KR0186032B1 - 미생물 살충제제의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 δ-엔도톡신을 함유한 곤충에 대해서 특이적으로 작용하는 바실러스 투린기엔시스의 독소 단백을 함유하는 미생물 살충제제를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 바실러스 투린기엔시스를 배지중에 배양하고, 배양액의 균체를 침강시켜, 그 침강한 독소 단백을 함유하는 농축액을 건조하는 것을 포함하는 미생물 살충제제의 제조방법에 있어서, 이 방법은 다음의 (a),(b) 및 (c)의 공정중에서 적어도 하나의 공정을 포함한다 :

(a) 질소원의 적어도 일종으로서 돈육 분말을 함유하는 배지중에서 배양을 행하는 공정,

(b) 그 균의 배양 종료후의 배양액의 pH를 2∼4로 조정하고, 독소 단백을 침강시키는 공정, 그리고

(c) 그 침강 독소 단백을 함유하는 배양액 하층을 분취하고, 이것에 이산화규소 분말을 첨가하여 얻어지는 혼합물을 분무 건조하는 공정.

Description

미생물 살충제제의 제조방법

본 발명은 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)의 독소단백을 함유하는 미생물 살충제제의 제조방법에 관한 것이다.

바실러스 투린기엔시스는 그람 양성의 토양 센균으로 포자 형성기에 δ-엔도톡신이라는 독소 단백을 생산한다. 이 단백을 곤충류, 특히 인시목 유충이 섭취하면 사망하기 때문에, 바실러스 투린기엔시스의 균체를 포함하는 제제(BT제)를 이용한 살충제가 제조되고 있다. BT제는 농약으로서 미합중국 환경보호국(EPA)에 1965년에 인정되어 시판이 허가되어 있고, 일본에 있어서도 수개 회사로부터 BT제가 발매되고 있다. BT제 및 그 제법은 예를 들면, 미합중국 특허 제3071519호 및 제3086922호에 개시되어 있다. BT제는 이들 특허에도 개시되어 있는 것같이, 통상, 바실러스 투린기엔시스를 액체 배양하고, 균체를 자연 침강, 원심분리 등의 수법으로 채취하고, 이것을 건조하고, 적당한 부형제와 혼합하는 것에 의해 얻어진다. 여기서 독소 단백은 후술하는 것과 같이, 바실러스 투린기엔시스의 균체내의 존재하고, 그리고 균의 파쇄 등에 의해 균체외에 용출한 상태로 존재한다. 그러나 독소 단백을 침강시킴에는 장시간을 요하며, 또는 원심분리를 하면 독소 단백을 함유하는 균체가 펠렛상태가 되고, 이것을 취출하는 지대한 노력과 동력을 요하는 문제가 있다.

BT제는 화학 살충제에 비해, 표적해충에 선택적으로 살충 효과를 나타내는 것, 그리고 환경에의 안정성이 높기 때문에 농작물이나 산림의 수목의 해충방제에 적합하다고 생각되어 이것을 효과적으로 존재하는 방법의 개발이 요망되어 왔다.

본 발명은 상기 종래의 과제를 해결하는 것으로, 그 목적으로 하는 것은 바실러스 투린기엔시스의 독소 단백을 함유하는 미생물 살충제제를 효과적으로 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다. 본 발명은 다른 목적은 상기 바실러스 투린기엔시스를 효과적인 배양 및/또는 독소 단백을 함유하는 배양액으로부터 독소 단백을 간단한 조작에 의해 회수하여 제제화 하는 것을 포함하는 상기 미생물 제제의 효과적인 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 미생물 살충제의 제조방법은 바실러스 투린기엔시스를 배지중에서 배양하고, 배양액의 독소 단백을 침강시켜, 그 침강한 독소 단백을 함유하는 배양액을 건조하는 것을 포함하는 살충제제의 제조방법으로서, 다음의 (a),(b) 및 (c)의 공정중에서 적어도 하나의 공정을 포함한다 :

(a) 질소원의 적어도 일종으로 돈육 분말을 함유하는 배지중에서 배양을 행하는 공정,

(b) 그 균의 배양 종료후의 배양액의 pH를 2∼4로 조정하고, 독소단백을 침강시키는 공정, 그리고

(c) 그 침강 독소 단백을 함유하는 배양액 하층을 분리 채취하고, 이것에 이산화규소 분말을 첨가하여 얻어지는 혼합물을 분무 건조하는 공정

본 발명의 미생물 살충제제의 제조방법을 이하에서 공정별 순서로 설명한다.

(1) 균체의 배양

본발명에 사용하는 균은 곤충의 대하여 유해한 독소 단백을 생산하는 바실러스 투린기엔시스의 균주가 어느 것이나 사용된다. 그것에는, 예를 들면, 일본국 특공소58-23365호 공보에 기재된 바실러스 투린기엔시스 알레스티 P15A-1(미공연 균주기탁 제2458호), 및 동 공보 기재의 바실러스 투린기엔시스 아이자와이 14511(미공연 균주기탁 제2459호)가 있다. 이외에도, 아메리카타입 컬쳐 콜렉숀에 기탁되어 있는 바실러스 투린기엔시스, 바실러스 투린기엔시스 서브 스프 이스라엘렌시스 및 바실러스 투린기엔시스 서브스프 쿠르스타키의 각 균주가 사용될 수 있다. 예를 들면, ATCC No. 10792, 13366, 13367, 19265, 19266, 19267, 19268, 19269, 19270, 29730, 33740, 39756, 35646, 39152, 33679, 33680, 33681, 35866의 균주가 사용될 수 있다.

상기 바실러스 투린기엔시스의 배양은 탄소원, 질소원, 각종 염류 등을 포함하는 통상의 배지를 사용하여 호기성 조건하에서 행해진다. 예를 들면, 감자전분, 카제인, 대두박, 콘스팁 리커, 효모 엑기스, 인산삼암모늄등을 함유하는 액체 배지로 전배양을 행하고, 이어서, 감자 저분, 돈육 분말, 콘스팁 리커등을 함유하는 액체 배지로 본 배양을 행한다. 본 발명에 있어서는 상기와 같은 질소원의 주성분으로서 돈육 분말이 함유되는 것이 바람직하다. 여기서 말하는 「돈육 분말」이란 돈육의 건조 분말 이외에, 돈육 추출 엑기스, 돈육의 효소 분해물 등 돈육의 성분을 포함한다. 특히 본 배양에 있어서 돈육 분말을 함유하는 배지를 사용하는 것에 의해 δ-엔도톡신(독소 단백)의 생산이 촉진된다. 돈육 분말은 배지 성분의 총중량의 10중량% 이하, 바람직하기는 2∼10중량%의 비율로 사용된다. 배지의 pH는 6.7~7.3, 통상 pH 7 정도가 되고, 배양 온도는 26∼30˚C, 통상 28˚C 전후에서 행해진다. 통상, 상기 조건하에서 전배양을 16시간 정도 행하고, 이어서 이것을 종균으로 하여 본 배양의 배지에 접종하고, 48시간 정도의 통기 교반하에서 배양을 행한다.

(2) 배양액의 pH 조정 및 균체의 분리

배양 종료후의 배양액에 적당한 산, 예를 들면, 황산, 염산, 아세트산등을 첨가하고, 그 배양액의 pH를 2∼4, 바람직하기는 pH 3정도로 조정하는 것에 의해 독소 단백이 급속히 침강한다. 또한 이것에 의해 잡균의 증식을 막을 수가 있다.

pH 조정된 배양액을 통상 실온에서 70시간 정도 방치하면 독소 단백이 발효조의 저부(배양액 용량의 40∼60%를 차지하는 부분)에 침강한다. 상기 pH 조정을 하지 않고, 원심 분리기 등의 수단에 의해서 독소 단백을 침강시키는 것도 물론 가능하다. 다음에, 침강 독소 단백을 함유하는 배양액 하층을 분취하고, 필요에 따라 여과하고, 배양액중의 부유 고형물을 제거한다.

상기 배양 종료후의 배양액중에 있어서는, δ-엔도톡신은 균체내에 존재하나, 그 일부는 균의 용균 등에 의해 균체외 배지중에 존재한다. 따라서, 본 명세서에 있어서, 「독소 단백」 이란 균체외 및 균체내의 δ-엔도톡신을 포함한다. 또한, 예를 들면, 「독소 단백」 이 실질적으로「균체의 침강」을 의미하고, 또는「독소단백」이 균체와 δ-엔도톡신과의 혼합물을 의미하는 경우가 있다.

(3) 침강 독소 단백 함유액의 건조

상기한 (2)항에서 얻어진 침강 독소 단백 함유액에는, 바람직하기에는 이산화규소 분말이 가해져서, 건조에 제공된다. 이산화규소 분말로서는 입경이 0.1∼200μm, 바람직하기는 0.5∼32μm, 더욱 바람직하기는 평균 입경이 6∼8μm의 분말이 사용된다. 예를 들면, #80 카프렉스(시오노기 제약 주식회사 제품)가 적합하다. 이산화규소 분말은 침강 독소 단백 함유액의 6중량% 이하, 바람직하기는 2∼6중량%, 더욱 바람직하기는 2∼3중량%의 비율로 첨가된다. 충분히 교반하여 균일히 한 후, pH를 7정도로 조정한 후, 분무 건조, 통풍 건조 등의 수단에 의해 건조가 행해진다. 예를 들면, 250℃정도의 열풍을 송풍하여 분무 건조를 행하고, 필요에 따라서 체로 쳐서 입도를 조절한다.

상기 이산화규소 분말을 가하는 것에 의해, 건조 공정에 있어서, 예를 들면, 독소 단백 분말이 건조실의 벽면에 붙거나, 독소 단백 분말 상호간이 결합하여 블록 상태로 되는 일이 없다. 따라서, 건조실의 벽면으로부터 독소 단백 분말을 긁어내는 등의 종래의 번잡한 작업을 수반하지 않고 건조를 행하는 것이 가능하다.

이와 같이 해서 얻은 바실러스 투린기엔시스의 독소 단백 분말에, 통상 적당한 부형제가 가해져서 제품이 된다. 부형제로서는 점토 분말, 뉴칼겐(다게모도 유시 제품)등이 사용된다. 건조된 원분말의 함유율은 통상, 20∼50중량%가 되고, 다른 균주의 독소 단백 분말이 혼합되어 있어도 무방하다.

이와 같이 본 발명에 의하면 바실러스 투린기엔시스의 독소 단백을 함유하는 미생물 살충제제가 다음의 (a),(b) 및 (c)의 공정중에서 적어도 하나의 공정을 함유하는 방법에 의해 제조된다.

(a) 질소원의 적어도 일종으로서 돈육 분말을 함유하는 배지중에서 배양을 행하는 공정,

(b) 그 균의 배양 종료후의 배양액을 pH를 2∼4로 조정하고, 독소 단백을 침강하는 공정, 및

(c) 그 침강 독소 단백을 함유하는 배양액 하층을 분취하고, 이것에 이산화규소 분말을 첨가해서 얻어지는 혼합물을 분무 건조하는 공정.

상기 (a)의 공정을 채용하는 것에 의해, 균체증식이 촉진되고, 또한 독소 단백의 생산량이 올라간다. (b)의 공정을 채용하는 것에 의해 독소 단백이 단시간내에 침강하고, 더욱이, 발효조의 저부(배양액의 40∼60용량%의 부분)에 독소 단백을 침강시키는 것이 가능하게 되었다. 따라서, 이 침강 독소 단백을 함유하는 하층액을 채취하는 것에 의해, 건조를 단시간으로 행하는 것이 가능하다. 또한 (c)의 공정을 채용하는 것에 의해, 건조중의 독소 단백 분말이 건조용 챔버의 벽면에 부착하는 일이 없고, 용이하게 건조가 행해진다.

이와 같이, 본 발명에 의하면, 바실러스 투린기엔시스의 독소 단백을 함유하는 미생물 살충제제가 효과적으로 제조된다. 그 균체로 생성되는 δ-엔도톡신은 작물의 해충이 되는 곤충이 대부분을 점하는 인시목 곤충에 대해 살충능력을 나타내기 때문에 자연 환경을 파괴하는 일 없이 살충제제로서 적합하게 사용된다.

[실시예 1]

이하에 본 발명을 실시예에 의거 구체적으로 설명한다.

본 실시예에서 사용한 균은 바실러스 투린기엔시스 서브스프 아이자와이 및 바실러스 투린기엔시스 서브스프 쿠르스타키이다. 각각 같은 조작으로 균체의 배양을 행하고, 이어서 이들의 균체를 혼합해서 살충제제를 얻는다.

(A) 균주의 전배양

통상 한천 배지(사면배지)를 사용하여 배양한 균주를 표 1에 표시한 액체 배지(600ml × 12개)를 사용하여 16시간 진탕 배양을 행했다.

6N-HC1을 사용하여 pH7.0±0.2로 조정한다. 상기 진탕 배양은 회전식 진탕기(회전수 200±5rpm, 진폭 1인치)를 사용하여, 28±1℃의 온도에서 행했다. 이 배양액의 pH는 5.8이고, TS(고형분 함량 : 균체량을 나타내는 지표가 될 수 있다; 측정방법은 후술)는 2.5%이었다. 또한, 이 배양액을 현미경 관찰하고, 오염의 유무 및 균의 형태에 이상이 없는 것이 확인되었다.

(B) 균체의 본배양

교반기를 구비한 본 배양용의 탱크(용량 9m )의 내부를 멸균후, 이 탱크에 표 2에서 표시하는 본배양 배지를 넣고, 20% 수산화나트륨을 가해서 pH를 7.0±0.1로 조절하였다.

다음에, 탱크내에 직접 증기를 불어 넣고, 탱크내 온도 121±1˚C에서 35분간 배지를 멸균하였다. 탱크내의 온도를 28℃±1℃로 조절하였다.

배지에 (A)항에서 얻은 종균액을 가하고, 탱크내 온도28±1℃, pH6.8∼7.3, 통기량 3.9±0.5Nm /분, 및 교반회수 160±3rpm 조건하에서, 배양을 개시하였다. 배양중은, 필요에 따라서 소포제(P-2000)를 첨가하였다. 48시간 내지 52시간까지의 사이에 pH가 7.8이상이 된 시점에서 배양을 정지하였다.

배양 종료와 통기를 정지하고, 교반 회전수를 80rpm으로 바꾸고 80분간 탈기를 행했다. 배양액의 10ml를 채취하고 10분간 원심 분리하고, 침강한 고형분(T.S)를 측정한 바 36%이었다. 다시 배양액중의 균체를 부릴리안 블루 사푸라닌(BBS) 염색하고, 현미경으로 1500배로 확대하고, 시야중의 과립상의 독소 단백 수를 계산했다. 5시야의 평균을 산출한 결과 54개 이었다.

다음에, 배양액에 62% 황산을 53±7Kg가하고 배양액의 pH를 2.9∼3.0으로 조정했다. 다시 30분간 교반한 후에 시료 채취를 해서 pH가 3.0±0.1인 것을 확인하고서 교반을 정지했다.

(C) 탄소 단백의 침강 및 독소 단백 함유액의 분취

상기 pH를 3으로 조정한 배양액을 실온에서 70±4시간 방치하고, 독소단백을 침강시켰다. 독소 단백은 배양액 전체의 약 60% 용적의 부분에 침강했다. 배양액 상등액을 배양 탱크외로 배제했다. 하층액 약 4000ℓ몰을 15분간 교반(교반 회전수 80rpm)해서 혼합하고, 이것을 직렬로 연결한 브후나 여과기 2대(20멧쉬 및 28멧쉬, 에 도입하고 가압하에서 여과를 행했다.

(D) 이산화규소 분말의 첨가 및 건조

(C)항에서 얻어진 여액 약 8000㎏에 수돗물 270㎏을 가해서 혼합하고, 이 혼합액을 슬러리 탱크로 이송했다. 이것에 이산화규소 분말(가프렉스 #80) 190㎏을 가해서, 10분간 교반하고, 20% 수산화나트륨을 가해서, pH7.0으로 조절했다. 이것을 다시 30분간 교반하고, pH가 7.0±0.1인 것을 확인했다.

이 중화후의 슬러리를 240±20㎏/시간의 비율로 건조기에 공급하고, 아토마이저 회전수 17000rpm, 열풍 온도 250±2℃의 조건하에서 분무 건조를 행했다. 건조물을 60멧쉬의 채에 걸러 약 750㎏의 건조 원분말을 얻었다.

(E) 제제의 조제

이와 같이 하여 얻은 바실러스 투린기엔시스 서브스프 아이자와이의 건조 원분말 및 바실러스 투린기엔시스 서브스프 쿠르스타키의 건조 원분말을 1 : 1의 중량비로 혼합하고, 이 혼합물 24중량부, 뉴카르겐(다께모도 유시 제품) 3중량부 및 미분말상 점도(입경 1∼40㎛) 73중량부를 혼합하여 미생물 살충제제를 얻었다.

[실험예 1]

실시예 1의 (D)항에서 얻어진 바실러스 투린기엔시스 서브스프 아이자와이의 건조 원분말 및 바실러스 투린기엔시스 서브스프 쿠르스타키의 건조 원분말의 활성을 하기의 방법에 의해 측정했다.

이것과는 별도로, 표 2의 돈육 분말 대신에 대두박을 사용하여 실시예 1과 같이 균체의 배양을 행하고(참고예 1), 이것에 대해서도 건조 원분말의 활성을 같은 방법을 측정했다. 이 결과를 표 3에 표시한다. 표 3에 있어서는, 괄호내의 수치는 참고예 1에 있어서 건조 원분말의 활성을 1로했을 때의 활성비이다.

건조 원분말의 활성측정법 : 건조 원분말을 여러 농도로 함유하는 현탁액을 조제하고, 그 0.5㎖을 누에의 인공 사료 10g에 넣고 혼련해, 그 원분말을 여러 가지의 농도로 함유하는 인공 사료를 얻었다. 이것을 여지상에 두께 3∼5mm로 넓게펴서 패트리 접시에 넣고, 이위에 누에(3령, 3일째의 유충)을 방치하고, 25℃에서 3일간 보존했다. 그 후, 이 원분말을 함유한 사료를 빼내고, 대신에 원분말을 함유하지 않은 인공 사료를 주어서 48시간 사육하고, 살충률을 구했다. 인공사료의 사료 농도와 살충률과의 관계를 그래프에 그리고, 플롯트법에 의해 LC[(누에의 50%가 사망한 때의 인공사료 10g중의 상기 원분말의 중량(mg)]을 구했다. LC을 1단위 (유닛트)로 한다. 예를 들면 LC이 0.05mg/10g 사료인 때에, 원분말 100kg의 총활성은 2 x 10 단위이다.

표 3에 있어서, GU는 기가유닛트(10 유닛트)를 표시한다. 표 3의 결과로부터 질소원소로서는 돈육 분말을 사용하는 것에 의해 생산되는 독소 단백의 양은 1.6∼1.8배 높게 되는 것을 알수 있다.

[실험예 2]

실시예 1(C)항에 있어서 pH를 3으로 조제하는 공정을 행하지 않은 것 이외는, 실시예 1과 같이 조작해서 살충제제를 얻었다(참고예 2). 실시예 1 및 참고예 2의 각각에 대해서, 균체를 70시간 침강시킨 후의 독소 단백 함유액(하층부분)의 고형분 농도, 분무 건조에 걸린 시간, 얻어진 건조 분말의 총활성을 표 4에 나타낸다. 표 4에서 괄호내의 수치는 참고예 2의 값을 1로 했을 때의 비율을 나타낸다.

표 4에서, MV는 메가유닛트(10 유닛트)를 나타낸다. 표 4의 결과로부터, 배양액의 pH를 조정하는 것에 의해, 배양액중의 균체가 신속하게 침강하기 때문에, 건조에 요하는 시간이 대폭으로 단축되는 것을 알수 있다. 그러면서도, 이 조작에 의한 활성의 손실은 전혀 없다는 것이 명확하다.

[실험예 3]

가프렉스 #80의 대신으로 하이플로 수퍼셀(죤 만빌 제품 규조토)을 1.5중량% 또는 2.0중량%의 비율로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 같이 하여 살충제제를 얻었다(참고예 3-1, 3-2). 실시예 1 및 참고예 3-1 및 3-2에 있어서, 독소 단백 함유액으로부터의 건조 원분말의 회수율을 측정했다. 그 결과를 표 5에 표시한다. 표 5에서 괄호내의 수치는 실시예의 회수율을 1로 한 경우의 회수율을 표시한다.

Claims (5)

1. 바실러스 투린기엔시스를 배지중에서 배양하고, 배양액의 독소 단백을 침강시켜, 그 침강된 독소 단백을 함유하는 분리 하층액을 건조하는 것을 포함하는 미생물 살충제제의 제조방법에 있어서, 다음의 (a),(b) 그리고 (c)의 공정 중에서 적어도 하나의 공정을 포함하는 제조방법 :

   (a) 질소원의 적어도 일종으로서 돈육 분말을 함유하는 배지중에서 배양을 행하는 공정,

   (b) 그 균의 배양 종료후의 배양액의 pH를 2∼4로 조정하고, 독소단백을 침강시키는 공정, 그리고

   (c) 그 침강 독소 단백을 함유하는 배양액 하층을 분취하고, 이것에 이산화규소 분말을 첨가하여 얻어지는 혼합물을 분무 건조하는 공정.
2. 제1항에 있어서, 돈육 분말이 배지 성분의 총중량의 2∼10중량%의 비율로 함유되는 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 이산화규소 분말의 평균 입경이 6∼8㎛인 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 이산화규소 분말이 침강 독소 단백 함유액의 2∼6중량%의 비율로 첨가되는 제조방법.
5. 제1항에 있어서, (a),(b) 그리고 (c)의 공정의 모든 것을 함유하는 제조방법.

   표 5의 결과로부터 이산화규소 분말인 카프렉스 $80을 사용하는 것에 의해 유동성이 개선되어, 분말의 회수율이 증가하는 것을 알 수 있다.

   본 발명에 의하면, 바시러스 투린기엔시스의 독소 단백을 함유하는 살충제제의 제조에 있어서, 균체의 증식이 촉진되어, 또한 독소 단백의 생산량이 높아지고, 그래서 번잡한 조작을 행하는 일이 없이 배양액을 처리하여 독소 단백 함유액을 단시간에 건조시키는 것이 가능하게 된다. 이와 같이 미생물 살충제제가 효과적으로 제조되기 때문에 그 제제를 염가로 제공하는 것이 가능하게 된다.