KR100225457B1

KR100225457B1 - 항암 효과가 있는 새로운 피롤리진 유도체, 그의 염 및 그들의 용매 화합물 그리고 그들의 제조방법

Info

Publication number: KR100225457B1
Application number: KR1019960068305A
Authority: KR
Inventors: 우진석; 이정옥; 이대실
Original assignee: 우진석; 주식회사진켐
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 1999-10-15
Also published as: WO1998027095A1; AU5413598A; KR19980049575A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 새로운 피롤리진 유도체, 그의 염 및그들의 용매 화합물, 그들의 제조방법 그리고 이를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 항암제 또는 유전자 관련된 연구에 사용하는 용도에 관한 것이다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서 R₁, X, X', Y 및 n은 명세서에서 정의한 바와 같다.)

본 발명의 피롤리진 유도체 및 그의 염은 수용성 용매에 잘 녹고, 체내에서 안정하여 항암제로 유용하게 사용될 수 있고, 이에 더하여 핵산과 위치 특이적으로결합하는 올리고 뉴클레오타이드, 펩타이드 유사체 및 콜레스테롤 등과 결합시킬수 있어 유전자 치료 등에서도 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항암 효과가 있는 새로운 피롤리진 유도체, 그의 염 및 그들의 용매 화합물그리고 그들의 제조방법

본 발명은 하기 화학식 1의 새로운 피롤리진 유도체, 그의 염 및 그들의 용매 화합물, 그들의 제조방법 그리고 이를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 항암제 또는 유전자 관련 연구에 사용하는 용도에 관한 것이다.

상기 화학식에서, R₁은 C₁-C₁₀의 알킬기, C₃-C₇의 시클로알킬기, C₃-C₆의 알케닐기, 페닐기이고,X 및 X'은 각각 하이드록시기, 알콕시기, 알킬치오기, 실릴옥시기이고, Y는 하이드록시기, 머캅토기, 아미노기. 할로겐기, 카보닐기이고, n은 1-10이며 다른 물질이 결합하는 경우의 링커 길이이다.

더욱 상세하게는, 본 발명의 새로운 피롤리진 유도체 및 그의 염은 수용성용매에 잘 녹고, 체내에서 안정하여 우수한 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라 핵산과 위치 특이적으로 결합하는 올리고 뉴클레오타이드, 펩타이드 유사체 및 콜레스테롤 등과 결합시킬 수 있어 유전자 치료 등에 유용하게 이용될 수 있다.

일반적으로 암의 치료에 사용되는 많은 항암제들은 세포내에 존재하는 핵산과 반응할 수 있는 기능 구조(functional group)를 포함하므로 항암 작용을 나타내게 된다. 구체적으로, 항암제로 널리 사용되는 시스플라틴, 마이토마이신 및 사이글로포스파마이드 등은 다른 구조적 특징과 함께 핵산과 반응하는 기능 구조들을포함하여 그들의 항암 효과를 나타내게 된다.

또한, 자연에서 추출된 화합물들인 마이토마이신 C (mitomycin C)와 피롤리지딘 알칼로이드(pyrrolizidine alkaloids)의 경우를 비교하여 보면 상기 기능 구조의 독특한 특징을 관찰할 수 있다. 상기 마이토마이신 C와 피롤리지딘 알칼로이드는 세포내에서 활성화(activation)되는 경우, 상호 유사한 피롤 구조(pyrrolesubstructure)를 가지게 되지만(Carter, S. K., and Crooke, S, T., Mytomycin C. Current Status and New Development, Academic Press, New York, 1978; Woo, J. S. et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 3407), 마이토마이신 C의 경우는 탁월한 항암제로 사용될 수 있는 반면에 피콜리지딘 알칼로이드는 잡초 속에 존재하는 독성 물질로 작용하여 전세계적으로 가축들을 중독시키는 주요 원인이 되고 있다.

이와 같이 상기 마이토마이신 C와 피폴리지딘 알칼로이드가 세포내에서 다른 작용을 나타내는 것은 이들 화합물의 반응성이 다르기 때문이다. 구체적으로,피롤리지딘 알칼로이드에서 유래한 피롤 대사산물 (pyrrole metabolite)들은 핵산과 반응할 수 있는 기능 구조를 가지고 있으나, 그 반응성이 너무 크고 독성이 강하여 항암제로서 사용되는데 적합하지 않다(반응식 1참조), 반면, 상기와 유사한핵산과 반응할 수 있는 기능 구조를 가지는 마이토마이신 C는 그 반응성이 적당하여 피롤 대사산물이 세포의 핵에 도달할 수 있어 핵산(DNA) 과 직접적으로 반응할수 있다 (반응식 2참조).

하지만, 마이토바이신 C가 좋은 항암제로 사용되기 위하여 몇 가지 문제점이 해결되어야 한다. 구체적으로 마이토마이신 C는 소량만이 자연에 존재하여 보통의 천연 물질과 마친가지로 추출될 수 있는 양이 제한되고, 유기적으로 합성하는것도 용이하지 않으므로 이를 대량으로 공급하는 것이 어렵다. 또한, 마이토마이신 C는 핵산과 반응하기 위하여 세포내에 존재하는 환원효소를 필요로 하는데, 일반적으로 상기 환원효소의 세포내 농도는 그리 높지 않아 항암 효과가 감소하게 된다.

1976년 미국 뉴욕 대학의 앤더슨과 코리는 자연에서 추출된 상기 마이토마이신 C 및 피롤리지딘 알칼로이드를 모델로 사용하여 용이하게 합성할 수 있으면서핵산에 대한 반응성이 마이토마이신 C와 유사하여 항암 효과가 탁월한 새로운 피롤리진 화합물(pyrrolizine compounds, 화학식 2 참조)을 성공적으로 합성하였다.

(Anderson, W. K. and Corey, P. F., Journal of Medicinal Chemistry, 1976, 20,812).

이들은 피롤리지딘 알칼로이드의 피롤 대사산물의 반응성을 느리게 조절하기 위하여, 구조적으로 피롤 환 구조(pyrrole ring system)의 전자 밀도를 조절할 수 있는 치환기 R₂및 핵산과 반응하여 치환하는 부위인 에스터 그룹(R₃COO-)을 고려하여 다양하게 치환시켰다. 이때, 치환기 R₂은 메틸기, 트리플푸오르메틸기, 페닐기, 4-클로로페닐기, 4-플루오르페닐기, 4-메톡시페닐기, 3,4-디클로로페닐기 등이며, 치환기 R₃은 메틸기, NHCH₃,NHC₂H₅, NH-n-C₄H₉, NH-이소프로필기, NH-시클로핵실기 등이다.

상기와 같이 치환기 R₂및 치환기 R₃을 다양하게 조합하여 화합물들을 제조한 결과, 이들 중에서 치환기 R₂가 전자를 끌어당기는 그룹 (electron-withdrawing group)인 경우보다 전자를 밀어주는 그룹(electron-donating group)인 경우가 더욱 항암 효과가 탁월하고, 에스터 방출 그룹(ester leaving group) R₃이 아세테이트(CH₃)인 경우보다 카바메이트(NHCH₃)인 경우가 더 안정하여 그의 항암효과가 보다 우수하게 나타난다. 다시 말하자면, 전자를 끌어당기는 그룹 R₂는 피롤 환 구조의 전자 밀도를 낮추므로 피롤 환 내의 여분의 전자(질소내 반응에 관여하지 않는 전자)가 반응하는 것을 막아 그의 반응성을 감소시키고, 에스터 방출그룹으로 사용한 안정한 카바메이트는 상기 화합물들이 피롤리지딘 알칼로이드의 피롤 대사산물보다 상당히 안정된 반응성을 갖게 한다.

상기 과정을 통해, 앤더슨과 코리는 대표적인 화합물로서 R₂은 3,4-디클로로페닐기이고 R₃은 NH-이소프로필기인 2,3-디하이드로-(3',4'-디클로로페닐)-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 비스(이소프로필카바메이트) 및 그의 유도체를 제조하여 그들이 백혈병을 치료하는데 탁월한 효과 (antileukimicactivity)를 나타냄을 확인하였다. 하지만 이들 화합물은 수용성 용매에서 용해도가 좋지 않고 에스터 방출 그룹이 세포내 물질인 물, 글루타치온 및 그외 뉴클레오파일 등으로 치환되는 경우 항암 효과를 상실하게 되므로 항암제로서 사용되는데 많은 어려운 점이 있었다. 따라서 지금까지 이들 화합물은 그의 항암 효과가 탁월함에 비하여 항암제로서는 널리 사용되지 못하였다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 극복하는 새로운 항암제를 개발하기 위하여 노력한 결과, 수용성 용매에 잘 녹고 상기 세포내 물질에 대해 안정하며 세포핵내의 핵산(DNA)과 결합하여 우수한 항암 효과를 나타내는 새로운 피롤리진 유도체 및 그의 염을 제조하였다. 본 발명의 화합물은 생물학적으로 중요한 물질인 올리고 뉴클레오타이드, 펩타이드 유사체 및 콜레스테롤 등과도 결합시킬 수 있어 유전자 치료 등을 포함한 유전자 관련 연구에 용이하게 이용될 수 있다.

본 발명은 항암 효과가 있는 화학식 1의 새로운 피롤리진 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그들의 용매 화합물을 제공함에 그 목적이 있다.

상기 화학식에서, R₁은 C₁-C₁₀의 알킬기, C₃-C₇의 시클로알킬기, C₃-C₆의 알케닐기, 페닐기이고, X 및 X'은 각각 하이드록시기, 알콕시기, 알킬치오기, 실릴옥시기이고, Y는 하이드록시기, 머캅토기, 아미노기, 할로겐기, 카보닐기이고, n은 1-10 이며 다른 물질이 결합하는 경우의 링커 길이이다.

구체적으로, 본 발명은 상기 화학식에서 R₁이 C₁-C₃직쇄 알킬기이고, X및 X'는 각각 하이드록시기, 메톡시기, 에톡시기, 메틸치오기, 에틸치오기, 트리메틸실릴옥시기 또는 t-부틸디메틸실릴옥시기, Y는 하이드록시기, 머캅토기 또는 아미노기 그리고 n은 1-6 인 피롤리진 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그들의 용매 화합물을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 2,3-디하이드로-5-[4'(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그의 용매 화합물을 제공한다.

또한, 본 발명은 2,3-디하이드로-5-[4'(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6, 7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그의 용매 화합물을 제공한다.

또한, 본 발명은 2,3-디하이드로-5-[4'(β-아세톡시에틸메틸아미노)페닐-6,7-비스(에톡시메틸)-1H-피롤리진, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그의 용매 화합물을 제공한다.

또한, 본 발명은 R₁이 C₁-C₃직쇄 알킬기이고, X는 트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이며, Y는 하디드록시기, 클로로기, 브로모기 또는 요오드기인 피롤리진 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그의 용매 화합물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 새로운 피롤리진 유도체 및 그의 염을 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 2,3-디하이드로-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-0-[N,N-디이소프로필아미노)β-시아노에톡시포스파인] 및 그의 제조방법을 제공한다.

상기 화합물을 이용하면 핵산 합성기에서 직접 사용하여 올리고 뉴클레오타이드와 결합시킬 수 있는 피롤리진 유도체를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 새로운 피롤리진 유도체 및 그의 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 항암제로 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다.

또한, 본 발명의 피롤리진 유도체는 생물학적으로 중요한 물질인 올리고 뉴클레오타이드, 펩타이드 유도체 및 콜레스테롤 등과 결합시킬 수 있어 유전자 치료방법(gen

e therapy)을 포함한 유전자 관련 연구 등에 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로 핵산과 위치 특이적으로 결합하는 상기 물질을 결합시킴으로써 상기 피롤리진 유도체를 위치 특이적 핵산 알킬화제(site-specific DNA alkylating agent)등으로 사용할 수 있다.

본 발명은 세포내의 핵산과 결합하여 항암 효과를 나타낼 수 있는 화학식 1의 새로운 피롤리진 유도체, 그의 염 및 그들의 용매 화합물을 제공한다.

상기 화학식 1에서, R은 C₁-C₁₀의 알킬기, C₃-C₇의 시클로알킬기, C₃-C₆의 알케닐기, 페닐기이고, X 및 X'은 각각 하이드록시기, 알콕시기, 알킬치오기, 실릴옥시기이고, Y는 하이드록시기, 머캅토기, 아미노기, 할로겐기, 카보닐기이고, n은 1-10이며 다른 물질이 결합하는 경우의 링커 길이이다.

상기 화학식 1에서 R₁, X 및 X' 에 포함된 알킬기는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이고, 여기에는 에틸기, 프로필기, 프로프-2-일기, 부틸기, 부트-2-일기, 2-메틸프로프-2-일기, 펜틸기, 펜트-3-일기 또는 헥실기 등이 포함된다. 또한 알케닐기는 프로페닐기를 포함하고, 시클로알킬기는 시클로프로필기, 시클로펜틸기 또는 시클로헥실기를 포함한다.

또한, 상기 화학식 1에서 X 및 X' 에 포함된 알콕시기(OR₄)는 R₄가 R₁과같거나 페닐-C_1-3알킬, 4.4'-디메톡시트리페닐-메틸 또는 그 유사 그룹이고, 알킬치오기(SR

₅) 는 R₅가 상기 R₁과 같으며, 실릴옥시기(OSiR₆R₇R₈)는 R₆, R₇, R₈은 서로같거나 다른 알킬기로서 상기 R₁과 같다. 이때, 페닐-C_1-3알킬기는 벤질기, 펜에틸기 또는 3-페닐프로필기를 포함한다.

또한, 상기 화학식 1에서 Y에 포함된 카보닐기는 카보닐클로라이드 또는메틸에스터기를 포함한다.

바람직하게는 R₁이 C₁-C₃직쇄 알킬기이고, X 및 X'는 각각 하이드록시기,메톡시기, 에톡시기, 메틸치오기, 에틸치오기, 트리메틸실릴옥시기 또는 t-부틸디메틸실릴옥시기, Y는 하이드록시기, 머캅토기 또는 아미노기 그리고 n은 1-6인 경우인데, 이 때 가장 바람직한 활성을 나타낸다.

또한, 바람직하게는 R₁이 C₁-C₃직쇄 알킬기이고, X 및 X'는 트리틸기 또는 4. 4'-디메톡시트리틸기이며, Y는 하이드록시기, 클로로기, 브로모기 또는 요오드기인 경우이다.

특히, 본 발명에서 바람직한 화합물은 하기 화학식 3의 화합물, 그의 염 및그들의 용매 화합물이다.

상기 화학식 3에서 R₉은 메틸기, 에틸기 또는 프로필기이고, R₁₀는 수소,메틸기, 에틸기 또는 프로필기이며, n은 1 - 6인 경우이다.

구체적으로, 본 발명의 화합물 중 바람직한 화합물들을 나열하면 다음과 같다.

2,3-디하이드로-5-[4'-(δ-하이드록시부틸에틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진, 2,3-디하이드로-5-[4'-(δ-하이드록시부틸에틸아미노)페닐]-6,7-비스(에톡시메틸)-1H-피롤리진, 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시부틸에틸아미노)페닐]-6,7-비스(트리메틸실리로일메틸)-1H-피롤리진, 2,3

-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(에톡시메틸)-1H-피롤리진, 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(DMTr-0-메틸)-1H-피롤리진 및 그들의 염 그리고 그들의 용매 화합물이다.

또한, 본 발명의 화합물 중 특히 바람직한 화합물은 하기 화학식 4의 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 및 그의 염 그리고 그들의 용매 화합물이다.

본 발명은 화합물은 수용성 용매에서 잘 녹으면서 물에 의해 에스터기가 분해되지 않아 핵산과 효과적으로 반응할 수 있다. 비록 하이드록시기가 에스터기보다 상당히 반응성이 적은 방출 그룹이지만 피롤 환 구조의 전자를 밀어주는 능력을 가진 아민기로 인하여 반응성이 증가하므로 전체적인 반응성은 기존의 2,3-디하이드로-5-(3',4'-디클로로페닐)-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 비스(이소프로필카바메이트

) 및 그의 유도체 (IPP) 화합물과 유사하다. 따라서 본 발명의 화학식 4의 화합물은 탁월한 항암 효과를 나타내게 한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 화합물은 하기 화학식 5 의 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진 및 그의 염 그리고 그들의 용매 화합물이다.

상기 화학식 7의 화합물은 상기 화학식 6의 화합물 중 하이드록시기가 메톡시기로 치환되어 전체적인 반응성이 낮아진 화합물이다. 상기 메톡시기는 하이드록시기 보다 반응성이 적은 방출 그룹으로 염기성 조건에서는 반응성이 거의 없고 약산성인 조건에서는 서서히 반응성을 보이는 것으로 보고되어 있다. 따라서 이는핵산의 골격을 이루는 인산기가 약산성인 것을 고려하면 세포내의 다른 물질과는반응하지 않고 오직 핵산에 도달한 경우에만 반응성을 나타내는 특성을 지니게 된다.

특히, 상기 화학식 7의 화합물은 다른 생물학적으로 중요한 물질과 결합할수 있는 하이드록시기를 기능 구조로 가지고 있다.

또한, 본 발명의 가장 바람직한 화합물은 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-아세톡시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(에톡시메틸)1H-피롤리진 및 그의 염 그리고 그들의 용매 화합물이다.

본 발명은 화학식 1의 새로운 피롤리진 유도체 및 그의 염을 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 1) 앤더슨과 코리의 방법으로 제조한 N-(4-플루오르벤조일)프롤린을 하이드록시기를 가진 2차 아민 화합물과 커플링 반응을 수행하여 4-위치에 아미노기가 도입된 화합물을 얻고, 2) 이를 무수 아세트산 및 디메틸아세틸렌디카복실레이트를 반응시켜 6,7-위치가 적절히 치환된 피롤리진 화합물을 얻고, 3) 다시 이를 환원하는 과정을 통하여 본 발명의 목적 화합물인 피롤리진 유도체 및 그의 염을 제조한다, 한편, 상기의 목적 화합물은 치환기를 변환시켜 같은 골격 구조를 가지는 다른 화합물로 변환시킬 수 있다.

따라서 상기 과정에 더하여, 무수산을 가하여 다른 목적 화합물인 피롤리진유도체 및 그의 염을 제조한다. 또한 상기 화합물의 에스터 방출 그룹에 뉴클레오파일을 반응시켜 또 다른 목적 화합물인 피롤리진 유도체 및 그의 염을 제조한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 화학식 1의 새로운 피롤리진 유도체를 제조하기 위하여, 1) 화학식 6의 화합물인 N-(4-플루오르벤조일)프롤린을 화학식 7의 하이드록시기를 가진 2차 아민 화합물과 커플링 반응을 수행함으로써 4-위치에 아미노기가 도입된 화학식 8의 화합물을 제조한다 (반응식 3 참조).

화학식 7의 화합물은 n-메틸에탄올아민 및 N-메틸부탄올아민 등을 포함하고, 이 때 R₁₁과 n은 상기에서 정의한 바와 같다. 상기 반응에 사용되는 용매로는 디메틸설포옥사이드(DMSO)가 가장 바람직하고, 이 때, 반드시 K₂CO₃를 첨가하여야 한다. 또한, 반응 온도는 80-100℃가 바람직하고, 반응 시간은 7-10일 정도가 바람직하며, 특히 아르곤 존재 하에서 상기 반응을 수행하는 것이 바람직하다.

상기 반응을 이용하여 피롤리진 화합물에 다양한 링커 및 기능기(functionalgro

up)를 도입할 수 있다.

2) 다음, 화학식 8의 화합물을 무수 아세트산과 디메틸아세틸렌디카복실레이트

(dimethyl acetylenedicarboxylate, DMAD)을 반응시켜 화학식 9 의 화합물을 제조한다(반응식 4 참조).

본 발명은 화학식 8의 화합물을 먼저 약 60℃에서 무수 아세트산을 사용하여 녹이고 이를 다시 실온에서 식힌 다음 디메틸아세틸렌디카복시레이트와 서서히반응시키는 1,3-디폴라어디션(1,3-dipolar addition) 방법으로 화학식 9의 화합물을 제조한다. 이는 앤더슨과 코리의 방법인 무수 아세트산과 디메틸아세틸렌디카복실레이트를 동시에 반응시키는 방법과는 차이가 있다.

3) 다음, 화학식 9의 화합물을 환원시켜 화학식 10의 화합물을 제조한다(반응식 5참조).

이 때 사용되는 환원제는 리튬 알루미늄하이드라이드(LiAlH₄)와 같은 적당한반응성을 가지는 촉매가 바람직하다.

4) 화학식 10의 화합물과 무수산(acid anhydride)을 반응시켜 화학식 11의 화합물을 제조한다(반응식 6참조).

바람직하게는 화학식 10의 화합물에서 R₁₁이 메틸기이고 n은 2인 경우인화학식 4의 화합물을 무수 아세트산과 반응시켜 화학식 11에서 R₁₁과 R₁₂가 메틸기이고 n이 2인 화합물을 제조할 수 있다. 상기 화학식 7의 화합물은 반응성이 매우 커서 보관이 용이하지 않으므로 이를 합성한 다음 즉시 다음 반응에 사용해야한다.

5) 화학식 11의 화합물에 존재하는 에스터 방출 그룹과 뉴클레오파일을 반응시켜 화학식 12의 화합물 및 그의 유도체를 제조한다 (반응식 7 참조).

상기에서 R₁₁은 메틸기, 에틸기 및 프로필기이고, R₁₂는 일반 알킬기이다.뉴클레오파일 RS는 알킬설파이드 이온으로 CH₃CH₂S, HOCH₂CH₂S등을 나타내며, RO는 알콕사이드 이온으로 메톡사이드, 에톡사이드를 나타낸다.

구체적으로, 화학식 7의 화합물은 R₁₂과 R₁₃이 메틸기이고 n이 2인 화학식 11의 화합물을 뉴클레오파일인 메톡사이드 등과 반응시켜 제조된다. 이 때 피롤리진 환에 붙어있는 2개의 에스터기는 방출 그룹으로 메톡사이드로 치환되고 링커에 있는 에스터기는 용해되어 하이드록시기로 전환된다.

또한, 본 발명은 핵산 합성기에서 직접 올리고 뉴클레오타이드와 결합할 수있는 화학식 8의 화합물인 2,3-디하이드로-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-0-[(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스파인] 및 그의 제조방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명은, 1) 앤더슨과 코리의 방법으로 제조한 N-(4-플루오르벤조일)프롤린을 하이드록시기를 가진 2차 아민 화합물과 커플링 반응을 수행하여 4-위치에 아미노기가 도입된 화합물을 얻고, 2) 이를 무수 아세트산 및 디메틸아세틸렌디카복실레이트(DMAD)를 반응시켜 6,7-위치가 적절히 치환된 피롤리진 화합물을 얻고, 3) 다시 이를 환원시키고, 4) 이를 무수산으로 반응시킨 다음 이의 에스터 방출 그룹에 뉴클레오파일을 반응시키고, 5) 이에 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트 등을 반응시키는 과정을 통하여 본 발명의 2,3-디하이드로-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-0-[(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스파인)을 제조한다.

구체적으로, 본 발명은 상기 화학식 7의 화합물에 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트 등을 반응시켜 핵산 합성기의 합성의 마지막 단계에서 이를 올리고 디옥시 뉴클레오타이드 등의 5'-말단에 결합시킬 수 있는 상기 화합물을 제조한다.

이외에 핵산 등에 결합할 수 있는 콜레스테롤 또는 단백질 유사체 등도 본발명의 피롤리진 유도체 및 그의 염에 결합시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물들이 나타내는 항암 효과를 여러 종류의 암세포를 사용하여 조사한다.

구체적으로 본 발명의 화합물인 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 및 그의 염 그리고 그의 용매 화합물이 나타내는 항암 효과를 표준 세포에 대한 암세포의 성장 정도를 측정하여 확인한다(표 1참조).

이외에도, 본 발명의 화합물은 핵산과 위치 특이적으로 결합하는 리간드인올리고 뉴클레오타이드, 단백질 유사체 또는 콜레스테롤 등을 이에 결합시킴으로써 유전자와 관련된 연구에 유용하게 이용될 수 있다. 구체적으로 상기 화합물은 유전자 치료 방법(gene therapy), 안티센서(antisensor), 안티진(antigene) 및 위치특이적 유전자 억제(site-specific gene blocking)등에 이용될 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진의 제조

[단계 1]

N-(4-플루오르벤조일)프롤린의 제조

800mL의 증류수에 50g(0.43mol)의 1-프롤린, 7mg의 티몰프탈레인과 170g의Na₂CO₃를 가한 용액을 실온에서 진한 수산화나트륨 수용액으로 처리하여 용액이 파란색이 될 때까지 반응시켰다. 섞인 반응 용액을 얼음같이 찬 물에 식히고 에테르에 녹인 4-플루오르벤조일클로라이드(60ml, 81g, 0.51mmol, F.W. : 158.56, d :1.342)를 조금씩 가하고, 이 때 진한 수산화나트륨 용액을 가하여 파란색을 유지시켰다. 이 반응 혼합액을 상기의 과정이 끝난 후 에테르(2×250mL)로 추출한 다음 실온에서 30분간 더 교반하였다. 진한 염산으로 수층을 pH 1 까지 산성화시키고 에틸아세테이트(4×

400mL)로 추출하였다. 혼합된 에틸아세테이트 용액은 소금물(brine, 300mL)로 세척한 다음 무수황산나트륨으로 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 그 잔류물을 뜨거운 에틸아세테이트 (300mL)에 녹여, 그 용액을 빠르게 교반하면서 헥산을 천천히 가하였다. 이를 실온에서 식힌 다음 침전물을 유리 필터에 모으면 흰 가루 상태의 목적 화합물이 80g 얻어졌다. 남은 모액을 다시 상기와 유사한 과정으로 처리하여 목적 화합물 15g을 추가로 얻을 수 있었다(수율 93%).

융점 : 168 - 170℃

C₁₂H_12NO₃F 에 대한 원소 분석치 - 실측치(%) ; C : 60.4, H : 5.3, N : 5.8

이론치(%) : C : 60.7, H : 5.1, N : 5.9

[단계 2]

N-[4-(N-메틸하이드록시에틸아미노)벤조일]프롤린의 칼륨염 제조

상기 단계 1에서 얻은 14g의 N-(4-플루오르벤조일)프롤린(59mmol), 8.3g 무수 탄산칼륨, 24mL 무수 DMSO 에 녹은 12 mL N-메틸에탄올아민을 아르곤 존재 하에서 95℃로 10일간 반응시켰다. RP-HPLC 분석을 수행하여 반응물 중에 매우 적은 양의 N-(4-플루오르벤조일)프롤린이 남아있음을 확인하였다. 녹지 않은 염은 필터로걸러 충분량의 CH₂Cl₂로 씻은 다음 이를 진공에서 농축시켰다. 그 잔류물을 50mL 또거운 CH₂CL_2에녹이고 녹지 않은 불순물을 필터로 걸러 제거한다. 거른 용액을 진공에서 농축하여 그 잔류물을 50mL 에테르에 현탁한 다음 에테르를 감압하에 증발시켜 제거함으로써 N-(4-플루오르벤조일)프롤린이 소량 포함된 17g N-[4-(N-메틸하이드록시에틸아미노)벤조일]프롤린의 칼륨염을 흰 거품 형태로 얻었다. 본 화합물은 0.1M 트리에틸암모니움 아세테이트 완충용액 (pH 7.5)에 녹인 30% CH₃CN 용액에서 측정한 최대 자외선 흡량이 290nm 파장에서 관찰되었다. 이 화합물은 다음 반응을 위하여 정제하지 않고 사용하였다.

[단계 3]

디메틸-2,3-디하이드로-5-[4'-(N-메틸아세톡시에틸아미노)페닐]-1H-피롤리진-6,7-디카복실레이트의 제조

10.15g N-[4-(n-메틸하이드록시에틸아미노)벤조일]프롤린의 칼륨염을 따뜻한 35mL 무수 아세트산에 녹여 이를 실온에서 식힌 후 17mL 디메틸 아세틸렌디카복실레이트를 가하였다. 이를 이산화탄소의 생성을 조사할 수 있는 환류 응축기(reflux

condenser) 및 가스 버블러가 장착된 플라스크에 넣어 천천히 120℃로 가열하면서 섞었다. 온도가 120℃로 올라가면서 이산화탄소가 매우 빠른 속도로 증가하였고, 기체 발생률이 실질적으로 감소한 다음에도 1시간 정도 온도를 계속 유지시켰다. 반응 혼합액은 진공에서 농축되었고 그 잔류물은 5mL, CH₂CL₂에 녹여 실리카겔 컬럼크로마토그라피로 정제하였다. 이 때 전개용매로는 헥산 : 에틸아세테이트의 비율이 3 : 1 인 혼합용매를 사용하였다. 순수한 산물을 포함하는 분획을 합하여 농축하여 목적 화합물인 디메틸 2,3-디하이드로-5-[4'-(N-메틸아세톡시에틸아미노)페닐-1H-피롤리진-6,7-디카복실레이트 7g을 흰 고체로 얻었다. 이를 분석하기 위하여 뜨거운 메탄올로 재결정하였다.

융점 : 109-110℃

¹H NMR (CDCI₃) δ2.03(s, 3H, CH₃C=0), 2.49(p, 2H, C2), 3.01(s, 3H,C

H₃N), 3.11(t, 2H, C1), 3.62(t, 2H, Cα), 3.75(s, 3H, OCH3), 3.80(s, 3H, OCH₃), 3.93(t, 2H, C3), 4.28(t, 2H, Cβ), 6.73(d, 2H, 페닐), 7.29(d, 2H, 페닐)

[단계 4]

2g 리튬 알루미늄하이드라이드를 건조 에테르에 현탁시켜 건조 CH₂Cl₂에 단계 3에서 얻은 화합물인 2,3-디하이드로-5-[4'-(N-메틸아세톡시에틸아미노)페닐]-1H-피롤리진-6,7-디카복실레이트 5g을 녹인 용액을 한 방울씩 가한 다음 30분 동안 가열하였다. 이를 다시 25℃로 식히고 과량의 하이드라이드는 수분 에테르와 수분을 차례로 가하여 그의 염이 하얗게 될 때까지 분해시켰다. 이렇게 얻은 반응물을 유리로 걸러 뜨거운 CH₂Cl₂로 여러 번 씻었다. 혼합된 유기층은 진공에서 농축하여 실리카겔 컬럼 크로마토그라피(7 : 2 : 0.5 : 0.5 : EtOAc-헥산-Et³N-MeOH)를 수행하였다. 이렇게 얻은 순수한 화합물을 포함한 분획을 혼합하여 농축하고 그 결과목적 화합물인 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 3g을 옅은 노란 색의 고체로 얻었다.

¹H NMR (CDCI₃) δ 2.46(t, 2H, C2), 2.88(t, 2H, C1), 3.01(s, 3H, CH₃-N),3.51(t, 2H, Cα), 3.81(t, 2H,_Cβ), 3.89(t, 2H, C3), 4.57(s, 2H, C6'),4.59(s, 2H, C7'), 6.81(d, 2H, bb'), 7.23(d, 2H, aa')

[실시예 2]

2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 화합물인 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 460mg, 2.8mL 무수 트리에틸아민 및 무수 CH₂Cl₂에 녹은 10mg 4-디메틸아미노피리딘 용액을 25℃에서 1mL무수 아세트산과 함께 반응시켰다. 1시간이 경과한 다음 그 반응 혼합액을 20mL 무수 메탄올과 반응시키고 5mL로 농축시켰다.

그 농축된 용액을 1M 메톡시나트륨(Na⁺MeO)과 20mL 메탄올로 반응시키고 25℃에서 방치하였다, 이를 진공에서 농축하여 2mI CH₂CI₂에 현탁시킨 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 수행하여 200mg의 목적 화합물을 노란 고체로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 2.42(p, 2H, C2), 2.84(t, 2H, C1), 2.99(s, 3H, CH₃-N),3.30(s, 6H, 2XCH₃O), 3.48(t, 2H, Cα), 3.71(t, 2H, Cβ), 3.88(t, 2H, C3),4.24(s, 2H, C6'), 4.47(s, 2H, C7'), 6.78(d, 2H, bb'), 7.20(d, 2H, aa')

[실시예 3]

상기 실시예1에서 얻은 화합물인 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 1g, 5mL 무수 트리에틸아민 및 무수 CH₂Cl₂에 녹은 15mg 4-디메틸아미노피리딘 용액을 25℃에서 2mL 무수 아세트산과 함께 반응시켰다. 1시간이 경과한 다음 그 반응 혼합액을 40mL 무수 에탄올과 섞은 다음 10mL로 농축시켰다. 그 농축된 용액을 40mL 무수 에탄올에 녹은 2g 에톡시나트륨 (Na⁺EtO)과 반응시키고 25℃에서 12시간 동안 방치하였다. 이를 진공에서 농축하여 5mL CH₂CI₂에 현탁시킨 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 수행하여 600mg의 목적 화합물을 하얀 고체로 얻었다.

융점 : 52-53℃

¹H NMR(DMSO-d6) δ 1.10(tof d, 6H, 2XCH₃CH₂O), 1.94(s, 3H, CH₃C=O),2.37(p, 2H, C2), 2.76(t, 2H, C1), 2.93(s, 3H, CH₃-N), 3.40(q of d, 4H,2XCH₃CH₂O), 3.60(t, 2H, Cα), 3.88(t, 2H, C3), 4.16(s, 2H, C6'), 4.18(t, 2H, Cβ), 4.28(s, 2H, C7'), 6.76(d, 2H, bb'), 7.25(d, 2H, aa')

LRMS : m/e 415(M⁺+1), 414(M⁺), 369, 325, 282

[실시예 4]

2,3-디하이드로-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-0-[(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스핀의 제조

실시예 2에서 얻은 화합물인 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 100mg 과 5mL 무수 CH₂CI₂에 녹인0.2ml 무수 디이소프로필에틸아민 용액에 0.1ml 2-시아노에틸 N,N'-디아소프로필클로로포스포아미다이트를 아르곤 존재 하에서 반응시켰다. 1시간 경과한 다음 이 반응 혼합액을 25℃에서 2ml로 농축하여 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 수행한 결과, 목적 화합물인 2,3-디하이드로-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-0-[(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스파인 90mg을 옅은 노란 색의 오일 형태로 얻었다.

¹H NMR(CDCl₃) δ 1.1∼1.2 (m, 12H, 2X(CH₃)2CH-), 2.42(p, 2H, C2),2.57(t, 2H, -CH₂CN), 2.87(t, 2H, C1), 3.02(s, 3H, CH₃-N), 3.36(s, 6H, 2X-OCH3),3.5∼3.7(m), 3.75(m, 2H, CH(CH₃)₂), 3.89(t, 2H, C3), 4.26(s, 2H, C6'), 4.39(s,2H, C7'), 6.74(d, 2H, bb'), 7.27(d, 2H, aa')

LRMS 질량 스펙트럼 : m/e 545(M⁺+1), 554(M⁺), 326, 313, 295, 250,237

FAB 질량 스펙트럼 : m/e 597 (M⁺+1+p-니트로벤질알코올-N, N-디이소프로필아민), 526, 560, 461

[실시예 5]

항암 효과 측정

본 발명의 화합물인 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 및 그의 염들이 나타내는 항암 효과를 여러 종류의 암세포를 사용하여 조사하였다.

본 발명은 암 세포주로 A549, SKOV-3, HCT-15, XF-498, SKMEL-2를 이용하는데, 10%소태아 혈청이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂에서 배양하였고 1주일에 1-2회씩 계대 배양하였다. 세포들을 부착면으로부터 분리시키기위하여는 0.25% 트립산 및 3mM CDTA를 인산 완충용액에 녹여 사용하였다. 각 세포를 96-웰 플레이트(Nunc사 제품)의 각 웰에 5×10³-2×104⁴개씩 가하고, 각종 화합물은 소량의 DMSO에 녹여 상기 배지로 희석하여 사용하는데, 이 때 최종 DMSO농도는 0.5% 이하가 되도록 하였다. 상기 화합물 용액을 200μ1 씩 세포가 틀어있는 각 웰에 가한 다음 48시간 동안 배양하는데, 화합물을 가하는 시점에서 플레이트를 하나 따로 모았다(time zero plate). 이들 플레이트를 SRB 방법에 준하여 TCA로 세포를 고정한 다음 SRB 용액으로 염색하고 이에 1% 아세트산을 가하여 세포를 세척하였다. 다음 10mM 트리스 완충용액을 사용하여 염색액을 용출시키고 520nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 표준 세포에 대한 암세포의 성장 정도를 측정하여 표1에 나타냈다.

[표 1]

본 발명의 피롤리진 유도체 및 그의 염은 세포 내에 존재하는 핵산과 효과적으로 반응하여 세포의 성장을 억제하므로 탁월한 항암 효과를 나타내게 된다. 또한기존의 피롤리진 화합물과는 달리 수용성 용매에서 용해도가 크고 반응성이 적당하여 세포내에서 핵산 이외의 물질과 결합하지 않으므로 우수한 항암제로서 기대되는바가 크다.

구체적으로, 본 발명의 2,3-디하이드로-5-(4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 및 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-아세톡시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(에톡시메틸)-1H-피롤리진 화합물을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 안정하면서 항암제로서 그 효능도 매우 탁월하다.

또한, 본 발명의 피롤리진 화합물은 생물학적으로 중요하고 헥산과 위치 특이적으로 결합할 수 있는 물질인 올리고 뉴클레오타이드, 펩타이드 유사체 및 콜레스테롤 등과 용이하게 결합될 수 있어 유전자와 관련된 연구 등에 유용하게 사용될수 있다. 구체적으로 이는 위치 특이적 핵산 알킬화제 등으로 개발되어 유전자 치료방법, 안티센서 및 안티진(antigene)에 응용될 수 있다,

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 새로운 피롤리진 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그들의 용매 화합물.

[화학식 1]

상기 화학식에서, R₁은 C₁-C₁₀의 알킬기, C₃-C₇의 시클로알킬기, C₃-C₆의 알케닐기, 페닐기이고, X 및 X'은 각각 하이드록시기, 알콕시기, 알킬치오기, 실릴옥시기이고, Y는 하이드록시기, 머캅토기, 아미노기, 할로겐기, 카보닐기이고, n은 1-10며 다른 물질이 결합하는 경우의 링커 길이이다.
제1항에 있어서, R₁이 C₁-C₁₀직쇄 알킬기이고, X 및 X'은 하이드록시기,메톡시기, 에톡시기, 메틸치오기, 에틸치오기, 트리메틸실릴옥시기 또는 t-부틸디메틸실릴옥시기, Y는 하이드록시기, 머캅토기 또는 아미노기 그리고 n은 1-6인 것을 특징으로 하는 피롤리진 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그들의 용매 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 2,3-디하이드로-5-[4'(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진인 것을 특징으로 하는 피롤리진 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그들의 용매 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진인 것을 특징으로 하는 피롤리진유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그들의 용매 화합물.
제1항에 있어서, 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-아세톡시에틸메틸아미노)페닐

-6,7-비스(에톡시메틸)-1H-피롤리진인 것을 특징으로 하는 피롤리진 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그들의 용매 화합물.
제1항에 있어서, R₁이 C₁-C₃직쇄 알킬기이고, X 및 X'은 트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이며, Y는 하이드록시기, 클로로기, 브로모기 또는 요오드기인 것을 특징이로 하는 피롤리진 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그들의 용매 화합물.
1) N-(4-플루오르벤조일)프롤린을 하이드록시기를 가진 2차 아민 화합물과커플링 반응을 수행하여 4-위치에 아미노기가 도입된 화합물을 얻는 단계, 2) 이를 무수 아세트산 및 디메틸아세틸렌디카복실레이트(DMAD)를 반응시켜6,7-위치가 적절히 치환된 피롤리진 화합물을 얻는 단계, 3) 다시 이를 환원하는 단계를 포함하는 피롤리진 유도체의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 과정에 더하여 무수산을 가한 다음 피롤리진 유도체의 에스터 방출 그룹에 뉴클레오파일을 반응시키는 피롤리진 유도체 제조방법.
핵산 합성기에서 올리고 뉴클레오타이드를 결합시키는데 사용될 수 있는 피롤리진 유도체인 2,3-디하이드로-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-0-[(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스파인].
1) N-(4-플루오르벤조일)프롤린을 하이드록시기를 가진 2차 아민 화합물과커플링 반응을 수행하여 4-위치에 아미노기가 도입된 화합물을 얻는 단계, 2) 이를 무수 아세트산 및 디메틸아세틸렌디카복실레이트(DMAD)를 반응시켜 6,7-위치가 적절히 치환된 피롤리진 화합물을 얻는 단계, 3) 이를 환원하는 단계, 4) 이에 무수산을 반응시킨 다음 그의 에스터 방출 그룹에 뉴클레오파일을 반응시키는 단계, 4)이에 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트 등을 반응시키는 단계를 포함하는 2,3-디하이드로-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥시메틸아미노)페닐]-0-[(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스파인]의 제조방법.