KR0132439B1

KR0132439B1 - 항암활성 증강제

Info

Publication number: KR0132439B1
Application number: KR1019890011470A
Authority: KR
Inventors: 오사무 오가와; 이꾸오 기시; 요시유끼 다하라; 마사노리 스기다
Original assignee: 마사다 오사무; 닛신세이훈 가부시끼가이샤
Priority date: 1988-08-11
Filing date: 1989-08-11
Publication date: 1998-04-17
Also published as: ATE101036T1; KR900002767A; DE68912850T2; CA1339502C; EP0355604B1; US5004756A; JP2847783B2; JPH02138211A; ES2061831T3; EP0355604A2; DE68912850D1; EP0355604A3

Abstract

내용없음.

Description

항암활성 증강제

본 발명은 신규인 지방유제에 관한 것이며, 보다 상세하게는

으로 표시되는 N-소라네실-N,N'-비스(3,4-디메톡시벤질)에틸렌디아민-말산염을 함유하는 지방유제에 관한 것이다.

본 발명의 지방유제는 항암활성 증강작용을 갖고, 다른 항암제와 함께 병용함으로서 그 항암제의 항암활성을 증강시키는 것이다.

으로 표시되는 N-소라네실-N,N'-비스(3,4-디메톡시벤질)에틸렌디아민은 이미 공지된 화합물이다.

이 화학식(2)으로 표시되는 화합물은, 항비루스 활성 및 항종양활성을 갖는 일련의 이소프레닐아민 유도체중 하나이며, 특허명세서에 기재되어 있는 것이다(특개소 57-192339호).

그런데 최근, 폐암, 위암, 유암, 방광암, 고환종양 등의 고형암 또는 백혈병, 악성림프종 등의 조혈기 종양에 대한 제암제 또는 항암제가 다양하게 개발되어 왔으나 아직 이러한 악성종양을 완전히 치유 또는 예방할 수 있는 약제는 등장하고 있지 않다. 예를 들면 지금까지 항암제 또는 제암제로서 의료상 사용되고 있는 약제로서, 마이토마이신C(MMC), 시클로포스파미드(CPA), 멜팔란(MPL), 니무스틴(ACNU), 카르보콘(CQ), 빈크리스틴(VCR),빈블라스틴(VLB), 빈데신(VDS), 블레오마이신(BLM), 5-플루오로라우실(5-FU), 아드리아마이신(ADM), 시스플라틴(CDDP), 액티노마이신D(ACD), 메토트랙세이트(MTX), 아크라루비신(ACR), 토요마이신(TM), 네오카르티노스타틴(NCS), 이포스파미드(Ifos) 등이 등장하고 있다(주: 괄호내는 각 약제의 약호를 표시하고, 이하 이러한 약호를 사용하는 경우도 있다). 이들 약제는 각각 특유의 항암 스펙트럼을 가지므로, 각 영역에 있어서 선택적, 특이적으로 사용되고 있다. 예를 들면 아드리아마이신(ADM)은, 다른 약제와 비교하여, 항암 스펙트럼이 넓은 것이 특색의 하나로서 들 수 있으며, 유암, 방광암, 폐암, 고환종양, 악성 림프종, 급성 백혈병 등에 대하여 사용되고 있다. 그러나 이 질환에 대한 ADM의 효과도 한계가 있으며, 또 그에 따라 사용한 ADM에 대하여, 내성을 표시하는 암세포가 드문드문 보이기 시작하고, 성가시게, 이 ADM 내성 암세포에 대해서는 다른 약제도 항암작용이 발현되지 않는 복잡한 문제 자체가 생기고 있다.

또 ADM 이외의 다른 약제에 대해서도 그 사용에 따라 약제내성 종양세포의 발현이 문제시되고 있다.

그런데 최근에 이르러, 상술한 약제내성 종양세포에 대하여 유효한 화합물의 검색이 검토되고 있으며, 이제까지 화학식(2)으로 표시되는 N-소라네실-N,N'-비스(3,4-디메톡시벤질)에틸렌디아민 자체 또는 그 염산염을 아드리아마이신(ADM)과 복합처방제로 하였을 때에, ADM의 약효 특히 약제내성이 생긴 종양 세포에 대한 약효를 증강시키는 것이 신규로 발견되어 특허출원이 행해졌다(특개소 61-200913호). 그러므로 본 발명자들은 약제내성 극복에 대하여 한층 더 검토를 한 결과, 화학식(2)으로 표시되는 N-소라네실-N,N'-비스(3,4-디메톡시벤질)에틸렌디아민의 산부가염 중에서 특히 화학식(1)으로 표시되는 말산염에는, 화학식(2)으로 표시되는 화합물 자체 또는 그 염산염과 비교하여, 우수한 항암활성이 인지됨과 동시에 아드리아마이신 뿐만 아니라 그 이외의 항암제의 항암활성, 특히 약제내성 종양 세포에 대한 약효를 증강시키는 작용이 있는 것을 확인하고, 이러한 작용이 화학식(1)으로 표시되는 말산염에 어느 정도 특이한 것임을 발견하여, 본 발명을 완성한 것이다.

또한 본 발명자들은 화학식(1)으로 표시되는 말산염의 실제의 투여에 있어서 DDS(드러그딜리버리 시스템: 약물 송달 시스템)를 응용하여 화학식(1)로 표시되는 말산염을 지방 유제중의 지방 소구자(리피드 마이크로 스페아)중에 봉입하면, 그 지방소구자가 선택적으로 종양세포에 이송되고, 그때 봉입된 화학식(1)으로 표시되는 말산염이 효과를 발현하고, 유효한 치료법을 확립할 수 있을 것으로 생각하여 검토를 하고, 그 결과, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉 본 발명은 화학식(1)로 표시되는 N-소라네실-N,N'-비스(3,4-디메톡시벤질)에틸렌디아민 말산염을 함유하는 지방유제를 제공하는 것이며, 보다 구체적으로는

(a) 화학식(1)으로 표시되는 말산염 0.1∼10%(w/v),

(b) 식물유, 탄소원자수 8∼12개의 중쇄 지방산의 트리글리세리드 및 탄소원자수 6∼18개의 지방산의 디 및 모노글리세리드로부터 선택되는 적어도 1종의 지방 유제기제 5∼50%(w/v),

(c) 인지질 및 비이온계 계면활성제로부터 선택되는 적어도 1종의 유화제 0.05∼25%(w/v) 및

(d) 물로 구성된 지방유제를 제공하는 것이다.

본 발명은, 특히 화학식(1)으로 표시되는 말산염을 지방유제로 했을 경우, 화학식(1)의 말산염이 지방유제중의 리피드마이크로 스페아중에 봉입되고, 그 리피드마이크로 스페아가 종양세포에 이송되며 그때에 봉입된 화학식(1)의 말산염이 다른 항암제의 항암활성을 증강시키는 점에 특징을 갖는 것이고, 항암제와 병용함으로서 그 항암활성이 현저하게 증강되는 점에서 특이한 것이다.

본 발명이 제공하고자 하는 화학식(1)으로 표시되는 말산염의 한쪽이 유리염기인 화학식(2)으로 표시되는 N-소라네실-N,N'-비스(3,4-디메톡시벤질)에틸렌디아민은, 무색투명한 유상물질이지만 화학식(1)으로 표시되는 말산은 융점 42∼44℃의 무색 내지 담황색결정이다. 본 말산염은, 예를 들면 이하의 제조법에 의하여 수득할 수 있다. 즉, 화학식(2)으로 표시되는 N-소라네실-N,N'-비스(3,4-디메톡시벤질)에틸렌디아민을 적당한 유기용매, 바람직하기는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 알코올계 용매, 에테르, 테트라히드로푸란, 디옥산 등의 에테르계 용매에 용해시키고, 이 용액에 사용한 화학식(2)으로 표시되는 화합물에 대하여 1.0 내지 1.5몰 당량의 말산을 용해시킨 용액을 가하여, 그 혼합용액을 가온시키고, 그 후 용매를 증류제거하고, 수득된 잔류물을 에테르계 용매로 세정한 후, 재결정을 행하여 소망하는 말산염을 얻을 수 있다.

이 경우, 공지의 화학식(2)으로 표시되는 화합물, 또는 그 염산염이 수지상의 초점조성의 화합물인 것을 고려하면, 화학식(1)으로 표시되는 말산염은 그 취급이 매우 용이하다는 것이 판명되었다.

본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염은 그 자체에서도 항암활성을 갖는 것이 판명되었지만, 다른 항암제와 병용함으로서 그 항암제의 활성이 현저하게 증강되는 점에 특징이 있다. 활성이 증강되는 항암제로서는 종래 임상적으로 사용되고 있는 각종 항암제를 들 수 있지만, 그 중에서도 아드리아마이신, 액티노마이신-D, 마이토마이신C, 블레오마이신, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 페플로마이신 등을 들 수 있고, 특히 이들 약제에 대하여 내성을 나타내는 종양세포에 우수한 효과를 발휘할 수 있는 점은 특이적인 것이라고 말할 수 있다.

본 발명에 있어서는 화학식(1)으로 표시되는 말산염을 함유하는 지방유제는 다른 항암제와 조합 투여하여 사용되지만, 그 투여량은 투여방법 및 대상질환에 의하여 일괄적으로 한정할 수 없지만 일반적으로 화학식(1)의 말산염으로서 1.0mg 내지 2,000mg/일의 범위내에서 임의로 선택할 수 있다. 특히 화학식(1)으로 표시되는 말산염으로서 약 4mg 내지 약 1,000mg/일이 적당하다. 그러나 항암활성 증강작용을 목적으로 다른 항암제와 병용하여 사용하는 경우의 투여량은, 그 항암제의 종류에 따라 다르며, 일반적으로 다른 항암제의 투여량은 상용량이고, 화학식(1)의 말산염의 투여량은 상대쪽의 항암제의 지방유제를 증강하는 범위내에서 선택된다. 또한 실제의 투여에 있어서는 지방유제가 인정된 투여형태가 되는 점은, 화학식(2)의 화합물자체 또는 그 염산염이 지방유제화 될 수 없는 것으로 보아 특이적인 것이다.

즉, 지방유제로서 실제 투여할 수 있는 1미크론 이하의 미세입자를 확보하기 위해서는 입자 하전이 +20mV 내지 +50 mV의 범위내에 있는 것이 필요하며, 화학식(2)의 화합물 자체 또는 그 염산염에서는 입자 하전이 이러한 범위내의 것이 안되며, 입자응집이 생겨 버리는 것이 판명된다.

따라서, N-소라네실-N,N'-비스(3,4-디메톡시벤질)에틸렌디아민의 본래의 약효를 발휘하는 지방유제로서는, 그 화합물을 말산염으로 하지 않으면 안되고, 그 점에서 본 발명의 지방유제는 특이적인 것이라고 말할 수 있다.

이 경우의 지방유제는 통상의 지방유제의 지방 입자중에 상기 화학식(1)으로 표시되는 말산염을 도입함으로서 조제되고, 예를 들면 그 말산염을 지방유제기제중에 용해시키고, 유화제를 사용하여 수중에 분산시켜 수중유형유제로 함으로서 용이하게 제조할 수 있다.

그러나 본 발명의 지방유제의 조제시에 사용할 수 있는 지방유제기제로서는, 종래로부터 소위 지방유제의 조제시에 보통 사용되고 있는 제약학적으로 허용될 수 있는 임의의 유지류가 포함되고 구체적으로는 대두유, 면실유, 유채유, 잇꽃유 등의 식물유; 통상 MCT라 약칭되고 있는 탄소수 8∼12개의 중쇄지방산(예를 들면, 카프릴산, 카프린산, 라우린산 등)의 트리글리세리드; 탄소수 6∼18개의 지방산(예를 들면, 카프론산, 카프린산, 미리스트산, 팔미트산, 리놀산, 스테아르산 등)의 모노 또는 디글리세리드 등을 들 수 있으며, 이것들은 각각 단독, 2종 또는 그 이상 조합으로 사용할 수 있다. 이것들 중 특히 대두유, 파나세트 810(일본 유지 주식회사제, MCT의 혼합물)이 바람직하게 사용된다. 이러한 지방유제기제의 사용량은 엄밀히 제한되는 것이 아니라, 상기 화학식(1)으로 표시되는 말산염 및/또는 다른 배합성분의 종류나 양에 따라 광범위하게 변경시킬 수 있는데, 일반적으로 1∼50%(w/v), 바람직하기는 3∼30%(w/v), 더욱 바람직하기는 5∼20%(w/v)의 범위로 하는 것이 좋다.

또한 본 명세서에 있어서, 지방유제의 배합성분의 함량 또는 사용량에 대하여 사용하는 백분율 「%(w/v)」은 특별히 문제가 없는 한 최종의 지방유제제품 100용량부당의 중량부를 의미한다. 또, 상기 지방유제기제를 수중에 안정적으로 분산시키기 위한 유화제로서는, 생리학적으로 허용될 수 있는 인지질 및 비이온계 계면활성제로부터 선택되는 적어도 1종의 유화제가 사용된다. 생리학적으로 허용될 수 있는 인지질로서는, 예를 들면, 황탄 인지질 , 대두 인지질, 포스파티딜콜린 등이 있으며, 또 비이온계 계면활성제로서는 예를 들면 폴리옥시알킬렌 공중합체(예를 들면, 평균 분자량이 1,000∼20,000의 범위의 폴리옥시에틸렌-폴리옥시알킬렌유도체(예를 들면, 경화 피마자유 폴리옥시에틸렌-(40)-에테르, 경화 피마자유 폴리옥시에틸렌-(20)-에테르)) 등이 포함된다. 이것들의 유화제는 각각 단독으로 사용할 수 있으며, 또는 2종 또는 그 이상 병용하여도 좋고, 본 발명에서 사용하는 유화제는 일반적으로 6∼15, 바람직하기는 10∼14의 범위내의 HLB를 갖는 것이 바람직하다.

이러한 유화제는 상기 화학식(1)으로 표시되는 말산염을 함유하는 지방유제기제 입자를 수중에 안정적으로 분산 유지하는데 필요한 양으로 사용되고, 그 양은 유화제의 종류에 따라 일반적으로 0.05∼25%(w/v), 바람직하기는 0.2 ∼6%(w/v), 더욱 바람직하기는 0.6∼2.4%(w/v) 의 범위이고, 또 상기 지방유제기제를 기준으로 하면, 그 기제 100중량부당 6∼24중량부, 특히 6∼15중량부의 범위가 적당하다.

또한 본 발명의 지방유제에 있어서 분산매가 되는 물로서는 증류수 또는 이온 교환수를 적량사용할 수 있고, 경우에 따라서는 에탄올과 같은 수혼화성 유기용매를 소량 혼합하여도 좋다.

본 발명의 지방유제에는 통상 행해지고 있는 바와 같이, 필요에 따라, 등장화제, 유화조제, 안정화제 등의 첨가제를 더욱 함유시킬 수 있다.

배합할 수 있는 등장화제로서는 예를 들면 글리세릴; 소르비톨, 크실리톨 등의 당알코올; 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스와 같은 이당류; L-알라닌, L-발린, 글리신 등의 아미노산 등이 있으며 이것들 중에서 적당한 1종 또는 그 이상 선택하여 사용된다. 이 등장화제는 지방유제가 체액의 침투압과 거의 동등하게 되도록 조절하기 위하여 첨가되는 것이며, 그 양은 지방유제중의 최종 농도가 일반적으로 0.1∼0.5몰/ℓ, 바람직하기는 0.25∼0.35몰/ℓ의 범위가 되도록 한 것이다.

또, 적당히 배합할 수 있는 유화조제로서는 예를 들면 탄소수 10∼20개의 지방산(예를 들면 스테아르산, 팔미트산, 리놀산, 리놀렌산 등) 및 그 염(예를 들면 나트륨염, 칼륨염 등), 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 스테아릴아민 등이 있으며, 이것들은 일반적으로 0.4%(w/v)까지의 범위, 바람직하기는 0.01~0.2%(w/v)의 범위에서 사용할 수 있고, 특히 상기 지방산 또는 그 염은 0.01∼0.1%(w/v)의 범위에서, 그리고 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 스테아릴아민은 0.05∼0.3%(w/v) 특히 0.1∼0.2%(w/v)의 범위에서 유리하게 사용할 수 있다.

또한 안정제로서는 콜레스테롤 또는 토코페롤을 사용할 수 있다. 콜레스테롤은 일반적으로 1.2%(w/v)까지, 바람직하기는 0.2∼0.4%(w/v)의 범위의 양으로 사용하고, 그리고, 토코페롤은 2.5%(w/v)까지, 바람직하기는 0.2∼0.8%(w/v)의 범위에서 사용하는 것이 좋다.

또, 안정제로서는, 알부민 또는 그의 지방산, 아미드 유도체, 다당류 또는 그의 지방산 에스테르 유도체 등도 사용할 수 있다. 사람용의 제제를 조제할 경우의 알부민으로서는 항원성의 관점에서 사람 유래의 것이 바람직하고, 그의 지방산 아미드 유도체로서는, 알부민 중에 존재하는 전아미노기의 5∼40%을 탄소수 14∼18개의 지방산(예를 들면 팔미트산, 스테아르산 등)으로 아미드화한 것을 들 수 있다. 한편 다당류로서는, 덱스트란, 풀루란, 히드록시에틸전분 등이 포함되고, 이러한 지방산 에스테르 유도체로서는, 그 다당류에 존재하는 전 수산기의 5∼40%가 탄소수 14∼18개의 지방산(예를 들면 팔미트산, 스테아르산 등)에 의하여 에스테르화되어 있는 것을 들 수 있다.

이러한 안정제는 일반적으로 0.02∼5%(w/v), 바람직하기는 0.2∼2.5%(w/v)의 범위에서 첨가할 수 있다.

본 발명의 지방유제는 그 자체 공지의 유화 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 그때 유화기로서는 통상의 호모지나이저를 사용할 수 있지만, 안정적이며 미세한 지방유제를 조제하기 위해서는 2종류의 호모지나이저를 병용하는 것이 좋다. 구체적으로는 예를 들면 소정량의 화학식(1)으로 표시되는 말산염을 상기의 지방유제기제, 예를 들면 대두유중에 적당히 가온하며 용해혼화하고, 이것에 소정량의 유화제 예를 들면 정제대두인지질 및 필요에 따라 다른 첨가제, 예를 들면 유화조제, 안정화제, 등장화제 등을 가하고 가온교반하여 균일하게 하고, 이어서 물을 넣어 호모지나이저로 처리하고, 수중유형의 조유화액을 조제하고, 그후 이것을 가압형 호모지나이저, 예를 들면 만톤-가우린형 호모노지나이저에 의하여 균질화함으로서, 본 발명의 지방유제를 수득할 수 있다. 또한 안정화제, 등장화제는 생성된 지방유제에 가하여도 좋다.

일반적으로 상기의 유화조작은, 생성하는 지방유제중의 분산지방입자의 평균입자경이 대체로 1μ 이하, 바람직하기는 0.3μ 이하가 될 때까지 행하는 것이 바람직하다.

또, 약효성분인 화학식(1)로 표시되는 말산염은 일반적으로 0.1∼10%(w/v), 바람직하기는 0.3∼3%(w/v), 더욱 바람직하기는 1∼3%(w/v)의 범위의 농도가 되는 비율로 사용하는 것이 좋다.

상기와 같이하여 제조되는 본 발명의 지방유제는 필요에 따라 동결 건조할 수 있으며, 그와 같이 동결 건조하므로서 수득되는 분말은 물에 재용해하면 기존의 지방유제로 되돌릴 수 있으므로, 본 발명에서 말하는 「지방유제」에는 이러한 동결 건조된 것도 포함되는 것을 양해해야 할 것이다.

본 발명에 의하여 제공되는 화학식(1)의 화합물 함유 지방유제는, 주사 등에 의하여 비경구적으로 투여된다. 주사형태로서는 정맥내 투여가 바람직하다. 본 발명의 지방유제는 비경구투여된 경우, 종양세포로의 이행성(종양세포로의 취입)이 매우 우수하고, 그 결과, 종양세포에 대한 다른 항암제의 항암활성을 강력히 증강시키는 것이다.

본 발명이 제공하는 지방유제를 다른 항암제와 함께 병용하고, 그 항암제의 항암활성을 증강시키는 방법 및 담암 또는 자연 발생암을 갖는 온혈 동물에 항암제와 함께 본 발명의 지방유제를 투여하고, 그 온혈동물에 발생한 암을 치료하는 방법에 있어서의 본 발명의 지방유제의 실제의 투여 스케줄로서는 이하의 방법을 채용하는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명의 지방유제는 한편으로는 다른 항암제 투여와 동시에 병용투여한다. 또 다른 방법으로는, 항암제 투여전 24시간 이내에 본 발명의 지방유제를 투여하고, 그 후 항암제 투여와 동시 또는 그 수시간 전에 본 발명의 지방유제를 투여하고, 이러한 투여 형태를 연속적 또는 간헐적으로 반복한다. 이 투여방법에 의하여, 병용하는 다른 항암제의 항암활성이 현저하게 증강되고, 치료효과가 유효하게 발휘되는 것이다.

이러한 점에서 보면, 본 발명의 지방유제는 특히 암화학요법에 다대한 공헌을 부여하는 것이다.

이하에 본 발명이 제공하는 N-소라네실-N,N'-비스(3,4-디메톡시벤질)에틸렌디아민-말산염 및 그 말산염을 함유하는 지방유제의 약리활성을 설명한다.

[A] 약효약리시험

A-Ⅰ; 항암활성 및 항암활성 증강작용(시험관내)

파트1:

방법 : 차이니즈 햄스터 난소종양세포로서 감수성주 V79/S 및 아드리아마이신(ADM) 내성주 V79/ADM; 및 사람의 간암세포로서 감수성주 PLC/S 및 콜히친 내성주 PLC/Col을 사용하였다.

상기의 각종 양세포중, 감수성 세포는 400개, 내성세포는 600개를 10% 소혈청 첨가 이글(Eagle)MEM 배지 10ml중에 24시간 배양후, 하기 제1표중에 기재한 각 약제를 에탄올에 용해시킨 용액 50㎍을 가하고, 그후, 9일간 배양하고, 각각의 종양세포의 콜로니형성(증식)을 50% 억제하는 약제농도를 계산하여 구하였다.

또한 V79/S 및 V79/ADM에 대해서는 표중에 명기한 모든 약제를 사용하여 실험하였지만, PLC/S 및 PLC/Col에 대해서는 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염, 아드리아마이신 및 페프로마이신(PEP)만으로 행하였다.

결과 : 제1표에 각 종양 세포증식을 50% 억제하는데 필요한 각 약제농도(㎍/ml)를 IC₅₀으로서 표시하였다.

표중의 결과에서 명백히 알 수 있듯이, 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염은 그 자체가 종양증식억제(항암)작용을 가짐과 동시에, ADM 내성 차이니즈 햄스터 난소 종양세포(V79/ADM) 또는 콜히친 내성 사람의 간암세포(PLC/Col)의 증식을 그러한 감수성 세포의 증식을 억제하는데 필요한 용량과 비교하여, 보다 저농도로 억제하고, 명백한 약제내성 종양세포에 대한 종양증식억제(항암)작용 및 약제 내성극복 작용을 표시하고 있는 것이 판명되었다.

그에 대하여, 임상적으로 사용되고 있는 아드리아마이신(ADM)에서는, 그의 내성종양세포에 대하여 항암활성이 저명한 감약이 생기고 또 다른 제암 또는 항암제인 ACR, ACD 및 최근, 급성백혈병, 급성림프종, 유암에 대하여 항암활성이 인지됨으로서 시판된 미톡산트론에서는, 약제내성종양세포(V79/ADM)의 증식에 대한 IC치는 감수성 세포에 대한 IC치 보다 큰 것이 되어 있어, 약제 내성이 극복되어 있지 않다.

그점에서 보면 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염은 우수한 것이라는 것을 알 수 있다.

파트2:

방법 : 임상분리된 사람의 암세포로서, 폐선암, 폐편평상피암, 골육종 및 난소암을 선택하고, 이들 종양세포에 대한 살세포작용을 조사하였다. 즉, 각종 종양조직을 면도칼로 잘게 잘라, 생리식염수중 1mm 메쉬로 세정하고, 결합조직을 제거한다. 이어서 수득된 용액을 1000rpm으로 1분간 웜심처리하여 괴사물질을 제거하고, 생리식염수로 세정하여 종양세포를 얻었다.

이어서, 상기와 같이하여 수득된 종양세포 약 10mg을 조직배양액(RPMI 1640+10% 소의 태아혈청) 0.4ml중에 넣고, 또한 하기 제2표중에 기재한 농도의 각 약제를 넣고, 37℃로 4 내지 8시간 반응시킨다. 그후 펌핑하여 조직편을 분산하고 1000rpm으로 5분간 원심후, 세포도말하고, Giemsa 염색하고 현미경하에 종양세포의 형태변화를 토대로 살세포 작용을 검토하였다.

또한 실험은 상기 종양세포 각각 2예씩 계 8예로 행하였다.

또 화학식(1)의 말산염은 8예중 3예는 3㎍/ml, 5예는 30㎍/ml 농도로 검토하였다.

결과 : 상기의 종양세포에 대한 살세포작용을 표중에 표시한 시험관내 농도를 사용하여 검토하고, 8예중에 있어서의 피셔(Fischer)의 유의차 검정으로 유의차 있다고 판정된 유효예를 제2표에 정리하였다.

* Fischer의 유의차검정으로 유의차 있다고 판정된 예

표중의 결과에서 확실시되듯이, 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염은 각종 종양세포에 대하여 살세포 작용을 나타내고 있는 것이 판명되었다.

A-Ⅱ; 항암활성 및 항암활성 증강작용(생체내)

파트 1:

방법 : 체중 20±3g의 수컷 BDF생쥐 3 내지 6마리를 사용하여, 종양세포로서 B16 멜라노마세포를 선택하고, 그 멜라노마세포를 호모지네이트하고, 0.5ml/생쥐의 양으로 각 생쥐피하에 이식하고 그의 7일후로부터 4일 걸러 3회 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염 5mg/kg/회 및 항암제로서 네오카르티노스타틴(NCS) 0.45mg/kg/회를 각각 복강내에 단독 또는 병용 투여하여 생쥐의 연명률을, 처리군/무처리 대조군(T/C: %)에서 구하였다.

결과 : T/C(%)를 제3표에 나타냈다.

* M.S.T.(중간 생존 시간)에서의 비교

표중의 결과에서 확실시되듯이, 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염의 투여군은 무처리 대조군과 비교하여 그 연명효과는 특히 우수한 것이고 또 NCS 단독투여군 보다 유의하게 효과가 있음이 판명되었다. 또한, 병용투여군에 있어서는 단독투여군과 비교하여 그의 연명률에 차이는 없고, 본 시험에 있어서 항암활성 중 증강작용은 확실히 관찰할 수 없었다.

파트 2:

방법 : 체중 20±2g의 수컷 BDF생쥐 1군 6마리 사용하고, 종양세포로서 Lewis 폐암세포를 각 생쥐의 겨드랑이 배 피하에 10개량 이식하고, 그의 7일 후에, 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염 함유지방유제(주: 실시예 2의 지방유제) 및 항암제로서 아드리아마이신(ADM)을 하기 표중의 투여량으로 정맥내 투여하고, 각 군의 생쥐의 연명률을 처리군/무처리 대조군(T/C: %)에서 구하였다.

결과 : 그 T/C(%)를 제4표에 나타냈다.

1) M.S.T.(중간 생존 시간)비교

2) 화합물(Ⅰ) 말산염 환산량

표중의 결과에서 판명된 바와 같이, 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염 함유 지방유제는, 현저한 연명 효과를 표시하고, 함암활성이 우수함을 알 수 있다.

파트 3:

방법 : 체중 20±2g의 수컷 BDF생쥐를 1군 6마리 사용하고, 종양세포로서 P388 생쥐 백혈병 세포(이식후 1주간째의 세포)를 0.9% 생리식염수로 세정한 후, 그의 세포 갯수가 5×10개/ml가 되도록 생리식염수에 현탁하고, 그 현탁액을 1마리당 0.2ml(10개) 복강내 투여하였다.

종양세포이식 24시간 후에 화학식(1)으로 표시되는 말산염 및 시클로포스파미드(CPA)를 순차 1회 복강내에 투여하고, 각 군의 생쥐의 연명률을 구하였다.

또한 화학식(1)로 표시되는 말산염은 Tween 80으로 1 : 5의 비율로 생리식염수에 현탁하고 이것을 원액으로 하고, 같은 농도의 Tween 80 용액으로 희석하여 사용하였다. CPA는 생리식염수에 용해하여, 사용하였다.

결과 : CPA를 50mg/kg 및 100mg/kg 및 화학식(1)으로 표시되는 말산염을 10 및 20mg/kg의 조합으로 단독 및 병용투여하고, 연명률을 구하였다. 또한 연명률은 P388 생쥐의 백혈병 세포만 이식한 대조군에 대한 처리군의 T/C(%) 및 CPA 단독투여군에 대한 병용처리군의 T/C(%)로 표시하고, 그 결과를 정리하여 제5표에 표시하였다. 또한 더불어 30일 후의 생존생쥐의 수도 표시하였다.

1) MST: 중간 생존 시간

2) ( )내는 CPA 단독투여군에 대한 %

3) 30일간 생존 동물수

상기의 결과에서 보면, 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염은, 저농도에 있어서 CPA의 항암활성을 현저하게 증강하고, 특히 CPA 100mg/kg 투여군에 있어서는 화학식(1)의 말산염 10mg/kg과 병용하고, 그 효과가 우수한 것이 판명되었다.

A-Ⅲ : 항암활성 증강 작용

방법 : 차이니즈 햄스터 난소종양 세포로서 감수성주 V79/S 및 아드리아 마이신(ADM) 내성주 V79/ADM; 사람의 간암세포로서 감수성주 PLC/S 및 콜히친 내성주 PLC/Col; 및 생쥐의 백혈병 세포로서 감수성주 L5178Y 및 아클라루비신 내성주 L51 78Y/ACR을 사용하고, 화학식(1)으로 표시되는 말산염과의 병용에 의한 항암활성 증강 작용을 검토하였다.

즉, 상기 각 종양세포중, 감수성 세포는 400개, 내성세포는 600개를 각각 10% 소의 혈청첨가 이글 MEM 배지 10ml중에 24시간 배양하고 이어서 시험약제를 첨가하고, 그후 9일간 배양하고, 각각의 종양세포의 콜로니형성(증식)을 50% 억제하는데 필요한 농도(IC: ㎍/ml)를 계산하여, 구하였다.

실험은 이하의 조합으로 행하였다.

(a) 차이니즈 햄스터 난소종양 세포

항암제로서 아드리아마이신(ADM), 아클라루비신(ACR), 액티노마이신D(ACD), 5-플루오로우라실(5-FU), 시타라빈(Ara-C), 시스플라틴(CDDP), 메토트렉세이트(MTX), 마이토라이신C(MMC), 니무스틴(ACNU), 미톡산트론 에토포시드(VP-16), 빈크리스틴(VCR), 블레오마이신(BLM), 페플로마이신(PEP)을 사용하여, 감수성 세포의 계에서는 화학식(1)으로 표시되는 말산염을 10㎍/ml 병용하고, 내성세포의 계에서는 화학식(1)으로 표시되는 말산염을 3㎍/ml, 5㎍/ml 및 10㎍/ml 병용하여 행하였다.

(b) 사람의 간암세포

항암제로서 아드리아마이신(ADM) 및 페플로마이신(PEP)을 사용하고, 화학식(1)으로 표시되는 말산염을 5㎍/ml 병용하여 행하였다.

(c) 생쥐의 백혈병 세포

항암제로서 아드리아마이신(ADM) 및 아크랄 비신(ACD)을 사용하고, 화학식(1)으로 표시되는 말산염을 20㎍/ml 병용하여 행하였다.

결과 : 각각의 결과를 제6표 및 제7표에 나타냈다.

* μM (IC: ㎍/ml)

IC: ㎍/ml

이상의 결과에서 판단하면 화학식(1)의 말산염은 다른 항암제와 병용함으로서 양호하게 항암활성이 증강되어 있는 것이 판명되었다. 또 특히 다제내성의 종양세포에 대하여 그 증강작용은 우수한 것이며, 화학식(1)의 말산염의 유용성을 알 수 있다.

A-Ⅳ : 종양 증식억제작용

방법 : 체중 240∼270g의 Balb/c 암컷쥐(7주된 것)를 1군 8마리 사용하고, 메틸콜란트렌 유발종양세포(Meth-A)를 복강내에 이식하고 이어서 화학식(1)으로 표시되는 말산염을 투여하고, 16일간 후의 종양세포의 중량을, 약제무투여 대조군의 종양세포의 중량과의 대비로 그 증식억제 작용을 검토하였다.

화학식(1)의 말산염의 투여량은 1.25, 2.5, 5.0 및 10.0mg/kg/일로 하고 쥐복강내 투여를 행하고, 투여 스케줄은 하기 제8표에 기재한 바와 같이 수행한다.

또 다른 항암제로서 마이토마이신C(MMC)를 1mg/kg/일 투여한 군에 대해서도 검토하였다.

결과 : 종양세포이식 16일 후의 종양의 중량(g), 그 대조군과의 비교(T/C(%): 처리군/무처리군) 및 16일후의 생존 쥐수를 함께 제8표에 나탄냈다.

1) 투여량 : mg/kg/일

2) 단위 : g

상기의 결과에서 판명된 바와 같이, 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염은 Meth-A 이식쥐에 있어서의 종양의 증식을 상당히 억제하고 있음을 알 수 있다.

A-V : 항암활성 증강작용(생체내)

방법 : 4∼5주 된 ICR 누드 생쥐를 일군 7마리로서 사용하였다. 사람의 위암주 H-81을 종양세포로서 사용하고, 그 종양세포의 조직편을 2mm 각으로 도려내어, ICR 누드 생쥐의 우측등 피하에 이식하였다. 이식후의 종양체적을 장경×단경×두께/2에 의하여 산출하고, 그 값이 100mm정도에 달하는 이식후 11일째에서 약제 투여를 개시하였다.

약제 투여순서는 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염 함유지방유제(주: 실시예2의 지방유제)를 정맥내 투여하고, 그후 20±5분후에 아드리아마이신(ADM)을 동일하게 정맥내 투여하였다. 투여횟수는, 투여개시일로부터 5일마다 1회 투여의 계 4회로 하였다.

결과 : 각 군에 있어서의 약제의 투여량은 하기 표와 같다.

측정일에 있어서의 각 쥐의 종양체적을 장경×단경×두께/2에 의하여 산출하고, 대조(약제 무투여)군에 대한 종양증식억제율을 구하였다. 측정일은 약제의 각 투여일 및 약제 투여개시 4주간 후로 하고, 그 결과를 제9표에 표시하였다.

* p0.5, ** : p0.1, *** : p0.01

1) 화합물(Ⅰ) 말산염 환산량

주1 : ADM 5mg/kg에 대해서는 제1회 투여만으로 4주간 후에 평가하였다.

주2 : 4주간 후의 결과에 대해서만 대조군에 대하여 유의차 검정을 행하였다.

표중의 결과에서 판명된 바와 같이, 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염 함유지방유제는, ADM과 병용함으로서 ADM의 항암활성을 상승적으로 증강하고 있음을 알 수 있다. 특히, 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염 5mg/kg 및 ADM 5mg/kg의 병용군에서는, 종양체적을 확실히 축소시키는 경향을 볼 수 있다.

또, 어느 군에 있어서도 누드 생쥐의 사망예는 관찰할 수 없고 부작용도 전혀 관찰할 수 없었다.

이상의 점에서 보다, 본 발명의 지방유제에는 현저한 항암활성 증강작용이 관찰됨을 알 수 있다.

A-Ⅳ : 항암활성 증강작용(생체내)

방법 : ICR 누드 생쥐를 일군 6마리로서 사용하고, 상기 A-V에 기재한 방법에 준하였다.

종양세포로서 사람의 종양세포(근육선유육종 HT-1080)를 사용하고, 이식후 5일째부터 약제 투여를 개시하였다.

약제투여 순서는, 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염 함유지방유제(주: 실시예 2의 지방유제)를 정맥내 투여하고, 그후 20±5분 후에 아드리아마이신(ADM)을 동일하게 정맥내 투여하였다. 투여횟수는 투여 개시일에서 5일 마다 1회 투여하여 계 4회로 하였다.

또, 마이토마이신C(MMC)에 대해서도 동일한 시험을 행하였다.

결과 : 각 군에 있어서의 약제의 투여량은 하기 표와 같다.

종양이식 36일로 종양 덩어리를 적출하고, 종양 중량을 측정하고, 대조(약제 무투여)군에 대한 종양 중량차로부터 종양 저지율(%)을 구하였다. 그 결과를 제10a 및 10b표에 표시하였다.

1) 화합물(Ⅰ) 말산염 환산량

1) 화합물(Ⅰ) 말산염 환산량

표중의 결과에서도 판명된 바와 같이 본 발명의 지방유제는 HT-1080에 대하여, ADM 및 MMC의 항암활성을 상당히 증강시키고 있음을 알 수 있다.

이상의 각 약리시험의 결과에서 확실한 바와 같이, 본 발명의 화학식(1)으로 표시되는 말산염은 그 및 항암활성 증강작용이 특히 우수한 것이며, 또 화학식(1)의 말산염을 함유하는 지방유제에 있어서도 그 효과가 양호함이 판명되었다.

다음에 본 발명의 지방유제의 안정성 시험에 대하여 기술한다.

[B] 안정성 시험

본 발명에 의하여 제공되는 화학식(1)의 말산염을 함유하는 지방유제에 대하여, 3개월간의 안정성 시험을 하였다. 함량의 측정은 고속액체 크로마토그래프법(장치: 히타치 제작소제 655-15)으로 행하고, 입자경의 측정은 광투과식 입도 분포계(호리바 제작소제 CAPA-500)로 행하였다. 그 결과를 하기의 제11표에 표시한다. 실온(25℃), 3개월간의 안정성 시험에서는, 함량의 저하, 외관 변화 또는 pH 및 입자경(평균)변화는 거의 관찰되지 않으며, 따라서 화학식(1)의 말산염을 함유하는 지방유제는 제제학적으로 매우 안정적이라고 말할 수 있다.

( )내는 잔존율%을 표시한다.

1) mg/kg

2)평균치: ㎛

다음에 본 발명을 제조실시예, 제제실시예로 설명한다.

[실시예 1]

N-소라네실-N,N'-비스(3,4-디메톡시벤질)에틸렌디아민-말산염[화학식(1)의 화합물]

N-소라네실-N,N'-비스(3,4-디메톡시벤질)에틸렌디아민 20g(0.02몰)을 에탄올 200ml에 용해시키고, 이 용액에 말산 4.1g(0.03몰)의 에탄올 10ml 용액을 가하고 평온하게 가온한다. 이어서 에탄올을 감압증류 제거하고, 수득된 잔류물을 에테르로 세정하고, 에탄올-에테르 혼액으로 재결정하고, 융점 42∼44℃의 무색결정으로서 말산염 18.2g(수율: 79.7%)을 수득하였다.

독성시험:

이상과 같이 하여 수득된 화학식(1)의 말산염의 독성시험을 생쥐에 행하였다. 그 결과, 경구투여에 있어서 2,000mg/kg이라도 하등 이상은 볼 수 없고, 독성은 관찰할 수 없었다.

[실시예 2]

지방유제

일국(日局) 대두유 20g에 화학식(1)의 말산염 4.0g을 가하고, 가온하여 용해시킨다. 이것에 정제대두인지질 2.4g 및 글리세린 5g을 넣고 가온하면서 세게 교반하여 용해한 후, 적당량의 증류수를 가하여 폴리트론 호모지나이저로 교반하고 조 유화액을 조제한다.

이 조 유화액을 또한 만톤-가우린형 호모노지나이저에 의하여 고압유화시킨 후, 증류수를 가하여 200ml로 함으로서 매우 미세한 지방유제가 수득되었다. 분산지방입자의 평균입자경은 0.21μ이며, 1μ 이상의 입자는 함유되지 않았다.

[실시예 3]

지방유제

실시예2에 있어서 글리세린 5g으로 바꾸고, D-소르비톨 13g을 사용하고, 실시예 5와 동일하게 조제하여, 화학식(1)의 말산염 4.0g을 함유하는 지방유제 200ml을 수득하였다. 분산지방입자의 평균입자경은 0.21μ이며, 1μ 이상의 입자는 함유되지 않았다.

[실시예 4]

지방유제

일국 대두유 20g에 화학식(1)의 말산염 4.0g을 넣고, 가온하여 용해한다. 이것에 정제 난황인지질 2.4g을 가하고, 가온하면서 세게 교반하여 용해시킨 후, 적당량의 증류수를 가하여 폴리트론 호모지나이저로 교반하고 조유화액을 조제한다.

이 조유화액을 또한 만톤-가우린형 호모노지나이저에 의하여 고압 유화시킨 후, 증류수를 가하여 200ml로 함으로서 매우 미세한 지방유제가 수득되었다. 분산지방입자의 평균 입자경은 0.22μ이며, 1μ이상의 입자는 함유되지 않았다.

[실시예 5]

지방유제

일국 대두유 10g 및 MCT 10g에 화학식(1)의 말산염 4.0g을 놓고, 가온하여 용해한다. 이것에 정제대두인지질 1.2g 및 정제난황인지질 1.2g을 가하고, 가온하면서 세게 교반하여 용해한 후, 적당량의 증류수를 가하여 폴리트론 호모지나이저로 교반하여 조유화액을 조제한다.

이 조유화액을 또한 만톤-가우린형 호모노지나이저에 의하여 고압유화시킨후, 증류수를 가하여 200ml로 하므로 매우 미세한 지방유제가 수득되었다. 분산지방 입자의 평균입자경은 0.22μ이며, 1μ 이상의 입자는 함유되지 않았다.

[실시예 6]

지방유제

실시예 2에 있어서 대두유를 20g에서 10g으로 변경하고, 실시예 2와 동일하게 조제하여, 화학식(1)의 말산염 4.0g을 함유하는 지방유제 200ml를 수득하였다. 분산지방입자의 평균입자경은 0.20μ이며, 1μ 이상의 입자는 함유되지 않았다.

Claims

(a)화학식(1)

으로 표시되는 N-소라네실-N,N'-비스(3,4-디메톡시벤질)에틸렌디아민 말산염 0.1∼10%(w/v), (b) 식물유, 탄소원자수 8∼12개의 중쇄지방산의 트리글리세리드 및 탄소원자수 6∼18개의 지방산의 디 및 모노글리세리드로부터 선택되는 적어도 1종의 지방유제기제 5∼50%(w/v), (c) 인지질 및 비이온계 계면활성제로부터 선택되는 적어도 1종의 유화제 지방유제기제 5~50%(W/V), (C) 인지질 밍 바이온계 계면활성제로 부터 선택되는 적어도 1종의 유화제 0.05∼25%(w/v) 및 (d) 물로 구성된 항암활성 증강작용을 가지는 지방유제.
제1항에 있어서, 식물유가 대두유인 지방유제.
제1항에 있어서, 인지질이 대두인지질인 지방유제.
제1항에 있어서, 글리세린, 당알코올, 단당류, 이당류 및 아미노산으로부터 선택되는 적어도 1종의 등장화제를 또한 함유하는 지방유제.
제1항에 있어서, 탄소수 10∼20개의 지방산 및 그 염, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린 및 스테아릴아민으로부터 선택되는 1종의 유화조제를 또한 함유하는 지방유제.
제1항에 있어서, 콜레스테롤 및 토코페롤로부터 선택되는 안정화제를 또한 함유하는 지방유제.
제1항에 있어서, 알부민 및 그 지방산 아미드 유도체 및 다당류 및 그 지방산 에스테르 유도체로부터 선택되는 적어도 1종의 안정화제를 또한 함유하는 지방유제.
제1항에 있어서, (a) 화학식(1)으로 표시되는 말산염 0.3∼3%(w/v), (b) 대두유 5∼30%(w/v), (c) 대두인지질 0.5∼25%(w/v), (d) D-소르비톨 5∼20%(w/v) 및 (e) 물로 구성된 지방유제.