JPWO2021136689A5

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Publication number: JPWO2021136689A5
Application number: JP2022530763A
Authority: JP
Publication date: 2023-12-15

Claims

総レチノイドを基準として少なくとも約７０％の酢酸レチニルを含むレチノイドの産生に関与する遺伝子を発現する含油性酵母細胞であって、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＬＩＰ８の活性を有する内在性酵素の、減少又は消失を含む１つ又は複数の遺伝子改変を含む、含油性酵母細胞。
レチノール、酢酸レチニル、レチニル脂肪酸エステル、ビタミンＡ、又はこれらの混合物からなる群から選択されるレチノイドの製造方法における請求項１に記載の宿主細胞の使用であって、総レチノイドを基準として少なくとも約７０％が酢酸レチニルである使用。
発酵方法で生成されるレチノイドミックス中の酢酸レチニル以外のレチノイドの割合を減少させるか又は消失させる方法であって、
（１）レチノールの酢酸レチニルへの変換に関与する酵素をコードする異種遺伝子、及び任意選択的な、レチナールのレチノールへの変換及び／又はベータ－カロチンからレチナールへの変換に関与する酵素をコードする遺伝子を、レチノイド産生宿主細胞に導入する工程、
（２）ＬＩＰ２、ＬＩＰ３、ＬＩＰ４、ＴＧＬ、ＬＩＰ１６、ＬＩＰ１７、ＬＩＰ１８、及び／又はこれらの組み合わせと組み合わせてヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のＬＩＰ８に対応する内在性酵素活性に、１つ又は複数の改変を導入する工程であって、前記改変は、そのような酵素活性の減少又は消失である、工程
を含む方法。
レチノール、酢酸レチニル、ビタミンＡ、並びにレチノール、酢酸レチニル、及びビタミンＡを含むミックスからなる群から選択される生成物の製造方法であって、
（ａ）酢酸レチニルの形成が可能なレチノイド産生宿主細胞を準備する工程、
（ｂ）前記宿主細胞のゲノムへの１つ又は複数の改変の導入の工程であって、前記改変が、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のＬＩＰ８に対応する酵素活性を減少させ又は消失させること、並びに任意選択的に、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のＬＩＰ２、及び／又はＬＩＰ３、及び／又はＬＩＰ４、及び／又はＴＧＬ、及び／又はＬＩＰ１６、及び／又はＬＩＰ１７、及び／又はＬＩＰ１８に対応する酵素活性をさらに減少させ又は消失させることを含み、前記改変宿主細胞は、依然として、炭素源として植物油で増殖可能である、工程、
（ｃ）任意選択的な、当業者に既知の、レチノール、酢酸レチニル、及び／又はビタミンＡの産生に関与する（異種）酵素の１つ又は複数のコピーの発現を含むさらなる改変の導入の工程、
（ｄ）レチノール、酢酸レチニル、及び／又はビタミンＡが形成される好適な条件下での、そのような改変宿主細胞の培養の工程であって、前記改変宿主細胞は、炭素源として植物油で増殖する、培養の工程、
並びに
（ｅ）任意選択的な、前記培養（発酵）培地からのレチノール、酢酸レチニル、及び／又はビタミンＡの単離及び／又はさらなる精製の工程、
を含む方法。
炭素源として植物油で増殖した酢酸レチニル産生宿主細胞の発酵における酢酸レチニルの割合を増加させるために改変すべき好適な内在性ヒドロラーゼの同定方法であって、
（１）植物油のグリセロール及び脂肪酸への前消化に関与する内在性リパーゼ又はエステラーゼ酵素を発現する、酢酸レチニル産生が可能な含油性酵母を提供する工程、
（２）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５に対する少なくとも約５０％の、例えば、６０、７０、８０、９０、９５、９８、又は１００％の配列相同性に基づく、内在性リパーゼ又は内在性エステラーゼ酵素の選択の工程、
（３）選択された遺伝子の過剰発現、及び総レチノイドを基準とする酢酸レチニルの割合の比較の工程、
（４）遺伝子の選択の工程であって、過剰発現が、レチノイドミックス中の酢酸レチニルの割合にマイナスの影響を及ぼしていた、遺伝子の選択の工程、
並びに
（５）レチノイドミックス中における酢酸レチニル形成の富化のために選択された遺伝子の減少又は消失の工程
を含む方法。