도능, 치료적 활성등을 포함하는 화합물의 생물학적으로 관련된 특성을 의미한다.
용어 "항체"란 천연 면역글로불린 서열을 갖는 폴리크로날 및 모노클로날 항체, 합성 항체 유도체 등을 포함하는데, 항체는 다양한 표지물, 형광물질, 방사성 물질, 효소, 비오틴/아비딘중 어떠한 것에도 결합되도록 변형시킬 수 있다. 합성 항체 유도체에는 돌연변이되어 변형된 결합 특이성에 대해 선택된 천연 면역글로불린 서열, 일반적으로 유전자 변형된 세균에 의해 생산되는 일본쇄인 다양한 면역글로불린 유전자 유도된 폴리펩티드, 변형된 불변영역을 함유하도록 변형된 항체 등을 포함하는데; 항체 형성 원칙을 기초로 한 이와 같은 합성 항체 유도체의 고찰이 문헌[참조; Winter and Milstein, Nature, 349:293-299 (1991)]에 나타나 있다.
본 발명은 수용성 중합체에 결합시키기 위하여 폴리펩티드를 변형시키는데 사용하기 위한 PEG, 즉 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체의 하이드라진 또는 옥실아민 유도체인 신규한 폴리펩티드 변형 제제를 제공한다. 본 발명의 수용성 중합체 제제는 다양한 수용성 중합체를 목적하는 폴리펩티드에 공유 결합시키는데 사용할 수 있다. 본 수용성 중합체의 하이드라진 및 옥실아민 유도체, 즉 수용성 중합체 제제는 관심 대상인 단백질상에 존재하는 알데하이드 그룹 또는 기타 적합한 작용 그룹과의 반응을 통해 단백질에 공유 결합될 수 있다. 알데하이드 그룹은 폴리펩티드 상의 하이드록실 그룹(또는 기타 산화 활성화 그룹)을 부분 산화시켜 도입할 수 있다. 산화 활성화 그룹의 예에는 당단백질의 카보하이드레이트 잔기 상에 존재하는 하이드록실 그룹이 포함된다. 적합한 산화 방법, 즉 부분적 산화에는 관심 대상인 폴리 펩티드를 페리오데이트 또는 당해분야의 숙련가에게 공지된 기타 산화제와 같은 산화제로 처리하거나, 관심 대상인 단백질의 부위 상에서 산화 반응을 촉매할 수 있는 효소(예 : 갈락토오스 옥시다제)를 부가함을 포함한다. 본 발명의 또다른 양태는 제제 분자, 즉 수용성 중합체 하이드라진 또는 옥실아민 유도체에 의해 하나 이상의 수용성 중합체 하이드라진 또는 옥실아민 유도체에 의해 하나 이상의 수용성 폴리펩티드에 공유 결합될 수 있는 변형된 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
폴리펩티드에 대해 수용성 중합체를 커플링시키는 데 유용한 화합물의 일반식은 하기가 바람직하다:
하이드라진 유도체
(I) P-O-CH2-CO-NHNH2
하이드라진 유도체;
(II) P-O-CO-NHNH2
하이드라진 카복실레이트 유도체;
(III) P-NH-CO-NHNH2
세마카바지드 유도체;
(IV) P-NH-CS-NHNH2
티오세미카바지드 유도체;
(V) P-NHCO-NHNHCO-NHNH2
카본산 디하이드라지드 유도체;
(VI) P-NHNHCONHNH2
카바지드 유도체;
(VII) P-NHNHCSNHNH2
티오카바지드 유도체;
(VIII) P-NH-CO-C6H4NHNH2
아릴 하이드라지드 유도체 및
(IX) P-O-CO-CH2CH2-CO-NHNH2
하이드라지드 유도체;
옥실아민 유도체
(XIX) P-O-CH2CH2-CO-ONH2;
(XX) P-O-CH2CH2-O-CO-ONH2;
(XXI) P-O-CH2CH2-NH-CO-ONH2;
(XXII) P-O-CH2CH2-NH-CS-ONH2;
(XXIII) P-O-CH2CH2-0NH2;
(XXIV) P-O-CH2CH2-NH-CO-CH20NH2;
(XXV) P-O-CH2CH2-O-CO-CH2-0NH2;
(XXVI) P-O-CH2CH2-CH(OH)-CH2-0NH2; 및
(XXVII) P-O-CH2CH2-CO-CH2--0NH2.
P는 상기 일반식중 수용성 유기 중합체를 나타낸다. 관심있는 수용성 유기 중합체는 중합체 골격에 부착된 하이드록실 그룹을 지니며 하기를 포함하는 공지된 수용성 중합체로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: (a) 덱스트란 설페이트, P-아미노 가교결합된 덱스트린 및 카복시메틸 덱스트린을 포함하는 덱스트란 및 덱스트란 유도체, (b) 메틸셀룰로즈 및 카복시메틸 셀룰로즈를 포함하는 셀룰로즈 및 셀룰로즈 유도체, (c) 전분 및 덱스트린, 및 전분의 유도체 및 하이드로일락트, (d) 폴리에틸렌 글리콜, 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(여기서, 단독중합체 및 공중합체는 한쪽의 말단에서 알킬 그룹으로 치환되거나 비치환된다)을 포함하는 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, (e) 헤파린 및 헤파린의 프래그먼트, (f) 폴리비닐 알콜 및 폴리비닐 에틸 에테르, (g) 폴리비닐피롤리돈, (h) α,β-폴리[(2-하이드록시 에틸)-DL]-아스파트아미드, 및 (i) 폴리옥시에틸화 폴리올.
바람직하게는, 수-용성 중합체 (P)는 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 덱스트린 및 덱스트린 유도체, 더욱 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 유도체로부터 선택된다. 폴리에틸렌 글리콜 수용성 중합체에는 말단 하이드록실 그룹 하나가 R 그룹, 즉 RO-PEG(여기서, R은 알킬, 아릴, 알킬아릴, 아로일, 알카노일, 벤조일, 아릴알킬에테르, 사이클로알킬, 사이클로알킬 아릴 등일 수 있다)로 변형된 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 나열된 수용성 중합체는 P로써 나타낸 수용성 중합체의 단순한 예이다. 특정적으로 기술된 수용성 중합체의 다양한 유도체는 이들이 수용성인한 모두 고려될 수 있다. 더욱 바람직하게, 수용성 중합체 (P)는 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 유도체, (단백질 사이의 가교결합을 방지하기 위해) 특히 바람직한 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)의 모노메틸 에테르로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 수용성 중합체 제제에 의해 변형된 폴리펩티드가 약제로 사용될 경우, 중합체 P는 독성이 없어야 한다.
일반식 (I) 내지 (IX)의 화합물은 일반적으로 하기 일반식으로써 나타낼 수 있다:
상기식에서, X는 O 또는 S이고, Q는 -NHNH2및 -C6H4-NHNH2로 이루어진 그룹으로부터 선택되며; Y는 -O-, -OCH2-, -NH-, -NHNH-, -O-CO-CH2CH2- 및 -NHCO-N-NHNH로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; P는 수용성 유기 중합체(화합물 (I) 내지 (IX)와 같이)이다.
일반식 (XIX) 내지 (XXVII)의 화합물은 일반적으로 하기 식으로써 나타낼 수 있다 :
P - Y - X - Q
X는 C=O, C=S, CH2또는 CHOH이고; Q는 -ONH2- 및 -CH2-ONH2로 이루어진 그룹으로 부터 석택되며; Y는 -O-CH2CH2-, -O-CH2CH2-O-, -O-CH2CH2-N-, O-CH2CH2-S 및 -O-CH2CH2CH-로 이루어진 그룹으로 부터 선택되고; P는 수용성 유기 중합체(화합물 (XIX) 내지 (XXVII)와 같이)이다.
일반식 (I) 내지 (IX)의 분자이외에, 본 발명은 또한 일반식 (I) 내지 (IX)의 분자와의 반응에 의해 변형된 폴리 펩티드를 포함한다. 일반식 (I) 내지 (IV) 및 일반식 (VI) 내지 (IX)의 수용성 중합체 제제에 의해 변형된 폴리펩티드는 각각 하기 일반식 (X) 내지 (XVIII)으로 나타낼 수 있다 :
하이드라지드-변형된 폴리펩티드
(X) [P-O-CH2-CO-NHN=CH-]n-Z,
(XI) [P-O-CO-NHN=CH-]n-Z,
(XII) [P-NH-CO-NHN=CH-]n-Z,
(XIII) [P-NH-CS-NHN=CH-]n-Z,
(XIV) [P-NHCO-N-NHNHCO-NHN=CH-]n-Z,
(XV) [P-NHNCON=CH-]n-Z,
(XVI) [P-NHNCSN=CH-]n-Z,
(XVII) [P-NH-CO-C6H4-NHN=CH-]n-Z, and
(XVIII) [P-O-CO-CH2CH2-CO-NHN=CH-]n-Z,
상기식에서, P는 전술한 바와 같은 수용성 중합체이고, Z는 전술한 바와 같은 폴리펩티드이며, n은 1 내지 x(여기서, x는 폴리펩티드 Z중에 존재하는 산화 활성화 그룹의 최대 수이다) 범위내의 수이다. 수용성 중합체 제제와 Z사이에 형성된 하이드라존 결합내 C는 원래 Z상에 존재하나, 수용성 중하체 제제는 아니다.
일반식 (XIX) 내지 (XXVII)의 분자 이외에, 본 발명은 또한 일반식 (XIX) 내지 (XXVII)의 분자와의 반응에 의해 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 일반식 (XIX) 내지 (XXVII)의 수용성 중합체 제제에 의해 변형된 폴리펩티드는 각각 일반식 (XXVIII) 내지 (XXXVI)으로 나타낼 수 있다 :
옥실아민-개질된 폴리펩티드
(XXVIII) [P-O-CH2CH2-CO-ON=CH-]n-Z;
(XXIX) [P-O-CH2CH2-O-CO-ON=CH-]n-Z;
(XXX) [P-O-CH2CH2-NH-CO-ON=CH-]n-Z;
(XXXI)[P-O-CH2CH2-NH-CS-ON=CH-]n-Z;
(XXXII) [P-O-CH2CH2-ON=CH-]n-Z;
(XXXIII) [P-O-CH2CH2-NH-CO-CH2-ON=CH-]n-Z;
(XXXIV) [P-O-CH2CH2-O-CO-CH2-ON=CH-]n-Z;
(XXXV) [P-O-CH2CH2-CH(0H)-CH2-ON=CH-]n-Z;
(XXXVI) [P-O-CH2CH2-CO-CH2-ON=CH-]n-Z,
상기식에서, P는 전술한 바와 같은 수용성 중합체이고, Z는 전술한 바와 같은 폴리펩티드이며, n은 1 내지 x(여기서, x는 폴리펩티드 Z중에 존재하는 산화 및 활성화 그룹의 최대수이다)이다. 수용성 중합체 제제와 및 Z 사이에 형성된 옥심 결합내 탄소 원자는 원래 Z상에 존재하나 수용성 중합체 제제는 아니다.
비록 폴리펩티드가 폴리펩티드 분자당 x개 이하의 수용성 중합체의 커플링에 의해 변형될 수 있긴 하지만, x개 미만의 수용성 중합체 분자에 의해 주어진 폴리펩티드를 변형시킴이 바람직할 수 있다. 일부 폴리펩티드의 경우, 폴리펩티드의 분자당 수용성 중합체의 수의 증가가 변형되지 않은 폴리펩티드와 비교할때 생물학적 활성을 감소시킬 수 있기 때문에, 폴리펩티드를 최대수의 수용성 중합체(즉, x개의 수용성 중합체/폴리펩티드 분자)로 유도체화시킴이 바람직할 수 있다. 일예로, 제 2도, 제 4도, 제 5도, 제 9도, 제 10도 및 제 11도를 참도하면, 몇몇 결과는 수용성 중합체 변형된 EPO를 사용하여 수득한 것이다.
일반식 (X) 내지 (XVIII)의 하이드라존 결합된 화합물에서와 같이 및 일반식 (XXVIII) 내지 (XXXVI)의 옥심 결합된 화합물에서와 같이 당단백질 분자에 결합된 수용성 중합체의 수를 측정하는 상이한 방법은 상이한 결과를 가져올수 있다. 이와 같은 용도를 위하여, 폴리펩티드가 수용성 중합체 분자/단백질 분자의 주어진 수로서 유도된다고 가정하는 경우, 주어진 수용성 중합체의 수는 겔 여과 크로마토그래피 보유 시간에 의해 측정된 경험적으로 결정된 수치이다.
일반식 (X) 내지 (XVIII)의 화합물의 합성은 하이드라존 결합 및 이들 하이드라존 결합이 존재하는 폴리펩티드 상에서의 부위를 통하여 폴리펩티드에 결합된 수용성 중합체의 정확한 수에 대해서 다른 하나의 상이한 반응 산물의 혼합물의 생성을 초래할 수 있다. 유사하게 일반식 (XXVIII) 내지 (XXXVI)의 화합물의 합성은 옥심 결합 및 이들 옥심 결합이 존재하는 폴리펩티드 상의 부위에 결합된 수용성 중합체의 정확한 수에 대해서 다른 하나와 상이한 반응 산물의 혼합물의 생성을 초래할 수 있다. 중합체(P)가 가변하는 양의 다수의 동일한 단위를 포함함에 따라, P의 분자량은 상당히 변화할 수 있는 것으로 사료된다. 더우기, P가 주어진 분자량을 지니는 경우, 분자량은 분자내에 존재하는 소단위 수에 대해서 다른 하나와 상이한 분자 P의 그룹의 평균 분자량을 반영하는 단지 대략적인 것일 수 있다. 일반적으로, P의 분자량은 약 200 내지 200,000, 바람직하게는 700 내지 30,000, 더욱 바람직하게는 2,000 내지 12,000 범위일 수 있다. 일반식 (I) 내지 (IX)의 분자 및 일반식 (XXVIII) 내지 (XXXVI)의 분자가 폴리펩티드에 커플링될 경우, P에 대한 적합한 분자량은 변형될 특이한 폴리펩티드 및 선택될 특정한 수용성 중합체에 따라 변할 수 있다. 개개의 폴리펩티드 분자는 일반식 (I) 내지 (IX)의 화합물(하이드라존) 또는 일반식(XIX) 내지 (XXVII)의 화합물(옥심), 또는 하이드라존과 옥심의 모든 배합물의 상이한 양태와의 반응 수단에 의해 하나 이상의 상이한 수용성 중합체로 유도될 수 있다.
본 발명의 장점은 폴리펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 감소시키거나, 이미 공지된 화학적 커플링 방법 및 화합물에 의해 유사한 수의 동일한 수용성 중합체/ 폴리펩티드 분자를 결합시킴으로써 감소될 수 있는 생물학적 활성보다 적은 정도로 생물학적 활성을 감소시킴 없이, 수용성 중합체의 결합에 의해 폴리펩티드를 변형시킬 수 있다는 것이다. EPO의 생물학적 활성의 일면에는 적혈구 세포 형성의 자극이 포함된다. EPO의 생물학적 활성의 상세한 기술은 문헌[참조 ; Krantz, S.B., Blood 77:419-434(1991)]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 또 다른 장점은 일반식 (I) 내지 (IX)의 화합물 또는 일반식 (XIX) 내지 (XXVIII)의 화합물에 의해 변형된 폴리펩티드가, 동일한 펩티드를 라이신 변형을 위해 흔히 사용된 (기존의 발명 mPEG의 활성 에스테르를 이용하여 폴리펩티드에 대해 수용성 중합체를 결합시킴으로써 동일한 정도로 변형시킨 경우보다 이들의 생물학적 활성을 더욱 높은 정도로 보유할 수 있는 것이다. 즉, 본 발명은 변형과 관련하여 생물학적 활성의 상실이 최소화된 반면 수용성 중합체의 공유 결합과 관련된 장점을 지닌 변형된 폴리펩티드를 제공한다. 중요하게는, 수용성 중합체에 의해 더욱 높게 유도될 수 있으며, 한편으로는 더욱 높은 정도의 유도화와 관련한 장점을 지닐 수 있는 폴리펩티드를 통상적인 방법을 사용하여 수용성 중합체를 더욱 적은 정도로 유도시킨 폴리펩티드와 같이 생물학적 활성 수준이 동일하거나 더욱 높은 폴리펩티드로 제조할 수 있다.
단백질에 PEG를 커플링하기 위한 PEG-아민 대신 PEG (및 기타 수용성 중합체)의 유도체를 형성하는 하이드라존을 사용하는 다른 장점은 알데히드에 하이드라지드 또는 옥실아민(또는 유사한 화합물)을 커플링시키면 각각 하이드라존 또는 옥심이 수득되는 한편, 아민을 통해 커플링시키면 하이드라존 또는 옥심보다 덜 안정하며 적합한 유도체를 수득하기 위해 감소될 필요가 있는 이민을 수득하는 것이다. 따라서 하이드라존 형성 화합물 대신 아민을 사용하는 경우 별도의 단계가 요구된다.
본 발명의 다른 장점은 더욱 높은 수준의 수용성 중합체가 다른 수용성 중합체 유도체 보다 당단백질에 부착될 수 있다는 것이다. 세미카바지드[일반식(III)], 티오세미카바지드[일반식(IV)], 및 카본산 디하이드라지드 [일반식(V)] 유도체가 본 발명의 비교가능한 하이드라지드 유도체보다 더욱 높은 반응성으로 인하여 특히 관심있다. 본원에서 기술한 세미카바지드, 티오세미카바지드 및 카복실레이트 하이드라지드를 사용한 EPO의 mPEG 유도체화를 포함하는 반응은 각각의 EPO 분자당 약 31 내지 34개의 mPEG 분자의 첨가를 초래하는 반면, 상응하는 EPO의 하이드라지드 유도체를 사용하는 유사한 반응은 EPO 각각의 분자에 대해 mPEG 약 6 내지 12개의 분자의 추가를 초래한다. 카본산 디하이드라지드 및 하이드라지드 카복실레이트 유도체 및 EPO 사이의 반응은 EPO 각각의 분자에 대해 22개의 이하의 mPEG 분자 첨가를 가져온다. mPEG의 하이드라지드 유도체에 있어서 EPO의 각각의 분자에 대해 약 20개의 mPEG 분자를 혼입하기 위해서는, 매우 강한 산화 조건, 즉, 50mM의 과요오드화물하에 실온에서 60분간 배양하는 조건이 요구된다. 본 mPEG 세미카바지드 및 티오세미카바지드 유도체는 PEG를 사용하여 변형시킨 EPO를 유사한 정도로, 그러나 더욱 온화한 산화 조건, 즉 10mM 과요오드화물하에 5 내지 15분간 0℃에서 제공하는데 사용될 수 있다. 강한 산화 조건은 많은 폴리펩티드의 구조적 및 생물학적 특성에 역효과를 미칠수 있기 때문에, PEG 세미카바지드, 카본산 디하이드라지드, 하이드라지드 카복실레이트, 및 티오세미카바지드 유도체가 PEG(또는 기타 수용성 중합체)를 사용한 폴리펩티드 변형용으로 특히 유용한 화합물일 수 있다.
신규한 일련의 mPEG의 옥실아민 유도체를 합성하고 반응시켜 EPO의 산화된 카보하이드레이트 그룹을 형성한다. 몇몇 mPEG-옥실아민은 산화된 카보하이드레이트에 높은 반응성을 나타낸다. 또한, 더 적은 수의 mPEG는 EPO상에 혼입되어 세미카바지드 및 카복실레이트 하이드라지드(하이드라존 형성) mPEG-유도체로 나타난 바와 같이 여전히 높은 생체내 활성을 수득할 수 있다. 이러한 더욱 적은수의 mPEG 혼입을 더 짧고 더 완화한 조건을 변형에 사용할 수 있는 경우에 유리하다. 또한 mPEG-유도체의 더욱 적은 양은 변형 반응에서 사용할 수 있다.
유사하게, 일반식(XXI), 일반식(XXIV) 및 일반식(XXIII)의 화합물을 비교가능한 일반식(XIX) 옥실아민 유도체와 비교하여 사용할 경우, 특히 고농도의 수용성 중합체가 당단백질에 결합된다. 상술한 일반식(XXI) 및 일반식(XXIV)로 EPO를 유도화시키는 반응은 18 내지 19 이하의 mPEGS/EPO 및 EOP 1분자당 31mPEG 분자를 각각 생성시키는 반면에, EPO의 상응하는 일반식(XXII) 및 (XIX) 옥실아민을 사용한 유사한 반응은 EPO 1분자당 mPEG 약 3 내지 4분자를 생성한다. 더욱 중요하게는, 생성된 옥실아민-유도된 PEG-EPO의 생활성은 놀랍게도 수용성 중합체 대 EPO의 더욱 적당한 결합 농도에서 훨씬 높다(참조 하기 및 제 17도). 이와 관련하여, 일반식(XXIII)의 12mPEG 분리된 분획의 생활성은 특히 중요하다(제 16도 및 제 17도 참조).
mPEG를 산화된 카보하이드레이트 그룹에 커플링시켜 높은 활성을 갖는 긴 작용성 mPEG-EPO를 생성하는 능력은 선택된 mPEG-유도체에 의존한다. 어느 정도의 mPEG 카보하이드레이트 변형 유도체는 최적량의 mPEG를 EPO 상에 결합시키기에는 반응성이 충분하지 못하다. 몇몇 mPEG-유도체는 생성된 결합의 안정성으로 인해 EPO상에 다랑의 혼입을 요구한다. mPEG 혼입의 최적량은 세미카바지드 유도체에 대해 약 17 내지 25, 더욱 바람직하게는 약 22이고; 카복실레이트 하이드라지드 유도체에 대해 약 22 내지 32, 더욱 바람직하게는 약 31이다. mPEG-옥실아민의 반응성은 약 3 내지 36mPEGs/EPO이다.
본 발명의 수용성 중합체 제제는 다양한 폴리펩티드, 또는 알데히드 또는 하이드록실 그룹의 산화로부터 유도된 본 발명의 수용성 중합체 제제의 하이드로지드 분율(또는 유사한 작용성 분율)과 화학적으로 반응할 수 있는 유사한 화학 반응성을 갖는 작용성 그룹(예 : 케톤, 락톤, 활성화된 카복실산 또는 활성화된 카복실산 유도체)을 함유하는 유사한 분자를 변형시키기 위해 사용될 수 있고, 다른 산화반응 활성 가능한 그룹의 산화는 중요한 폴리펩티드(본 폴리펩티드는 당단백질인 경우 카보하이드레이트 잔기, 및 1차 서열에서 아미노산 잔기, 예를 들면, 세린, 트레오닌, 하이드록시리신의 N-말단을 포함)상에 존재하거나, 하이드라진 또는 옥실아민 반응성 그룹이 임의의 산화적 처리전 또는 이후에 폴리펩티드 상에 존재하는 것이다. 중요한 폴리펩티드는 항체, 모노클로날 및 폴리클로날, 시토킨, 성장인자, 호르몬, 효소, 단백질 또는 펩티드 리간드 등을 포함한다. 본 발명의 수용성 중합체 제제 분자를 형성하는 하이드라존 결합 또는 옥심 결합에 의해 변형시키기 위해 중요한 폴리펩티드는 천연 원료, 유전공학 세포, 예를 들면 EPO의 생성을 위한 표현 벡터로 변형되거나 시험관내 합성 방법에 의해 생성된 CHO 세포로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 목적에 대해 특히 바람직한 폴리펩티드는 사람이든 제조합형 개체든 EPO, 및 이의 전구체 및 중간체 및 모방체이다.
본 발명의 수용성 중합체 제제를 사용하여 대부분의 폴리 펩티드를 변형시킬 수 있는 반면에, 이것은 (1) 약물로서 사용하기 위한 폴리펩티드, 및 (2) 분석에서 사용하기 위한 폴리 펩티드를 변형시킨다는 것이 특히 중요하다. 분석에서 사용하기 위한 폴리펩티드는 특이적 결합 단백질, 특이적-결합 단백질 및 효소에 의해 인식된 폴리펩티드를 포함한다. 특이적 결합 단백질에 의해, 항체, 호르몬, 수용체, 렉틴등이 의도된다.
다양한 폴리펩티드는 상이한 수용성 중합체에 결합시키기 위해 및 상이한 농도 또는 변형으로 본 발명의 수용성 중합체 제제 및 이들을 사용하는 방법에 의해 변형될 수 있다. (1) EPO에 대한 유도된 mPEG의 반응성, 및 생성된 mPEG-EPO의 생활성(예 : mPEG/EPO의 약 3 내지 36 분자로부터의 반응성)에 좌우될 수 있는, 개개 폴리펩티드 분자에 결합된 수용성 중합체의 수; (2) 수용성 중합체의 분자량(예 : 2,000 내지 12,000달톤); (3) 수용성 중합체의 구조(예 : 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜)); (4) 수용성 중합체 제제와 중요한 폴리펩티드 사이의 반응에서의 조건(예 : 온도 및 기간); 및 (5) 변형에 대한 폴리펩티드는 공유 결합하기 위해 활성화되는 산화 조건(예 : 단백질 1mg당 10 내지 40μmol/mg 범위의 과요오드산염)과 같은 다양한 매개 변수는 생성된 수용성 중합체 변형된 폴리펩티드의 생물학적 성질에 영향을 줄 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 공유 포합하기 위한 폴리 펩티드의 활성은 과요오드산염(0.1 내지 1,000μmol/mg 단백질)과 변형시키기 위한 단백질을 1분 내지 3일, 더욱 바람직하게는 단백질 1mg당 과요오드산염 0.5 내지 50μmol을 5분 내지 180분 동안 혼합시켜 수행한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 포합하기 위한 활성은 과요오드산염과 변형시키기 위한 단백질을 -10℃ 내지 50℃, 더욱 바람직하게는 0℃ 내지 30℃에서 혼합시킴에 의해 수행한다.
변형시키기 위한 단백질이 EPO인 경우 본 발명의 바람직한 양태에서, EPO는 일반식(II) 내지 일반식(VIII)의 화합물로 유도되고, 더욱 바람직하게는 일반식(II) 내지 일반식(V)의 화합물, 일반식(III)의 화합물, 세미카바지드, 및 일반식(II), 카복실 레이트 하이드라진, 특히 바람직하게는 수용성 중합체 P가 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이고 EPO 각 분자가 메톡시폴리에틸렌 글리콜 3 내지 36분자, 더욱 바람직하게는 17 내지 25분자(세미카바지드의 경우), 및 더욱 바람직하게는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 22 내지 32분자(카복실레이트 히드라지드)에 의해 유도되고 사용되는 mPEG는 평균 분자량이 약 5000달톤이다. mPEG 5000 세미카바지드 변형된 EPO를 생성하기 위한 바람직한 반응 조건은 0 내지 30℃에서 5 내지 60분 동안이고, EPO 1mg당 과요오드산염 0.5 내지 50μmole(산화제로서 과요오드산염)이다. 본 발명의 수용성 중합체 제제 및 방법에 의해 변형시키기 위한 EPO는 바람직하게는 유전 공학 세포, 더욱 바람직하게는 EPO를 생성하기 위해 유전적으로 변형된 CHO 세포로부터 수득된다. EPO를 변형시키기 위한 바람직한 수용성 중합체 제제 및 조건을 사용하여, 기대치 못한 EPO의 생활성 반감기가 연장되고 증가된 헤마토크릿 농도가 증가되었음을 예를 들면 제 2도, 제 4도 및 제 5도에서 확인할 수 있다.
다른 바람직한 양태에서, EPO는 일반식(XX) 내지 (XXVII)의 화합물, 더욱 바람직하게는 일반식 (XXI), (XXIV) 및 (XXIII)의 화합물로 유도되며, 여기서 수용성 중합체 P는 mPEG이고 EPO 1분자당, 각각 일반식(XXI), (XXIV) 및 (XXIII)에 대해 약 18 내지 19mPEG, 31mPEG, 및 17mPEG에 의해 유도된다. 이들 결과는 사용된 mPEG의 평균 분자량이 약 5000달톤일 경우 수득 된다. 일반식(XXIII)의 화합물은 22mPEG 세미카바지드 및 31mPEG 카복실레이트 하이드라지드와 비교되는 생체내 생활성을 갖는 12mPEG 분획을 갖는다. 일반식(XXI), (XXIV) 및 (XXIII)의 반응성(mPEG/EPO)은 동일 반응 조건하에서 PEG 하이드라존의 반응성을 초과한다. mPEG 5000 옥심을 생성하기 위한 바람직한 조건은 더욱 높은 생체내 생활성을 생성하기 위해 더욱 완화한 산화 조건, 예를 들면 더 짧은 산화 시간 또는 상응하는 하이 드라지드 보다 더 적은 농도의 산화제가 요구될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 수용성 중합체 제제로 포함, 즉 공유 포함시키기 위해 폴리펩티드를 활성화시키는 방법을 제공한다. 포합시키기 위한 폴리펩티드를 활성화시키는 방법은 부분적으로 중요한 폴리펩티드를 산화시키는 단계를 포함한다. 부분적 산화는 과요오드산염 및 당해 분야의 전문가에게 공지된 다른 산화제와 같은 산화제를 첨가함에 의해 또는 갈락토즈 옥시다제와 같은 중요한 폴리펩티드 분율에 대한 산화반응을 촉진시킬 수 있는 효소를 첨가하므로써 성취될 수 있다. 결합 시키기 위한 폴리펩티드를 부분적으로 산화시키는 방법은 과요오드산염을 단백질 1mg 당 0.1 내지 1,000μmole 농도를, 1분 내지 3일 동안, 더욱 바람직하게는 단백질 1mg 당 과요오드산염 0.5 내지 50μmole 농도는 5분 내지 180분 동안 첨가하는 것이다. 활성화를 수행하는 바람직한 온도는 -10℃ 내지 50℃, 더욱 바람직하게는 0℃ 내지 30℃이다.
상술한 어떠한 거대 분자의 염들, 예를 들면, 폴리펩티드, 수용성 중합체 및 이의 유도체는 이러한 분자가 다양한 pH의 수용액(또는 분리된)에서 존재할 경우 자연적으로 발생할 수 이다. 상술한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 및 다른 거대 분자의 모든 염들은 본 발명의 범주내에 있다고 생각된다. 예로는 알카리, 알칼리 토금속, 및 다른 카복실산 잔기의 금속염, 아미노 잔기의 산부가염(예 : HCl), 및 동일분자내에서 카복실산 및 아미노 잔기 사이에 반응에 의해 형성된 양쪽성 이온을 포함한다.
본 발명의 제제의 투여 형태는 본 화합물(들)이 도달될 유가체내에 위치 및/또는 세포를 결정할 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독으로 투여될 수 있지만 통상적으로 의도하는 투여 경로 및 표준 약제학적 실시에 대하여 선택된 약제학적 담체 또는 희석제와 혼합하여 투여될 것이다. 본 제제는 동맥내 또는 정맥내와 같은 비경구적으로 투여될 수 있다. 본 제제는 또한 경구, 피하, 또는 근육내 경로로 전달될 수 있다. 비경구로 투여하기 위해, 이들은 예를 들면, 용액을 등장성으로 만들기에 충분한 염들 또는 글루코즈와 같은 다른 용질을 함유할 수 있는 멸균, 수용액의 형태로 사용될 수 있다.
경구 형태의 투여에 대해서, 본 발명의 EPO 조성물은 정제, 캡슐, 로젠그스, 산제, 시럽, 예릭실제, 수용액 및 현택액등의 형태로 사용될 수 있다. 정제의 경우에, 사용될 수 있는 담체는 락토즈, 나트륨 시트레이트, 및 인산염을 포함한다. 전분과 같은 다양한 붕해제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활탁제는 정제에서 통상적으로 사용된다. 캡슐 형태로 투여하기 위해, 유용한 희석제는 락토즈 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이다. 수용액이 경구용으로 요구될 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제를 첨가할 수 있다.
EPO 치료에 반응하는 질병 상태의 치료에서 사람에게 투여할 경우, 처방 의사는 궁극적으로 치료 대상 사람에 대해 적합한 투여량을 결정할 것이며, 이것은 개개인의 체중, 연령 및 반응 외에도 환자의 질병의 특성 및 심한 정도에 따라 변할 수 있다. 퍼길레이트화된 형태에 약물의 투여량은 통상적으로 원래 약물에 대해 사용되는 것과 대략 비슷하지만, 어느 정도의 경우에서 이들 한계치를 벗어나는 투여량을 투여하는 것이 바람직하거나 필요하다.
또한 일반식(I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), 및 (IX), 및 (XIX), (XX), (XXI), (XXII), (XXIII), (XXIV), (XXV), (XXVI) 및 (XXVII)의 수용성 중합체 제제를 분리적으로 또는 다양한 배합, 키트의 형태로 공급하여 중요한 펩티드의 편리하고 재생성가능한 유도화를 제공한다. 중요한 키트는 일반식(I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), 또는 (IX), 또는 일반식(XIX), (XX), (XXI), (XXII), (XXIII), (XXIV), (XXV), (XXVK) 및 (XXVII)의 수용성 중합체 제제, 완충제, 산화제, 반응 지시 화합물, 단백 농도 측정제(예 : 브레드포드(Bradford) 분석)등을 포함한 용액을 함유할 수 있다. 키트내에 포함된 화합물은 바람직하게는 재생성 및 최소 실수를 제공하기 위해 예비-측정된 분율 및 예비-혼합된 용액으로 제공된다. 키트는 또한 설명을 포함한다. 설명은 본 발명의 방법을 수행할 경우 여러가지 단계를 지시한다.
수용성 중합체 유도체의 합성
본 발명의 화합물의 하기 합성법은 예시적이고 본 발명을 제한하지 않는다. 유기 화합 분야에 통상 기술자는 예시된 합성법을 변형시킬 수 있다.
하이드라존 형성 m-PEG의 합성
mPEG-하이드라지드 합성
mPEG-하이드라지드를 합성하는 다수의 벙법이 있다. 두가지 방법을 예시한다.
mPEG 5000-산(20.8g, 4mmol)을 디클로로메탄 30ml에 용해시키고 디클로로메탄 15ml중 t-부틸카바지드(2.64g, 8mmol)를 가한 다음, 디사이클로헥실카보디이미드 1.68(8mmol)을 디메틸 포름 아미드 10ml에 용해시킨다. 반응을 실온에서 밤새 수행시킨 후, 반응 혼합물을 여과한다. 여액을 농축시키고 생성된 잔사를 디클로로메탄에 취한다. 에테르를 가해서 mPEG-t-부틸-카바지드를 침전시키고 이것을 여과해서 건조시킨다. 생성물을 디클로로메탄/트리플로오로아세트산(1:1) 혼합물에 넣는다. 40분후, 용액을 농축시키고, 디클로로메탄에 재용해시켜서 에테르를 가한다. 생성물을 여과로 회수한다.
수율 : 17.7g
IR: (C=O) 1730, 1700,
원소분석 계산치 : N, 0.55.
실측치 : N, 0.44.
하기 나타낸 선택적 방법은 하기와 같이 mPEG-알콜을 에스테르로 전환시킨다. 그런 다음, mPEG-에스테르를 하이드라진으로 가수분해시켜 mPEG-하이드라지드를 수득한다. mPEG-에스테르의 합성은 문헌[참조 : ROyer, G.P., and Anantharmaiah, G.M. (1979) J. Amer. Chem. Soc. 101, 3394-3395]과 유사하다.
통상적인 합성 방법에 있어서, mPEG-OH는 고진공 오븐에서 85°에서 약 5시간 동안 건조시킨다. 냉각시킨 후, mPEG-OH(MW=5000, 1mmol) 5g을 무수 테트라하이드로푸란 5ml에 용해시킨다. 수소화나트륨 26.4mg(1.1mmol)에 무수 테트라하이드로 푸란 1ml를 가한다. mPEG 5000 용액을 NaH에 적가하다. 혼합물을 아르곤 대기하의 실온에서 1시간 동안 교반한다. 이동안 용액은 오렌지 색을 띠게 된다. 브로모아세틸산 벤질 에스테르(2.29g, 10mmol)를 무수 테트라하이드로푸란 1ml에 용해시키고 이를 mPEG 5000 혼합물에 적가한다. 반응물을 아르곤 대기하의 실온에서 밤새 교반한 후 여과한다. 냉 에테르를 여액에 가하여 mPEG 5000-벤질 에스테르를 침전시키고 고체를 수거하여 건조시킨다. 수율 4.5g, IR(C=O) 1752, 화합물은 메탄올/메틸렌 클로라이드(5:1)로 용출시키면서 LH-20 컬럼에서 겔 여과에 의해 다시 정제한다.
mPEG 5000-벤질 에스테르는 히드라진으로 처리하여 하이드라지드로 전환시킨다. 통상의 실험에서는, mPEG 5000-벤질 에스테르 1.0g(0.194mmol)을 아르곤 대기하에 메탄올/메틸렌 클로라이드 3ml에 용해시킨다. 하이드라진(0.091ml, 2.91mmol)을 가하고 용액을 실온에서 약 70시간 동안 교반한다. 혼합물을 메탄올/메틸렌 클로라이드(5:1)로 용출시키는 LH-20 컬럼에 가한다. mPEG 5000-하이드라진을 하이드라지드로부터 분리하여 에테르로 침전시킨다. 교체를 여과하여 수거한다.
수율 0.78g
IR(H2N-C=O): 1669.
분석, 계산치 : N, 0.55.
실측치 : N, 0.34.
상기 기술한 방법을 사용하여 mPEG 2000-하이드라지드, mPEG 6000-하이드라지드, mPEG 8500-하이드라지드 및 mPEG 12000-하이드라지드를 또한 합성한다.
상기 mPEG 5000-하이드라진 카복실레이트는 다음과 같이 합성한다. 메톡시폴리옥시에틸렌 이미다졸릴 카보닐(시그마케미칼로부터 구입, 2.5g, 0.49mmol)을 메틸렌 클로라이드 10ml 중의 하이드라진(0.077ml, 2.45mmol)으로 처리한다. 실온에서 4시간 후 반응 혼합물을 여과하고 여액을 냉 에테르로 처리한다. 생성된 침전물을 수거한다.
수율 : 2.22g,
IR(C=O): 1718.
분석. 계산치 : N, 0.55.
실측치 : N, 0.595.
상기 mPEG 5000-세미카바지드는 다음과 같이 합성한다. mPEG 5000-아민을 문헌[참조: Rajasekharan Pillai, V.N., 및 Mutter, M. (1980) J. Org. Chem. 45, 5364-5370]에 기술된 바와 같이 합성한다. mPEG 5000-아민(2g, 0.4mmol)을 디클로로메탄 9ml에 용해시키고 트리에틸아민 0.28ml를 가한다. 아르곤 대기하에서 포스겐(톨루엔중, 0.42ml, 0.8mmol)을 혼합물에 가한다. 밤새 반응시킨 다음 아르곤으로 버블시켜 과량의 포스겐을 제거한다. 용액을 농축시키고 잔사를 디클로로메탄에 용해시킨 다음, 하이드라진 0.063ml(2mmol)에 이어 메탄올 2ml를 가한다. 4시간 동안 반응시킨 다음 냉 에테르를 가하고 침전물을 여과하여 제거하여 건조시킨다.
수율 : 1.51g.
IR(C=O) : 1683.
분석. 계산치 : N, 0.83.
실측치 : N, 0.56.
상기 기술한 방법을 사용하여 mPEG 2000, mPEG 6000, mPEG 8500 및 mPEG 12000의 세미카바지드를 또한 합성한다.
mPEG-티오세미카바지드의 합성
디클로로메탄 5ml 중의 mPEG 5000-아민 1.5g(0.3mmol)에 트리에틸아민 0.1ml(0.75mmol) 및 디-2-피리딜티오노카보네이트 0.071g(0.3mmol)을 가한다. 밤새 반응시키고 하이드라진 0.047ml(0.3mmol)를 가한다. 4시간 후, 혼합물을 여과하고 여액을 냉에테르로 처리한다. 생성물을 여과하여 수거한다.
수율 : 1.34g.
IR(N-H 스트레치) : 3332.
분석. 계산치 : N, 0.83.
실측치 : N, 0.255.
mPEG-카본산 디하이드라지드의 합성
아르곤으로 퍼어징시킨 반응 플라스크에 디클로로메탄 2ml 중의 3급-부틸 카바자이트(0.04g, 0.3mmol), 트리에틸아민 0.084ml(0.6mmol) 및 토리포스겐 0.03g(0.1mmol)을 가한다. 5분후, 디클로로메탄 4ml 중의 mPEG 5000-아민 1.5g(0.3mmol)을 가한다. 밤새 반응시킨 다음 냉에테르를 가하여 생성물을 침전시킨다. 생성물을 여과하여 분리한다. 수율: 1.44g. 보호된 디하이드라지드(0.61g)를 실온에서 10분간 트리플루오로아세트산 2ml로 처리한다. 트리플루오로아세트산을 제거하고 생성된 오일을 메틸렌 클로라이드에 용해시켜 농축시킨다. 이 단계를 반복한다. 오일을 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 생성물을 냉에테르로 침전시킨다. 생성물을 여과하여 분리한다.
수율: 0.41g.
IR(C=O): 1965.
분석. 계산치 : N, 1.37.
실측치 : N, 0.41.
상기 mPEG 5000-아릴하이드라진을 다음과 같이 합성한다. 4-하이드라지노벤조산과 디옥산 중의 디-3급-부틸 파이로카보네이트를 0℃에서 염기의 존재하에 반응시켜 Boc-NHNH-C6H4-COOH를 제조한다. 보호된 아릴산 하이드라진(0.378g, 1.5mmol)을 디클로로메탄/디메틸포름아미드 용액(4ml, 1:1) 중에서 mPEG-아민(1.5g, 0.3mmol)과 반응시킨다. 디사이클로헥실카보디이미드(0.31g, 1.5mmol), 1-하이드록시벤조트리아졸(0.2g, 1.5mmol) 및 트리에틸아민(0.21ml, 1.5mmol)을 또한 가한다. 밤새 반응시킨 다음, 반응물을 여과한다. 여액을 에테르로 처리하고 침전물을 수거한다. 침전물을 트리플루오로아세트산으로 처리하고 30분후, 트리플루오로아세트산을 제거한다. 오일성 잔사에 에테르를 가하여 mPEG-아릴하이드라진 생성물을 침전시킨다. 생성물을 여과하여 분리한다.
수율: 1.19g.
IR(N-H): 3267; (C=O): 1655; (C=C): 1606.
분석. 계산치 : N, 0.82.
실측치 : N, 0.50.
옥심-형성 mPEG의 합성
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-CO-ONH2의 합성
mPEG 5000-석신이미드 에스테르(NHS)(2.0g, 0.4mmol)를 디클로로메탄 10ml에 용해시킨다. 3급-부틸 N-하이드록시카바메이트(0.53g, 4mmol)에 이어 트리에틸아민 0.7ml, 5mmol)을 가한다. 밤새 반응시킨 다음 냉 에스테르를 가하고 생성된 침전물을 여과하여 수거하여 세척 및 여과한다. 생성물(1.5g)을 디클로로메탄/트리플루오로아세트산(1:1) 혼합물에 가한다. 60분후, 용액을 농축시킨다. 화합물은 메탄올/메틸렌 클로라이드(5:1)로 용출시키면서 LH-20 칼럼에서 겔 여과하여 다시 정제시킨다.
수율: 1.2g.
IR(C=O): 1741.
분석. 계산치 : N, 0.28.
실측치 : N, 0.13.
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-CO-ONH2의 합성
mPEG 5000-옥시카보닐이미다졸(2.0g, 0.4mmol)을 디클로로메탄 10ml에 용해시킨다. 3급-부틸 N-하이드록시카바메이트(0.53g, 4mmol)에 이어 트리에틸아민 0.7ml(5mmol)를 가한다. 밤새 반응시킨 다음, 냉 에테르를 가하고 생성된 침전물을 여과하여 수거하여 세척 및 여과한다. 생성물(1.5g)을 디클로로메탄/트리플루오로아세트산(1:2) 혼합물에 가한다. 60분 후, 용액을 농축시킨다. 화합물은 메탄올/메틸렌 클로라이드(5:1)로 용출시키면서 LH-20 칼럼에서 겔여과하여 다시 정제시킨다.
수율: 1.2g.
IR(C=O): 1692.
분석. 계산치 : N, 0.28.
실측치 : N, 0.15.
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-CO-ONH2의 합성
mPEG 5000-아민(2.0g, 0.4mmol)을 카보닐디이미다졸(0.23g, 1.45mmol)과 함께 클로로포름 10ml에 용해시킨다. 이를 문헌[참조: Ranucci, E., 및 Feruti, P. (1991) Macromolecules 24, 3747-3752]에 기술된 바와 같이 카보닐디이미다졸을 사용하여 mPEG-알콜을 활성화시키기 위한 방법에 따라 반응시킨다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 물 7ml를 가하고 유기층을 추출한다. 수 추출을 5회 반복한다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 염을 여과한다. 여액에 t-부틸 IV-하이드록시 카바메이트(0.53g, 4mmol)을 트리에틸아민(0.71ml, 5mmol)과 함께 가한다. 반응물을 밤새 교반한 후에 냉 에테르를 가하고 생성된 침전을 여과하여 수집하고 세척하고 건조시킨다. 생성물(1.5g)을 디클로로메탄/트리플루오로아세트산(1:2) 혼합물 중에 넣는다. 60분 후에 용액을 농축한다. 화합물을 메탄올/메틸렌 클로라이드(5:1)로 용출시키면서 LH-20 칼럼 상에서 겔 여과하여 추가로 정제한다.
수율: 1.3g
IR: (C=O): 1726.
원소분석. 계산치 : N, 0.55.
실측치 : N, 0.43.
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-CS-ONH2의 합성
mPEG-5000-아민(1.5g, 0.3mmol)을 디클로로메탄 30ml에 용해시킨다. 트리에틸아민(0.1ml, 0.75mmol)을 가한 후 디-2-피리딜티오노카보네이트(0.082g, 0.35mmol)을 가한다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후에 t-부틸 N-하이드록시카바메이트(0.52g, 4mmol)과 함께 트리에틸아민(0.5ml, 3.75mmol)을 가한다. 반응물을 밤새 교반한 후 냉 에테르를 가하고 생성된 침전을 여과하여 수집하고 세척하고 건조시킨다. 생성물(1.6g)을 디클로로메탄/트리플루오로아세트산(1:1) 혼합물 중에 넣는다. 30분 후에 용액을 농축한다. 화합물을 메탄올/메틸렌 클로라이드(5:1)로 용출하면서 LH-20 칼럼상에서 겔여과한다.
수율: 0.72g.
IR: (C=S): 1684.
원소분석. 계산치 : N, 0.55.
실측치 : N, 0.30.
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-ONH2의 합성
mPEG-5000-트레실레이트(2.0g, 0.4mmol)을 디클로로메탄 10ml에 용해시킨 다음 t-부틸 N-하이드록시카바메이트(0.53g, 4mmol) 및 트리에틸아민(0.7ml, 5mmol)를 가한다. 혼합물 45℃(환류)로 가열하고 반응물을 밤새 반응시킨다. 냉 에테르를 반응 혼합물에 가하고 생성된 침전물을 여과하여 수집하고, 세척하고 건조시킨다. 생성물(1.5g)을 디클로로메탄/트리플루오로아세트산(3:7) 혼합물 중에 넣는다. 60분 후에 용액을 농축한다. 화합물을 메탄올/메틸렌 클로라이드(5:1)로 용출시키는 LH-20칼럼 상에서 겔여과에 의해 추가로 정제한다.
수율: 1.6g.
원소분석; 계산치 : N, 0.28.
실측치 : N, 0.19.
다른 합성법은 다음과 같다. t-부틸 N-하이드록시카바 메이트(0.53g, 4mmol)를 테트라하이드로푸란 1ml에 가한후 NaH(78mg, 3.25mmol)에 가한다. 수 분후에 당해 용액을 테트라하이드로푸란 5ml중 mPEG-5000-트레실레이트(1.0g, 0.2mmol)에 가한다. 혼합물을 40℃로 가열한 후 밤새 반응시킨다. 냉 에테르를 반응 혼합물에 가하고 생성된 침전물을 여과하여 수집하고, 세척하고 건조시킨다. 생성물(1.5g)을 디클로로메탄/트리플루오로아세트산(3:7) 혼합물 중에 넣는다. 60분 후에 용액을 농축한다. 화합물을 메탄올/메틸렌클로라이드(5:1)로 용출시키는 LH-20 칼럼상에서 겔 여과에 의해 정제한다.
수율: 0.75g.
원소분석. 계산치 : N, 0.28.
실측치 : N, 0.10.
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-NH-CO-CH2-ONH2의 합성
mPEG-5000-아민(2.0g, 0.4mmmol) 및 Boc-아미노옥시아세트산(0.2g, 1.05mmol)을 디클로로메탄 20ml에 용해시키다. 벤조 트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스 페이트(1.1g, 2mmol)를 가한 후 디이소프로필에틸아민(0.7ml, 3.9mmol)을 가한다. 반응물을 실온에서 약 72시간 동안 교반한 후에 냉 에테르를 가하고 생성된 침전물을 여과하여 수집하고, 세척하고 건조시킨다. 수집된 침전물의 반을 디클로로메탄/트리플루오로아세트산(3:7) 혼합물 중에 넣는다. 60분 후에 용액을 농축한다. 화합물을 메탄올/메틸렌 클로라이드(5:1)로 용출시키는 LH-20 칼럼 상에서 겔 여과에 의해 추가로 정제한다. 생성된 황색 침전물을 물에 용해시키고 탈색 탄소로 처리한다. 약 24시간 후에 탈색 탄소를 여과하고, 맑은 여액을 농축한다. 잔사를 디클로메탄에 용해시키고, 황산나트륨으로 건조시키며, 여과하고 여액을 냉 에테르로 처리한다. 백색 생성물을 수득한다.
수율: 0.5g.
IR; (C=O): 1676.
원소분석. 계산치 : N, 0.55.
실측치 : N, 0.50.
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-CO-CH2-ONH2의 합성
mPEG-500-아민(2.0g, 0.4mmmol) 및 Boc-아미노옥시아세트산(0.2g, 1.05mmol)을 디클로로메탄 20ml에 용해시킨다. 벤조 트리아졸-1-일-옥시트리피롤리딘포스포늄 헥사플루오로포스 페이트(1.1g, 2mmol)를 가한 후 디이소프로필에틸아민(0.7ml, 3.9mmol)을 가한다. 반응물을 실온에서 약 2시간 동안 교반한 후에 디메틸아미노피리딘(0.244g, 2mmol)을 가한다. 약 4일 후에 냉 에테르를 가하고 생성된 침전물을 여과하여 수집하고, 세척하고 건조 시킨다. 침전물을 물에 용해시키고 탈색 탄소로 처리한다. 약 24시간 후 탈색 탄소를 여과하고 맑은 여액을 농축한다. 잔사를 디클로로메탄에 용해시키고, 황산나트륨으로 건조시킨 다음 여과하고, 여액을 냉 에테르로 처리한다.
원소분석. 계산치 : N, 0.28.
실측치 : N, 0.14.
수집한 침전물의 반을 디클로로메탄/트리플루오로아세트산(2:1) 혼합물 중에 넣는다. 30분 후에 용액을 농축한다. 화합물을 메탄올/메틸렌 클로라이드(5:1)로 용출시키는 LH-20 칼럼상에서 겔 여과에 의해 추가로 정제한다.
수율: 0.3g.
IR; (C=O): 1734.
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-CH(OH)-CH2-ONH2의 합성
mPEG-5000-에폭사이드(1.0g, 0.2mmol)을 0.1M NaOH 10ml에 용해시키고, t-부틸 N-하이드록시카바메이트(0.53g, 4mmol)을 가한다. 밤새 반응시킨 후에 반응 혼합물을 디클로로 메탄으로 추출한다. 황산나트륨을 가하고 여과한다. 냉 에테르를 디클로로메탄 용액에 가하고, 생성된 침전물을 여과하여 수집하고, 세척하고 건조시킨다. 화합물을 메탄올/ 메틸렌 클로라이드(5:1)로 용출시키는 LH-20 칼럼 상에서 겔 여과에 의해 추가로 정제한다. 보호된 mPEG-유도체(0.25g)을 디클로로메탄/트리플루오로아세트산(1:1) 혼합물에 용해시킨다. 30분 후에 용액을 농축하고 디클로로메탄에 용해시킨다. 화합물을 에테르로부터 침전시켜 분리하다.
수율: 0.2g.
IR; (O-H): 3447.
원소분석. 계산치 : N, 0.28.
실측치 : N, 0.21.
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-CO-CH2-ONH2의 합성
mPEG-O-CH2CH2-CH(OH)-CH2-ONH-Boc(0.3g, o.6mmol)을 무수 디메틸 설폭사이드 3ml에 넣고 무수 아세트산 무수물 2ml를 가한다. 약 24시간 동안 실온에서 반응 시킨후, 냉 에테르를 가하고, 생성된 침전물을 여과하여 수집하고, 세척하고 건조시킨다. 생성물을 디클로로메탄/트리플루오로아세트산(1:1) 혼합물 중에 넣는다. 30분 후에, 용액을 농축한다. 화합물을 냉 에테르로부터 침전시켜 분리한다.
수율: 0.18g.
IR; (C=O): 1698.
원소분석. 계산치 : N, 0.28.
실측치 : N, 0.20.
mPEG-오르니틴 세미카바자이드의 합성
mPEG-5000-아민(5.0g, 1mmol)을 무수 메틸렌 클로라이드 5ml에 용해시키고 무수 디메틸포름아미드 10ml를 가한다. Fmoc-Orn(Boc)-OPfp(3.1g, 5mmol)을 가한다. 1시간 후에 용액을 실온에서 농축한다. 잔사에 물을 가하고, 용액을 여과하고, 원심분리하고, 여과하여 수용액 중에 분산된 고체를 제거한다. 여과한 수용액을 농축하고, 잔사를 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 황산나트륨으로 건조시킨다. 용액을 여과한다. 여액을 냉 에테르로 처리한다. 생성된 침전물을 여과하여 수집하고, 세척하고 건조시킨다.
수율: 3.3g.
IR; (C=O): 1713, 1680.
Fmoc 그룹을 25% 피페리딘(메틸렌 클로라이드중)로 30분간 화합물을 처리하여 제거한다. 냉 에테르를 용액에 가하여 mPEG-유도체를 침전시킨다. 침전물을 수집하고, 세척하고 건조 시킨다. mPEG-유도체 1.4g을 메틸렌 클로라이드 3ml에 용해시키고 아세트산 무수물 1ml를 가하여 유리 α-아미노 그룹을 아세틸화시킨다. 약 1.7시간 후에 용액을 실온에서 농축한다. 생성된 고체를 메틸렌 클로라이드(3:5)중 트리플루오로아세트산으로 실온에서 1시간 동안 처리한다. 용매를 제거하고 생성된 오일을 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 냉 에테르를 가한다. 형성된 침전물을 수집하고, 세척하고 건조시킨다.
수율: 1.1g.
IR; (C=O): 1685.
mPEG-유도체를 무수 메틸렌 클로라이드 3ml에 용해시키고 트리에틸아민(0.54ml, 3.84mmol)을 가한 후 톨루엔(1.92mmol)중 포스겐 1ml를 가하고 무수 메틸렌 클로라이드 2ml를 추가로 가한다. 실온에서 밤새 반응시킨 후 용매를 제거한다. 잔사를 무수 메틸렌 클로라이드 3ml 용해시키고 하이드라존(0.2ml, 5.76mmol)을 가한다. 용액이 투명해질 때까지 무수 메탄올(3.4ml)을 가한다. 실온에서 4시간 후에 용액을 원심분리하여 분리한 후 농축한다. 화합물을 메탄올/메틸렌 클로라이드(5:1)로 용출시키는 LH-20 칼럼 상에서 겔 여과하여 정제한다.
수율: 0.7g.
IR; (C=O): 1675.
상술한 본 발명은 하기 실시예에 의해 설명되나, 본 발명이 이로 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
EPO(하이드라지드법)의 변형
대표적인 실험에서, EPO(0.5-1.0mg)[오르토 바이오택(Ortho Biotech)로부터 제조됨]를 100mM 나트륨 아세테이트 (pH 5.6, 총 용적 0.786ml)에 용해시킨다.
과요오드산 나트륨 용액 10mg/ml를 충분히 가하여 최종 농도가 10mmol인 과요오드산 나트륨 용액을 수득한다. 30분 동안 0℃암실에서 산화시킨 후 80mmol Na2SO3를 0.33ml가한다. 5분 후에, 용액을 농축시키고 미소농축기내에서 pH4.2의 10mmol 아세트산나트륨으로 3회 세척한다. 최종 농축후, 산화된 EPO 용액을 100mM 아세트산나트륨으로 1.0ml가 되도록 한다. mPEG 5000-하이드라지드(50mg)를 산화된 EPO에 가한다. 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반한다. mPEG 5000-EPO를 0.05% 나트륨 아지드를 함유하는 인산염 완충액으로 용출시키는 세파크릴(Sephacryl) S-200-HR 칼럼(1mm × 45mm)을 사용하여 겔 여과에 의해 정제시킨다. mPEG 개질 EPO의 양을 pH 7의 0.1M 인산염 완충액을 사용하는 조박스GF-250 또는 GF-450 칼럼을 사용하여 HPLC 겔 여과에 의해 측정한다. 6 내지 12개의 분자로부터, mPEG는 EPO의 각각의 분자에 결합된 것이다.
EPO의 변형(세미카바지드 방법)
하이드라지드 방법에 대한 동일한 방법은 수행하되, 단, 산화 반응시간을 5분으로 감소시키고 mPEG-하이드라지드(50mg)의 양에 비해 감소된 양의 mPEG-세미카바지드(10mg)를 사용한다. 산화시간을 감소시키고 mPEG 분자량을 감소시키는 경우에는, 보다 많은(약 18) mPEG 분자가 EPO에 결합된다. 산화 시간이 길어지고(15분) mPEG-세미카바지드 부가량이 많아지는 경우 약 30개의 mPEG 분자가 사용된 mPEG 분자량에 따라 EPO에 결합된다. 따라서, mPEG-세미카바지드는 mPEG-하이드라지드 보다 반응성이 더 큰것으로 보이며, 유사한 반응 조건하에서 mPEG-하이드라지드가 EPO에 결합할 수 있는 수 보다 많은 수의 mPEG를 EPO에 결합 시킨다.
카보하이드레이트 그룹 또는 아미노산 측쇄 상에서 mPEG로 EPO를 변형시키는 효과의 비교가 제 1도에 도시되어 있다. 분석 HPLC 겔 여과 조건은 상기 기술한 바와 동일하다. 변형되지 않은 EPO의 크로마토그램은 제1a도에 도시되어 있다. 10.5분의 체류 시간에서 단일 피이크가 나타난다. EPO를 이의 카보하이드레이트 그룹에서 mPEG 5000으로 변형시키는 경우(제 16도 참조) 9.4분의 체류 시간에서 정제하지 않은 반응 생성물에 대한 커다란 단일 피크가 나타난다. EPO를 리신의 측쇄와 반응하는 mPEG 5000의 석신이미드 에스테르와 반응시키는 경우, 반응 생성물의 불균질 혼합물이 수득된다(7.5 내지 10.2분에서 피크가 나타남). CSF-1, 인터류킨-2 및 β-인터페론에 커플링되는 석신이미드를 사용하는 mPEG 개질에 대한 유사한 불균질 패턴이 나타난다(참조 : u.s. Pat No. 4,847,325 및 4,9117,888). 석신이미드가 커플링된 저분자량의 불순물이 보다 과량으로 존재한다(제1c도). mPEG의 석신이미드 유도체를 사용하는 활성 에스테르 커플링은 단백질에 mPEG을 결합하기 위한 바람직한 방법이다[참조: Nucci, M.L., Shorr, R., and Abuchowski, A. (1991) Adv. Drug Delivery Rev., 6, 133-151]. EPO는 또한 전술한 세미카바지드 방법을 사용하여 mPEG 8500으로 유도체화한다[생물학적 실험 결과는 제 4도 참조]. 전술한 세미카바지드 방법을 사용하면 또한 mPEG 12000으로 변형시킨 EPO(제 3도 참조) 및 mPEG 2000으로 변형시킨 EPO(제 10도 참조) 수득된다.
EPO는 또는 티오세미카바지드, 히드라지드 카복실레이트 및 mPEG의 카본산 디히드라지드 유도체에 의해 변형된다. 이들 mPEG 유도체는 이들 유도체를 사용하는 경우 mPEG의 하이드라이드 유도체에 비해 EPO에 mPEG를 커플링시키는 고수준이 수득된다는 점에서 mPEG의 세미카바지드 유도체와 유사하게 작용한다. 산화 조건이 EPO의 생물학적 활성을 손상시키지 않는한, 승온, 과요오드산나트륨의 농도 증가 및 반응 시간 증대 및 감소와 같은, 기타의 EPO 산화 조건을 사용할 수 있다.
EPO의 대규모 변형(세미카바지드 또는 카복실레이트 하이드라지드 방법)
EPO(12.0mg)(오르토 바이오택 제품)를 pH가 5.5이고 총용적이 1.8ml인 100mM 아세트산나트륨에 위치시키고, 40mg/ml 농도의 과요오드산 나트륨(0.215ml)을 가한다. 0℃ 암실에서 20분 동안 산화시킨 후 에틸렌 글리콜 0.02ml를 가하고, 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반시키다. 산화된-EPO를 세파덱스() G-25 칼럼(2.5cm × 9cm)을 사용하여 겔 여과에 의해 정제시키고 pH 4.3의 100mM 아세트산 나트륨 완충액으로 용출시킨다. 용출산화된 EPO(10 내지 11ml)를 풀링시킨다. mPEG-5000 세미카바지드(100mg)를 정제 산화된 EPO에 가한다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반시킨다. mPEG-5000 EPO를 0.2M NaCl, 0.02M 시트르산 나트륨, 0.025% 나트륨 아지드로 이루어진, pH 7.0의 완충액으로 용출시키는S-200-HR 칼럼을 사용하여 겔 여과에 의해 정제한다.
mPEG 5000 세미카바지드 200mg을 사용하여 전술한 변형을 반복한다. 반응성은 EPO 1분자당 mPEG 약 22분자이다.
전술한 바와 같은 반응물의 양 절반을 사용하고, 카복실레이트 하이드라지드 200mg을 사용하여 전술한 변형을 반복한다. 반응성은 EP 1분자당 mPEG 약 30분자이다.
EPO의 변형(옥심 방법)
A. mPEG-CH2CH2-NH-CO-CH2-ONH2
대규모 세미카바지드 방법과 동일한 방법으로 수행한다. 그러나, mPEG 5000 세미카바지드를 첨가하는 대신에, mPEG 5000-CH2-CH2-NH-CO-CH2-ONH2(50mg)을 산화시킨 EPO 2.15ml와 실온에서 밤새도록 혼합한다. mPEG 5000-EPO를 0.2M NaCl, 0.02M 시트르산 나트륨, 0.025% 나트륨 아지드로 이루어진 pH 7의 완충액으로 용출시키는S-200-HR 칼럼을 사용하여 겔 여과에 의해 정제시킨다. 페노멘넥스 바이오셉-섹(Phenomenex Biosep-Sec)-S4000 칼럼(30cm × 0.017cm)을 사용하여 HPLC 겔 여과에 의해 측정한 바에 의하면 mPEG-5000 약 31분자가 EPO 각각의 분자에 결합되는 것으로 나타낸다. 또한 mPEG-EPO 25분자로 이루어진 소량의 분획을 분리하여 이를 생물학적 시험에 사용한다[참조: 제 16도, 제 18도 및 제 19도].
B. mPEG-O-CH2CH2-NH-CO-ONH2
mPEG-O-CH2CH2-NH-CO-ONH2를 사용하여 EPO의 변형을 반복한다. 변형 A에서 상기 사용한 방법을 이용하여 측정한 바에 의하면 mPEG 5000 약 18 내지 19분자가 PEG 각각의 분자에 결합된 것으로 밝혀졌다. 생물학적 레이타는 제 16도, 제 18도 및 제 19도에 나타냈다.
C. mPEG-O-CH2CH2-ONH2
mPEG-O-CH2CH2-ONH2를 사용하여 EPO 개질을 반복한다. 상기 개질 A에서 사용한 방법을 이용하여 측정한 바에 의하면 PEG 각각의 분자에 mPEG 5000 약 17분자가 결합된 것으로 밝혀졌다. 또한 22mPEG, 12mPEG의 소량의 두 분획을 분리시킨다(참조: 제 17도, 제 18도, 제 19도).
D. mPEG-O-CH2CH2-CO-ONH2
PEG-옥심 유도체 mPEG-O-CH2CH2-NH-CO-ONH2를 사용하여 EPO 변형을 반복한다. 상기 변형 A에서 사용한 방법을 이용하여 측정한 바에 의하면 EPO 각각의 분자에 mPEG 5000 약 3분자가 결합된 것으로 밝혀졌다.
E. mPEG-O-CH2CH2-CH(OH)-CH2-ONH2
PEG-옥심 유도체 mPEG-O-CH2CH2-CH(OH)-CH2-ONH2를 사용하여 EPO 변형을 반복한다. 상기 변형 A에서 사용한 방법을 이용하여 측정한 바에 의하면 EPO 각각의 분자에 mPEG 500 약 31분자가 결합된 것으로 밝혀졌다.
F. mPEG-O-CH2CH2-NH-CS-ONH2
PEG-옥심 유도체 mPEG-O-CH2CH2-NH-CS-ONH2를 사용하여 EPO 변형을 반복한다. 상기 변형 A에서 사용한 방법을 이용하여 측정한 바에 의하면 EPO 각각의 분자에 mPEG 5000 약 4분자가 결합된 것으로 밝혀졌다.
mPEG-EPO의 생물학적 활성
mPEG-EPO 유도체를 변형 단백질 주사후 생성된 적혈구 증가를 측정함으로써 생체내에서 생물학적 활성에 대해 분석한다[참조 : Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J., Aoki, K., Cohen, A.M., Smalling, R., Trail, G., Lin, F.K., Browne, J.K., and Hines, D.K. (1986) Immunobiol. 172: 213-224]. 간단하게는, 마우스(암컷 CD-1, 생후 8주)에게 0.4μg의 단백질을 1일 1회, 2일 연속해서 복강내 또는 피하 주사한다. 예정된 날에 헤마토크릿 해독을 위해 취혈한다.
mPEG의 하이드라지드 유도체를 통해 결합된 mPEG-EPOs의 생체내 생물학적 활성(헤마토크릿 수준)은 제 2도, 제 4도 및 제 5도와 표 1 및 표 2에 기재되어 있다. 측정치를 요약하면, 제 2도 및 제 5도에 의하면, mPEG 커플링의 최적수가 명확하지 않으며 가장 우수한 mPEG-EPO를 수득하기 위해서는 합성 및 생물학적 시험에 의해서 결정되어야 한다. 제 4도에는 하이드라지드 및 세미카바지드 결합제를 사용하는 mPEG 커플링을 비교 도시하였다. 세미카바지드 결합제를 사용하는 경우 mPEG-EPO에 대한 헤마토크릿 수준이 높고 길게 나타난다. 측정된 결과는 부분적으로는 세미카바지드 결합제를 사용하여 수득할 수 있는 mPEG의 혼입 정도가 높음에 기인한 것이다. 표 1은 mPEG-EPO의 생물학적 활성을 혼입된 mPEG의 수와 사용된 mPEG의 분자량과의 함수로 나타낸다.
표 1에 사용된 mPEG의 분자량 및 커플링된 mPEG의 양을 비교하는 상이한 하이드라지드 mPEG-EPO의 생물학적 활성을 요약하고 있다.
표 2에서는 사용된 상이한 mPEG 하이드라지드 결합제를 비교 도시한다. 표 2에서는 mPEG의 최적량을 혼입시킨 경우, mPEG-5000-하이드라지드 유도체로 변형시킨 EPO의 생물학적 활성이 요약되어 있다. 카보하이드레이트 mPEG-유도체 모두는 최적량의 mPEG를 충분히 커플링시키지 못하고 다른 요인으로 인해 EPO에 동일한 생물학적 활성을 제공하지는 못한다. 생물학적 활성은 각각의 결합제에 대해 수득한 가장 우수한 값이다.
마우스에 있어서 EPO 및 mPEG 5000-EPO에대한 헤마토크릿의 농도는 제 2도에서 도시하고 있다. 12 PEG-EPO는 mPEG 5000-하이드라지드를 커플링하여 제조하고 이는 상기에서 주어진 실험적 조건하에서 이러한 mPEG 유도체에의해 획득될 수 있는 최대 혼입을 반영한다. 18PEG 및 28PEG EPO는 mPEG 5000-세미카바지드와의 커플링에 의해 제조된다. mPEG의 세미카바지드 유도체는 본 mPEG 유도체를 사용하여 혼입될 수 있는 다량의 mPEG로 인하여 mPEG의 하이드라지드 유도체 보다 훨씬 우수한 생물학적 활성을 나타낸다. mPEG 5000-EPOs 3개 전부는 원래의 EPO와 비교할 경우 증가된 최대치 및 연장된 활성을 보여준다. 따라서 PEG를 함유하는 단백질의 카보하이드레이트 그룹의 변형은 훨씬 더 강력한 치료학적 단백질을 수득할 수 있다.
다양한 mPEG의 효과에 관한 추가의 데이타에 있어서 헤마토크릿 농도에 관한 실험에 사용된 하이드라지드-변형된 EPO는 제 8도 내지 제 15도에 기재되어 있다. 제 8도 내지 제 15도에 기재된 실험에 사용된 mPEG 변형된 EPO는 제 2도 내지 제 5도에 기재된 실험에 사용된 기타 mPEG 변형된 EPO 분자에 대하여 필수적으로 기술된 바대로 적당한 수용성 중합체를 사용하여 제조한다.
mPEG의 옥심-형성 유도체를 통해 결합된 mPEG-EPOs의 생체내의 생물학적 활성(헤마토크릿 농도)은 제 16도 및 제 17도에 나타내고 있다. 요약하면 제 16도는 mPEG-O-CH2CH2-NH-CO-ONH2("A") 및 mPEG-O-CH2CH2-NH-CO-CH2-ONH2("C") 결합제를 사용하여 mPEG 커플링을 비교한 것이다. EPO의 1분자당 mPEG 31개의 분자를 갖는(일반식 XXXIII에 상응하는) 결합제 "C"에 비교되는 EPO의 1분자당 mPEG 분자 18개를 갖는 (일반식 XXX에 상응하는) 결합제 "A"를 사용하여 보다 높은 mPEG-EPO의 헤마토크릿 농도를 수득할 수 있다. 또한, EPO 한 분자당 mPEG 분자 31개를 갖는 결합제 "C"(일반식 XXXIII)의 보다 높은 헤마토크릿 활성이 현저하다.
제 17도는 EPO의 1분자당 mPEG 분자 22, 17 및 12개에서 mPEG-O-CH2CH2-ONH2(일반식 XXIII)("B")를 사용하여 mPEG 커플링을 비교한다. 가장 높은 헤마토크릿 농도는 가장 낮은 페길레이션(pegylation) 정도에서 수득되고, 헤마토크릿은 페길레이션 정도에 반비례하여 감소된다. 그러나, mPEG-O--CH2CH2-ONH2옥심 유도체를 사용하는 모든 mPEG 결합제에 있어서, 원래의 EPO에 비하여 헤마토크릿이 보다 높고 증가된 기간을 갖는다. 특히, 주목할 만한 가치는 일반식 XXIII의 12mPEG-EPO의 생물학적 활성이다. 하이드라지드 유도체화된 12mPEG-EPO는 옥실아민 유도체화된 EPO와 같이 헤마토크릿 상승 정도나 기간을 만들지 못한다.
mPEG-EPO에 결합하는 항체
mPEG-EPOs의 항유전성은 클리니겐(ClinigenTM) 에라트로포이메틴(EPO) EIA 시험 키트 사용에 의해 결정된다. 즉, 평가 분석은 EPO에 모노클로날 항체를 피복시킨 미소한 적절양의 플레이트로 이루어진다. EPO 또는 mPEG-EPO는 피복시킨 플레이트와 상호작용 시킨다. 플레이트를 세척한 후 플레이트 위에서 EPO에 라벨을 시붙인 폴리클로날 항체를 배양한다.
하이드라지드 유도된 EPO에 대한 ELISA 평가 분석의 결과는 제 3도에 나타내고 있다. mPEG-EPO 주어진 mPEG 분자량에 대하여 첨부된 적당한 mPEG의 수로 나타내고 있다.
예를 들면, 분자량이 약 5000인 mPEG 분자 12개를 의미하는 12PEG-5K를 EPO 각각의 분자에 커플링시킨다. 데이타는 EPO에 커플된 mPEG의 수가 증가함에 따라 단백질의 함유전성이 감소됨을 나타낸다. 유사하게는 mPEG의 분자량이 증가함에 따라 변형된 EPO의 양유전성, 즉 항체와의 결합도를 감소시킨다. mPEG의 하이드라지드 유도체와 산화된 EPO의 반응은 세마카바지드, 티오세미카바지드 및 카본산 디히드라지드 PEG 유도체와 함께 나타나는 높은 커플링 농도에 도달치 못함에 따라 기타 mPEG 유도체와 함께 나타나는 바대로 면역 유전성에 있어서 커다란 감소를 제공할 수 없다. 단백질의 면역 유전성 감소는 또한 단백질의 면역 유전성 감소와도 상호관련된다. 따라서 EPG의 카보하이레이트 그룹에 커플된 mPEG-EPO는 가장 효과적인 최고 농도에서 커플될 수 있는 mPEG의 유도체를 갖는 단백질에 관련된 잠재적 면역 유전성을 감소시킬 수 있다.
mPEG를 갖는 추가의 ELISA 데이타에 있어서 하이드라지드 유도체는 제 6도에 나타내고 있다.
옥심 유도체화 EPO에 대한 ELISA 평가 분석의 결과치는 제 18도에 나타나 있다. 데이타는 EPO에 커플된 mPEG의 수가 증가함에 따라 단백질의 항유전성이 감소됨을 보여준다. 비교적 저 커플링 농도(18 PEG-A, 17 PEG-B, 12 PEG-B)에서 일어나는 결합제와 산화된 EPO의 반응은 비교적 고농도 배합(22 PEG-B, 25PEG-C 및 31 PEG-C)과 함께 나타나는 바대로 항유전성에 있어서 커다란 감소를 일으키지 않는다. 항유전성을 감소시키는 결합제의 성능의 상기의 차이는 주로 커플링 농도 (예 : 비교 12 PEG-B 및 22 PEG-B)를 기준으로 하여 결정된다. 따라서, 옥심 결합을 토하여 EPO의 카보하이드레이트 그룹에 커플링된 mPEG는 가장 효과적인 높은 농도에서 커플될 수 있는 mPEG의 상기의 유도체를 가지고 당해 단백질과 관련된 잠재적인 면역 유전성을 감소시킬 수 있다.
고추 냉이 과산화효소의 개질: 히드라지드와 세미카바지드
[커플링의 비교]
고추냉이 퍼옥시다제(HRP)는 글리콜 단백질 효소(옥시드-환원 효소)이다. EPO외에 또다른 당단백질이 두개의 상이한 카보하이드레이트 변형제 사이의 변형의 차이를 보여줄 수 있는지를 알아보기 위해 mPEG 5000-하이드라지드 또는 mPEG 5000-세미카바지드로 HRP를 변형시킨다. 통상적인 실험에 있어서, 고추냉이 과산화 효소(2mg)를 pH가 5.6이고 총 부피가 0.8ml인 100mM 아세트산나트륨 중에 넣는다. 10mMol에서 나트륨 퍼요오데이트의 최종 농도를 얻기 위해 10mg/ml의 나트륨 퍼요오데이트 용액 충분량을 가한다. 어두운 곳에서 0℃에서 15분 동안 산화시킨 후 80mMol Na2SO30.33ml를 가한다. 5분 경과후 용액을 농축하고 pH가 4.2인 100mMol 나트륨 아세테이트로 미소 농축기 안에서 3회 세척한다. 반은 PEP 5000-하이드라지드이고 반은 mPEG 5000-세미카바지드 30mg인 산화된 고추냉이 과산화 효소 용액을 분리시킨다. 2개의 산화된 고추냉이 과산화 효소 용액을 실온에서 밤새 교반한다. PEG 변형도는 pH가 7인 0.1M 포스 페이트 완충제를 사용하는 ZorbarxTMGF-250 칼럼을 사용하는 HPLC 겔 여과에 의해 결정된다. mPEG 5000-하이드라지드 변형된 고추냉이 과산화 효소는 대략 7 PEG 분자/HRP를 갖고, mPEG 5000-세미카바지드 변형된 고추냉이 과산화 효소는 대략 19 PEG 분자/HRP를 갖는다. 카보하이드레이트 그룹에 부착된 PEG을 갖는 고추냉이 과산화 효소의 변형은 동일한 실험적 조건하에서 하이드라지드 보다 PEG의 세미카바지드를 사용하여 보다 효과적이 된다.
[반감기 결정]
반감기 시험은 약 0.3kg의 스프라구 다레이 래트(Sprague-Dawley rat) 숫컷으로 수행한다. 각각의 화합물에 대해 3마리의 래트를 사용한다. 실험 내용은 하기와 같다. 각각의 래트에 EPO 또는 mPEG-EPO/1μg과 함께 정맥내 주사한다. 하이드라지드 유도체와 mPEG-EPO에 대하여, 사용된 mPEG-EPO는 mPEG 500 세미카바지드-18이고 이는 세미카바지드와 함께 EPO 변형에 관해 상기한 바와 같이 필수적으로 제조된다. 각각의 래트로부터 2, 5, 15, 45, 90분 및 3, 6, 24, 54시간에서 혈액을 채취한다. 헤파린화 튜브에서 혈액을 회수하고 혈청을 분리한다. EPO 의존 세포 증식 분석 평가로 EPO 생물학적 활성에 대하여 분리된 혈청을 시험한다. 사용된 생체내의 평가 분석은 FDC-P1/ER 세포라인을 사용한다. 상기의 쥐 세포라인은 EPO 수용체를 혼입하고 증식시 EPO에 의존한다. 평가 분석은 하기와 같이 수행한다. EPO 부재하에서 24시간 동안 세포를 성장시키고 이 시간에서 각각 상이한 농도에서 EPO 또는 mPEG-EPO를 상기 세포에 가한다. 42시간 동안 세포를 배양한 다음 세포에 연마된 티미딘을 가한다. 6시간 후, 세포를 채취하여 분석한다. 티미딘의 증가량에 의해 세포 증식이 결정된다. 결과를 제 7도에 나타났다.
옥심 유도체와 mPEG-EPO를 사용하여 상기와 같이 EPO 의존 세포 증식 평가분석을 수행한다. 결과치는 제 19도에 나타나 있다.
생체내 평가 분석 : 빈혈증의 마우스 모델
본 평가 분석에서 마우스가 TNF-α로 5일 연속 주사하여 빈혈이 걸리게 한다. 빈혈을 극복하기 위해 마우스가 TNF-α를 수용하도록 똑같이 5일에 걸쳐 또는 5일중 2일만 마우스에 EPO 또는 mPEG-EPO와 함께 SC(피하)주사시킨다. 결과를 제 15도에 나타냈다.
[평가]
전술한 명세서에 언급된 문헌 및 특허는 여기에서 참조로 인용한 것이다. 전술한 명세서는 당해 분야의 전문가들이 본 발명을 실시 가능하기에 충분하도록 고려되었다. 실제로 분자 생물학 및 관련 분야의 숙련가들에게 명백한 본 발명을 실시하기 위한 상기의 여러 변형들은 하기 특허청구 범위의 범주내에 해당된다.

Claims (69)

  1. 하기 일반식의 화합물
    상기식에서, X는 O 또는 S이고, Q는 -NHNH2및 -C2H14-NHNH2로 이루어진 그룹으로 부터 선택되며, YSMS -O-, -O-, -OCH2-, -NH-, -NHNH-, -O-CO-CH2CH2- 및 -NHCO-N-NHNH-로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, P는 수용성 중합체이며, 단 X가 O이고 Y는 O이며 Q가 NHNH2인 것, X가 O이고 Y는 NH이며 Q가 NHNH2인 것 및 X가 O이고 Y는 OCH2이며 Q가 NHNH2인 것은 제외된다.
  2. 제1항에 있어서, 일반식 P-NH-CS-NHNH2(IV)의 화합물, 일반식 P-NHCO-N-NHNHCO-NHNH2(V)의 화합물, 일반식 P-NHNHCONHNH2(VI)의 화합물, 일반식 P-NHNHCSNHNH2(VII)의 화합물, 일반식 P-NH-CO-C6H4-NHNH2(VIII)의 화합물 및 일반식 P-O-CO- CH2CH2-CO-NHNH2(IX)의 화합물로 이루어진 그룹에 속하는 화합물
  3. 제2항에 있어서, 일반식 P-NH-CS-NHNH2(IV)의 화합물.
  4. 제2항에 있어서, 일반식 P-NHCO-N-NHNHCO-NHNH2(V)의 화합물.
  5. 제2항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(이때, 단독중합체 및 공중합체는 비치환되거나 한쪽 말단이 알킬 그룹에 의해 치환된다), 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐 에틸 에테르, α, β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파트아미드], RO-PEG(여기서, R은 알킬, 아릴, 알킬아릴, 아로일, 알카노일, 벤조일, 아릴알킬에테르, 사이클로알킬 또는 사이클로알킬 아릴이다) 및 이들 중합체의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유도체인 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 수용성 중합체가 모노메톡시폴리 (에틸렌 글리콜)인 화합물.
  8. 변형시키기 위한 폴리펩티드를 제1항에 따른 화합물과 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 수용성 중합체 변형된 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 변형시키기 위한 폴리펩티드가 호르몬, 림포킨, 시토킨, 성장 인자, 효소, 백신 항원 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 변형된 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 변형시키기 위한 폴리펩티드가 항체이고, 혼합단계 이전에 당해 항체를 항체 상의 결합 부위에 특이적으로 결합될 수 있는 화합물과 합하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의해 제조된 변형된 폴리펩티드.
  11. 제9항에 있어서, 변형시키기 위한 폴리펩티드가 효소이고, 혼합단계 이전에 당해 폴리펩티드를 효소용 기질과 합하는 기질과 합하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의해 제조된, 변형된 폴리펩티드.
  12. 제9항에 있어서, 변형시키기 위한 폴리펩티드가 당단백질인 변형된 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 당단백질이 에리트로포이에틴인 변형된 폴리펩티드.
  14. 제8항에 있어서, 혼합단계 이전에 산화제를 가하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의해 제조된, 변형된 폴리펩티드.
  15. 제8항에 따른 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  16. 제13항에 따른 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  17. 하기 일반식의 화합물로 이루어진 그룹에 속하는 화합물.
    [P-NH-CS-NHN=CH-]n-Z (XIII)
    [P-NHCO-NH-NHNHCO-NHN=CH-]n-Z (XIV)
    [P-HNNHCON=CH-]n-Z (XV)
    [P-HNNHCSN=CH-]n-Z (XVI)
    [P-NH-CO6H4-NHN=CH-]n-Z (XVII) 및
    [P-O-CO-CH2CH2-CO-NHN=CH-]n-Z (XVIII)
    상기식에서, Z는 폴리펩티드이고, n은 1 내지 x(여기서, x는 Z에 대한 산화 활성화 가능한 그룹의 수이다)이며, P는 수용성 중합체이다.
  18. 제17항에 있어서, 일반식 [P-NH-CS-NHN=CH-]n-Z(XIII)의 화합물.
  19. 제17항에 있어서, 일반식 [P-NHCO-NH-NHNHCO-NHN=CH-]n-2(XIV)의 화합물.
  20. 제17항에 있어서, 일반식 [P-HNNHCON=CH-]n-Z(XV)의 화합물.
  21. 제17항에 있어서, 일반식 [P-HNNHCSN=CH-]n-Z(XVI)의 화합물.
  22. 제17항에 있어서, P가 폴리에틸렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(이때, 단독중합체 및 공중합체는 비치환되거나 한쪽 말단이 알킬 그룹에 의해 치환된다), 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐 에틸 에테르, α,β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파트아미드], RO-PEG(여기서, R은 알킬, 아릴, 알킬아릴, 아로일, 알카노일, 벤조일, 아릴알킬 에테르, 사이클로알킬 또는 사이클로알킬아릴일 수 있다) 및 이들 중합체의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물.
  23. 제17항에 있어서, Z가 호르몬, 림포킨, 시토킨, 성장 인자, 효소, 백신 항원 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  24. 제23항에 있어서, Z가 당단백질인 화합물.
  25. 제24항에 있어서, 당단백질이 에리트로포이에틴인 화합물.
  26. 제17항에 있어서, Z가 에리트로포이에틴인 화합물.
  27. 제26항에 있어서, P가 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜)인 화합물.
  28. 제27항에 있어서, 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜)의 평균 분자량이 2,000 내지 12,000인 화합물.
  29. 제28항에 있어서, n이 10 내지 36인 화합물.
  30. 제29항에 있어서, n이 20 내지 32인 화합물.
  31. 제30항에 있어서, 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜)의 평균 분자량이 5,000인 화합물.
  32. 활성화시키기 위한 폴리펩티드를 산화제와 혼합하는 단계를 포함하여, 화합물(II), (III), (IV) 및 (V)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물 포함(Conjugation)시키기 위해 폴리펩티드를 활성화시키는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 산화제가 과요오드산나트륨인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 과요오드산염이 단백질 mg당 10 내지 40μmol의 농도로 존재하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 혼합단계가 -10 내지 50℃의 온도에서 수행되는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 혼합단계가 0 내지 30℃의 온도에서 수행되는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 혼합단계가 1분 내지 3일의 기간 동안 수행되는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 혼합단계가 1분 내지 60분의 기간 동안 수행되는 방법.
  39. 제1항에 따른 수용성 중합체 제제 화합물을 변형시키기 위한 폴리펩티드와 혼합하는 단계를 포함하여, 수용성 중합체 변형된 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 변형시키기 위한 폴리펩티드가 호르몬, 림포킨스, 시토킨, 성장 인자, 효소, 백신 항원 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 변형시키기 위한 폴리펩티드가 당단백질인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 당단백질이 에리트로포이에틴인 방법.
  43. 제39항에 있어서, 혼합단계 전에 변형시키기 위한 폴리펩티드에 산화제를 가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 산화제가 10 내지 40μM의 농도로 존재하는 과요오드산나트륨이고, P의 분자량이 4,000 내지 12,000이며, 수용성 중합체가 일반식 P-NH-CO-NHNH2(II)의 화합물인 방법.
  45. 제1항에 따른 수용성 중합체를 포함하는, 수용성 중합체를 사용하여 폴리펩티드를 변형시키기 위한 키트.
  46. 제45항에 있어서, 산화제를 추가로 포함하는 키트.
  47. 제46항에 있어서, 변형시키기 위한 폴리펩티드를 추가로 포함하는 키트.
  48. 하기 일반식의 화합물로 이루어진 그룹에 속하는 화합물.
    [P-O-CH2CH2-CO-ON=CH-]n-Z (XXVIII),
    [P-O-CH2CH2-O-CO-ON=CH-]n-Z (XXIX)
    [P-O-CH2CH2-NH-CO-ON=CH-]n-Z (XXX)
    [P-O-CH2CH2-NH-CS-ON=CH-]n-Z (XXXI)
    [P-O-CH2CH2-ON=CH-]n-Z (XXXII)
    [P-O-CH2CH2-NH-CO-CH2-ON=CH-]n-Z (XXXIII)
    [P-O-CH2CH2-O-CO-CH2-ON=CH-]n-Z (XXXIV)
    [P-O-CH2CH2-CH(0H)-CH2-ON=CH-]n-Z (XXXV) 및
    [P-O-CH2CH2-CO-CH2-ON=CH-]n-Z (XXXVI)
    상기식에서, Z는 폴리펩티드이고, n은 1 내지 x(여기서, x는 Z에 대한 산화 활성화가능한 그룹의 수이다)이며, P는 수용성 중합체이다.
  49. 제48항에 있어서, 일반식 [P-O-CH2CH2-NH-CO-ON=CH-]n-Z (XXX)의 화합물.
  50. 제48항에 있어서, 일반식 [P-O-CH2CH2-ON=CH-]n-Z (XXXII)의 화합물.
  51. 제48항에 있어서, 일반식 [P-O-CH2CH2-NH-CO-CH2-ON=CH-]n-Z (XXXIIII)의 화합물.
  52. 제48항에 있어서, 일반식 [P-O-CH2CH2-CO-CH2-ON=CH-]n-Z (XXVIII)의 화합물.
  53. 제48항에 있어서, P가 폴리에틸렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(이때, 단독중합체 및 공중합체는 비치환 되거나 한쪽 말단이 알킬 그룹에 의해 치환된다), 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 폴리비닐 에틸 에테르, α,β-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파트아미드], RO-PEG(여기서, R은 알킬, 아릴, 알킬아릴, 아로일, 알카노일, 벤조일, 아릴알킬 에테르, 사이클로알킬 또는 사이클로알킬아릴일 수 있다) 및 이들 중합체의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물.
  54. 제48항에 있어서, Z가 호르몬, 림포킨, 시토킨, 성장 인자, 효소, 백신 항원 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  55. 제50항에 있어서, Z가 당단백질인 화합물.
  56. 제51항에 있어서, 당단백질이 에리트로포이에틴인 화합물.
  57. 제52항에 있어서, Z가 에리트로포이에틴인 화합물.
  58. 제53항에 있어서, P가 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜)인 화합물.
  59. 제54항에 있어서, 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜)의 평균 분자량이 2,000 내지 12,000인 화합물.
  60. 제59항에 있어서, n이 3 내지 36인 화합물.
  61. 제60항에 있어서, n이 8 내지 31인 화합물.
  62. 제61항에 있어서, 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜의 평균 분자량이 5,000인 화합물.
  63. 활성화시키기 위한 폴리펩티드를 산화제와 혼합하는 단계를 포함하여, 화합물(XIX), (XXI), (XXIII) 및 (XXIV)로 이루어진 그루으로 부터 선택된 화합물과 포합시키기 위해 폴리 펩티드를 활성화시키는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 산화제가 과요오드산나트륨인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 과요오드산 염이 단백질 mg당 10 내지 40μmol의 농도로 존재하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 혼합단계가 -10 내지 50℃의 온도에서 수행되는 방법.
  67. 제66항에 있어서 혼합단계가 0 내지 30℃의 온도에서 수행되는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 혼합단계가 1분 내지 3일의 기간동안 수행되는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 혼합단계가 1분 내지 60분의 기간동안 수행되는 방법.
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