KR0135574B1 - 미생물 제초제의 제조법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물 제초제로서 유용한 식물 병원성 사상균의 분생자를 효율좋게 제조하는 방법을 제공한다.

식물 병원성 사상균을 발포담체 및 탄소수가 12-22인 지방산 또는 그 에스테르르 첨가한 액체 배지중에서 호기적으로 배양한 다음 발포담체를 대기중에 정치하여 분생자를 형성시키고, 형성된 분생자를 발포담체에서 분리회수한다.

Description

미생물 제초제의 제조법

제 1 도는 본 발명에 사용되는 신변종(新變種)의 에스테라제의 자이모그램이고,

제 2 도는 종래종(從來種)의 에스테라제의 자이모그램이다.

본 발명은 미생물 제초제로서 사용되는 식물 병원성사상균(病源性사상균絲狀菌)의 분생자(分生子)를 효율좋게 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근, 화학합성 제초제에 의한 환경오염이 큰 문제로 되고 있다. 한편, 자연계에는 잡초에 특이적인 식물 병원미생물이 알려져 있다. 특정의 잡초에 대하여 그 병원미생물을 제초제처럼 사용하여 잡초를 고사시키는 것은 미생물 제초제라 불리우며, 안전성이 높은 제초제로서 주목되고 있다. 예를 들면 벼와 대두의 포장(圃場)잡초인 노던 조인트베치(에스키노멘 버지니카)[northern jointvetch(Aeschynomene viginica)]의 방제에 병원미생물인 콜레토트리컴 글로에오스포리오이데스(Colletorichum gloeosporioides)가 미생물 제초제로서 사용되고 있다(Daniel, J.T. et al., Weed Sci. vol. 21, p 303-7, (1973)). 또 최근, 논의 잡초로서 오래전부터 문제가 되고 있는 피에 선택적인 미생물 제초제로서 드렉스레라(Drechslera)속의 미생물이 보고되어 있다(일본국 특개평 3-219883, 특개평 4-226905).

미생물 제초제로서 사용되는 식물 병원미생물이 사상균인 경우, 보존성 등의 문제에서 그 균사체(菌絲體)를 그대로 미생물 제초제로서 사용하는 것은 적고, 균사체에서 분생자를 형성시켜 그것을 미생물 제초제로서 사용하는 것이 많다.

사상균의 분생자의 생산방법으로서는 대맥, 탄 옥수수, 쌀 혹은 밀기울 등을 사용하는 고체배양법이나 통기교반조를 사용하는 액체배양법이 일반적으로 사용되고 있다. 고체배양법은 대량의 분생자를 생산하는데는 큰 면적이 필요하고, 잡균이 오염되기 쉽고, 배양조건의 제어가 어려운 것 등의 문제점이 있다. 사상균의 배양에 액체배양법을 사용하므로서 고체배양법에 있어서의 문제점의 몇가지는 해결할 수 있으나, 드렉스레라속 등의 사상균과 같이 액중에서는 분생자를 형성하기 어려운 사상균에서는 분생자 생산을 위하여 액체배양법을 단순히 적용할 수는 없다.

상기 문제점을 해결하기 위하여, 마추우라(松浦)는 300ml 용량 플라스크에 발포우레탄 담체의 존재하에, 피리큘라리아·오리제이(Pyricularia oryzae)나 헬민토스포륨·오리제이(Helminthosporium oryzae)등의 사상균을 진탕배양하여 발포담체에 균사(菌絲)를 생육시키고, 이어서 이 발포담체를 플라스크에서 꺼내어, 세정한 후, 일정의 습도로 조정된 공기중에 발포담체를 정치시키는 2단계 배양법에 의해 분생자가 형성될 수 있는 것을 보고하고 있다(Matsuura, K., J. Takeda, Res. Rab., Vol. 32, p. 427-495(1973)).

그러나 본 발명자 등이 마추우라의 발포담체를 사용하는 2단계 배양법을 드렉스레라(Drechslera) 속 등의 미생물 제초제로서 유용한 사상균의 분생자 생산에 응용하는 것을 실제로 시도하였으나, 분생자의 생산량이 현저히 낮아 실용적인 미생물 제초제용 분생자의 생산방법으로서는 문제가 많았다.

본 발명의 목적은 식물 병원성 사상균을 효율좋게 제조하는 방법을 제공하는데 있다. 따라서 본 발명자등은 발포담체를 사용한 2단계 배양법에 의해 드렉스레라(Drechslera) 속등의 미생물 제초제로서 유용한 식물 병원성 사상균의 분생자를 효율좋게 생산하는 방법에 대하여 예의 연구를 거듭하였다. 그 결과, 식물 병원성 사상균을 발포담체 및 탄소수가 12 22인 지방산 또는

그 에스테르를 첨가한 액체 배지 중에서 호기적으로 배양하고, 이어서 발포담체를 대기중에 정치 또는 유동하여 분생자를 형성시키고, 형성된 분생자를 발포담체에서 분리회수하므로서 분생자의 생산량이 현저하게 높게 되는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 식물 병원성 사상균을 발포담체 및 탄소수가 12-22인 지방산 또는 그 에스테르를 첨가한 액체 배지 중에서 호기적(好氣的)으로 배양하고, 이어서 발포담체를 대기중에 정치하여 분생자를 형성시키고, 형성된 분생자를 발포담체에서 분리회수하는 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용하는 식물 병원성 사상균이란, 그 분생자가 미생물 제초제로서 사용되는 미생물이다. 이와 같은 사상균의 예로서, 논의 잡초인 피에 선택적인 미생물 제초제로서 이용가능한 드렉스레라·모노세라스·모노세라스(Drechslera monocera var. monoceras) MH-0015(FERM BP-2652), MH-1889(FERM BP-3410), MH-2653(FERM BP-2653), MH-2679(FERM BP-2656), MH-4415(FERM BP-3413), MH-4418(FERM BP-3414), MH-5011(FERM BP-3415), MH-5017(FERM BP-3411), MH-5018(FERM BP-3412), MH-5511(FERM BP-3417), MH-9011(FERM BP-3416), 드렉스레라·모노세라스·마이크로스포러스(Drechslera monoceras var. monoceras) MH-111010(FERM BP-3864), MH-12024(FERM BP-4498), MH-121025(FERM BP-4499), MH-122124(FERM BP-4500), MH-122754(FERM BP-4501), MH-122755(FERM BP-4502), MH-122756(FERM BP-4503), 드렉스레라·라베넬리(Drechslera ravenelii) MH-0042(FERM BP-2659), MH-0060(FERM BP-2657), MH-2883(FERM BP-3408), 드렉스레라·포아(Drechslera poa) MH-0122(FERM BP-2655), MH-2781(FERM BP-3407) 또는 MH-2895(FERM BP-3409)가 있다.

이들의 균주는 어느 것이나 부다페스트 조약에 의거하여 일본국 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology)(주소 : 일본국 이바라기겐 쭈꾸바시 히가시 1쪼오메 1반 3고오, 우편번호 : 305)에 기탁되어 있다. 이들의 식물 병원성 사상균을 배양하여 분생자를 형성시키는 경우, 종균으로서 사용하는 사상균의 분생자 형성능력은 보존중이나 계대배양중에 서서히 저하되는 일이 많다. 이와같은 분생자 형성능의 저하는 식물 병원성 사상균을 그 숙주잡초와 접촉·증식시킨후, 액체배지중에서 호기적 배양의 종균으로서 사용하므로서 방지할 수 있는 경우가 많다.

본 발명에 있어서 사용하는 발포담체로서는, 사용하는 사상균이 부착증식할 수 있는 다공성의 것이라면 재질, 형상, 크기 등에 특히 제한은 없으나, 예를 들면, 우레탄, 폴리비닐알코올, 셀룰로오즈 등의 모서리의 길이가 1-30mm인 입방체모양의 다공성 발포담체가 적합하다. 발포담체의 세공경(細孔徑)은 0.01-10mm정도의 것이 바람직하다. 발포담체의 액체배지에의 첨가량은 배양액 1ℓ당 0.1-0.7ℓ 정도가 바람직하다.

본 발명에 있어서 사용하는 탄소수가 12-22인 지방산 또는 그 에스테르의 예로서는, 라우린산, 미리스틴산, 팔미틴산, 스테아린산, 아라키딘산, 베헨산 등의 직쇄포화지바산, 올레인산, 엘라이딘산, 리놀산, 리놀렌산등의 직쇄 불포화 지방산 등 이외에 이들의 직쇄포화지방산 및 직쇄불포화 지방산의 에스테르가 있다. 이들의 지방산 또는 그 에스테르는 단독으로 사용하여도 되고, 몇가지를 혼합하여 사용하여도 된다. 또, 탄소수가 12-22인 지방산을 함유하는 미강유, 채종유, 면실유, 참깨유, 야자유, 팜유, 해바라기유, 옥수수유, 아주까리유, 아마인유, 사프라와유, 올리브유 또는 대두유 등의 식물유는 값이 싸며, 분생자 생산량을 높이는 효과도 높으므로 특히 적합하다. 또한 탄소수가 12-22인 지방산의 에스테르로서 폴리옥시에틸렌글리콜 소르비탄 알킬에스테르계 계면활성제 또는 아실소르비탄계 계면활성제도 적당하게 사용할 수가 있다. 이들의 지방산 또는 그 에스테르의 배지에의 첨가량은, 통상 0.1-10%정도이다.

본 발명에 있어서 사용하는 액체배지로서는, 사용하는 미생물이 사용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류, 미량의 유기영양물 등을 적당하게 함유하는 것이라면 합성배지, 천연배지의 어느 것이나 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용하는 액체배양장치로서는, 시험관이나 플라스크의 진탕배양장치(振湯培養奬置), 통기교반배양죠, 기포탑형배양조(氣泡塔型培養槽)등 발포담체를 액체배지중에서 유동시킬 수 있는 것이 바람직하다.

배양조건은, 사용하는 균주나 배지에 의하여도 다르지만, 배양온도는 15-40, 배지의 pH는 3-9, 배양시간은 1-10일간 정도에서 호기적으로 행한다. 배양장치로서 통기교반배양조나 기포탑형 배양조를 사용하는 경우의 통기량은 0.1-4vvm 정도이다.

본 발명에 있어서는 이와 같이 하여 발포담체의 내부나 표층부에 사상균을 생육시킨 후, 바포담체를 배양액과 분리, 회수하여 대기중에 정치하여 발포체 표층에 균사체에서 분화한 분생자를 형성시킨다. 대기중에서 분생자를 형성시키는 방법으로서는, 트레이에 발포담체를 얇게 늘어놓고, 이 트레이를 온도·습도가 일정하게 제어된 실내에 정치하는 방법(트레이법)을 사용할 수 있다. 또한 트레이법에서는 큰 면적을 필요로 하는 것이 많으므로, 발포담체를 컬럼에 높게 겹쳐 쌓아 충전하고, 상부 또는 하부에서 온도·습도를 일정하게 제어한 공기를 통기하여 분생자를 형성시킬 수도 있다. 또, 액체배양종료후, 배양조에서 배양액만을 빼내고, 남은 발포담체를 정치하고, 필요하면 온도, 습도를 일정하게 제어한 공기를 통기하여 분생자를 형성시킬 수도 있다. 포자형성의 최적온도나 공기의 상대습도는 사용하는 미생물에 따라 다르지만, 통상은 온도 15 -40℃, 공기의 상대습도는 특히 제한되지 않으나 바람직하기는 40-100% 습도이다. 분생자 형성에 필요한 시간은 1-15일 정도이다.

또, 본 발명에 있어서 포자를 형성하기 위하여 발포담체를 정치하는 대신에, 분생자의 형성을 저해하지 않는 정도의 발포담체의 교반 및 유동화를 행하여도 된다.

본 발명에 있어서 포자를 형성하기 위하여 발포담체를 정치하는 대신에, 분생자의 형성을 저해하지 않는 정도의 발포담체의 교반 및 유동화를 행하여도 된다.

본 발명에 있어서는 이와 같이하여 발포담체표층에 형성된 분생자를 발포담체에서 분리·회수한다. 분생자는 발포담체에 진동을 준다든지, 발포담체를 액중에서 교반함으로써 용이하게 발포담체는 그대로 다시 액체배양에 사용할 수도 있다. 한편, 회수한 분생자는 그대로 미생물 제초제로서 사용하는 것도 가능하지만, 일반적으로는 안정화제등을 첨가하여 제제화(製劑化)한 것을 제초제로서 사용하는 것이 많다.

[실시예]

이하에 본 발명에 관한 드렉스레라·모노세라스·마이크로스포러스 및 미생물 제초제용 분생자의 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

미생물의 분리, 선발방법 및 동정(同定)

1) 병원미생물의 분리방법

자연발병하고 있는 들피를 채집하여, 병반(病斑)을 중심으로하여 10-20mm의 조직절편을 제작하여, 70% 에틸알코올 수용액에 1-2초간 침지후, 유효염소농도 2%의 차아염소산나트륨수용액에 10분간 침지함으로써, 표면살균을 하였다. 표면 살균한 병반조직은, 멸균증류수로 3회 세정후, 한첨배지위에 치상(置床)하고, 10℃의 항온기중에서 72시간의 정치배양을 하였다. 배양후, 생육한 사상균의 균사 선단을 현미경하에서 단균사(單菌絲) 분리를 행하여, 영양배지상에 순수분리하여, 7000여 균주를 얻었다. 그 중의 신규미생물인 본 발명에 관한 신변종중, 대표로서 균주 MH111010, MH-121024, MH-121025, MH-122124, MH-122754, MH122755, MH-122756의 각 균주에 대하여는, 들피에 대한 병원성과 벼에 대한 인간성을 검정하였다.

2) 분리 미생물의 들피에 대한 병원성 및 벼에 대한 안전선의 검정

들피 및 벼(품종; 닛뽄바레)를 시험관내에서 무균적으로 육성하여 시험재료로 하였다. 즉, 들피 및 벼의 종자를 70% 에틸알코올 수용액에 1-2초간 침지후, 유효염소농도 2%의 차아염소산나트륨 수용액에 1-2초간 침지후, 유효염소농도 2%의 차아염소산 나트륨 수용액에 10분간 침지함으로써, 표면살균을 행하였다. 표면살균한 종자는, 멸균증류수로 3회 세정후, 미리 멸균한 시험관내의 배지에 파종하여, 식물육성용 챔버내에서 1.5염기까지 육묘하였다.

한편, 분리한 본 발명 미생물은, 포테이토, 덱스트로즈 한천배지에서 평판배양을 하여, 균총(菌叢)의 외연부를 멸균한 코르크보러로 구멍을 뚫음으로써 제작한 균총디스크를 접종원으로서 사용하였다.

균총디스크는, 들피 및 벼를 육성한 시험관내의 배지중에 식균하여, 식물육성용 쳄버내에서 15℃, 10일간 배양한 후, 미생물이 들피 및 벼에 대한 병원성을, 하기의 -,+,++,+++의 4단계로 평가하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

또한, MH-0003 균주는 드렉스레라속(Drechlera sp.), MH-0007 균주는 포마속(Phoma sp.), MH-0011 균주는 푸자륨속(Fusarium sp.), MH-0015 균주는 드렉스레라속(Drechslera monoceras), MH-9011 균주는 드렉스레라속(Drechslera monoceras)이며 어느 것이나 비교를 위해 시험에 제공하였다.

+++ : 고사

++ : 현저한 생육저해

+ : 약간 생육저해

- : 영향 없음

3) 미생물의 동정

피에 대하여 현저한 병원성을 나타내며, 벼에 미치는 영향이 하등 확인되지 않았든 균주에 대하여 동정을 하였다. 그 결과 MH-111010, MH-121024, MH-121025, MH-122124, MH-122754, MH-122755, MH-122756 균주는, 맥아한천배지상(麥芽寒天培地上), 28℃에서 7일간 평판배양함으로써, 콜로니의 크기는 직경 65-75mm에 달하고, 불규칙한 생육을 나타내었다. 콜로니의 색은 회흑색으로, 분생자에 출흔(出痕)이 있으며, 크기는 폭이 17-27(통상 18-23)㎛, 길이가 35-110(통상, 70-100)㎛로, 긴직경과 짧은 직경의 비(길이/폭)의 평균치는 6.1 이하(통상, 4.5-5.0)이였다. 또 형상은 약간 직선상이다. 분생자의 격벽은, 대부분이 4-6개로, 분생자 병(柄)의 형상은 똑바르다. 한편, 종래 알려져 있는, 드렉스레라·모노세라스(Drechslera monoceras)에서는, 분생자의 크기는 폭이 16-25(통상 17-20)㎛, 길이가 60-150(통상 100-120)㎛이고, 긴직경과 짧은 직경의 비(길이/폭) 평균치는 5.9 이상(통상 6.2-6.5)이었다. 또 형상은 약간 구부러져 있다. 분생자의 격벽은, 대부분이 4-10(통상 5-7)개이고, 부생자 병(柄)의 형상은 똑바르다. 이상의 특징에서, MH-111010, MH-121024, MH-121025, MH-122124, MH-122754, MH-122755, MH-122756 균주는 드렉스레라·모노세라스(Drechslera monoceras)와 근사하다고 판명하였으나, 종래의 균주와는 다르게 분생자의 크기 및 형상, 격벽수(隔璧數)가 꼭들어맞지 않으며 병원성도 다르다.

또한, 본 발명에 사용되는 신변종이 종래의 드렉스레라·모노세라스(Drechslera monoceras)와 다른 것을 실증하기 위하여, 효소의 아이소자임 패턴을 비교하였다. 효소로서는 환경에 영향받기 어려운 α-에스테라제를 사용하여 헌터(Hunter)등의 방법에 따라 하였다.

본 발명에 사용되는 신변종 및 비교를 위한 각종 균주를 포테이토, 슈크로스 배지중, 25℃, 어두운 조건하에서, 7-10일 정치 배양하여, 균체매트를 얻었다.

얻은 균체매트를 증류수로 세정하여, 중량을 측정한 후, -80℃의 냉동기에서 동결건조하여, 1-1.5배 용량의 0.05M 트리스 염산 버퍼(pH 7.4)를 가하여 파쇄하였다. 이 파쇄액을 여과하고, 여액을 10000rpm으로 원심분리하여, 그 상등액을 샘프롤 하였다. 샘플중의 단백질은 로우리 방법으로 정량하였다.

라지 슬랩 겔 전기영동층을 사용하여, 하층에 10% 아크릴아미드겔, 상층에 농축겔을 조제하여, 상기 방법에서 얻은 샘플을 1웰당 50㎛m의 단백질량이 되도록 층을 겹친 후, 러닝버퍼(running buffer)중, 30mA에서 2시간 전기영동을 하였다.

전기영동을 행한 겔의 에스테라제의 염색은 다음과 같이 하였다. 0.05M 트리스 염산 100ml에 2ml의 1% α-나프틸초산/50% 아세톤수용액과 100mg의 패스트 바이올렛 B염(fast violet B salt)을 가한 염색액에 얻은 겔을 첨지하고, 진탕하여 30분 염색하였다. 염색후, 게을 증류수로 세정하여, 각 밴드의 이동도를 측정하였다.

본 발명에 사용하는 신변종의 에스탈제의 자이모그램의 패턴을 제 1 도에, 종래종의 에스테라제의 지이모그램의 패턴을 제 2 도에 나타내었다. 이 결과에서, 본 발명에 사용하는 신변종은 명확하게, 종래의 드렉스레라·모노세라스와 다른 것을 시사하였다.

본 실시예에서 사용한 에스테라제의 전기영동패턴의 미생물의 분류에의 응용은 담균자류(擔菌子類)에서는 일반적으로 사용되고 있는 방법이며, 본 발명자는 종래의 드렉스레라·모노세라스를 드렉스레라·모노세라스·모노세라스, 종래 발견되지 않은 본 발명에 사용되는 신변종을 드렉스레라·모노세라스·마이크로스포러스로 구별하였다.

또한, 유전자의 레벨에서도 드렉스레라·모노세라스·모노세라스와 본 발명에 사용되는 신변종 드렉스레라·모노세라스·마이크로스포러스와는 다르다는 것이 예상되지만 실제 DNA로 코드된 RNA에서도 변종간에서의 차이를 발견할 수가 있다.

이상의 특징에서, 본 발명에 사용되는 신변종 MH-111010, MH-121024, MH-121025, MH-122124, MH-122754, MH-122755, MH-122756 등은 드렉스레라·모노세라스(Drechslera monoceras)와는 다른 신규 미생물이라 판정하고, 본 발명에 사용되는 드렉스레라·모노세라스·마이크로스포러스(Drechslera monocerus var. microsporus), 종래의 드렉스레라·모노세라스를 드렉스레라·모노세라스 모노세라스(Drechslera monocerus var. monoceras)로서 일본균학회에 투고중이다.

MH-111010, MH-121024, MH-121025, MH-122124, MH-122754, MH-122755, MH-122756 균주등에 대하여는 일본국 통산성 공업기술원 생명공학공업기술 연구소에 기탁하였다.

본 발명에 관한 드렉스레라·모노세라스·마이크로스포러스(Drechslera monocerus var. microsporus)는 신규 미생물이며, 국립예방위생연구소의 병원체 등 안전관리규정에 있어서 병원체로서의 기재는 없다.

한편, 들피에 대하여 하등의 벼원성이 나타나지 않았던, MH-0003은 드렉스레라속(Drechslera sp.), MH-0007 균주는 포마속(Phoma sp.)으로 동정하였다. 또 들피 및 벼에 대하여 병원성을 가진 MH-0011 균주는 푸자륨속(Fusarium sp.), 들피에 대하여 병원성을 가지며 벼에 대하여 하등의 병원을 나타내지 않는 MH-0015 및 MH-9011은 어느 것이나 드렉스레라, 모노세라스의 공지균주(일본 공개특허공보 평 3-219883호)이다.

이상의 동정은 M.B. Ellis(1971) Demariaceus Hyphomycetes p. 404-5, p. 412, Commomwealth Mycological Institute, Kew, England 참조하여 행하였다.

[실시예 2]

모서리의 길이를 5mm로 절단한 발포우레탄 담체(브리지스톤(주)제 에바라이트 SFHR-30)450개, 표 2 에 나타낸 조성의 배지 150ml를 500ml 용량 배플 부착 3각 플라스크에 가하여, 121℃에서 20분 가압증기 멸균하였다. 비교를 위하여, 발포우레탄 담체를 가하지 않은 경우도 하였다. 이들의 배양액에 포테이토 덱스트로즈 한천 배지상에서 25℃, 4주간 배양하여 형성시킨 드렉스레라· 모노세라스(Drechslera monoceras) MH-111010(FERM BP-3864)의 분생자 30000개를 접종하였다. 온도 25℃, 100rpm로 7일간 배양한 후, 발포담체를 가하여 배양한 3각 플라스크내의 배양액을 4메쉬의 체에 통과시켜 발포우레탄담체를 배양액에서 회수하였다. 이 발포우레탄을 직경 90mm의 샤레중에 옮겨, 온도 25℃, 상대습도 80%의 실내에 7일간 정치하여 분생자를 형성시킨 경우와 배양액중에서 균체를 회수하지 않고 그대로 온도 25 ℃, 상대습도 80%의 실내에 7일간 정치하여 분생자를 형성시킨 2가지로 하였다. 분생자 형성후, 샤레중의 발포우레탄 담체 혹은 균체를 증류수 150ml 중에 투입·교반하여 분생자를 발포우레탄 담체에서 유리시켰다. 40메쉬의 체로 발포우레탄 담체 혹은 균체를 제외한 분생자 현탁액에서 여지에 의해 분생자를 여별·회수하였다.

배양액중에서 균체를 회수하지 않고 그대로 정치하여, 분생자를 형성시킨 3각 플라스크에서도 동일하게 분생자를 여별·회수하였다. 회수한 분생자의 수를 현미경하에서 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타냈다.

[실시예 3]

모서리 길이 5mm로 절단한 발포우레탄담체(브리지스톤(주)제 에바라이트 SFHR-30) 450개, 표 2에 나타낸 조성의 배지 150ml 및 표 4에 나타낸 탄소수가 12-22의 포화지방산 중의 하나 1.5g를 500ml 용량 배플 부착 3각 플라스크에 가하여, 121℃에서 20분간 가아증기로 멸균하였다. 이 배양액에 포테이토 덱스트로즈 한천배지상에서 25℃, 4주간 배양하여 형성시킨 드렉스레라·모노세라스·마이크로스포러스(Drechslera monocerus var. microsporus) MH-111010(FERM BP-3864)의 분생자 30000개를 접종하였다. 온도 25℃, 100rpm로 7일간 배양한후, 삼각플라스크내의 배양액을 40메쉬의 체에 통과시킨 발포우레탄 담체를 배양액에서 회수하였다. 이어 면적 100cm 의 트레이상에 발포우레탄 담체를 옮겨, 온도 25℃, 상대습도 80%의 실내에 7일간 정치하여, 분생자를 형서시켰다. 이어, 발포우레탄 담체를 증류수 150ml중에 투입, 교반하여 분생자를 발포우레탄 담체에서 유리시켰다. 40메쉬의 체로 발포우레탄 담체를 제외한 분생자 현탁액에서 여지로 분생자를 여별·회수하였다. 회수한 분생자의 수를 현미경하에서 측정하여, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 비교를 위해, 탄소수가 10이하의 지방산을 사용한 경우 지방산 무첨가의 경우의 결과도 표 4에 나타내었다.

[실시예 4]

모서리 길이 5mm로 절단한 발포우레탄 담체(브리지스톤(주)제-에바라이트 SFHR-30)450개, 표2에 나타낸 조성의 배지 150ml 및 올레인산 1.5g를 500ml 용량 배플 부착 3각플라스크에 가하여, 121℃에서 20분간 가압증기 멸균하였다. 또, 비교로서, 올레인산 무첨가의 배지도 작성하였다. 표 5에 나타낸 균주를 각각 포테이토 덱스트로즈 한천배지상에서 25℃, 4주간 배양하여 분생자를 형성시켜, 백금이로 분생자를 취하여 이들의 배양액에 접종하였다. 온도 25℃, 100rpm으로 7일간 배양한 후, 3각 플라스크내의 배양액을 40메쉬의 체에 통과시켜 발포우레탄 담체를 배양액에서 회수하였다. 이어, 면적 100cm 의 트레이상에 발포우레탄 담체를 옮겨, 온도 25℃, 상대습도 50%의 실내에 7일간 정치하여, 분생자를 형성시켰다. 이어, 발포우레탄 담체를 증류수 150ml 중에 투입·교반하여 분생자를 발포우레탄 담체에서 유리시켰다. 40메쉬의 체로 발포우레탄 담체를 제외한 분생자 현탁액에서 여과지에 의해 분생자를 여별·회수하였다. 회수한 분생자의 수를 현미경하에서 측정하여 그 결과를 표 5에 나타내었다.

[실시예 5]

발포셀룰로오스담체(토오쿄리가기가이(주)제 파이범 MIF-5) 450개, 표 2에 나타낸 조성의 배지 150ml 및 표 6에 나타낸 탄소수가 18인 불포화지방산중의 하나 0.75g를 500ml 용량의 배플부착 3각플라스크에 가하여, 121℃에서 20분간 가압증기 멸균하였다. 이 배양액에 드렉스레라, 모노세라스(Drechslera monoceras) MH-9011(FERM BP-3146)의 분생자 30000개를 접종하였다. 온도 25℃, 100rpm로 7일간 배양한 후, 3각플라스크내의 배양액을 피벳으로 빨아내어 제거하고, 다시 온도 25℃의 실내에 7일간 정치하여, 분생자를 형성시켰다. 이어 증류수 150ml를 이 3각플라스크에 투입·교반하여 분생자를 발포셀룰로오스 담체에서 유리시켰다. 40메쉬의 체로 발포셀룰로오스 담체를 제외한 분생자 현탁액에서 요과지에 의해 분생자를 여별·회수하였다. 회수한 분생자의 수를 현미경하에서 측정하여, 그 결과를 표 6에 나타냈다.

[실시예 6]

모서리 길이 3mm로 절단한 발포 PVA 담체(카네보우(주)제 벨이터 KF(D)) 2100개 또는 모서리 길이 7mm로 절단한 같은 발포 PVA 담체 164개, 표 2에 나타낸 조성의 배지 150ml 및 표 7에 나타낸 폴리옥시 에틸렌글리콜 소르비탄 알킬에스테르계 계면활서제(트윈계 계면활성제)또는 아실소르비탄계 계면활성제(스팬계 계면활성제)중의 하나 1.5g를 500ml 용량 배플 부착 3각플라스크에 가하여, 121℃에서 20분간 가압증기 멸균하였다. 이 배양액에 드렉스레라·모노세라스(Drechslera monoceras) MH-9011(FERM BP-3416)의 분생자 30000개를 접종하였다. 온도 25℃, 100prm로 7일간 배양한 후, 40메쉬의 체에 의해 발포 PVA 담체를 배양액에서 회수하였다. 이어 면적 100cm 의 트레이상에 발포 PVA 담체를 옮겨, 온도 25℃, 상대습도 80%의 실내에 7일간 정치하여, 분생자를 형성시켰다. 이어, 발포우레탄 담체를 40메쉬의 체에 투입하여 강하게 진탕하여 분생자를 발포우레탄 담체에서 유리시켰다. 회수한 분생자의 수를 현미경하에서 측정하여, 그 결과를 표 7에 나타내었다.

[실시예 7]

모서리 길이 5mm로 절단한 발포우레탄 담체(브리지스톤(주)제 에바라이트 SFHR-30) 15000개, 표 2에 나타낸 조성의 배지 5ℓ 및 표 8에 나타낸 유지류 중의 하나 50g을 6ℓ용량 기포탑형 배양조에 가하여 121℃에서 20분간 가압증기 멸균하였다. 이 배양액에 드렉스레라·모노세라스(Drechsleras monoceras) MH-9011(FERM BP-3416)의 분생자 30000개를 접종하였다. 온도 25℃, 통기량 31/min로 7일간 배양한후, 기포탑형 배양조내의 배양액을 40메쉬의 체에 통과시켜 발포우레탄 담체를 배양액에서 회수하였다. 발포우레탄 담체를 직경 80mm, 길이 1m의 컬럼에 옮겨, 온도 25℃, 상대습도 80%의 공기를 컬럼의 상부에서 11/min로 통기하면서 7일간 정치하였다. 이어 발포우레탄 담체를 증류수 5ℓ중에 투입·교반하여 분생자를 발포우레탄 담체에서 유리시켰다. 40메쉬의 체로 발포우레탄 담체를 제외한 분생자 현탁액에서 여과지에 의해 분생자를 여별·회수하였다. 회수한 분생자의 수를 현미경하에서 측정하여, 그 결과를 표 8에 나타내었다.

[실시예 8]

모서리 길이 5mm로 절단한 발포우레탄 담체(브리지스톤(주) 에바라이트 SFHR-30) 15,000개, 표 2에 나타낸 조성의 배지 5ℓ 및 미강유 50g을 6ℓ 용량 통기교반형 배양조에 가하여, 121℃에서 20분간 가압증기 멸균하였다. 이 배양액에 드렉스레라·모노세라스(Drechsleras monoceras) MH-111010(FERM BP-3864)의 분생자 30000개를 접종하였다. 온도 25℃, 통기량 31/min, 회전수 200rpm로 7일간 배양한 후, 통기교반형 배양조내의 배양액을 통기구멍에서 빼내었다. 이어 통기구멍에서 온도 25℃, 상대습도 80%의 공기를 31/min로 통기하면서, 7일간 발포담체를 정치하였다. 증류수 5ℓ를 배양조에 투입하여, 회전수 200rpm로 1시간 교반하여, 분생자를 발포우레탄 담체에서 유리시킨 후 분생자 현탁액을 통기구멍에서 빼내었다. 분생자 현탁액에서 여과지에 의하여 분생자를 여별·회수하여, 분생자의 수를 현미경하에서 측정하였다. 이어 배양조에 다시 표 1에 나타낸 조성의 배지 5ℓ 및 미강유 50g를 가하여, 121℃에서 20분간 가압증기로 멸균한 후 드렉스레라·모노세라스(Drechsleras monoceras) MH-111010(FERM BP-3864)의 분생자 30,000개를 접종하여 상기한 방법과 같이 배양, 분생자 형성, 분생자 회수를 행하였다. 동일의 발포우레탄 담체를 반복사용하여, 같은 조작을 합계 10회 반복하였다. 그 결과를 표 9에 나타냈다.

[실시예 9]

모서리 길이 5mm로 절단한 발포우레탄 담체(브리지스톤(주)제 에바라이트 SFQX-30) 450개, 표 2에 나타낸 조성의 배지 150ml 및 미강유 1.5g를 500ml 용량 배플 부착 3각플라스크에 가하여, 121℃에서 20분간 가압증기 멸균하였다. 이 배양액에 드렉스레라·라베넬리(Drechslera ravenelii) MH-2883(FERM-BP 3408) 또는 드렉스레라·포아(Drechslera poa) MH-2781(FERM BP-3407)의 분생자 30,000개를 접종하였다.

온도 25℃, 100rpm로 7일간 배양한 후, 3각플라스크내의 배양액을 40메쉬의 체에 통과시켜 발포우레탄 담체를 배양액에서 회수하였다. 이어, 면적 100cm 의 트레이상에 발포우레탄 담체를 옮겨 온도 25℃, 상대습도 80%의 실내에 7일간 정치하여, 분생자를 형성시켰다. 이어, 발포우레탄 담체를 증류수 150ml 중에 투입·교반하여 분생자를 발포우레탄 담체에서 분리시켰다. 40메쉬의 체로 바포우레탄 담체를 제거한 분생자 현탁액에서 여과지에 의하여 분생자를 여별·회수하였다. 회수한 분생자의 수를 현미경하에서 측정하여, 그 결과를 표 10에 나타내었다. 비교를 위하여 미강유를 첨가하지 않은 경우의 결과도 표 10에 나타내었다.

[실시예 10]

모서리 길이 5mm로 절단한 발포우레탄 담체(브리지스톤(주)제 에바라이트 SFHR-30) 15000개, 표 2에 나타낸 조성의 배지 5ℓ 및 올레인산 50g를 6ℓ 용량 통기교반형 배야조에 가하여, 121℃에서 20분간 가압증기 멸균하였다. 비교를 위해, 올레인산 무첨가의 경우도 같이 하였다. 이 배양액에 드렉스레라·모노세라스(Drechsleras monoceras) MH-111010(FERM BP-3864)의 분생자 10 개를 접종하였다. 온도 25℃, 통기량 31/min, 회전수 200rpm로 7일간 배양한 후, 통기교반형 배양조내의 배양액을 통기구멍에서 빼내었다. 이어 통기구멍에서 온도 25℃, 상대습도 20%의 공기를 31/min로 통기하면서 7일간 발포담체를 정치하여, 동일조내에서 분생자를 형성시켰다. 증류수 5ℓ을 배양조에 투입하여, 회전수 200rpm로 1시간 교반하여 분생자를 발포우레탄 담체에서 유리시킨 후 분생자 현탁액을 통기구멍에서 빼내었다. 분생자 현탁액에서 여과지에 의하여 분생자를 여별·회수하여 분생자의 수를 현미경하에서 측정하여, 그 결과를 표 11에 나타내었다.

[실시예 11]

모서리 길이 5mm로 절단한 발포우레탄담체(브리지스톤(주) 에바라이트 SFHR-30) 15,000개, 표 2에 나타낸 조성의 배지 5ℓ 및 아마인유 50g을 6ℓ 용량 기포탑형 배양조에 가하여, 121℃에서 20분간 가압증기로 멸균하였다. 이 배양액에 드렉스레라·모노세라스(Drechsleras monoceras) MH-111010(FERM BP-3864)의 분생자 10 개를 접종하였다. 온도 25℃, 통기량 31/min로 7일간 배양한 후, 기포탑형 배양조내의 배양액을 40메쉬의 체에 통과시켜 발포우레탄 담체를 배양액에서 회수하였다. 발포우레탄 담체를 직경 200m, 길이 500mm의 롤러보틀에 옮겨, 온도 25℃, 상대습도 20%의 통기량 11/min, 회전속도 1회전/1시간의 조건하에서 7일간 분생자를 형성시켰다. 비교로서, 배양후 기포탑형 배양조에서 회수한 발포우레탄 담체를 직경 80mm, 길이 1m의 컬럼에 옮겨, 온도 25℃, 상대습도 20%의 공기를 컬럼의 상부에서 11/min으로 통기하면서 7일간 정치하였다. 이어, 발포우레탄 담체를 증류수 5ℓ중에 투입·교반하여 분생자를 발포우레탄 담체에서 유리시켰다. 40메쉬의 체로 발포우레탄 담체를 제거한 분생자 현탁액에서 여과지에 의하여 분생자를 여별, 회수하였다. 회수한 분생자의 수를 현미경하에서 측정하여, 그 결과를 표 12에 나타냈다.

Claims (15)

1. 드렉스레라속(Drechslera)에 속하는 식물 병원성 사상균을 발포담체 및 탄소수가 12-22인 지방산 또는 그 에스테르를 첨가한 액체배지중에서 호기적으로 배양하고, 이어서 발포담체를 대기중에 정치 또는 유동화하여 분생자를 형성시키고, 형성된 분생자를 발포담체에서 분리회수하는 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 드렉레라속의 사상균은 피에 병원성을 나타내는 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 드렉스레라속의 사상균은 드렉스레라·모노세라스(Drechslera monoceras), 드렉스레라·라베넬리(Drechslera ravenelii) 또는 드렉스레라·포아(Drechslera poa)인 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
4. 제3항에 있어서, 드렉스레라·모노세라스는 드렉스레라·모노세라스·모노세라스(Drechslera monoceras var. monoceras) 혹은 드렉스레라·모노세라스·마이크로스포러스(Drechslera monoceras var. microsporus)인 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
5. 제4항에 있어서, 드렉스레라·모노세라스·모노세라스는 드렉스레라·모노세라스·모노세라스(Drechslera monoceras var. monoceras) MH-0015(FERM BP-2652), MH-1889(FERM BP-3410), MH-2653(FERM BP-2653), MH-2679(FERM BP-2656), MH-4415(FERM BP-3413), MH-4418(FERM BP-3414), MH-5011(FERM BP-3415), MH-5017(FERM BP-3411), MH-5018(FERM BP-3412), MH-5511(FERM BP-3417), 또는 MH-9011(FERM BP-3416)이고, 드렉스레라·모노세라스·마이크로스포러스는 드렉스레라·모노세라스·마이크로스포러스(Drechslera monoceras var. monoceras) MH-111010(FERM BP-3864), MH-12024(FERM BP-4498), MH-121025(FERM BP-4499), MH-122124(FERM BP-4500), MH-122754(FERM BP-4501), MH-122755(FERM BP-4502), MH-122756(FERM BP-4503)인 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
6. 제3항에 있어서, 드렉스레라·라베넬리는 드렉스레라·라베넬리(Drechslera ravenelii) MH-0042(FERM BP-2659), MH-0060(FERM BP-2657) 또는 MH-2883(FERM BP-3408)이며, 드렉스레라·포아는 드렉스레라·포아(Drechslera poa) MH-0122(FERM BP-2655), MH-2781(FERM BP-3407) 또는 MH-2895(FERM BP-3409)인 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 탄소수가 12-22인 지방산 또는 그 에스테르를 함유하는 식물종자유를 사용하는 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 식물종자유는 미강유, 채종유, 면실유, 참깨유, 팜유, 야자유, 해바라기유, 옥수수유, 아주까리유, 아마인유, 사프라와유, 올리브유 또는 대두유를 사용하는 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 탄소수가 12-22인 지방산 에스테르로서 폴리옥시에틸렌글리콜 소르비탄 알킬에스테르계 계면활성제 또는 아실소르비탄계 계면활성제를 사용하는 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 액체배지중에서의 호기적 배양과 잇따른 대기중에서의 분생자 형성을 동일용기내에서 행하는 것을 특징으로 하는 미생물 제초용 분생자의 제조방법.
11. 제7항에 있어서, 액체배지중에서의 호기적 배양과 잇따른 대기중에서의 분생자 형성을 동일용기내에서 행하는 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
12. 제9항에 있어서, 액체배지중에서의 호기적 배양과 잇따른 대기중에서의 분생자 형성을 동일용기내에서 행하는 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분생자 회수 후의 발포담체를 다시 액체배양중에서 호기적 배양에 사용하는 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
14. 제7항에 있어서, 분생자 회수 후의 바포담체를 다시 액체배양중에서의 호기적 배양에 사용하는 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.
15. 제9항에 있어서, 분생자 회수 후의 발포담체를 다시 액체배양중에서의 호기적 배양에 사용하는 것을 특징으로 하는 미생물 제초제용 분생자의 제조방법.