CN111107833A - 反式视黄醛的生产 - Google Patents

Abstract

本发明涉及经由β‑胡萝卜素的立体选择性转换来生产维生素A醛(视黄醛)的新颖酶促方法，所述方法包括使用具有β‑胡萝卜素氧化酶(BCO)活性，特别是具有对反式视黄醛的偏好的反式选择性酶。所述方法对于维生素A的生物技术生产特别有用。

Description

反式视黄醛的生产

本发明涉及经由β-胡萝卜素的立体选择性转换来生产维生素A醛(视黄醛(retinal/retinaldehyde))的新颖酶促方法，所述方法包括使用具有β-胡萝卜素氧化酶(BCO)活性，特别是具有对反式视黄醛的偏好的反式选择性酶。所述方法对于维生素A的生物技术生产特别有用。

视黄醛是类视黄醇生产方法，特别是诸如维生素A生产方法中的重要中间体/前体。类视黄醇，包括维生素A，是必须经由营养品供应给人类的非常重要且不可缺少的营养因子之一。类视黄醇促进人类的健康，尤其是在视觉、免疫系统和生长方面。

目前用于类视黄醇(包括维生素A及其前体)的化学生产方法具有一些不期望的特性，诸如高能耗、复杂的纯化步骤和/或不期望的副产物。因此，在过去的几十年中，已经研究了其他制造类视黄醇(包括维生素A及其前体)的方法，包括微生物转换步骤，这将更加经济和环保。

通常，产生类视黄醇的生物系统在工业上难以处理，且/或以低水平产生化合物，使得商业规模的分离是不可行的。造成这种情况的原因有一些，包括类视黄醇在此类生物系统中的不稳定性或副产物的相对高产量。

因此，改善β-胡萝卜素酶促转换为维生素A的产物特异性和/或生产率是一项持续存在的任务。特别地，期望优化参与β-胡萝卜素朝向产生被视为最稳定同种型的反式同种型(诸如反式视黄醛)的转换的酶的选择性。

令人惊讶地，我们现在能够鉴定从各种物种中分离出的所谓的反式切割酶，即能够将β-胡萝卜素选择性转换为视黄醛，特别是反式视黄醛的酶，其中此类酶朝向产生反式同种型的生产率和/或选择性导致反式同种型与顺式同种型之间的产物比值为至少约2的视黄醛混合物，优选地其中基于类视黄醇的总量，反式同种型的产量在至少约65％的范围内。

具体地，本发明涉及具有立体选择性氧化β-胡萝卜素朝向反式同种型(诸如反式视黄醛)，即将β-胡萝卜素转换为包含反式视黄醛和顺式视黄醛的视黄醛混合物的活性的BCO，其中基于视黄醛的总量，相对于反式视黄醛的量，顺式视黄醛的量已被减少或消除，从而特别地导致基于视黄醛的总量，顺式视黄醛的百分比为约35％或更小。

本发明优选地涉及一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，尤其是产生类视黄醇的宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文所限定的此类选择性BCO，所述宿主细胞产生包含顺式视黄醛和反式视黄醛二者的视黄醛混合物，其中基于由所述宿主细胞产生的视黄醛的总量，反式视黄醛的百分比为至少约65％，优选地68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％。

术语“β-胡萝卜素氧化酶”、“β-胡萝卜素加氧酶”、“具有β-胡萝卜素氧化活性的酶”或“BCO”在本文中可互换使用，并且是指能够催化β-胡萝卜素转换为视黄醛的酶，特别地其中相对于朝向将β-胡萝卜素氧化为反式同种型(诸如反式视黄醛)的活性，朝向将β-胡萝卜素氧化为顺式同种型(诸如顺式视黄醛)的活性已被降低或消除。此类BCO在本文中被称为立体选择性酶，具有相对于顺式同种型，朝向产生反式同种型的偏好。

与酶促催化β-胡萝卜素从而经由所述BCO的作用导致视黄醛，即导致如本文所限定的反式同种型和顺式同种型的混合物结合使用的术语“转换”、“氧化”、“切割”在本文中可互换使用。

如本文所用，关于BCO的术语“立体选择性”、“选择性”、“反式选择性”酶在本文中可互换使用。它们是指具有增强的朝向反式同种型的催化活性，即增强的朝向将β-胡萝卜素催化成反式视黄醛的活性的酶，即如本文所公开的BCO。如果基于通过根据本发明的酶或包含/表达所述酶的此类产生胡萝卜素的宿主细胞(特别是真菌宿主细胞)产生的类视黄醇的总量，反式同种型(诸如反式视黄醛)的百分比在至少约65％的范围内，则根据本发明的酶是反式特异性的。

如本文所用，术语“真菌宿主细胞”尤其包括酵母作为宿主细胞，例如耶氏酵母属(Yarrowia)或酵母属(Saccharomyces)。

可将导致顺式同种型，特别是顺式视黄醛的产生降低或消除的如本文所限定的立体选择性酶引入合适的宿主细胞中，即表达为异源酶，或可以表达为内源酶。它们可获自任何产生类胡萝卜素的生物体，诸如产生类视黄醇的生物体，包括植物、动物、藻类、真菌或细菌，优选地真菌、藻类、植物、动物。

与已知的BCO，诸如根据SEQ ID NO:7的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)BCO相比，根据本发明的合适的立体选择性BCO显示出朝向产生反式同种型，例如在包含由β-胡萝卜素的转换生成的反式视黄醛和顺式视黄醛的视黄醛混合物中的反式视黄醛的改善的产物比值，该产物比值与使用已知的黑腹果蝇BCO序列(SEQ ID NO:7)相比，朝向反式同种型增加了至少约6％。优选地，与使用果蝇属(Drosophila)BCO产生的反式视黄醛的量相比，在包含反式视黄醛和顺式视黄醛的视黄醛混合物中反式视黄醛的量增加了至少约10％、20％、30％、40％、45％、48％、50％、55％、56％、60％、61％、62％、63、64％，或甚至增加了至少约70-100％，即导致视黄醛混合物中反式视黄醛的量在至少约65％至90％、至少约95％或98％，或甚至高达约100％的反式视黄醛的范围内。

在一个实施方式中，具有如本文所限定的BCO活性，优选地朝向形成反式视黄醛的立体选择性作用的多肽可获自真菌，特别是双核菌亚界(Dikarya)，包括但不限于选自子囊菌门(Ascomycota)或担子菌门(Basidiomycota)的真菌，具体地如本文所限定的所述多肽和/或编码所述BCO的基因源自镰刀菌属(Fusarium)或黑粉菌属(Ustilago)，优选地分离自藤仓镰刀菌(F.fujikuroi)或玉米黑粉菌(U.maydis)。

在一个优选的实施方式中，具有如本文所限定的立体选择性BCO活性，优选地β-胡萝卜素至反式视黄醛氧化活性，其中基于视黄醛的总量，与顺式视黄醛相比，反式视黄醛的量为至少约65％的多肽选自与源自EAK81726的多肽序列具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％的同一性的多肽，诸如来自玉米黑粉菌(Ustilago maydis)的BCO(UmCCO1)，例如与根据SEQ ID NO:1的多肽(包括由例如SEQ ID NO:2的多核苷酸编码的多肽)具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽。

在一个特别优选的实施方式中，产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，包含真菌BCO，诸如选自如本文所限定的黑粉菌属或镰刀菌属，所述宿主细胞以低于2的BCO基因拷贝数生长或基于低表达启动子(诸如特别是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)ENO1基因登录号XM_505509.1上游的400个碱基对)生长，从而由于对前体和/或细胞组分或其他特别有用的启动子元件(诸如HYPO、HSP、CWP、TPI ENO、ALK)具有较低的非特异性氧化活性而导致视黄醛产物的输出增加(WO2015116781)。技术人员知道如何进一步修饰相应的宿主细胞以实现如本文所限定的真菌BCO的最佳活性。

在一个优选的实施方式中，具有如本文所限定的立体选择性BCO活性，优选地β-胡萝卜素至反式视黄醛氧化活性，其中基于视黄醛的总量，与顺式视黄醛相比，反式视黄醛的量为至少约65％的多肽选自与源自AJ854252.1的多肽序列具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％的同一性的多肽，诸如来自藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)的BCO(FfCarX)，例如与根据SEQ ID NO:3的多肽(包括由例如SEQ ID NO:4的多核苷酸编码的多肽)具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽。

在另一个实施方式中，具有如本文所限定的立体选择性BCO活性，优选地朝向形成反式视黄醛的立体选择性作用的多肽可获自真核生物，特别是植物，包括但不限于被子植物(Angiosperms)，特别地如本文所限定的所述多肽和/或编码所述BCO的基因源自番红花属(Crocus)，优选地分离自番红花(C.sativus)。

在一个优选的实施方式中，具有如本文所限定的立体选择性BCO活性，优选地β-胡萝卜素至反式视黄醛氧化活性，其中基于视黄醛的总量，与顺式视黄醛相比，反式视黄醛的量为至少约65％的多肽选自与源自序列Q84K96.1的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％的同一性的多肽，诸如来自番红花(Crocus sativus)的BCO(CsZCO)，例如与根据SEQ ID NO:5的多肽(包括由例如SEQ IDNO:6的多核苷酸编码的多肽)具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽。

在另一个实施方式中，具有如本文所限定的立体选择性BCO活性，优选地朝向形成反式视黄醛的立体选择性作用的多肽可获自真核生物，特别是鱼类，包括但不限于辐鳍鱼亚纲(Actinopterygii)，特别地如本文所限定的所述多肽和/或编码所述BCO的基因源自短担尼鱼属(Danio)、真鮰属(Ictalurus)、狗鱼属(Esox)或矛尾鱼属(Latimeria)，优选地分离自斑马鱼(D.rerio)、斑点叉尾鮰(I.punctatus)、白斑狗鱼(E.lucius)或西印度洋矛尾鱼(L.chalumnae)。

在一个优选的实施方式中，具有如本文所限定的立体选择性BCO活性，优选地β-胡萝卜素至反式视黄醛氧化活性，其中基于视黄醛的总量，与顺式视黄醛相比，反式视黄醛的量为至少约65％的多肽选自与根据SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:17的多肽(包括由例如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的多核苷酸编码的多肽)具有至少50％，诸如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多肽。

视黄醛混合物中反式同种型产量的增加意味着与在使用已知的黑腹果蝇(SEQ IDNO:7)的方法中获得的反式视黄醛的量相比，基于经由β-胡萝卜素的酶促转换所产生的视黄醛的总量，反式视黄醛增加了至少约6％。这可以通过使用如本文所述的真菌、植物或鱼类的立体选择性BCO来实现。

如本文所限定的“异源表达的”是指将表达如本文所限定的BCO中的一种的基因引入产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中。用于将外来核酸分子引入细胞，诸如如本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中的技术是本领域中已知的。它们包括使用各种强度的启动子和终止子以及隔离子(isolator)来限制对重要基因表达的反式效应。此外，合成生物学的出现已经使这些技术的使用变得常规。根据本发明的宿主细胞可包含/表达如本文所公开的真菌BCO，优选地包含编码例如如本文所限定的真菌BCO(诸如从黑粉菌属或镰刀菌属分离的BCO，更优选地来自藤仓镰刀菌或玉米黑粉菌的BCO，最优选地与根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％的同一性的BCO)的多核苷酸的仅一个拷贝。或者，真菌BCO可在低表达启动子的控制下表达。

用于使如本文所限定的宿主细胞产生更多蛋白质(诸如如本文所限定的具有朝向反式视黄醛形成的选择性的立体选择性BCO)和/或基因拷贝的修饰可以包括：使用强启动子、合适的转录和/或翻译增强子，或将一个或多个基因拷贝引入产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌细胞中，导致在给定时间内相应酶的积累增加。技术人员知道根据宿主细胞使用哪些技术。基因表达的增加或减少可以通过各种方法来测量，诸如本领域已知的Northern、Southern或Western印迹技术。这些技术对于表达非真菌性BCO特别有用。

可以以不同的方式来进行在核酸或氨基酸中生成突变，即诱变，诸如通过随机诱变或定点诱变，由诸如辐射等试剂(agents)引起的物理损伤，化学处理，或插入遗传元件。技术人员知道如何引入突变。

如技术人员已知的，如本文所限定的BCO可以在适于在相应宿主细胞中表达的质粒上表达。

因此，本发明涉及如本文所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含编码如本文所述的BCO的表达载体或已整合到宿主细胞的染色体DNA中的编码如本文所述的BCO的多核苷酸。此类产生类胡萝卜素的宿主细胞被称为重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含在表达载体上或整合到染色体DNA中的编码如本文所述的BCO的异源多核苷酸。产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，可包含编码如本文所限定的BCO(诸如与根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的多肽具有至少约60％同一性，或与根据SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽具有至少约50％同一性的多肽)的基因的一个或多个拷贝，从而导致编码如本文所限定的BCO的此类基因过表达。关于如本文所限定的真菌BCO，基因拷贝为1是优选的。基因表达的增加可以通过各种方法来测量，诸如本领域已知的Northern、Southern或Western印迹技术。

基于如本文所公开的序列和对反式同种型的偏好，即立体选择性活性，能够容易地推断出编码具有如本文所限定的立体选择性BCO活性的多肽的其他合适的基因，其可用于将β-胡萝卜素转换为视黄醛，特别地基于视黄醛的总量，与顺式视黄醛相比，至少约65％的反式视黄醛。因此，本发明涉及一种鉴定新颖的立体选择性BCO的方法，其中将与根据SEQID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或至多100％的同一性，与根据SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽具有至少约50％的同一性的多肽用作具有产生反式同种型的偏好的新颖的立体选择性BCO的筛选过程中的探针。如本文所述，任何具有BCO活性的多肽都可用于从β-胡萝卜素产生视黄醛，只要立体选择性作用导致与所产生的视黄醛混合物中的顺式视黄醛的量相比有至少约65％的反式视黄醛即可。因此，要用于根据本发明的方法的合适的BCO包括这样的酶，所述酶能够由β-胡萝卜素的转换产生基于视黄醛的总量，约35％或更少的顺式同种型，诸如约35％或更少的顺式视黄醛。

本发明特别地涉及此类立体选择性BCO在生产包含反式视黄醛和顺式视黄醛的视黄醛混合物的方法中的用途，其中顺式视黄醛的产量已被降低或消除，并且其中反式视黄醛的产量已经增加，从而导致视黄醛混合物中反式视黄醛和顺式视黄醛之间的比值为至少约2。该方法可以用表达所述立体选择性BCO的合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞执行，优选地其中编码所述BCO的基因是异源表达的，即被引入到所述宿主细胞中。视黄醛，优选反式视黄醛，可以通过(已知的)合适机制的作用而被进一步转换为维生素A。

因此，本发明涉及一种降低视黄醛混合物中顺式视黄醛的百分比或增加视黄醛混合物中反式视黄醛的百分比的方法，其中所述视黄醛是经由使如本文所限定的BCO中的一种与β-胡萝卜素接触而生成的，从而导致了百分比为至少约65％至98％的反式视黄醛或约35％或更少的顺式视黄醛的视黄醛混合物。具体地，所述方法包括(a)将编码如本文所限定的立体选择性BCO中的一种的核酸分子引入如本文所限定的合适的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中，(b)经由所述表达的立体选择性BCO的作用将β-胡萝卜素酶促切割成顺式/反式视黄醛混合物，其中基于视黄醛的总量，所述混合物中反式视黄醛的百分比为至少65％，以及任选地(3)在技术人员已知的合适条件下将视黄醛，优选地反式视黄醛转换为维生素A。

如本文所用，使朝向将β-胡萝卜素转换为顺式同种型(例如，顺式视黄醛)的活性降低或消除，即提高朝向将β-胡萝卜素转换为反式同种型(例如，反式视黄醛)的产物比，意指反式与顺式(例如反式视黄醛与顺式视黄醛)之间的产物比为至少约2:1，诸如至少约3:1，特别地4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、9.2:1、9.5:1、9.8:1或甚至至多10:1，所述产物比是用如本文所限定的立体特异性BCO实现的。

视黄醛混合物中顺式同种型的产量降低或消除是指基于经由β-胡萝卜素的酶促转换产生的视黄醛的总量，将顺式视黄醛的量限制为约35％或更少。这可以通过使用如本文所述的立体选择性BCO来实现。

如本文所用，关于反式同种型的产生，特别是关于使用如本文所限定的BCO由β-胡萝卜素的转换产生反式视黄醛的术语“至少约65％”是指所产生的视黄醛中的至少约65％，诸如68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％是反式视黄醛的形式。关于顺式同种型的产生，特别是关于使用如本文所限定的立体选择性BCO由β-胡萝卜素的转换产生顺式视黄醛的术语“约35％或更少”是指所产生的视黄醛中的约35％或更少，诸如30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％或直至0％是顺式视黄醛的形式。

术语“序列同一性”、“％同一性”或“序列同源性”在本文中可互换使用。出于本发明的目的，在此限定，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同源性或序列同一性的百分比，对序列进行比对以实现最佳比较目的。为了优化两个序列之间的比对，可以在进行比较的两个序列中的任一序列中引入空位。此类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，可以在较短的长度上进行比对，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核苷酸/碱基或氨基酸上进行比对。序列同一性是两个序列之间在所报告的比对区域上相同匹配的百分比。可以使用用于两个序列的比对的Needleman和Wunsch算法来确定两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列都可以通过算法来进行比对。已在计算机程序NEEDLE中实现了Needleman-Wunsch算法。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite(2000)Rice,Longden和Bleasby,Trends in Genetics 16,(6)，第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62来用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。所使用的任选参数是为10的空位开放罚分和为0.5的空位延伸罚分。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。

如上所述通过程序NEEDLE进行比对后，查询序列与本发明序列之间的序列同一性百分比计算如下：在两个序列中显示相同氨基酸或相同核苷酸的比对中对应位置的数目除以减去比对中的空位总数后的比对总长度。如本文所限定的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。如果所比较的两个氨基酸序列在他们的任何氨基酸上都没有差异，则它们是相同的或具有100％的同一性。关于本文所限定的源自植物的酶，技术人员知道事实上植物来源的酶可包含叶绿体靶向信号，所述叶绿体靶向信号将经由特定的酶(例如叶绿体加工酶(chloroplast processing enzyme,CPE))被切割。

取决于宿主细胞，如本文所限定的多核苷酸，诸如编码根据SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽的多核苷酸，可经优化以在相应宿主细胞中表达。技术人员知道如何生成此类经修饰的多核苷酸。应当理解的是，如本文所限定的多核苷酸还包括此类经宿主优化的核酸分子，只要它们仍表达具有如本文所限定的相应活性的多肽即可。

因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含编码如本文所限定的BCO的多核苷酸，所述多核苷酸经优化以在所述宿主细胞中表达，而不影响宿主细胞的生长或酶的表达模式。特别地，产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，选自耶氏酵母属，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)，其中编码如本文所限定的BCO的多核苷酸选自与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6具有至少60％，诸如65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性，或与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:18具有至少约50％，诸如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的多核苷酸。

如本文所限定的BCO还包括带有不改变酶活性的一种或多种氨基酸取代的酶，即所述酶相对于野生型酶显示出相同的性质并且催化β-胡萝卜素转换为视黄醛，特别地转换为反式视黄醛的量是至少约65％。此类突变也称为“沉默突变”，其不改变如本文所述的酶的(酶促)活性。

根据本发明的核酸分子可仅包含由本发明提供的核酸序列(诸如如本文所公开的序列)的部分或片段，例如可用作探针或引物的片段或编码如本文所限定的BCO的部分的片段。由BCO基因的克隆确定的核苷酸序列允许生成被设计用于鉴定和/或克隆来自其他物种的其他同源物的探针和引物。探针/引物通常包含基本上纯化的寡核苷酸，所述基本上纯化的寡核苷酸通常包含优选在高度严格条件下与本文所公开的序列中所示的核苷酸序列的至少约12个或15个，优选约18个或20个，更优选约22个或25个，甚至更优选约30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个或75个或更多个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域，或其片段或衍生物。

此类杂交条件的优选的非限制性示例是在约45℃下于6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50℃下，优选在55℃下，更优选在60℃下，甚至更优选在65℃下在1x SSC，0.1％SDS中进行一次或多次洗涤。

高度严格条件包括例如在42℃下使用洋地黄毒苷(DIG)标记的DNA探针(通过使用DIG标记系统；Roche Diagnostics GmbH,68298Mannheim,德国制备)在含有或不含有100μg/ml鲑鱼精DNA的溶液(诸如DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH))，或包含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02％十二烷基硫酸钠、0.1％的N-月桂酰肌氨酸和2％的封闭剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中孵育2h至4天，然后在室温下在2xSSC和0.1％SDS中将滤器(filters)洗涤两次(持续5至15分钟)，以及然后在65-68℃下在0.5x SSC和0.1％SDS或0.1x SSC和0.1％SDS中洗涤两次(持续15-30分钟)。

编码如本文所限定的立体选择性BCO中的一种的多核苷酸/酶的表达可以在任何宿主系统中实现，所述宿主系统包括适于类胡萝卜素/类视黄醇产生并且允许表达编码如本文所公开的酶(包括如本文所述的功能等同物或衍生物)中的一种的核酸的任何(微)生物。合适的产生类胡萝卜素/类视黄醇的宿主(微)生物的示例是细菌、藻类、真菌(包括酵母)、植物或动物细胞。优选的细菌是以下属的细菌：埃希氏菌属(Escherichia)，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)；链霉菌属(Streptomyces)；泛菌属(Pantoea)(欧文氏菌属(Erwinia))；芽孢杆菌属(Bacillus)；黄杆菌属(Flavobacterium)；聚球藻属(Synechococcus)；乳杆菌属(Lactobacillus)；棒状杆菌属(Corynebacterium)；微球菌属(Micrococcus)；Mixococcus；短杆菌属(Brevibacterium)；慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)；戈登氏菌属(Gordonia)；迪茨氏菌属(Dietzia)；鼠尾菌属(Muricauda)；鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)；集胞藻属(Synochocystis)；副球菌属(Paracoccus)，诸如产玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)。优选的真核微生物，特别是真菌(包括酵母)，选自酵母属(Saccharomyces)，诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；曲霉属(Aspergillus)，诸如黑曲霉(Aspergillus niger)；毕赤酵母属(Pichia)，诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；汉逊酵母属(Hansenula)，诸如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；须霉属(Phycomyces)，诸如布氏须霉(Phycomycesblakesleanus)；毛霉属(Mucor)；红酵母属(Rhodotorula)；掷孢酵母属(Sporobolomyces)；法夫酵母属(Xanthophyllomyces)；发夫酵母属(Phaffia)；布拉霉属(Blakeslea)，诸如三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)；或耶氏酵母属(Yarrowia)，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。特别地，优选的是在真菌宿主细胞，诸如耶氏酵母属或酵母属中表达，或在埃希氏菌属中表达，更优选地在解脂耶氏酵母或酿酒酵母中表达。

关于本发明，应当理解的是，生物(诸如微生物、真菌、藻类或植物)也包括具有相同生理性质的此类物种的同义词或基名(basonyms)，如由国际原核生物命名法(International Code of Nomenclature of Prokaryotes)或关于藻类、真菌和植物的国际命名法(International Code of Nomenclature)(Melbourne法)所限定的。

如本文所用，产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，是这样的宿主细胞，其中相应的多肽在体内表达并具有活性，从而导致产生类胡萝卜素，例如β-胡萝卜素。用于生成产生类胡萝卜素的宿主细胞的基因和方法是本领域已知的，参见例如WO2006102342。取决于要产生的类胡萝卜素，可以涉及不同的基因。

如本文所用，产生类视黄醇的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，是这样的宿主细胞，其中相应的多肽在体内表达并具有活性，从而导致经由β-胡萝卜素的酶促转换产生类视黄醇，例如维生素A及其前体。这些多肽包括如本文所限定的BCO。维生素A途径的基因和生成产生类视黄醇的宿主细胞的方法是本领域已知的。优选地，β-胡萝卜素经由如本文所限定的BCO的作用被转换为视黄醛，所述视黄醛经由具有视黄醇脱氢酶活性的酶的作用被进一步转换为视黄醇，并且所述视黄醇经由乙酰转移酶(诸如ATF1)的作用被转换为视黄醇乙酸酯(retinol acetate)。视黄醇乙酸酯可以是从宿主细胞中分离出来的选定的类视黄醇。

本发明涉及一种通过如本文所述的BCO的作用经由β-胡萝卜素的酶促转换来产生视黄醛，特别是视黄醛的反式同种型，其中反式视黄醛的量为至少65％的方法，其中BCO优选地在如本文所述的合适条件下在合适的宿主细胞中异源表达。可以从培养基和/或宿主细胞中分离产生的视黄醛，特别是反式视黄醛，并任选地进一步纯化。在另一个实施方式中，视黄醛，特别是反式视黄醛可以在产生维生素A的多步方法中用作前体。如本领域中已知的，可以从培养基和/或宿主细胞中分离维生素A，并任选地进一步纯化。

宿主细胞，即微生物、藻类、真菌、动物或植物细胞，能够表达产生β-胡萝卜素的基因、如本文所限定的BCO基因和/或任选地生物合成维生素A所需的其他基因，所述宿主细胞可以如技术人员关于不同宿主细胞所已知的那样在需氧或厌氧条件下在补充有适当营养物的水性培养基中培养。任选地，如本文所限定，所述培养是在参与电子转移的蛋白质和/或辅因子存在下进行的。宿主细胞的培养/生长可以以分批、补料分批、半连续或连续模式进行。如本领域技术人员所已知的，取决于宿主细胞，优选地类视黄醇(诸如维生素A)和前体(诸如视黄醛)的产生可变化。选自耶氏酵母属的产生β-胡萝卜素和类视黄醇的宿主细胞的培养和分离描述于例如WO2008042338中。关于在选自大肠杆菌的宿主细胞中的类视黄醇产生，方法描述于例如Jang等人，Microbial Cell Factories,10:95(2011)中。在例如WO2014096992中公开了在酵母宿主细胞(诸如酿酒酵母)中生产β-胡萝卜素和类视黄醇的具体方法。

如本文所用，关于酶的术语“比活性”或“活性”是指其催化活性，即其催化从给定底物形成产物的能力。比活性定义了在给定时间段内和在限定温度下每限定量的蛋白质消耗的底物和/或产生的产物的量。通常，比活性表示为每mg蛋白质每分钟消耗的底物或形成的产物的μmol数。通常，μmol/min缩写为U(＝单位)。因此，在本文件全文中可互换地使用μmol/min/(mg蛋白质)或U/(mg蛋白质)的比活性单位定义。如果酶在体内，即在如本文所限定的宿主细胞内，或在合适的底物存在下的系统内，执行其催化活性，则所述酶是有活性的。技术人员知道如何测量酶活性，特别是如本文所限定的BCO的活性。评估如本文所限定的合适BCO用于由β-胡萝卜素转换进行反式视黄醛产生的能力的分析方法是本领域已知的，诸如在WO2014096992的实施例4中所述。简而言之，产物(诸如反式视黄醛、顺式视黄醛、β-胡萝卜素等)的滴度可通过HPLC测量。

如本文所用的类视黄醇包括β-胡萝卜素切割产物，也称为脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoids)，包括但不限于视黄醛、视黄酸、视黄醇、视黄酸甲醇盐(retinoicmethoxide)、视黄醇乙酸酯(retinyl acetate)、视黄酯(retinyl ester)、4-酮-类视黄醇、3羟基-类视黄醇，或它们的组合。类视黄醇的生物合成描述于例如WO2008042338中。

如本文所用的视黄醛是以IUPAC名称(2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯醛已知的。视黄醛在本文中可互换地称为维生素A醛，并且包括顺式同种型和反式同种型两者，诸如11-顺式视黄醛、13-顺式视黄醛、反式视黄醛和全反式视黄醛。顺式视黄醛和反式视黄醛的混合物在本文中被称为“视黄醛混合物”，其中关于反式视黄醛的百分比“至少约65％”或关于顺式视黄醛的百分比“约35％或更少”是指此类视黄醛混合物中的反式视黄醛与顺式视黄醛的比值。

如本文所用的术语“类胡萝卜素”是本领域公知的。它包括通过两个具有20个碳的香叶基香叶基焦磷酸酯分子的连接而自然形成的长的40个碳缀合的类异戊二烯多烯。这些类胡萝卜素包括但不限于八氢番茄红素、番茄红素和胡萝卜素，诸如β-胡萝卜素，所述类胡萝卜素可以在4-酮位置或3-羟基位置上被氧化以产生角黄素、玉米黄质或虾青素。类胡萝卜素的生物合成描述于例如WO2006102342中。

如本文所用的维生素A可以是水溶液中存在的维生素A的任何化学形式，诸如未解离的，其游离酸形式，或解离为阴离子。如本文所用的该术语包括生物技术维生素A途径中的所有前体或中间体。它还包含维生素A乙酸酯。

特别地，本发明的特征在于以下实施方式：

-一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含立体选择性β-胡萝卜素氧化酶(BCO)，所述宿主细胞产生包含顺式视黄醛和反式视黄醛的视黄醛混合物，其中由所述宿主细胞产生的所述混合物中反式视黄醛的百分比是至少约65％，优选68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中基于由所述宿主细胞产生的视黄醛的总量，在包含反式视黄醛和顺式视黄醛的视黄醛混合物中反式视黄醛的百分比在约至少65％至98％，优选地约至少65％至95％，更优选地至少约65％至90％的范围内。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含异源的立体选择性BCO。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物、真菌、藻类或微生物，优选地选自真菌，包括酵母，更优选地选自酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、须霉属(Phycomyces)、毛霉属(Mucor)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)、发夫酵母属(Phaffia)、布拉霉属(Blakeslea)或耶氏酵母属(Yarrowia)，甚至更优选地选自解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物、真菌、藻类或微生物，优选地选自埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、聚球藻属(Synechococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、Mixococcus、短杆菌属(Brevibacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、鼠尾菌属(Muricauda)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、集胞藻属(Synochocystis)或副球菌属(Paracoccus)。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中BCO选自真菌、植物或鱼类，优选地选自镰刀菌属、黑粉菌属、番红花属、短担尼鱼属或真鮰属，更优选地选自藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、番红花(Crocus sativus)、斑马鱼(Danio rerio)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、白斑狗鱼(Esox lucius)、矛尾鱼(Latimeria chalumnae)，最优选地选自与根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的多肽具有至少约60％同一性，或与根据SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽具有至少约50％的同一性的多肽。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，其中所述反式视黄醛被进一步转换为维生素A。

-一种经由如本文所限定的立体选择性BCO的酶促活性生产包含反式视黄醛和顺式视黄醛的视黄醛混合物的方法，所述方法包括使β-胡萝卜素与所述BCO接触，其中所述视黄醛混合物中反式视黄醛与顺式视黄醛的比值为至少约2:1。

-一种减少由β-胡萝卜素的酶促切割产生的顺式视黄醛的量的方法，所述方法包括使β-胡萝卜素与如本文所限定的立体选择性BCO接触，其中基于视黄醛的总量，由β-胡萝卜素的切割导致的所述视黄醛混合物中的顺式视黄醛的量在约35％或更少的范围内。

-一种增加由β-胡萝卜素的酶促切割产生的反式视黄醛的量的方法，所述方法包括使β-胡萝卜素与如本文所限定的立体选择性BCO接触，其中基于视黄醛的总量，在所述视黄醛混合物中反式视黄醛的量在至少约65％至98％的范围内。

-如上文和本文所限定的方法，所述方法使用如本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含立体选择性β-胡萝卜素氧化酶(BCO)，所述宿主细胞产生包含顺式视黄醛和反式视黄醛的视黄醛混合物，其中基于由所述宿主细胞产生的视黄醛的总量，反式视黄醛的百分比是至少约65％，优选68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％。

-一种生产维生素A的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将编码如本文所限定的立体选择性BCO的核酸分子引入合适的产生胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中；

(b)将β-胡萝卜素酶促转换为如本文所限定的包含顺式视黄醛和反式视黄醛的视黄醛混合物，其中基于视黄醛的总量，反式视黄醛的百分比为至少约65％，

(c)在合适的培养条件下将反式视黄醛转换为维生素A。

-如上文和本文所限定的产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞用于产生包含比值为2:1的反式视黄醛和顺式视黄醛的视黄醛混合物的用途，其中所述宿主细胞表达具有朝向产生反式同种型的立体选择性的异源BCO。

以下实施例仅是说明性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。在本申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容通过引用并入本文，特别是WO2006102342、WO2008042338或WO2014096992。

实施例

实施例1：通用方法、菌株和质粒

本文所述的所有基本分子生物学和DNA操纵程序通常是根据Sambrook等人(编著)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress:New York(1989)或Ausubel等人(编著)Current Protocols in MolecularBiology.Wiley:New York(1998)执行的。

摇板试验。通常，向800μl的0.075％酵母提取物、0.25％的蛋白胨(0.25X YP)接种10μl新近生长的耶氏酵母属，并覆盖200μl的Drakeol5矿物油碳源，5％的矿物油中的玉米油和/或5％的水相中的葡萄糖。使转化体在24孔板(Multitron，30℃，800RPM)中在含有20％十二烷的YPD培养基中生长4天。将矿物油级分从摇板孔中移出，并使用光电二极管阵列检测器在正相柱上通过HPLC进行分析。

DNA转化。通过在YPD板培养基上过夜生长来转化菌株，从板上刮下50μl细胞，然后通过在含有1μg转化DNA(通常是用于整合转化的线性DNA)、40％PEG 3550MW、100mM乙酸锂、50mM二硫苏糖醇、5mM Tris-Cl pH 8.0、0.5mM EDTA的500μl中在40℃下孵育60分钟来转化，随后直接铺板到选择性培养基上，或者在显性抗生素标记物选择的情况下，使细胞在30℃下在YPD液体培养基上生长4小时，然后再铺板到选择性培养基上。

DNA分子生物学。在pUC57载体中以NheI和MluI末端合成基因。通常，将基因亚克隆到MB5082‘URA3’、MB6157 HygR和MB8327 NatR载体中，以用于解脂耶氏酵母转化中的标记物选择，如在WO2016172282中所述。为了通过基因和标记物HindIII/XbaI(MB5082)或PvuII(MB6157和MB8327)的随机非同源末端连接来进行干净的基因插入，分别通过凝胶电泳和Qiagen凝胶纯化柱进行纯化。

质粒列表。表1、表2和序列表中列出了要使用的质粒、菌株和密码子优化的序列。将核苷酸序列ID NO:2、ID NO:4、ID NO:6、ID NO:8、ID NO:10、ID NO:12、ID NO:14、ID NO:16、ID NO:18进行密码子优化以在耶氏酵母属中表达。

表1：用于构建携带异源BCO基因的菌株的质粒列表。序列ID NO是指插入物。有关更多详细信息，请参见文本。

表2：携带异源BCO基因的用于产生类视黄醇的耶氏酵母属菌株的列表。有关更多详细信息，请参见文本。

正相视黄醇方法。使用附接到Waters 717自动进样器的Waters 1525二元泵来注入样品。使用配有安全硅胶保护柱套件的150×4.6mm的Phenomenex Luna 3μSilica(2)来解析(resolve)类视黄醇。对于虾青素相关化合物，流动相由1000mL己烷、30mL异丙醇和0.1mL乙酸组成；或者对于玉米黄质相关化合物，流动相由1000mL己烷、60mL异丙醇和0.1mL乙酸组成。所述流动相的流速各自为每分钟0.6mL。柱温是环境温度。注入体积是20μL。检测器是从210nm至600nm进行收集的光电二极管阵列检测器。根据表3检测分析物。

表3：使用正相视黄醇方法的分析物列表。所有添加的中间体的加总给出了类视黄醇的总量。有关更多详细信息，请参见文本。

样品制备。根据条件，通过各种方法制备样品。对于全培养液或经洗涤的培养液样品，将培养液置于经称重的

管中，并加入流动相，根据制造商的用法说明书在

匀浆器(Bertin Corp,Rockville,MD,USA)中在最高设置3X下处理样品。在经洗涤的培养液中，将样品在微量离心机中的1.7ml管中以10000rpm旋转1分钟，将培养液倾析出，加入1ml水，混合，沉淀，然后倾析出，并定容至初始体积，将混合物再次沉淀，并用适量的流动相定容，并通过

珠磨进行处理。为了分析矿物油级分，将样品以4000RPM旋转10分钟，并通过正排量移液器(Eppendorf,Hauppauge,NY,USA)将油从顶部移出，在流动相中稀释，通过涡旋混合，并通过HPLC分析测量类视黄醇浓度。

发酵条件。发酵与前述条件相同，使用矿物油覆盖和搅拌罐，将玉米油加入总体积为0.5L至5L的台式反应器中(见WO2016172282)。通常，在补料分批搅拌罐反应器中观察到了相同的结果，具有提高的生产率，证明了该系统用于生产类视黄醇的效用。

实施例2：在解脂耶氏酵母中产生反式视黄醛

通常，用纯化的线性DNA片段转化β胡萝卜素菌株ML17544，所述纯化的线性DNA片段是通过对包含与URA3营养标记物连接的经密码子优化的片段的β胡萝卜素氧化酶(BCO)进行HindII和XbaI介导的限制性内切核酸酶切割而得到的。转化DNA来源于MB6702果蝇属NinaB BCO基因、MB6703番红花属BCO基因、MB8456镰刀菌属BCO基因、MB8457黑粉菌属BCO基因和MB6098短担尼鱼属BCO基因，由此使用经密码子优化的序列(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12)。然后使基因生长，在摇板分析中筛选6-8个分离株，将表现良好的分离株在补料分批搅拌罐反应中运行8-10天。如WO2014096992中所述使用标准参数通过HPLC检测顺式视黄醛和反式视黄醛，但使用用于类视黄醇分析物的纯化标准品进行校准。视黄醛混合物中的反式视黄醛的量可以分别增加到90％(使用番红花属BCO)、95％(使用镰刀菌属BCO)、98％(使用黑粉菌属BCO)和98％(使用短担尼鱼属BCO)。相比之下，基于视黄醛总量，来自黑腹果蝇的BCO(SEQ ID NO:7)导致了仅61％的反式视黄醛(参见表4)。

表4：通过异源BCO的作用增强的耶氏酵母属中的视黄醛产生。“％反式”是指类视黄醇混合物中反式视黄醛的百分比。有关更多详细信息，请参见文本。

实施例3：在酿酒酵母中产生反式视黄醛

通常，根据本领域已知的标准方法(诸如，如在US20160130628或WO2009126890中所述)，用编码酶(诸如香叶基香叶基合酶、八氢番茄红素合酶、番茄红素合酶、番茄红素环化酶)的异源基因转化β-胡萝卜素菌株，所述β-胡萝卜素菌株被构建用于产生β-胡萝卜素。此外，当用如本文所述的β-胡萝卜素氧化酶基因转化时，能够产生视黄醛。任选地，当用视黄醇脱氢酶转化时，则能够产生视黄醇。视黄醇可以任选地通过用编码醇乙酰基转移酶的基因转化而被乙酰化。任选地，可使内源性视黄醇乙酰化基因缺失。此外，任选地可以选择酶以产生并乙酰化视黄醇的反式形式，以分别产生全反式视黄醇乙酸酯和长链的反式视黄醇的酯。用这种方法，获得了与以解脂耶氏酵母为宿主相似的关于如本文所述的反式视黄醛特异性的结果。

实施例4：使用真菌BCO优化反式视黄醛生产

通常，将黑粉菌属BCO针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，并使用MluI/NheI亚克隆到下表5中的载体中，并检查活性。然后将这些质粒转化到产生胡萝卜素的菌株MB17544、产生番茄红素的菌株MB14925(erg9::ura3 carB HMG-tm GGS carRP(E78G)alk1D alk2D)和产生八氢番茄红素的菌株MB7206(erg9::ura3bart carB HMG GGS ura3 ade1)中(参见表5)。令人惊讶地，存在最佳活性，并且我们能够证明来自活性较低的启动子ALK1和ACT1的视黄醇的产量得到了提高。我们还观察到番茄红素菌株和八氢番茄红素菌株中前体的衰减减少。

表5：用于构建菌株的质粒列表。有关更多详细信息，请参见文本。

MB质粒	基因	描述
			6222	ENO	烯醇酶
6224	CWP	细胞壁蛋白
			6226	TPI	磷酸丙糖异构酶
6228	GAPDH	甘油磷酸脱氢酶
			6230	ACT	肌动蛋白
7311	ALK	烷烃同化
			6655	HYPO	假定的
6674	HSP	热休克蛋白

序列表

<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120> 反式视黄醛的生产

<130> 32582-WO-PCT

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 787

<212> PRT

<213> 玉米黑粉菌（Ustilago maydis）

<400> 1

Met Val Lys Gly Ser Ser Asn Arg Arg Gln His Ser Ala Ser Leu Gln

1 5 10 15

Gly Leu Pro Ser Ser Gln His Cys Ala Pro Val Ile Ser Ile Pro Ser

20 25 30

Pro Pro Pro Pro Ala Glu Asp His Ala Tyr Pro Pro Ser Ser Phe Thr

35 40 45

Ile Pro Leu Ser Lys Asp Glu Glu Leu Ala Glu Ala Gly Pro Ser Arg

50 55 60

Pro Gly Ser Ser Ala Ile Ser Arg Arg Pro Val Leu Ser Arg Arg Arg

65 70 75 80

Thr Ser Lys Lys Glu Tyr Val His Pro Tyr Leu Ser Gly Asn Phe Ala

85 90 95

Pro Val Thr Thr Glu Cys Pro Leu Thr Asp Cys Leu Phe Glu Gly Thr

100 105 110

Ile Pro Glu Glu Phe Ala Gly Ser Gln Tyr Val Arg Asn Gly Gly Asn

115 120 125

Pro Leu Ala Asn Ser Glu Arg Asp Arg Asp Ala His Trp Phe Asp Ala

130 135 140

Asp Gly Met Leu Ala Gly Val Leu Phe Arg Arg Thr Pro Lys Gly Thr

145 150 155 160

Ile Gln Pro Cys Phe Leu Asn Arg Phe Ile Leu Thr Asp Leu Leu Leu

165 170 175

Ser Thr Pro Glu His Ser Arg Leu Pro Tyr Val Pro Ser Ile Ala Thr

180 185 190

Leu Val Asn Pro His Thr Ser Val Phe Trp Leu Leu Cys Glu Ile Ile

195 200 205

Arg Thr Phe Val Leu Ala Met Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly Leu

210 215 220

Gly Gly Asn Gln Lys Leu Lys Arg Ile Ser Val Ala Asn Thr Ser Val

225 230 235 240

Phe Trp His Asp Gly Lys Ala Met Ala Gly Cys Glu Ser Gly Pro Pro

245 250 255

Met Arg Ile Met Leu Pro Gly Leu Glu Thr Ala Gly Trp Tyr Thr Gly

260 265 270

Glu Glu Asp Lys Glu Lys Glu Thr Cys Asp Lys Asn Ser Gly Asn Ser

275 280 285

Leu Thr Ser Ser Ser Ser Lys Gly Phe Gly Gly Gly Pro Pro Ile Val

290 295 300

Ser Met Leu Arg Glu Phe Thr Thr Ala His Pro Lys Ile Asp Pro Arg

305 310 315 320

Thr Gln Glu Leu Leu Leu Tyr His Met Cys Phe Glu Pro Pro Tyr Leu

325 330 335

Arg Ile Ser Val Ile Pro Ala Ser Gln Ser Lys Lys Thr Asp Leu Pro

340 345 350

Ala His Ala Lys Thr Ile Lys Gly Lys Ala Val Arg Gly Leu Lys Gln

355 360 365

Pro Lys Met Met His Asp Phe Gly Ala Thr Ala Thr Gln Thr Val Ile

370 375 380

Ile Asp Val Pro Leu Ser Leu Asp Met Met Asn Leu Val Arg Gly Lys

385 390 395 400

Pro Ile Leu His Tyr Asp Pro Ser Gln Pro Thr Arg Phe Gly Ile Leu

405 410 415

Pro Arg Tyr Glu Pro Glu Arg Val Arg Trp Tyr Glu Ser Ala Glu Ala

420 425 430

Cys Cys Ile Tyr His Thr Ala Asn Ser Trp Asp Asp Asp Gly Lys Phe

435 440 445

Asp Ala Ser His Glu His Ala Thr Arg Ser Ala Ile Arg Gly Val Asn

450 455 460

Met Leu Gly Cys Arg Leu Asn Ser Ala Thr Leu Val Tyr Ser Ala Gly

465 470 475 480

Asn Leu Leu Pro Pro Ser His Val Leu Pro Pro Pro Asn Cys Pro Glu

485 490 495

Lys Cys Gln Leu Tyr Tyr Trp Arg Phe Asp Leu Glu His Ala Glu Thr

500 505 510

Asn Thr Ile Ser His Glu Phe Ala Leu Ser Asp Ile Pro Phe Glu Phe

515 520 525

Pro Thr Ile Asn Glu Asp Tyr Ser Met Gln Gln Ala Cys Tyr Val Tyr

530 535 540

Gly Thr Ser Met Arg Asp Gly Thr Phe Asp Ala Gly Leu Gly Lys Ala

545 550 555 560

Ala Lys Ile Asp Ala Leu Val Lys Leu Asp Ala Gln Ala Leu Ile Arg

565 570 575

Lys Gly Lys Ala Met Trp Ser Gln Gly Arg Leu Lys Ala Gly Asp Ser

580 585 590

Val Asp Thr Arg Thr Val Glu Glu Val Leu Thr Ala Gln Arg Asp Gly

595 600 605

Ser Ala Ser Pro Glu Asp Pro Ile Lys Ile Phe Glu Met Pro Arg Gly

610 615 620

Trp Tyr Ala Gln Glu Thr Thr Phe Val Pro Arg Arg Ser Ser Thr Asn

625 630 635 640

Glu Thr Ser Gln Glu Asp Asp Gly Trp Leu Val Cys Tyr Val Phe Asp

645 650 655

Glu Ala Thr Gly Leu His Pro Ser Thr Gly Glu Val Leu Pro Gly Ala

660 665 670

Ser Ser Glu Leu Trp Ile Ile Asp Ala Lys Leu Met Ser Arg Val Val

675 680 685

Cys Arg Ile Lys Leu Pro Gln Arg Val Pro Tyr Gly Leu His Gly Thr

690 695 700

Leu Phe Thr Glu Glu Gln Ile Ala Ser Gln Lys Pro Ile Asp Pro Ser

705 710 715 720

Gln Val Arg Ser Trp Ala Leu Ser Ile Asn Leu Ala Asp Pro Phe Ser

725 730 735

Ser Ser Ala Leu Gly Ser Thr Val Tyr Ser Ala Ala Gly Lys Ala Ala

740 745 750

Thr Ser Lys Phe Lys Asn Arg Glu Glu Thr Tyr Ala Ala Phe Ile Lys

755 760 765

Asp Pro Ile Arg Ile Gly Ala Trp Trp Val Lys Arg Asn Ile Glu Leu

770 775 780

Leu Ile Ala

785

<210> 2

<211> 2364

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 耶氏酵母属密码子优化的UmCCO1

<400> 2

atggttaagg gctcctctaa ccgacgacag cactccgctt cccttcaggg actcccttct 60

tctcagcact gtgcccccgt tatctctatt ccttctcccc ctccccctgc tgaggatcac 120

gcttaccccc cttcctcttt cactattcct ctctccaagg atgaggagct tgctgaggcc 180

ggaccctctc gacccggttc ctctgctatt tctcgacgac ctgttctgtc tcgacgacga 240

acttctaaga aggagtacgt tcacccctac ctctccggca actttgcccc tgttaccact 300

gagtgccctc tcaccgattg tctctttgag ggtactatcc ctgaggagtt tgctggctcc 360

cagtacgtcc gaaacggcgg aaaccccctt gccaactccg agcgagatcg agatgcccac 420

tggttcgatg ctgacggtat gctggctgga gttctctttc gacgaacccc caagggcacc 480

attcagcctt gtttcctcaa ccgattcatt ctcaccgacc tcctgctctc tacccctgag 540

cactctcgac tcccttacgt cccttccatc gctactctcg tcaaccccca cacttccgtc 600

ttttggctcc tttgtgagat catccgaact ttcgttctgg ctatgcttac ctggctccct 660

ggcctcggac tcggtggcaa ccagaagctc aagcgaatct ctgttgctaa cacctccgtt 720

ttctggcacg acggaaaggc tatggctgga tgtgagtctg gaccccctat gcgaatcatg 780

ctccctggtc ttgagactgc cggctggtac actggtgagg aggataagga gaaggagact 840

tgtgataaga actctggcaa ctctctcact tcttcctctt ctaagggttt tggcggaggc 900

cctcccattg tctccatgct tcgagagttt accactgctc accccaagat tgaccctcga 960

acccaggagc tccttctcta ccacatgtgc ttcgagcccc cttaccttcg aatctctgtc 1020

atccctgctt ctcagtctaa gaagactgac ctccctgctc acgctaagac cattaagggt 1080

aaggctgtgc gaggtcttaa gcagcccaag atgatgcacg atttcggcgc taccgccact 1140

cagaccgtca tcatcgacgt ccctctctcc ctcgacatga tgaacctcgt ccgaggcaag 1200

cccattctgc actacgatcc ctctcagcct acccgattcg gtattcttcc ccgatacgag 1260

cctgagcgag tgcgatggta cgagtctgcc gaggcttgct gtatctacca caccgccaac 1320

tcttgggatg acgatggcaa gtttgacgct tctcacgagc acgctacccg atccgccatc 1380

cgaggcgtca acatgctcgg ctgccgactc aactctgcca ccctcgtgta ctctgctgga 1440

aaccttctcc ctccctctca cgtccttccc cctcccaact gccctgagaa gtgtcagctc 1500

tactactggc gattcgacct tgagcacgct gagactaaca ccatttccca cgagtttgct 1560

ctgtccgaca ttcctttcga gttccccacc atcaacgagg actactctat gcagcaggct 1620

tgttacgttt acggtacttc catgcgagat ggcacctttg acgctggact cggaaaggct 1680

gctaagattg acgcccttgt taagctggac gctcaggccc ttattcgaaa gggcaaggcc 1740

atgtggtccc agggacgact taaggctgga gactctgtgg acacccgaac cgttgaggag 1800

gttctcactg ctcagcgaga tggttctgcc tcccctgagg accctatcaa gattttcgag 1860

atgccccgag gatggtacgc tcaggagact accttcgtcc ctcgacgatc ctctactaac 1920

gagacttctc aggaggatga cggttggctc gtctgctacg tgttcgatga ggccactggc 1980

cttcaccctt ccaccggaga ggttctccct ggcgcttcct ccgagctgtg gatcattgat 2040

gccaagctca tgtcccgagt cgtttgccga atcaagctcc cccagcgagt cccttacgga 2100

ctccacggca ctctctttac cgaggagcag attgcctctc agaagcctat cgacccttct 2160

caggtccgat cctgggctct gtctatcaac cttgccgatc ccttctcctc ttccgccctt 2220

ggctctaccg tgtactccgc cgctggtaag gctgccacct ccaagtttaa gaaccgagag 2280

gagacttacg ctgccttcat caaggaccct atccgaatcg gcgcttggtg ggtcaagcga 2340

aacatcgagc tcctgattgc ttaa 2364

<210> 3

<211> 696

<212> PRT

<213> 藤仓镰刀菌（Fusarium fujikuroi）

<400> 3

Met Lys Phe Leu Gln Gln Asn Ser Phe Thr Gln Thr Ser Met Ser Gln

1 5 10 15

Pro His Glu Asp Val Ser Pro Ala Ile Arg His Pro Tyr Leu Thr Gly

20 25 30

Asn Phe Ala Pro Ile His Lys Thr Thr Asn Leu Thr Pro Cys Thr Tyr

35 40 45

Ser Gly Cys Ile Pro Pro Glu Leu Thr Gly Gly Gln Tyr Val Arg Asn

50 55 60

Gly Gly Asn Pro Val Ser His Gln Asp Leu Gly Lys Asp Ala His Trp

65 70 75 80

Phe Asp Gly Asp Gly Met Leu Ser Gly Val Ala Phe Arg Lys Ala Ser

85 90 95

Ile Asp Gly Lys Thr Ile Pro Glu Phe Val Asn Gln Tyr Ile Leu Thr

100 105 110

Asp Leu Tyr Leu Ser Arg Lys Thr Thr Ser Ile Ala Ser Pro Ile Met

115 120 125

Pro Ser Ile Thr Thr Leu Val Asn Pro Leu Ser Thr Met Phe Gln Ile

130 135 140

Met Phe Ala Thr Phe Arg Thr Ile Phe Leu Val Ile Leu Ser Asn Leu

145 150 155 160

Pro Gly Ser Gln Gln Ala Ile Lys Arg Ile Ser Val Ala Asn Thr Ala

165 170 175

Val Leu Tyr His Asp Gly Arg Ala Leu Ala Thr Cys Glu Ser Gly Pro

180 185 190

Pro Met Arg Ile Gln Leu Pro Ser Leu Asp Thr Val Gly Trp Phe Asp

195 200 205

Gly Val Glu Ala Glu Gly Glu Pro Glu Ile Ser Gln Ala Gly Ser Asp

210 215 220

Asp Ser Pro Phe Gly Gly Ser Gly Ile Phe Ser Phe Met Lys Glu Trp

225 230 235 240

Thr Thr Gly His Pro Lys Val Asp Pro Val Thr Gly Glu Met Leu Leu

245 250 255

Tyr His Asn Thr Phe Met Pro Pro Tyr Val His Cys Ser Val Leu Pro

260 265 270

Lys Ser Asn Glu Lys Ala Pro Gly His Arg Leu Val Asn Gln Pro Val

275 280 285

Leu Gly Val Ser Gly Ala Arg Met Met His Asp Phe Gly Ala Ser Arg

290 295 300

Ser His Thr Ile Ile Met Asp Leu Pro Leu Ser Leu Asp Pro Leu Asn

305 310 315 320

Thr Met Lys Gly Lys Glu Val Val Ala Tyr Asp Pro Thr Lys Pro Ser

325 330 335

Arg Phe Gly Val Phe Pro Arg His Leu Pro Ser Ser Val Arg Trp Phe

340 345 350

His Thr Ala Pro Cys Cys Ile Phe His Thr Ala Asn Thr Trp Asp Ser

355 360 365

Gln Ser Ser Glu Gly Glu Leu Ser Val Asn Leu Leu Ala Cys Arg Met

370 375 380

Thr Ser Ser Thr Leu Val Tyr Thr Ala Gly Asn Ile Arg Pro Pro Val

385 390 395 400

Arg Ser Arg Cys Thr Gln Ala Arg Val Trp Ser Asp Glu Arg Glu Glu

405 410 415

Thr Ala Cys Arg Tyr Lys Glu Ala Pro Ala Leu Glu Ser Pro Gly Glu

420 425 430

Ser Thr Gly Leu Ala Asp Tyr Phe Pro Ile Thr Ala Glu Ser Asp Asp

435 440 445

Tyr Asp Gln Cys Arg Leu Tyr Tyr Tyr Glu Phe Asp Leu Ala Met Glu

450 455 460

Ser Arg Asn His Val Lys Ser Gln Trp Ala Leu Ser Ala Ile Pro Phe

465 470 475 480

Glu Phe Pro Ser Val Arg Pro Asp Arg Glu Met Gln Glu Ala Arg Tyr

485 490 495

Ile Tyr Gly Cys Ser Thr Ser Thr Ser Cys Phe Gly Val Ala Leu Gly

500 505 510

Arg Ala Asp Lys Val Asp Leu Leu Val Lys Met Asp Ala Lys Thr Leu

515 520 525

Ile Gln Arg Gly Lys Lys Met Asn Ala Thr Ser Ile Thr Gly Cys Val

530 535 540

Asp Arg Arg Ser Val Cys Glu Ile Leu Gln Glu Gln Arg Lys Asp Asp

545 550 555 560

Pro Ile Tyr Ile Phe Arg Leu Pro Pro Asn His Tyr Ala Gln Glu Pro

565 570 575

Arg Phe Val Pro Arg Ala Cys Ser Thr Glu Glu Asp Asp Gly Tyr Leu

580 585 590

Leu Phe Tyr Val Phe Asp Glu Ser Gln Leu Leu Pro Ser Gly Asp Cys

595 600 605

Pro Pro Ser Ala Thr Ser Glu Leu Trp Ile Leu Asp Ala Lys Asn Met

610 615 620

Arg Asp Val Val Ala Lys Val Arg Leu Pro Gln Arg Val Pro Tyr Gly

625 630 635 640

Leu His Gly Thr Trp Phe Ser Ser Gln Asp Ile Glu Ser Gln Arg Ser

645 650 655

Val Glu Ser Leu Arg Ser Leu Glu Val Val Gln Arg Lys Lys Glu Glu

660 665 670

Trp Val Asn Ser Gly Gly Gln Ile Arg Lys Ser Trp Met Val Leu Arg

675 680 685

Glu Lys Leu Glu Lys Ala Val Gly

690 695

<210> 4

<211> 2091

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 耶氏酵母属密码子优化的FfCarX

<400> 4

atgaagtttc tccagcagaa ctcctttacc cagacctcta tgtctcagcc tcacgaggat 60

gtctctcccg ccattcgaca cccttacctt accggcaact ttgctcctat tcacaagacc 120

actaacctca ctccctgtac ttactctggc tgcattcccc ccgagcttac cggaggtcag 180

tacgttcgaa acggcggaaa ccctgtctcc caccaggatc tcggaaagga tgctcactgg 240

ttcgatggcg acggtatgct ctctggcgtc gcctttcgaa aggcttccat tgatggcaag 300

actatccctg agttcgttaa ccagtacatt cttaccgacc tttacctttc tcgaaagacc 360

acctctattg cttcccctat tatgccctct atcaccaccc tggttaaccc tctctctact 420

atgtttcaga tcatgttcgc caccttccga actatcttcc tcgtcattct ctccaacctc 480

cctggttctc agcaggctat caagcgaatc tccgttgcca acactgctgt tctttaccac 540

gatggtcgag ctcttgccac ttgcgagtct ggccccccca tgcgaatcca gcttccctcc 600

ctcgataccg ttggctggtt cgacggtgtt gaggctgagg gtgagcctga gatttctcag 660

gccggctctg atgactctcc cttcggcggt tccggcatct tctcctttat gaaggagtgg 720

accaccggcc accctaaggt ggaccccgtt accggagaga tgcttctcta ccacaacacc 780

ttcatgcctc cctacgtgca ctgctctgtt cttcccaagt ctaacgagaa ggctcccgga 840

caccgacttg ttaaccagcc cgttcttggt gtttctggtg cccgaatgat gcacgacttc 900

ggagcctctc gatctcacac tatcatcatg gaccttcccc tgtctctgga ccctctcaac 960

actatgaagg gaaaggaggt tgttgcttac gaccctacca agccttctcg attcggtgtg 1020

ttcccccgac accttccctc ttccgtgcga tggtttcaca ctgctccttg ctgtatcttt 1080

cacactgcta acacttggga ttctcagtcc tctgagggag agctttctgt taacctcctt 1140

gcctgccgaa tgacctcttc tacccttgtt tacactgccg gcaacatccg acctcccgtt 1200

cgatctcgat gtactcaggc ccgagtctgg tccgatgagc gagaggagac tgcttgtcga 1260

tacaaggagg ctcctgctct tgagtctcct ggtgagtcca ctggccttgc cgactacttt 1320

cccattaccg ctgagtccga cgactacgat cagtgccgac tctactacta cgagtttgac 1380

cttgctatgg agtcccgaaa ccacgtcaag tcccagtggg ctctctctgc cattcctttc 1440

gagtttccct ctgtgcgacc tgaccgagag atgcaggagg ctcgatacat ctacggctgt 1500

tccacttcca cttcttgctt cggtgtggct ctcggacgag ctgataaggt tgaccttctc 1560

gttaagatgg atgccaagac cctcattcag cgaggaaaga agatgaacgc tacttccatc 1620

accggatgcg ttgatcgacg atctgtctgc gagatccttc aggagcagcg aaaggatgac 1680

cctatttaca ttttccgact tccccctaac cactacgctc aggagccccg attcgttccc 1740

cgagcttgtt ctactgagga ggacgacgga tacctccttt tctacgtgtt cgacgagtct 1800

cagctccttc cctctggcga ttgtcctccc tctgctactt ctgagctttg gattcttgac 1860

gctaagaaca tgcgagatgt tgtggccaag gtccgacttc cccagcgagt tccttacggt 1920

ctgcacggta cttggttctc ttctcaggat attgagtctc agcgatctgt ggagtctctt 1980

cgatctcttg aggttgtgca gcgaaagaag gaggagtggg ttaactctgg aggccagatt 2040

cgaaagtcct ggatggttct tcgagagaag ctggagaagg ctgttggata g 2091

<210> 5

<211> 369

<212> PRT

<213> 番红花（Crocus sativus）

<400> 5

Met Gln Val Asp Pro Thr Lys Gly Ile Gly Leu Ala Asn Thr Ser Leu

1 5 10 15

Gln Phe Ser Asn Gly Arg Leu His Ala Leu Cys Glu Tyr Asp Leu Pro

20 25 30

Tyr Val Val Arg Leu Ser Pro Glu Asp Gly Asp Ile Ser Thr Val Gly

35 40 45

Arg Ile Glu Asn Asn Val Ser Thr Lys Ser Thr Thr Ala His Pro Lys

50 55 60

Thr Asp Pro Val Thr Gly Glu Thr Phe Ser Phe Ser Tyr Gly Pro Ile

65 70 75 80

Gln Pro Tyr Val Thr Tyr Ser Arg Tyr Asp Cys Asp Gly Lys Lys Ser

85 90 95

Gly Pro Asp Val Pro Ile Phe Ser Phe Lys Glu Pro Ser Phe Val His

100 105 110

Asp Phe Ala Ile Thr Glu His Tyr Ala Val Phe Pro Asp Ile Gln Ile

115 120 125

Val Met Lys Pro Ala Glu Ile Val Arg Gly Arg Arg Met Ile Gly Pro

130 135 140

Asp Leu Glu Lys Val Pro Arg Leu Gly Leu Leu Pro Arg Tyr Ala Thr

145 150 155 160

Ser Asp Ser Glu Met Arg Trp Phe Asp Val Pro Gly Phe Asn Met Val

165 170 175

His Val Val Asn Ala Trp Glu Glu Glu Gly Gly Glu Val Val Val Ile

180 185 190

Val Ala Pro Asn Val Ser Pro Ile Glu Asn Ala Ile Asp Arg Phe Asp

195 200 205

Leu Leu His Val Ser Val Glu Met Ala Arg Ile Glu Leu Lys Ser Gly

210 215 220

Ser Val Ser Arg Thr Leu Leu Ser Ala Glu Asn Leu Asp Phe Gly Val

225 230 235 240

Ile His Arg Gly Tyr Ser Gly Arg Lys Ser Arg Tyr Ala Tyr Leu Gly

245 250 255

Val Gly Asp Pro Met Pro Lys Ile Arg Gly Val Val Lys Val Asp Phe

260 265 270

Glu Leu Ala Gly Arg Gly Glu Cys Val Val Ala Arg Arg Glu Phe Gly

275 280 285

Val Gly Cys Phe Gly Gly Glu Pro Phe Phe Val Pro Ala Ser Ser Lys

290 295 300

Lys Ser Gly Gly Glu Glu Asp Asp Gly Tyr Val Val Ser Tyr Leu His

305 310 315 320

Asp Glu Gly Lys Gly Glu Ser Ser Phe Val Val Met Asp Ala Arg Ser

325 330 335

Pro Glu Leu Glu Ile Leu Ala Glu Val Val Leu Pro Arg Arg Val Pro

340 345 350

Tyr Gly Phe His Gly Leu Phe Val Thr Glu Ala Glu Leu Leu Ser Gln

355 360 365

Gln

<210> 6

<211> 1110

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 耶氏酵母属密码子优化的CsZCO

<400> 6

atgcaggtgg accccaccaa gggtatcggc ctggccaaca cttctctcca gttctccaac 60

ggacgactcc acgctctttg cgagtacgac ctcccctacg tcgttcgact ctcccccgag 120

gacggtgaca tctctaccgt cggacgaatc gagaacaacg tttctactaa gtctaccacc 180

gcccacccca agaccgaccc cgtcaccgga gagaccttct ctttctccta cggtcccatt 240

cagccctacg tcacctactc ccgatacgac tgcgacggca agaagtccgg ccccgacgtg 300

cccatcttct ctttcaagga gccctctttc gtccacgact tcgccatcac cgagcactac 360

gccgtctttc ccgacattca gatcgtgatg aagcccgccg agatcgttcg aggacgacga 420

atgatcggcc ccgaccttga gaaggtcccc cgactgggcc ttctcccccg atacgccacc 480

tccgactccg agatgcgatg gttcgacgtg cccggtttca acatggttca cgtggttaac 540

gcttgggagg aggagggcgg agaggtcgtg gtcatcgtgg cccccaacgt gtcccccatt 600

gagaacgcca tcgaccgatt cgacctcctc cacgtgtctg tggagatggc ccgaatcgag 660

ctgaagtccg gttccgtgtc ccgaaccctt ctctctgccg agaacctcga tttcggtgtg 720

attcaccgag gctactccgg tcgaaagtcc cgatacgctt acctcggagt cggcgacccc 780

atgcccaaga ttcgaggtgt ggtcaaggtg gacttcgagc tggccggacg aggagagtgc 840

gtggttgccc gacgagagtt cggcgtgggt tgtttcggtg gagagccctt ctttgtcccc 900

gcttcttcca agaagtctgg aggcgaggag gacgatggct acgttgtgtc ttaccttcac 960

gacgagggaa agggagagtc ctctttcgtc gtgatggacg ctcgatctcc cgagctggag 1020

attcttgccg aggtggttct gccccgacga gttccctacg gttttcacgg cctctttgtt 1080

accgaggccg agcttctctc ccagcagtag 1110

<210> 7

<211> 620

<212> PRT

<213> 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）

<400> 7

Met Ala Ala Gly Val Phe Lys Ser Phe Met Arg Asp Phe Phe Ala Val

1 5 10 15

Lys Tyr Asp Glu Gln Arg Asn Asp Pro Gln Ala Glu Arg Leu Asp Gly

20 25 30

Asn Gly Arg Leu Tyr Pro Asn Cys Ser Ser Asp Val Trp Leu Arg Ser

35 40 45

Cys Glu Arg Glu Ile Val Asp Pro Ile Glu Gly His His Ser Gly His

50 55 60

Ile Pro Lys Trp Ile Cys Gly Ser Leu Leu Arg Asn Gly Pro Gly Ser

65 70 75 80

Trp Lys Val Gly Asp Met Thr Phe Gly His Leu Phe Asp Cys Ser Ala

85 90 95

Leu Leu His Arg Phe Ala Ile Arg Asn Gly Arg Val Thr Tyr Gln Asn

100 105 110

Arg Phe Val Asp Thr Glu Thr Leu Arg Lys Asn Arg Ser Ala Gln Arg

115 120 125

Ile Val Val Thr Glu Phe Gly Thr Ala Ala Val Pro Asp Pro Cys His

130 135 140

Ser Ile Phe Asp Arg Phe Ala Ala Ile Phe Arg Pro Asp Ser Gly Thr

145 150 155 160

Asp Asn Ser Met Ile Ser Ile Tyr Pro Phe Gly Asp Gln Tyr Tyr Thr

165 170 175

Phe Thr Glu Thr Pro Phe Met His Arg Ile Asn Pro Cys Thr Leu Ala

180 185 190

Thr Glu Ala Arg Ile Cys Thr Thr Asp Phe Val Gly Val Val Asn His

195 200 205

Thr Ser His Pro His Val Leu Pro Ser Gly Thr Val Tyr Asn Leu Gly

210 215 220

Thr Thr Met Thr Arg Ser Gly Pro Ala Tyr Thr Ile Leu Ser Phe Pro

225 230 235 240

His Gly Glu Gln Met Phe Glu Asp Ala His Val Val Ala Thr Leu Pro

245 250 255

Cys Arg Trp Lys Leu His Pro Gly Tyr Met His Thr Phe Gly Leu Thr

260 265 270

Asp His Tyr Phe Val Ile Val Glu Gln Pro Leu Ser Val Ser Leu Thr

275 280 285

Glu Tyr Ile Lys Ala Gln Leu Gly Gly Gln Asn Leu Ser Ala Cys Leu

290 295 300

Lys Trp Phe Glu Asp Arg Pro Thr Leu Phe His Leu Ile Asp Arg Val

305 310 315 320

Ser Gly Lys Leu Val Gln Thr Tyr Glu Ser Glu Ala Phe Phe Tyr Leu

325 330 335

His Ile Ile Asn Cys Phe Glu Arg Asp Gly His Val Val Val Asp Ile

340 345 350

Cys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Met Ile Asn Cys Met Tyr Leu Glu Ala

355 360 365

Ile Ala Asn Met Gln Thr Asn Pro Asn Tyr Ala Thr Leu Phe Arg Gly

370 375 380

Arg Pro Leu Arg Phe Val Leu Pro Leu Gly Thr Ile Pro Pro Ala Ser

385 390 395 400

Ile Ala Lys Arg Gly Leu Val Lys Ser Phe Ser Leu Ala Gly Leu Ser

405 410 415

Ala Pro Gln Val Ser Arg Thr Met Lys His Ser Val Ser Gln Tyr Ala

420 425 430

Asp Ile Thr Tyr Met Pro Thr Asn Gly Lys Gln Ala Thr Ala Gly Glu

435 440 445

Glu Ser Pro Lys Arg Asp Ala Lys Arg Gly Arg Tyr Glu Glu Glu Asn

450 455 460

Leu Val Asn Leu Val Thr Met Glu Gly Ser Gln Ala Glu Ala Phe Gln

465 470 475 480

Gly Thr Asn Gly Ile Gln Leu Arg Pro Glu Met Leu Cys Asp Trp Gly

485 490 495

Cys Glu Thr Pro Arg Ile Tyr Tyr Glu Arg Tyr Met Gly Lys Asn Tyr

500 505 510

Arg Tyr Phe Tyr Ala Ile Ser Ser Asp Val Asp Ala Val Asn Pro Gly

515 520 525

Thr Leu Ile Lys Val Asp Val Trp Asn Lys Ser Cys Leu Thr Trp Cys

530 535 540

Glu Glu Asn Val Tyr Pro Ser Glu Pro Ile Phe Val Pro Ser Pro Asp

545 550 555 560

Pro Lys Ser Glu Asp Asp Gly Val Ile Leu Ala Ser Met Val Leu Gly

565 570 575

Gly Leu Asn Asp Arg Tyr Val Gly Leu Ile Val Leu Cys Ala Lys Thr

580 585 590

Met Thr Glu Leu Gly Arg Cys Asp Phe His Thr Asn Gly Pro Val Pro

595 600 605

Lys Cys Leu His Gly Trp Phe Ala Pro Asn Ala Ile

610 615 620

<210> 8

<211> 1863

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 耶氏酵母属密码子优化的DmNinaB

<400> 8

atggccgctg gtgttttcaa gtcttttatg cgagatttct ttgctgttaa gtacgatgag 60

cagcgaaacg acccccaggc cgagcgactg gacggcaacg gacgactgta ccccaactgc 120

tcctctgatg tttggcttcg atcttgcgag cgagagatcg ttgaccccat tgagggccac 180

cactccggtc acattcccaa gtggatttgc ggttccctgc tccgaaacgg ccccggctct 240

tggaaggttg gcgacatgac cttcggccac ctgttcgact gctccgccct gctccaccga 300

tttgccattc gaaacggacg agtcacctac cagaaccgat ttgttgacac tgagactctg 360

cgaaagaacc gatctgccca gcgaattgtt gtcaccgagt ttggcactgc cgctgttccc 420

gatccctgtc actccatctt cgaccgattt gccgccattt ttcgacccga ttctggaacc 480

gataactcca tgatttccat ctaccccttc ggcgaccagt actacacttt caccgagact 540

ccctttatgc accgaattaa cccctgcact ctcgctactg aggctcgaat ctgcaccacc 600

gacttcgttg gcgttgtcaa ccacacttct cacccccacg ttcttccctc tggcactgtt 660

tacaacctgg gcaccactat gacccgatct ggacccgctt acactatcct ctctttcccc 720

cacggcgagc agatgttcga ggacgctcac gttgtcgcca ctctgccctg ccgatggaag 780

ctgcaccccg gttatatgca caccttcggc ctcactgacc actactttgt cattgttgag 840

cagccccttt ccgtttccct cactgagtac atcaaggccc agcttggcgg acagaacctt 900

tccgcttgcc tcaagtggtt cgaggaccga cccactctct ttcaccttat tgatcgagtt 960

tccggcaagc tggtccagac ctacgagtcc gaggctttct tctacctgca catcatcaac 1020

tgctttgagc gagatggcca cgttgtcgtt gacatttgct cttaccgaaa ccccgagatg 1080

attaactgca tgtacctgga ggccattgcc aacatgcaga ctaaccccaa ctacgctacc 1140

ctctttcgag gacgacccct tcgattcgtc ctgcccctcg gcactattcc ccccgcctct 1200

atcgccaagc gaggactcgt caagtccttc tccctcgctg gactctccgc tccccaggtt 1260

tctcgaacca tgaagcactc cgtttctcag tacgccgata ttacctacat gcccaccaac 1320

ggaaagcagg ccactgctgg agaggagtcc cccaagcgag atgccaagcg aggccgatac 1380

gaggaggaga accttgtcaa cctggttact atggagggct ctcaggccga ggcttttcag 1440

ggcaccaacg gcattcagct tcgacccgag atgctgtgtg attggggctg tgagactccc 1500

cgaatctact acgagcgata catgggcaag aactaccgat acttctacgc catttcttcc 1560

gatgttgatg ctgtcaaccc cggcaccctc atcaaggttg atgtctggaa caagtcttgt 1620

cttacctggt gcgaggagaa cgtctacccc tctgagccca tttttgtccc ctctcccgat 1680

cccaagtccg aggacgatgg cgttatcctg gcctctatgg ttcttggcgg tcttaacgac 1740

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tag 1863

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<213> 斑马鱼（Danio rerio）

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<223> 斑马鱼BCO TPI aa

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 耶氏酵母属密码子优化的DrBCO-TPI

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<213> 斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）

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<212> DNA

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<223> 耶氏酵母属密码子优化的IpBCO

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<211> 527

<212> PRT

<213> 白斑狗鱼（Esox lucius）

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 耶氏酵母属密码子优化的ElBCO

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<212> PRT

<213> 矛尾鱼（Latimeria chalumnae）

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Leu Arg Asn Gly Pro Gly Met His Thr Val Gly Glu Thr Ser Tyr Asn

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His Trp Phe Asp Gly Leu Ala Leu Met His Ser Phe Thr Phe Lys Asp

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Gly Ile Thr Glu Asn Tyr Ile Val Phe Val Glu Gln Pro Phe Lys Leu

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260 265 270

Ser Cys Leu Asn Phe His Ser Glu Asp Lys Thr Phe Ile His Ile Ile

275 280 285

Asp Arg Arg Thr Lys Thr Ser Val Ser Thr Lys Phe His Thr Asp Ala

290 295 300

Leu Val Leu Tyr His His Val Asn Ala Tyr Glu Glu Asp Gly His Val

305 310 315 320

Val Phe Asp Val Ile Ala Tyr Asn Asp Ser Ser Leu Tyr Asp Met Phe

325 330 335

Tyr Leu Ala Asn Val Arg Gln Glu Ser Ala Glu Phe Glu Ala Lys Asn

340 345 350

Thr Ser Ser Ser Lys Pro Ala Cys Arg Arg Phe Val Ile Pro Leu Gln

355 360 365

Pro Asp Lys Asp Ala Glu Leu Gly Thr Asn Leu Val Lys Leu Ala Ser

370 375 380

Thr Thr Ala Asp Ala Ile Lys Glu Lys Asp Ser Ile Tyr Cys His Pro

385 390 395 400

Glu Ile Leu Val Glu Asp Ile Glu Leu Pro Arg Ile Asn Tyr Asn Tyr

405 410 415

Asn Gly Lys Lys Tyr Arg Tyr Ile Tyr Val Thr Gly Ile Ala Trp Lys

420 425 430

Pro Ile Pro Thr Lys Ile Val Lys Phe Asp Thr Leu Thr Arg Lys Ser

435 440 445

Val Glu Trp Gln Glu Glu Asp Cys Trp Pro Ala Glu Pro Val Phe Val

450 455 460

Pro Ser Pro Asp Ala Lys Glu Glu Asp Asp Gly Ile Val Leu Ser Ser

465 470 475 480

Ile Val Cys Thr Ser Pro Asn Lys Phe Pro Phe Leu Leu Ile Leu Asp

485 490 495

Ala Lys Thr Phe Thr Glu Leu Ala Arg Ala Ser Ile Asn Ala Asp Val

500 505 510

His Leu Asp Leu His Gly Tyr Phe Ile Pro Glu Lys Lys Lys Ala Gln

515 520 525

Ile Thr His

530

<210> 18

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 耶氏酵母属密码子优化的LcBCO

<400> 18

atgcagtctc tgttcggtaa gaacaagcga gagtgtcctg agcccattaa ggctgaggtg 60

aagggtcaga ttcctgcttg gctccagggt actctccttc gaaacggccc tggcatgcac 120

accgttggcg agacttctta caaccactgg ttcgacggac tcgctcttat gcactccttc 180

acctttaagg atggtgaggt tttttaccag tctaagtacc tgcgatccga cacctacaag 240

aagaacatgg aggccaaccg aattgtcgtg tctgagttcg gaaccatggc ctaccccgat 300

ccctgcaaga acattttttc caaggctttt tcttaccttt ctcacaccat ccctgagttt 360

accgacaact gtctgatcaa cattatgaag tgtggtgagg attactacgc tgttactgag 420

actaacttca tccgaaagat tgatcccaag tccctcgaca ccctggagaa ggttgactac 480

accaagtaca ttgctcttaa cctggcttcc tcccaccccc actacgatgc tgctggtgat 540

accattaaca tgggcacctc tatcgctgat aagggaaaga ctaagtacct gattgttaag 600

attcccaaca tgaagcccgt tgagtctgag aagaagaaga aggtctactt taagaacctg 660

gaggtgctct gctccatccc ttctcacgga cgacttaacc cttcttacta ccactccttt 720

ggcatcactg agaactacat cgttttcgtg gagcagccct ttaagctgga ccttctcaag 780

ctggccaccg cctacttccg aggtattaac tgggcctctt gtcttaactt ccactccgag 840

gacaagactt tcattcacat catcgatcga cgaaccaaga cctccgtttc cactaagttt 900

cacaccgatg ctctcgttct ttaccaccac gtcaacgctt acgaggagga tggccacgtt 960

gttttcgatg tcattgccta caacgactct tctctctacg atatgtttta cctcgccaac 1020

gttcgacagg agtctgccga gtttgaggct aagaacacct cttcctccaa gcctgcttgt 1080

cgacgatttg tcattcccct gcagcctgac aaggatgctg agctgggcac taacctggtc 1140

aagctcgctt ccactaccgc cgacgccatt aaggagaagg actccattta ctgccaccct 1200

gagatcctgg ttgaggatat tgagctccct cgaattaact acaactacaa cggcaagaag 1260

taccgataca tttacgttac tggtatcgcc tggaagccca ttcccactaa gattgtcaag 1320

tttgacactc tcactcgaaa gtccgtggag tggcaggagg aggactgttg gcccgccgag 1380

cctgtctttg ttccttcccc cgatgccaag gaggaggacg atggtattgt tctttcttcc 1440

atcgtgtgta cttcccctaa caagtttccc ttcctcctta ttctggacgc caagaccttt 1500

accgagctcg ctcgagcttc tattaacgcc gatgtccacc tcgaccttca cggatacttt 1560

atccctgaga agaagaaggc ccagatcacc cactag 1596

Claims (14)

1.一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，所述宿主细胞包含立体选择性β-胡萝卜素氧化酶(BCO)，所述宿主细胞产生包含顺式视黄醛和反式视黄醛的视黄醛混合物，其中由所述宿主细胞产生的所述混合物中反式视黄醛的百分比是至少约65％，优选68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或至多100％。

2.根据权利要求1所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中基于由所述宿主细胞产生的视黄醛的总量，在包含反式视黄醛和顺式视黄醛的所述视黄醛混合物中反式视黄醛的百分比在约至少65％至98％，优选地约至少65％至95％，更优选地至少约65％至90％的范围内。

3.根据权利要求1或2所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，所述宿主细胞包含异源立体选择性BCO。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述BCO选自真菌、植物或动物，优选地选自镰刀菌属(Fusarium)、黑粉菌属(Ustilago)、番红花属(Crocus)、果蝇属(Drosophila)、短担尼鱼属(Danio)、真鮰属(Ictalurus)、狗鱼属(Esox)、矛尾鱼属(Latimeria)，更优选地选自藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、番红花(Crocus sativus)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、斑马鱼(Danio rerio)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、白斑狗鱼(Esox lucius)、矛尾鱼(Latimeria chalumnae)。

5.根据权利要求4所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述BCO选自与根据来自数据库的名为EAK81726、AJ854252、Q84K96.1的序列的多肽具有至少约60％同一性，或与来自数据库的名为Q90WH4的序列的多肽具有至少50％的同一性的多肽。

6.根据权利要求5所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，所述宿主细胞表达这样的多核苷酸，所述多核苷酸编码与根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的多肽具有至少约60％同一性的多肽或与根据SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的多肽序列具有至少约50％的同一性的多肽。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自植物、真菌、藻类或微生物，诸如选自埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、聚球藻属(Synechococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、Mixococcus、短杆菌属(Brevibacterium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、鼠尾菌属(Muricauda)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、集胞藻属(Synochocystis)、副球菌属(Paracoccus)、酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、须霉属(Phycomyces)、毛霉属(Mucor)、红酵母属(Rhodotorula)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)、发夫酵母属(Phaffia)和布拉霉属(Blakeslea)；优选地选自真菌，包括酵母，更优选地选自酵母属、曲霉属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、须霉属、毛霉属、红酵母属、掷孢酵母属、法夫酵母属、发夫酵母属、布拉霉属和耶氏酵母属(Yarrowia)，最优选地选自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞，其中所述反式视黄醛被进一步转换为维生素A。

9.一种经由立体选择性BCO的酶促活性生产包含反式视黄醛和顺式视黄醛的视黄醛混合物的方法，所述方法包括使β-胡萝卜素与所述BCO接触，其中所述视黄醛混合物中反式视黄醛与顺式视黄醛的比值为至少约2:1。

10.一种减少由β-胡萝卜素的酶促切割产生的顺式视黄醛的量的方法，所述方法包括使β-胡萝卜素与立体选择性BCO接触，其中基于视黄醛的总量，由β-胡萝卜素的切割导致的所述视黄醛混合物中的顺式视黄醛的量在约35％或更少的范围内。

11.一种增加由β-胡萝卜素的酶促切割产生的反式视黄醛的量的方法，所述方法包括使β-胡萝卜素与立体选择性BCO接触，其中基于视黄醛的总量，所述视黄醛混合物中反式视黄醛的量在至少约65％至98％的范围内。

12.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，所述方法使用根据权利要求1至8中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞。

13.一种生产维生素A的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将编码立体选择性BCO的核酸分子引入合适的产生胡萝卜素的宿主细胞中；

(b)将β-胡萝卜素酶促转换为包含顺式视黄醛和反式视黄醛的视黄醛混合物，其中基于视黄醛的总量，反式视黄醛的百分比为至少约65％，

(c)在合适的培养条件下将反式视黄醛转换为维生素A。

14.根据权利要求1至8中任一项所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞用于产生包含比值为2:1的反式视黄醛和顺式视黄醛的视黄醛混合物的用途，其中所述宿主细胞表达具有朝向产生反式同种型的立体选择性的异源BCO。