KR0164288B1 - 재조합 대장균을 이용한 폴리-(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발레레이트)의 제조방법 - Google Patents

재조합 대장균을 이용한 폴리-(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발레레이트)의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돌연변이 균주가 아닌 일반 대장균을 PHB(poly-3-hydroxybutyrate) 합성 유전자가 클로닝된 플라스미드로 형질전환시킴으로써 제조된 재조합 대장균을, 탄소원으로 프로피온산이 포함한 배지에서 또는 유도인자로 초산 대사에 관여하는 효소들의 합성을 유도하고 탄소원으로 프로피온산이 첨가된 배지에서 배양하여, 폴리-(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발레레이트)(poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate))를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 고농도의 폴리-(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발레레이트)를 경제적으로 제조할 수 있다.

Description

재조합 대장균을 이용한 폴리-(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발레레이트)의 제조방법
제1도는 pSYL105로 형질전환된 대장균 LS5218을 유가식 배양한 결과를 나타내는 그래프이다.
제2도는 프로피온산 또는 발레르산 첨가배지에서의 재조합 대장균 XL1-Blue와 JM109의 성장곡선을 나타내는 그래프이다.
제3(a)도는 초산 유도(induction)농도에 따른 재조합 대장균 XL1-Blue의 건조균체 무게 및 이로부터 제조된 P(3HB-co-3HV)의 농도를 나타내는 그래프이다.
제3(b)도는 초산 유도농도를 달리하여 배양한 재조합 대장균 XL1-Blue로부터 제조된 P(3HB-co-3HV)의 함유율 및 3HV(3-hydroxyvalerate)의 함유율을 나타내는 그래프이다.
제4(a)도는 초산 및 올레산의 유도에 따른 재조합 대장균 XL1-Blue의 건조균체 무게를 나타내는 그래프이다.
제4(b)도는 재조합 대장균 XL1-Blue로부터 초산 및 올레산의 유도에 의해 제조된 P(3HB-co-3HV)의 농도를 나타내는 그래프이다.
제4(c)도는 재조합 대장균 XL1-Blue로부터 초산 및 올레산의 유도에 의해 제조된 P(3HB-co-3HV)의 함유율을 나타내는 그래프이다.
제4(d)도는 재조합 대장균 XL1-Blue로부터 초산 및 올레산의 유도에 의해 제조된 P(3HB-co-3HV)중의 3HV 함유율을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 재조합 대장균을 이용한 폴리-(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발레레이트)(poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate))(이하, P(3HB-co-3HV)라 함)의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 일반 대장균을 PHB(poly-3-hydroxybutyrate) 합성 유전자가 클로닝된 플라스미드로 형질전환시킴으로써 제조된 재조합 대장균을, 탄소원으로 프로피온산을 포함한 배지에서 배양하여 P(3HB-co-3HV)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근에 환경문제가 인류 최대의 관심사로 대두됨에 따라 생분해성 고분자에 대해서도 많은 연구가 진행되고 있다. 그 중에서도 광분해성 고분자나 전분을 기초로 한 생분해성 고분자와는 달리, 이종 중합체(heteropolymer)로서 미생물에 의해 합성,축적되는 천연고분자 물질인 P(3HB-co-3HV)에 대해서는 P(3HB-co-3HV)가 기존의 화학합성 고분자와 물리·화학·기계적 성질이 비슷하고, 생체 적합성, 압전성 및 서방성 등이 뛰어나며, 생분해성이 뛰어나 자연계에서 일정시간 경과하면 물과 이산화탄소로 완전분해가 되므로, 환경친화 플라스틱 대체품으로 널리 연구되고 있다. 특히, P(3HB-co-3HV)는 동중 중합체(homopolymer)인 PHB에 비해 물성 및 가공성이 우수하여 산업용 재료로서 지대한 관심의 대상이 되고 있다. 그러나, P(3HB-co-3HV)의 제조공정은 기존의 화학합성 고분자에 비해 생산단가가 높아, 아직까지도 범용으로는 사용되지 못하고 있다.
따라서, 생산단가를 낮추면서 생분해성 고분자를 고농도로 제조하기 위해, 저렴한 배지를 이용하여 고농도의 고분자를 생산할 수 있는 균주의 선택이 필수적이므로, 특정 돌연변이 균주를 사용하여 P(3HB-co-3HV)를 제조하려는 노력이 있어 왔다. 특히, 재조합 대장균에서 홀수개의 탄소를 갖는 탄소원을 이용하여 P(3HB-co-3HV)를 제조하기 위해서는 먼저 그 탄소원을 세포내로 도입하고 영양화하는 과정이 필요한데, 슬레이터(Slater) 등은 이때 fad, ato 오페론의 효소가 관여한다고 주장하며, 이 효소들이 대장균의 대사상태와 상관없이 세포내에 일정량 발현될 수 있는 fadR, atoC 돌연변이 균주인 대장균 LS5218을 이용하여 P(3HB-co-3HV)를 제조하는 방법을 제안하였다(참조: Slater et al., Appl. Environ. Microbiol., 58:1089(1992)).
그러나, 전기 돌연변이 균주를 이용하는 P(3HB-co-3HV)의 제조방법은 특정균주만을 사용해야 함은 물론, 대장균의 균주특성에 따라 PHB 축적능력이 다양한 변화를 나타낸다는 연구결과를 고려하면(참조: Lee et al., Biotechnol, Bioeng., 44:1337(1994)), P(3HB-co-3HV)를 제조하기 위하여 전기 돌연변이 균주를 이용하기에는 많은 제약이 따르게 되었다. 이외에도, 전기 LS5218 균주는 다른 대장균 균주에 비해 세포성장이나 P(3HB-co-3HV) 축적능력이 저하된다는 문제점을 가지고 있었다(참조: Yim et al., Korean J. Chem. Eng., 12(2):264(1995)).
따라서, 전기 문제점을 해결하기 위한 방안으로 균체성장 및 P(3HB-co-3HV) 축적능력이 모두 우수한 균주의 개발에 관심이 집중되었고, 이를 위하여 본 발명자들도 돌연변이 균주가 아닌 일반균주로부터 P(3HB-co-3HV)를 고농도로 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.
먼저, 본 발명자들은 여러 연구자들의 연구결과로부터 P(3HB-co-3HV) 생산에 있어서 탄소원으로 사용되는 홀수개의 탄소를 갖는 지방산(fatty acid)의 대사경로를 살펴본 결과, 탄소가 5개인 발레르산(valeric acid)의 경우, fad, ato 오페론이 관여하는 저사슬 지방산(short-chain fatty acid)의 대사경로를 통하여 분해되지만, 탄소가 3개인 프로피온산(propionic acid)은 초산의 대사경로와 유사한 경로를 통하여 분해됨을 확인하였다(참조: Black et al., Biochim. Biophys. Acta., 1210:123(1994); Kay, W.W., Biochim. Biophys. Acta., 264:508 (1972); Nunn, W. D. Bacteriol. Rev., 50:179(1986); Wegner et al., Bacteriol. Rev., 32:1(1968)). 따라서, 탄소원으로 프로피온산을 사용할 경우에는 fadR, atoC 돌연변이 균주를 이용하지 않더라도, 초산의 대사경로를 활성화시키는 적절한 유도방법을 통하여 P(3HB-co-3HV)를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
이에, 본 발명자들은 PHB 합성 유전자가 클로닝된 pSYL105(참조: Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44:1337(1994))로 형질전환된 여러가지 대장균들을 프로피온산이 첨가된 배지에서 적절한 유도인자로 초산 대사에 관여하는 효소들의 합성을 유도하고 프로피오산이 첨가된 배지에서 배양한 결과, 고농도의 P(3HB-co-3HV)를 경제적으로 제조할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 돌연변이 균주가 아닌 일반 대장균을 PHB 합성 유전자가 클로닝된 플라스미드로 형질전환시킴으로써 제조된 재조합 대장균을 탄소원으로 프로피온산을 포함한 배지에서 배양하여 P(3HB-co-3HV)를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 방법으로 제조된 P(3HB-co-3HV)를 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
PHB 합성 유전자가 클로닝된 플라스미드, 가장 바람직하게는 pSYL105(베타-락타메이즈, PHB 합성 유전자 및 플라스미드 R1의 parB의 영역을 포함하는 재조합 플라스미드; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44:1337(1994) 참조)로 돌연변이 균주가 아닌 일반 대장균 예를 들면, 대장균 XL1-Blue, JM109, HB101 및 DH5α 등을 형질전환시켰다.
이렇게 제조된 각 재조합 대장균을 탄소원으로 포도당과 프로피온산을 포함하고 있는 배지, 바람직하게는 ① KH2PO413.3g/l, (NH4)2HOP44g/l, MgSO4·7H2O 1.2g/l, 구연산 1.7g/l, FeSO4·7H2O 0.1g/l, CaCl2·2H2O 0.02g/l, ZnSO4·7H2O 0.0225g/l, MnSO4·4-5H2O 0.005g/l, CuSO4·5H2O 0.01g/l, (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001g/l 및 Na2B4O7·10H2O 0.0002g/l로 구성된 단순배지에 트립톤 2g/l, 포도당 20g/l 및 프로피온산 20mM을 첨가한 배지 혹은 ② 효모 추출액 5g/l, 트립톤 10g/l 및 NaCl 10g/l로 구성된 LB 복합배지에 포도당 20g/l와 프로피온산 20mM을 첨가한 배지에서, 25℃ 내지 40℃의 온도, 가장 바람직하게는 32℃로 배양한 결과, 전기 재조합 대장균들이 프로피온산을 탄소원으로 이용하여 균체내에 P(3HB-co-3HV)를 고농도로 축적시키는 것을 알 수 있었다.
아울러, P(3HB-co-3HV)의 생산성을 증진시키기 위하여, 재조합 대장균을 전기 배지성분 중의 포도당 및 프로피온산 대신에 유도인자가 포함된 배지에서 미리 배양하고, 탄소원으로 포도당 및 프로피온산을 추가로 첨가하여 배양한 결과, 건조균체 중량에 대하여 70% 이상의 함유율을 갖는 P(3HB-co-3HV)을 제조할 수 있었다. 이때, 유도인자로서는 초산 대사에 관여하는 효소들의 합성을 유도할 수 있는 초산, 프로피온산 및 올레산 등을 사용하였다.
따라서, 본 발명에 의하면, PHB 합성 유전자가 클로닝된 플라스미드로 형질전환된 일반 대장균으로부터 고농도의 P(3HB-co-3HV)를 경제적으로 제조할 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.
[실시예 1]
돌연변이 균주인 대장균 LS5218의 유가식 배양
fadR 및 atoC 돌연변이 균주인 LS5218과 일반 대장균 균주의 P(3HB-co-3HV) 축적능력을 비교하기 위하여, 고농도로 생산물을 제조할 수 있는 배양방법인 유가식 배양법을 이용하여, PHB 합성 유전자가 클로닝된 플라스미드로 형질전환된 대장균 LS5218(참조: Slater et al., Appl. Environ. Microbiol., 58:1089(1992))을 37℃에서 배양하였다(참조: 제1도). 이때, 하기 표 1의 단순배지에 탄소원으로 50mM 초산을 첨가한 배지를 초기 배지로 하였고, 포도당 700g/l, MgSO4·7H2O 20g/l 및 효모 추출액 35g/l로 구성된 용액을 입력배지(feeding solution)로 사용하였으며, 배양 16시간 후에 발레르산 25g/l을 첨가하고, 포도당의 농도는 일정하게 유지되도록 하였다.
제1도에서, (-●-)는 건조균체 무게; (-■-)는 실세포 무게(residual biomass concentration); 및, (-▲-)는 P(3HB-co-3HV) 농도를 각각 나타낸다. 제1도에 보듯이, 회분배양 결과인 하기 실시예 3 내지 5의 결과와 비교하면, 돌연변이 재조합 균주는 배양 21시간만에 4.0%의 3HV(3-hydroxyvalerate) 함유율을 갖는 22.5g/l의 P(3HB-co-3HV)를 제조하였으므로 최대 생산성은 1.07gl h 로 높은 편이나, P(3HB-co-3HV) 함유율은 25%로 저조하였다. 이때, P(3HB-co-3HV) 함유율은 P(3HB-co-3HV) 농도 대 건조균체 무게비의 백분율(%)로서 나타내었으며, 이하의 실시예에서도 동일하게 나타내었다.
[실시예 2]
프로피온산 또는 발레르산 첨가배지에서의 재조합 대장균의 성장
돌연변이 균주가 아닌 일반 대장균 XL1-Blue 및 JM109을 pSYL105로 형질전환시킴으로써 제조한 재조합 대장균을 이용하여, 프로피온산 또는 발레르산 첨가배지에서의 성장특성을 조사하였다. 상기 표 1의 단순배지에 포도당 20g/l 및 트립톤 2g/l, 프로피온산 또는 발레르산을 20mM 첨가한 다음, 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 배지의 산도를 pH 6.8로 적정하고, 엠피실린(ampicillin) 100mg/l를 첨가한 배지를 재조합 대장균의 성장을 위한 배지로 사용하였다. 전기의 재조합 대장균을 37℃의 온도에서 250rpm으로 진탕배양하였는데, 배양시간에 따른 성장곡선을 제2도에 나타내었다.
제2도에서, (-○-)는 프로피온산 첨가배지에서의 재조합 대장균 XL1-Blue의 성장곡선; (-●-)는 발레르산 첨가배지에서의 재조합 대장균 XL1-Blue의 성장곡선; (-□-)는 프로피온산 첨가배지에서의 재조합 대장균 JM109의 성장곡선; 및 (-■-)는 발레르산 첨가배지에서의 재조합 대장균 JM109의 성장곡선을 각각 나타낸다. 제2도에서 보듯이, 프로피온산 첨가배지에서의 재조합 대장균 XL1-Blue와 JM109 두 균주는 짧은 지연시간(lag time) 후에 성장을 시작한 반면, 발레르산 첨가배지에서는 20 내지 30시간의 긴 지연시간 후에 성장을 시작하는 것으로 보아, 전기 두 균주는 프로피온산을 쉽게 탄소원으로 이용할 수 있음을 알 수 있었다. 아울러, 두가지 탄소원 즉, 프로피오산과 발레르산 첨가배지에서 재조합 대장균 XL1-Blue의 성장속도가 재조합 대장균 JM109의 성장속도보다 더 빠름을 알 수 있었다.
따라서, 돌연변이가 아닌 일반 대장균 균주에서도 트립톤을 첨가한 단순배지에서 프로피온산을 쉽게 탄소원으로 이용할 수 있음을 확인하였다.
[실시예 3]
여러가지 재조합 대장균에서의 P(3HB-co-3HV) 제조
전기 실시예 2의 결과를 토대로, pSYL105로 형질전환된 일반 대장균 XL1-Blue, JM109, HB101, DH5α의 4가지 균주를 프로피온산 첨가배지에서 배양하여 P(3HB-co-3HV)를 제조하였다. 실시예 2에서와 마찬가지로 배지의 산도를 수산화나트륨을 사용하여 pH 6.8로 적정하였고, 배지에 엠피실린 100mg/l를 첨가하였으며, 각 재조합 대장균은 37℃, 250rpm에서 72시간 동안 배양하였다. 이때, 배지는 LB 복합배지(효모 추출액 5g/l, 트립톤 10g/l 및 NaCl 10g/l로 구성된 배지)와 표 1의 단순배지에 트립톤 2g/l를 첨가한 배지를 사용하였고, 탄소원으로 포도당 20g/l와 프로피온산 20mM을 각각 첨가하였다.
여러가지 재조합 대장균을 각 배지에서 배양하였을 경우, 건조균체 무게, P(3HB-co-3HV) 농도, P(3HB-co-3HV) 함유율 및 3HV의 함유율에 대한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
상기 표 2에서 보듯이, 전기 모든 재조합 대장균은 일반적으로 복합배지보다 단순배지에서의 배양시, 건조균체 무게, P(3HB-co-3HV) 농도, P(3HB-co-3HV) 함유율 및 3HV의 함유율이 높음을 알 수 있었다. 그 중에서도 재조합 대장균 XL1-Blue가 가장 높은 P(3HB-co-3HV) 함유율을 나타내었는데, 건조균체무게 및 P(3HB-co-3HV) 농도는 각각 2.55g/l 및 1.39g/l이었다.
[실시예 4]
초산 또는 프로피온산의 유도에 의한 P(3HB-co-3HV)의 제조
재조합 대장균으로부터 P(3HB-co-3HV)를 고농도로 제조하기 위하여, 프로피오산 대사경로에 관여하는 효소를 활성화하는 것으로 알려진 초산 또는 프로피온산을 이용한 유도실험을 다음과 같이 수행하였다. 초산 또는 프로피온산을 첨가한 상기 표 1의 단순배지(+ 트립톤 2g/l)에서 pSYL105로 형질전환된 대장균 XL1-Blue를 OD값이 0.8될 때까지 배양한 다음, 포도당 20g/l와 프로피온산 20mM를 첨가하여 72시간동안 배양하였다. 이때, 실시예 2 및 3에서와 같이 마찬가지로 배지는 수산화나트륨을 사용하여 pH 6.8이 되도록 하였고, 이어 엠피실린 100mg/l을 첨가하였다. 그러나, 실시예 2 내지 3에서와는 달리, 고분자 합성을 증진시키기 위하여 재조합 대장균의 최적 성장온도인 37℃보다 낮은 32℃에서 배양하였다.
초산을 이용한 유도실험 결과는 제3(a)도 및 제3(b)도에 나타내었다. 제3(a)도는 초산 유도농도에 따른 건조균체 무게(-●-) 및 P(3HB-co-3HV) 농도(-○-)를 나타내고, 제3(b)도는 초산 유도농도에 따른 P(3HB-co-3HV) 유율(-●-) 및 3HV 함유율(-○-)을 각각 나타낸다. 제3(a)도 및 제3(b)도에서 보듯이, 10mM의 초산으로 유도하였을때, 유도를 하지 않았을 때보다 P(3HB-co-3HV) 농도가 현저하게 증가하였음을 알 수 있으며, 이때의 P(3HB-co-3HV) 농도, P(3HB-co-3HV) 함유율, 3HV 함유율은 각각 5.86g/l, 73.0%, 10.1%이었다.
아울러, 프로피온산을 이용한 유도실험 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
상기 표 3에서 보듯이, 프로피온산 유도농도가 증가함에 따라 건조균체농도와 P(3HB-co-3HV) 농도는 감소하였으나, 3HV 함유량은 오히려 증가하여 30mM의 프로피온산 유도하에서 33.0%의 높은 3HV 함유율을 갖는 고분자 P(3HB-co-3HV)를 얻을 수 있었다.
[실시예 5]
올레산의 유도에 의한 P(3HB-co-3HV)의 제조
올레산을 이용한 유도실험에서, 유도인자로 초산 및 올레산을 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 pSYL105로 형질전환된 재조합 대장균 XL1-Blue을 배양하였다. 배양초기에 0.4g/l의 Brij 58(Junsei Chemical Co., JAPAN)과 함께 올레산 1g/l의 첨가 유무에 따라 측정한 건조균체 무게, P(3HB-co-3HV) 농도, P(3HB-co-3HV) 함유율 및 3HV 함유율을 각각 제4(a)도, 제4(b)도, 제(c)도 및 제4(d)도에 나타내었다. 제4(a)도 내지 제4(d)도에서, (□)는 올레산을 첨가하지 않은 경우의 결과를 나타내고, (■)는 올레산을 첨가한 경우의 결과를 나타낸다. 제4(a)도 내지 제4(d)도에서 보듯이, 초산 및 올레산의 유도 유무에 따라 가장 큰 변화를 보인 것은 3HV 함유율인데, 초산 유도를 하지 않았을 때 올레산의 첨가는 3HV 함유율을 4배나 증가시켰고, 초산 유도를 하였을 때에도 3HV 함유율을 증가시킴을 알 수 있었다. 따라서, 올레산의 첨가로 P(3HB-co-3HV) 중의 3HV 함유율을 크게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 돌연변이 균주가 아닌 일반 대장균을 PHB 합성 유전자가 클로닝된 플라스미드로 형질전환시킴으로써 제조된 재조합 대장균을, 탄소원으로 프로피온산이 첨가된 배지 또는 유도인자로 초산 대사에 관여하는 효소들의 합성을 유도하고 탄소원으로 프로피온산이 첨가된 배지에서 배양하여, 고농도의 P(3HB-co-3HV)를 경제적으로 제조하는 방법을 제공한다.

Claims (5)

  1. 돌연변이 균주가 아닌 일반 대장균(Escherichia coli)을 PHB(poly-3-hydroxybutyrate) 합성 유전자가 클로닝된 플라스미드로 형질전환시킴으로써 제조된 재조합 대장균을 탄소원으로 포도당과 프로피온산을 함유하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는 재조합 대장균을 이용한 폴리-(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발레레이트)(poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate))의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 일반 대장균은 대장균(Escherichia coli) XL1-Blue, JM109, HB101 및 DH5α로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 폴리-(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발레레이트)의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 포도당과 프로피온산을 포함하는 배지는 KH2PO413.3g/l, (NH4)2HPO44g/l, MgSO4·7H2O 1.2g/l, 구연산 1.7g/l, FeSO4·7H2O 0.1g/l, CaCl2·2H2O 0.02g/l, ZnSO4·7H2O 0.0225g/l, MnSO4·4-5H2O 0.005g/l, CuSO4·5H2O 0.01g/l, (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.001g/l 및 Na2B4O7·10H2O 0.0002g/l로 구성된 단순배지에 트립톤 2.0g/l, 포도당 20g/l 및 프로피온산 20mM을 첨가한 배지인 것을 특징으로 하는 폴리-(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발레레이트)의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 포도당과 프로피온산을 포함하는 배지는 효모 추출액 5g/l, 트립톤 10g/l 및 NaCl 10g/l로 구성된 LB 복합배지에 포도당 20g/l와 프로피온산 20mM을 첨가한 배지인 것을 특징으로 하는 폴리-(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발레레이트)의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 탄소원으로 포도당과 프로피온산을 첨가하기 전에 재조합 대장균을 초산, 프로피온산 및 올레산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 유도인자가 첨가된 배지에서 배양하는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리-(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발레레이트)의 제조방법.
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