KR0139769B1

KR0139769B1 - 당뇨병성 또는 노인성(당) 백내장 예방치료제

Info

Publication number: KR0139769B1
Application number: KR1019930013097A
Authority: KR
Inventors: 신국현; 유중근
Original assignee: 김태훈; 주식회사 유한양행
Priority date: 1992-07-13
Filing date: 1993-07-13
Publication date: 1998-06-01
Also published as: WO1994001106A1; KR940001899A

Abstract

본 발명은 백크안젤리신(Byakangelicin) 또는 3차 O-메틸배크안젤리신(tert-O-methyl byakangelicin)이 함유된 당뇨병성 또는 노인성 (당)백내장 예방 치료제에 관한 것이다.

즉, 본 발명은 천연약물로부터 폴리올경로의 주요한 효소(Keyenzyme)로 알려진 알도오스 환원효소의 활성을 저해하고, 수정체의 폴리올 축적을 억제하는 물질을 제공함으로써, 증가일로에 있는 당뇨병성 또는 노인성 (당)백내장 예방치료제의 제공에 관한 것이다.

Description

당뇨병성 또는 노인성(당) 백내장 예방 치료제

제 1도는 푸라노쿠마린에 의한 알도오스 환원효소의 저해효과를 나타낸 도면이고,

제 2도는 랫트의 수정체에 대한 덴시토미터 패턴을 나타낸 도면이고,

제 3도는 랫트에 있어서 갈락토오스로 유발된 백내장에 푸라노쿠마린의 전처리가 미치는 영향(in vivo)을 나타낸 도면이고,

제 4도는 랫트에 있어서 갈락토오스로 유발된 백내장에 백크안젤리신의 동시처리가 미치는 영향을 나타낸 도면이다.

본 발명은 백크안젤리신(Byakangelicin) 또는 3차 O-메틸배크안젤리신(tert-O-methyl byakangelicin)이 함유된 당뇨병성 또는 노인성(당) 백내장 예방 치료제에 관한 것이다.

당뇨병은 대표적인 성인병의 하나로서 전세계적으로 격증하고 있고 우리나라에서도 그 환자는 증가일로 있다. 오늘날 당뇨병 치료의 최대목표의 하나는 당뇨병 합병증의 유발이나 진전을 억제하는 것이며, 이들 합병증 중에서도 백내장은 당뇨병 환자에게서 호발하는 질환으로서 심하면 궁극에 가서 시각소실이라는 위험을 안고 있는 정복하여야 할 무서운 질병의 하나임은 주지의 사실이다.

현재 주목받고 있는 당뇨병성 합병증의 발병기전의 하나는 글루코오스 대사경로의 하나인 글루코오스가 소르비톨을 경우하여 프럭토오스로 변환되는 소위 폴리올대사계의 이상을 들 수 있다. 폴리올대사계의 이상이란, 고혈당에 의해서 수정체내에 글루코오스가 증가하면 폴리올 경로의 율속효소인 알도오스 환원효소에 의해 소르비톨의 산생이 항진되며, 축적이 일어남으로써, 결과적으로 세포내 침투압이 상승, 세포의 팽윤화의 가속 등으로 말미암아 백내장이 유발되는 것을 말한다(J.H.Kinoshita, Invest. Opthalmol. Vol4, 786, 1965)

따라서, 폴리올의 산생에 관여하는 효소인 알도오스 환원효소를 저해한다면, 폴리올의 산생을 억제시킬 수 있고 결과적으로 당뇨병성 합병증인 백내장 유발을 저지할 수 있다.

종래에 구명된 많은 효소 저해물질들은 시험관내 시험(in vitro) 및 생체내시험(in vivo) 모두에서 폴리올 형성을 억제하는 것들을 비교적 드물며, 특히 생체내 실험에 있어서 이러한 효소 저해제들을 장기간 사용한다는 특성 때문에 무엇보다도 안정성이 높고, 심한 부작용이 없는 것이 요구되나, 이를 만족시킬 수 있는 물질을 극히 드물다.

종래 시험관내 시험(in vivo)에서 알도오스 환원효소 저해작용이 확인된 것으로는 플라보노이드, 쿠마린 성분을 들 수 있고, 구어세틴과 그 유도체, 이소리퀴리토제닌, 고시핀 등이 우수한 저해활성이 있음이 구명 보고된 바 있다. 국내에서도 수종의 천연 쿠마린 유도체들이 수정체의 알도오스 환원효소에 미치는 저해효과가 있음이 보고된 바 있다.

이에 본 발명자들은 비교적 부작용이 경미한 천연약물인 생약으로부터 안전성이 높고 부작용이 없는 새로운 백내장 치료제를 개발하고자 연구를 거듭한 결과 백지(Angelica dahurica Benth, et Hook)로부터 추출된 백크안젤리신 및 그 유도체인 3차-O-메틸백크안젤리신이 당뇨병성 백내장에 유효하다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 천연약물로부터 폴리올경로의 주요한 효소(Keyenzyme)로 알려진 알도오스 환원효소의 활성을 저해하고, 수정체의 폴리올 축적을 억제하는 물질을 제공함으로써, 증가일로에 있는 당뇨병성 또는 노인성(당) 백내장 치료제 개발의 선두 화합물(lead compound)을 제공하는데 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

백지(Angelica dahurica Benth. et Hook)는 미나리과(Umbelliferae)에 속하는 다년생 초본으로서 고래로부터 한방에서 그 뿌리를 감기, 두통, 비염, 치통, 등 정혈, 진통 및 진정약으로서 상용되는 한약의 하나이며 중국에서는 향료 또는 조미료로도 많이 쓰인다. 우리나라, 일본, 중국 등에서 재배되며, 적어도 3종의 변종이 혼용된다.

이 식물의 주성분군은 수십종의 푸라노쿠마린(furanocoumarin) 들이며, 여러가지 생리작용과 최근에는 본 발명자들에 의해 간의 약물대사 효소 억제효과와 중추신경억제작용이 있음이 구명 보고된 바 있다.

본 발명자들은 백지로부터 알도오스 환원효소 억제성분으로서 4종의 푸라노쿠마린들을 확인, 그 화학구조를 동정하였으나, 이 중 백지의 특이성분이며 주성분인 배크안젤리신(byakangelicin) 및 그 유도체인 3차-O-메틸백크안젤리신(tert-O-methyl byakangelicin)이 생체내 실험에서 백내장 예방 및 치료에 효과가 있다는 것을 확인하였다.

백크안젤리신은 분자량 334의 담황색의 침상결정으로서 백지(Angelica Dahurica Radix)의 뿌리로부터 추출될 수 있다(Japanese chemical Indes,7,P516 (1987)).

백크안젤리신 및 그의 유도체인 3차-O-메틸백크안젤리신의 구조는 다음과 같다.

상기 백크안젤리신 및 3차-O-메틸백크안젤리신은 각각 또는 함께 0.1mg - 3,000mg을 더욱 바람직하게는 1mg - 100mg, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 경구 또는 복강 투여함으로써, 당뇨병성 또는 노인성(당) 백내장을 예방치료할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서 약제학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있는 대표적인 것으로 락토오스, 덱스트로스, 슈크로오스, 만니톨, 스타취(Starch), 아카시아고무, 인산칼슘, 알지네이트(alginates), 트리가칸스(tragacanth), 젤라틴, 칼슘실리케이트(calciumsilicate), 마이크로크리스탈라인 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 메톡시하이드록시벤조에이트(methoxyhydroxy-benzoate), 프로필하이드록시 벤조에이트(Propylhydroxy-benzoaate), 탈크(talc), 마그네슘스테아레이트, 미네랄오일(mimeraal oil)등을 들 수 있다.

또한 본 발명에 따른 조성물을 활택제, 습윤제(wetting agent), 감미제(sweeting agent), 향료(flaworing agent), 유화제, 현탁제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

이하에서는 생화학적 및 약제학적 시험예를 제시함으로써 백크안젤리신 및 그 유도체인 3차-O-메틸백크안젤리신의 유용성을 설명하고자 한다. 특별히 정의되지 아니하는 한 여기서 주어진 고체/고체, 액체/액체, 고체/액체의 %나 비율은 각각 중량/중량, 부피/부피, 중량/부피를 의미한다.

실시예1. 백지근(Angelica dahurica Benth. et Hook) 성분의 분리

건조된 백지근 3kg을 분쇄하여 조말을 얻고, 95% 메탄올로 6시간씩 3회 수욕에서 환류 추출하고 추출액을 합한 후 감압 증류하여 농축하고, n-헥산:메탄올:물(10:1:9)로 분획하여 헥산분획을 얻고, 수층은 다시 에테르로 계통분획하여 각 분획물을 얻고, 이 분획들을 합하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하였다.

n-헥산, 헥산/에테르, 벤젠/에테르 등으로 기울기 용출을 하여 헥산:에테르(100:5)에서 무색 침상 결정인 화합물 1, 헥산:에테르(100:6)에서 무색 침상 결정으로 화합물 2를 순수 분리하였다. 다시 극성을 높여 벤젠:에테르(20:1)로 용리하여 화합물 3 (미황색결정)을, 벤젠:에테르(5:1: ~3:1)에서 미황색의 결정인 화합물 4를 순수분리하였다.

상기의 성분 분리 공정을 도식으로 나타내면 도식 1과 같다.

실시예2. 백지근 활성성분의 구조동정

화합물 3은 m.p. 88℃의 황색 무정형 결정으로서, IR, MS,¹H-NMR 결과는 다음과 같다.

mp 88℃

IR νmax (KBr, cm^-1) : 3400 (broad, OH), 3100, 3120 (furan), 1705, 1605, 1590, 1480, 1430, 1350, 1145, 1065, 825

MS (m/z) : 348(M⁺), 333(M⁺-Me), 317(M⁺-OMe), 276(M⁺-C₄H₈O), 246(CH₂O), 245(M⁺C₅H₁₁O₂), 232(M⁺C₆H₁₂C₂), 217(232-Me), 203(231-CO), 189(217-CO), 175(203-CO), 160(189-CHO), 89(C₇H₅), 73(Me₂C=OMe)

¹H-NMR(CDCl₃) δ : 6.25(1H,d,J=9.8,H-3), 8.10(1H,d,J=9.8,H-4), 7.00(1H,d,J=2.4,H-2') 7.60(1H,d,J=2.4,H-3'), 3.85-4.30(2H,m,H-a), 4.60(1H,dd,H-b), 3.23(3H,s,H-d), 1.23(6H,s,H-C¹and H-C²), 4.15(3H,s,OMe)

화합물 4는 자외선에서 담황색 형광을 나타내는 m.p. 118℃의 담황색 결정으로서, IR,MS,¹H-NMR 결과는 다음과 같다.

mp 118℃

IR νmax (KBr, cm^-1) : 3540, 3100, 3120, 1710, 1605, 1595, 1490, 1386, 1370, 820

MS (m/z) : 334(M⁺), 319(M⁺-Me), 245(M⁺-C₄H₉O₂), 232(M⁺C₅H₁₀O₂), 217(232-Me), 203(231-CO), 189(217-CO), 175(203-CO), 160(189-CHO)

¹H-NMR(CDCl₃) δ : 6.27(1H,d,J=9.8,H-3), 8.11(1H,d,J=9.8,H-4), 7.00(1H,d,J=2.4,H-2) 7.63(1H,d,J=2.4,H-3'), 4.14-4.36(2H,m,H-a), 4.60(1H,dd,H-b), 1.31(3H,s,H-c¹), 1.27(3H,s,H-C²), 4.17(3H,s,OMe).

상기의 결과로부터 화합물 3는 3차-O-메틸백크안젤리신이고, 화합물 4는 백크안젤리신임을 동정하였고, 다른 화합물 1 및 2는 각각 mp 108℃의 이소임페라토린, mp 106℃의 임페라토린임을 동정하였다.

화합물 1 및 2의 NMR등의 결과는 다음과 같다.

(화합물 1)

mp 108℃

IR νmax (KBr, cm^-1) : 1725, 1680, 1590, 1500, 1480, 1380, 1170, 820

MS (m/z) : 270(M⁺) :

¹H-NMR(CDCl₃) δ : 6.26(1H,d,J=9.8,H-3), 8.15(1H,d,J=9.8,H-4), 7.1(1H,s,H-8), 6.86(1H,d,J=2.0,H-2'), 7.6(1H,d,J=2.0,H-3'), 4.90(2H,d,J=6.8,H-a), 5.50(1H,tq,J=7.1,H-b), 1.70(3H,s,H-C¹), 1.80(3H,s,H-C²)

(화합물 2)

mp 106℃

IR νmax (KBr, cm^-1) : 1718, 1595, 1497, 1380, 1360

MS (m/z) : 270(M⁺), 255(M⁺-Me), 202, 201, 173, 145

¹H-NMR(CDCl₃) δ : 6.35(1H,d,J=9.8,H-3), 7.74(1H,d,J=9.8,H-4), 7.34(1H,s,H-5), 6.79(1H,d,J=2.0,H-2'), 7.67(1H,d,J=2.0,H-3').

4.99(2H,d,J=7.1,H-a), 5.60(1H,tq,J=7.1,H-b), 1.72(6H,s,H-C¹and H-C²)

실시예 3. 알도오스 환원효소(AR)원의 조제

효소원의 조제는 헤이만 등이 사용한 방법(S.Hayman, J.H.Kinoshita, Isolation and Properties of Lens Aldose reductase,J.Bio. Chem. 240, 877 (1965))을 수정하여 실시하였다.

즉, 사후 5시간 이내의 소의 안구의 공막을 벗겨서 잘라내고 유리체를 제거한 다음 수정체를 적출하고, 그 습증량을 측정한 후 습증량의 5배 부피에 해당하는 5mM 인산염 완충액(pH 7.4)을 가한 후 워링 블렌더로 5분간 균질화하였다.

이 균질화액을 4℃에서 18,000g로 15분간 원심분리한 후, 그 상등액을 취하여 황산 암모늄을 40% 포화시킨후, 15분간 방치하고 12,000g에서 30분간 원심분리한 상등액을 취하여 효소원으로 하였다.

효소원의 단밸직의 정량은 로우리 법(O.H.Lowry, N.J.Rosenbrough,A.L.Farr,R.J.Randall, Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent, J. BioChem. 193, 265 (1951))에 의하여 실시하였고, 소의 혈청 알부민(Sigma Fr. V)을 표준물질로 하였다.

랫트의 경우는 수정체 습증량의 12배 부피에 해당하는 0.5mM PMSF(phenylmethyl sulfonyl fluoride)와 135mM Na-K 인산염 완충액을 가하여 워링 블렌더로 5분간 균질화하였다.

이 균질화액을 4℃에서 100,000g로 30분간 원심분리한 후 그 상등액을 취하여 효소원으로 하였다.

시험예 1. 알도오스 환원효소 저해작용의 측정(in vitro)

에이브램 등의 방법(N.Abram, Brubaker, Synthesis and Rat Lens Aldose Reductase Inhibitory Activity of Some Benzopyran-2-ones, J.Med. Chem. 29, 1094(1986))에 준하여 실시예 3에 따라 조제한 효소원과 10mM DL-글리세르알데히드, 0.16mM NADPH를 0.1M 인산염 완충액 (pH 6.2)에 용해하여 총부피 1ml로 한 후 UV 스펙트로포토미터의 cell에 가하고 340nm에서 5분간 1분간격으로 흡광도의 감소율을 측정하여 대조군의 효소활성으로 하였다.

이때 공시험군으로서 기질인 글리세르알데히드 대신 완충액만을 가하여 반응시켜서 흡광도의 변화를 측정하고, 대조군에서 공시험군을 감하여 준 흡광도의 변화가 0.055±0.005 흡광도단위 / 5min이 되도록 하였다.

위의 반응액에서 측정시료를 100㎍/ml가 되게 가하여 흡광도의 변화를 측정하고, 대조군의 그것에서 시료투여군의 흡광도를 감한 값을 구하여 대조군의 흡광도에 대한 비의 백분율을 검액에 의한 효소저해율로 하였다. 이를 도식으로 나타내면 도식 2와 같다.

검액의 농도를 단계적(적어도 3단계)으로 희석하여 각각의 효소저해율을 구하고 검액의 농도에 대한 효소저해율을 로지트-로그 페이퍼(logit-log paper)에 기록하여 50% 효소저해농도를 구하였다.

물에 불용인 시료는 0.1% 이내가 되도록 DMSO에 용해시켜서 반응액에 첨가하였다. 생약 검액의 조제는 건조중량 30g을 증류수를 가하여 수욕상에서 5시간 환류추출하고 여과한 여액 동결건조 후 용시에 적당한 농도로 희석하였다.

백지에서 분리한 4종의 푸라노쿠마린 성분들이 시험관내 실험에서 소의 수정체 알도오스 환원효소에 미치는 효과를 측정한 결과는 제1도에 나타내었다.

이 성분들의 억제작용의 강도를 비교검토하기 위하여 3단계의 농도에 대한 반응을 측정하여 그래프를 작성하고 각 성분들의 IC₅₀를 나타내면 다음 표1와 같다.

상기 표1 및 제1도의 결과에서 알 수 있는 바와 같이 3차-O-메틸-백크안젤리신이 2.8μM로서 효소 억제작용이 가장 강하였고, 배크안젤리신이 6.2μM로서 이에 필적하였으나 임페라토린 및 이소임페리토린은 각각 8.0μM 및 22μM로서 훨씬 억제강도가 약하였다.

시험예 2. 갈락토오스 유발 백내장 형성에 미치는 효과의 측정 (in vivo)

2-1동물에서 백내장의 유발

갈락토오스에 의한 백내장 유발은 오쿠다 등의 방법(J.Okuda, Effect of an Aldose Reductase Inhibitor on Cataract Formation and Tissue Polyol Level in Galactosemic Rat, Chem. Pharm. Bull. 33, 2990 (1985))에 준하여, 체중 50-60g의 스프라규-도울리 랫트에 0.9% 생리식염수 용액에 1g/ml의 갈락토오스를 현탁시켜 20-40g/kg b.w.씩을 오전(10시 전후) 및 오후(7시 전후)2회에 나누어 경구투여하고, 최고 20일까지 연속투여하여 야기시켰다. 대조군은 실험군과 같은 용량의 생리식염수를 투여하였다.

백내장 유발여부의 확인은 1차적으로 펜 라이트(pen-light)를 이용하여 육안으로 관찰하여 시행하였고, 랫트를 CHCl₃로 치사시킨 후 안구를 안과용 가위로 적출하고 수정체를 분리한 후 덴시토미터에 투과시켜 스펙트럼의 변화로 백내장의 진행을 관찰하며, 그 결과는 제 2 도와 같다.

또한 백내장 발현시 갈락토오스 투여량 및 동물의 체중에 대한 영향을 보면 다음 표 2와 같다.

표2. 랫트에서 백내장 발현시 갈락토오스 투여량 및 동물의 체중에의 영향

a) 갈락토오스 투여량

b) 최초 갈락토오스 투여시 체중

상기 표2에서 나타낸 바와 같이 체중 40-50g의 랫트에 갈락토오스를 40g/kg/day씩 투여시는 8±1일 만에 백내장이 유발되었으나, 90-100g의 랫트에서는 12±2일에 유발되어 체중 증가에 따라 유발속도도 다소 지연되고 또한 비슷한 체중에서 갈락토오스 용량이 1/2로 줄어지면 백내장 유발이 지연됨을 확인하였다.

따라서 시료 전처치 실험에서는 체중 40-50g의 랫트에 대하여 갈락토오스 40g/kg/day를 투여하였다.

2-2푸라노쿠마린 전처리가 백내장에 미치는 영향

40g/kg/day로 갈락토오스를 투여하기 7일전부터 배크안젤리신 및 임페라토린을 50mg/kg씩 0.5% CMC 현탁액으로 하여 1일 1회 복강내 투여하였으며, 갈락토오스 투여 개시일부터 45일간 시료 처치군과 대조군의 백내장 발생추이를 관찰하여 제3도에 나타내었다.

제3도에서 보는 바와 같이 대조군의 경우 투여개시후 12-15일 사이에 좌우 수정체 12개(n=6) 모두에서 백내장이 유발된 반면, 임페라토린 투여군은 13일째부터 1마리에서 백내장이 유발되었고 24일째는 50%의 발생률을 보였다. 그러나, 배크안젤리신 투여군은 28일째에 실험군 1마리에서만 백내장의 소견을 보이고 시험종료일인 45일째까지도 더 이상의 발현은 없었다.

2-3갈락토오스 투여와 동시에 배크안젤리신을 처치한 경우 백내장에 미치는 효과

갈락토오스 투여개시와 동시에 실시예 1에서 얻어진 배크안젤리신을 처치한 경우의 결과는 제 4도와 같다. 제 4도에서 알 수 있는 바와 같이 대조군에서 갈락토오스 투여후 7일째부터 백내장의 소견이 관찰되어 대조군의 77%, 시료처치군은 38%의 백내장 유발이 관찰되었다.

또한, 갈락토오스 투여량을 20g/kg/day로 낮추었더니 갈락토오스투여 13일째부터 백내장 유발이 시작되어 25일째에는 대조군 전부에서 백내장이 관찰된 반면, 시료인 배크안젤리신 투여군에서는 1마리만이 19일만에 백내장이 유발되었을 뿐 대조군에서 100% 유발된 26일째까지도 더이상의 백내장 발현은 없었다.

2-4갈락티톨의 함량측정

대조군과 배크안젤리신 투여군의 수정체를 실험 최종일에 적출하여 이 속에 함유된 갈락티톨을 추출하고 아세틸화 시킨 후 가스 크로마토그래피를 실시하여 갈락티톨 함량을 측정한 결과는 다음표 3과 같다.

갈락티톨 함량 측정방법은 휴의 방법(Tian-Sheung Hu, Reversal of galactose cataract with sorbinil in rats, Invest. Opthalmo. vis. sci. 24, 640(1983))에 의하여 측정하였다.

즉, 수정체 1개당 1ml의 0.3N ZnSO₄액을 가하고 워링 블렌더로 균질화한 후 동량의 0.3N Ba(OH)₂를 가하여 중화시킨 다음 10,000g에서 20분간 원심분리하여 상등액을 취하고 감압 농축하여 용매를 완전히 제거하였다.

잔사 1mg당 피리딘 100μl, 무수초산 200μl를 가하여 실온에서 24시간 방치후 얼음물을 가하여 30분간 방치한 다음, 3ml의 CHCl₃로 3회 추출하고 추출액을 합하여 감압 농축, 건조하였다.

이렇게 하여 얻은 반응물을 다시 100μl의 CHCl₃에 용해시키고 그액의 1μl를 가스크로마토그래프에 주입하여 각 폴리올의 크로마토그램을 얻고 각각의 표준검량선으로부터 함량을 산출하였다.

따로 갈락티톨 및 소르비톨 표준품을 각각 무게별로 취하고 상기와 같은 조작을 실시한 다음 각각의 크로마토그램과 대응하는 농도를 그래프로 표시하여 표준검량선을 작성하였다.

표3. 갈락토오스 유발 백내장이 형성된 랫트 수정체에서 갈락티톨 축적에 대한 배크안젤리신의 영향

a) : 두마리의 랫트로부터 적출한 4개의 수정체에서 얻은 결과를 평균

b) 갈락토오스 투여개시후 일수 및 동물을 치사시킨 날.

상기표3에서 알 수 있는 바와 같이 대조군의 경우는 수정체 g당 17.4μmoles인 반면 배크안젤리신 처치군의 갈락티톨 함량은 3.4μmoles로서 대조군의 약 80.5%의 갈락티톨 축적 감소를 나타냄을 알 수 있다.

대조군과 실험군의 수정체에 함유된 갈락티톨의 함량변화를 비교하기 위하여 갈락토오스 투여개시 5, 10 및 15일 경과후 수정체를 적출하고 분획하여 각각의 갈락티톨 함량을 측정한 결과, 상기 표3에서 알 수 있는 바와 같이 갈락토오스 투여 대조군에서는 5일에서 15일까지 경과함에 따라 수정체 g당 0.061μmoles에서 33.1μmoles까지 갈락티톨 함량의 증가를 보인 반면, 배크안젤리신 투여군은 5일만에는 대조군과 유사하였으나 15일만에 대조군의 갈락티톨 함량에 비하여 약 50%의 축적감소를 나타내었다.

이때 푸라노쿠마린 투여에 기인한 시험동물의 체중에 대한 영향 다음 표4와 같으며 푸라노쿠마린 투여는 시험동물의 체중 증가에 영향을 주지 않음을 알 수 있다.

표4. 배크안젤리신 및 임페라토린 전처리가 체중증가에 미치는 영향

N=6

* M±S.D.

＃: 갈락토오스 대조군

시험예 3. 스트렙토조토신(STZ) 유발 백내장에 대한 효과

3-1STZ에 의한 백내장 유발

스트렙토조토신에 의한 백내장의 유발은 체중 50-60g의 랫트의 꼬리정맥에 스트렙토조토신 65mg/kg의 양을 0.01M 시트르산염 완충액 (pH4.5) 3ml에 녹인 액 50-100mg/kg b.w.을 주사하여 실시하였다. 백내장 증상의 유발여부는 2-1과 동일한 방법에 따라 관찰하였다.

당뇨병 유발에 의한 혈당치의 변화는 효소법(L.P. Cawleey, F.E.Spear, R.Xendall, Ultramicrochemical Analyis of Blood Glucose with Glucose Oxidase, Am.J.Clin.Pathol.32, 195(1959))에 의하여 랫트의 꼬리로부터 채혈하고 3,000rpm에서 20분간 원심분리하여 얻은 혈청중의 글루코오스 농도를 글루코오스 산화효소 키트(glucose oxidase kit)를 이용하여 측정검토하였다.

표 5에 표시한 바와 같이, STZ을 랫트의 꼬리 정맥에 주사하고 백내장 유발 추이를 관찰한 결과, 100mg/kg인 경우는 STZ 투여후 6일이내에 실험동물 전부가 사망하였고 75, 65mg/kg 투여군들은 전부 7-8주 후에 백내장이 발현되었으나, 75mg/kg 투여군은 2마리가 사망하여 STZ의 독성을 반영하였고, 50mg/kg 투여군은 전혀 백내장 발현이 없을 뿐만 아니라 백내장 발현시의 혈당치는 정상 혈당치를 나타내었으므로, 100% 백내장이 발현되며 고혈당치를 유지하는 65mg/kg을 STZ투여량으로 하였다.

표5. 랫트의 혈청 글루코오스 레벨 및 백내장 발현에 대한 STZ 처치의 영향

N : 없음

- : 사망

* 글루코오스 : STZ 주사 4일후 측정한 글루코오스 레벨

** 글루코오스 : 백내장 발현시 글루코오스 레벨

3-2소르비톨 함량의 측정

STZ을 65mg/kg로 투여한 후 4일만에 채혈하여 혈당치를 측정하여 350mg/dl 이상인 랫트만을 취하여 2군으로 나누고 배크안젤리신을 50mg/kg씩 1일 1회 10일간 복강내 주사한 다음 수정체를 적출하여 2-4의 방법에 따라 소르비톨 함량을 측정한 결과 표6에서 보는 바와 같이 STZ을 투여한 대조군의 소르비톨 함량(1.39 μmoles/g lens)에 비하여 배크안젤리신 투여군의 소르비톨 함량(1.06 μmoles/g lens)이 약 24% 축적감소가 있음을 알 수 있었다.

표6. 스트렙토조토신 유발 당뇨병성 랫트의 수정체에 있어서 소르비톨 축적에 대한 배크안젤리신의 영향

a) 테이타는 동물 다섯마리의 평균 ±S.E.이다.

STZ 대조군과의 유의 수준: *P0.05

시험예 4. 독성시험

4-1백크안젤리신을 경구투여했을 때의 독성시험

백크안젤리신을 Crj:CD - 1계 암, 수, 마우스[5주령, 체중범위: 숫마우스(23.7-29.8g) 암마우스(20.4-24.5g)]에 각각 5000, 3125, 1953, 1221, 763mg/kg 용량으로 0.5% CMC-Na에 현탁시켜 군당 6마리씩 20ml/kg의 투여량으로 경구투여하였다.

경구투여후 사망율 및 LD₅₀는 다음표7과 같다.

표7. 경구투여시 사망률 및 LD₅₀

상기 표7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 백크안젤리신은 안전역이 높은 화합물인 것을 알 수 있으며, 특히 투여용량에서 안전성을 담보할 수 있을 정도로 안전역이 높다.

4-2백크안젤리신을 복강투여했을 때의 독성시험

백크안젤리신 Crj:CD-1 계 암,수 마우스 [5주령,체중범위 : 숫마우스(21.1 - 25.6g), 암마우스(21.1-25.4g)]에 각각 1000, 833, 694, 579, 482mg/kg 용량으로 0.5% CMC-Na에 현탁시켜 군당 10마리씩 20ml/kg의 투여량으로 복강내투여하였다.

경구투여후 사망율 및 LD₅₀는 다음표8과 같다.

표8. 복강투여시 사망률

상기 표8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 백크안젤리신은 복강투여시에도 상대적으로 안전역이 높은 화합물인 것을 알 수 있다.

상기의 실시예 및 시험결과에서 확인할 수 있는 바와 같이 백지근의 배크안젤리신 및 3차-O-메틸배크안젤리신은 큰 독성이 없이 시험관내 시험에서 뿐만 아니라, 생체내 시험에서도 유효함에 따라 당뇨병성 또는 노인성 (당)백내장에 대한 치료제로서 사용될 수 있다.

Claims

하기 구조식(Ⅰ)로 표시되는 백크안젤리신(Byakangelicin) 또는 3차-O-메틸백크안젤리신(tert-O-methyl byakangelicin)이 함유된 것을 특징으로 하는 당뇨병성 또는 노인성 (당)백내장 예방치료제
백크안젤리신(Byakangelicin) 또는 3차-O-메틸백크안젤리신(tert-O-methyl byakangelicin)과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 당뇨병성 또는 노인성 (당)백내장 예방치료제 조성물.