JP7298812B2 - レチニルエステルの生産 - Google Patents
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Description
(b)レチノールを、少なくとも約4の比率のトランス-及びシス-レチニルエステルを含む長鎖レチニルエステル混合物に酵素変換するステップと、
(c)適切な培養条件下でレチニルエステルをビタミンAに変換するステップと
を含む、ビタミンAの生産プロセス。
[実施例1:一般的な方法、菌株、及びプラスミド]
本明細書に記載される全ての基本的な分子生物学及びDNA操作手順は、一般的に、Sambrook et al.(eds.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press:New York(1989)、又はAusubel et al.(eds).Current Protocols in Molecular Biology.Wiley:New York(1998)に従って実施される。
通常、800μlの0.075%酵母抽出物、0.25%ペプトン(0.25X YP)に、10μlの新たに成長させたヤロウイア属(Yarrowia)を播種し、200μlのDrakeol5鉱油でオーバーレイし、炭素源として鉱油中5%のコーン油及び/又は水相中5%のグルコースを用いた。24ウェルプレート(Multitron、30℃、800RPM)において、形質転換体をYPD培地中で20%のドデカンと共に4日間成長させた。鉱油画分を振とうプレートウェルから取り出し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて、順相カラムでHPLCにより分析した。
菌株をYPDプレート培地上で一晩成長させることにより形質転換させる。50μlの細胞をプレートからこすり取り、1μgの形質転換DNA、通常は組込み形質転換のための直鎖DNA、40%のPEG 3550MW、100mMの酢酸リチウム、50mMのジチオスレイトール、5mMのTris-Cl(pH8.0)、0.5mMのEDTAを含む500μl中、40℃で60分間のインキュベーションにより形質転換させ、選択培地に直接プレーティングするか、或いは優性抗生物質マーカー選択の場合は、細胞をYPD液体培地において30℃で4時間増殖させた後、選択培地にプレーティングする。
pUC57ベクターにおいてNhel及びMlul末端を用いて遺伝子を合成した。国際公開第2016172282号パンフレットの場合のように、通常、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)形質転換におけるマーカー選択のために、遺伝子をMB5082「URA3」、MB6157HygR、及びMB8327NatRベクターにサブクローニングした。遺伝子及びマーカーHindlll/Xbal(MB5082)又はPvull(MB6157及びMB8327)のランダム非相同末端結合によるクリーンな遺伝子挿入のために、それぞれゲル電気泳動及びQiagenゲル精製カラムにより精製した。
使用するプラスミド、菌株、及びコドン最適化配列は、表1、2及び配列表に記載される。ヤロウイア属(Yarrowia)における発現に対してコドン最適化された配列番号1、2を除いて、全ての配列は、データベースにおけるヌクレオチド(nt)としての受託配列と同じであった。
Waters 717オートサンプラーに取り付けたWaters 1525バイナリーポンプを用いて、サンプルを注入した。安全シリカガードカラムキットを有するPhenomenex Luna 3μ Silica(2),150x4.6mmを使用して、レチノイドを分離した。移動相は、アスタキサンチン関連化合物に対する1000mLのヘキサン、30mLのイソプロパノール、及び0.1mLの酢酸、又はゼアキサンチン関連化合物に対する1000mLのヘキサン、60mLのイソプロパノール、及び0.1mLの酢酸のいずれかからなる。それぞれの流速は、0.6mL/分である。カラム温度は周囲温度である。注入容積は20μLである。検出器は、210nmから600nmまでを収集するフォトダイオードアレイ検出器である。表3に従って分析物を検出した。
条件に応じて種々の方法によりサンプルを調製した。全培養液又は洗浄培養液サンプルのために、培養液を秤量したPrecellys(登録商標)管に入れ、移動相を添加した。製造指示書に従って最高設定3XにおいてPrecellys(登録商標)ホモジナイザー(Bertin Corp,Rockville,MD,USA)内でサンプルを処理した。洗浄培養液中、サンプルを微量遠心管において10000rpmで1分間、1.7ml管内で回転させ、培養液をデカントし、1mlの水を添加し、混合し、ペレットにし、デカントして、元の容積にした。混合物を再度ペレットにし、適切な量の移動相中に入れ、Precellys(登録商標)ビーズビーティングにより処理した。鉱油画分の分析のために、サンプルを4000RPMで10分間回転させ、ポジティブディスプレイスメントピペット(Eppendorf,Hauppauge,NY,USA)により油を上部からデカントして除去し、移動相中に希釈し、ボルテックスにより混合し、HPLC分析によりレチノイド濃度を測定した。
発酵は既に記載された条件と同一であり、鉱油のオーバーレイと、0.5L~5Lの全容積のベンチトップ反応器内に供給されたコーン油である攪拌槽とを用いた(国際公開第2016172282号パンフレットを参照)。一般的に、生産性が増大された流加バッチ攪拌漕反応器を用いて同じ結果が観察され、レチノイドの生産のためのシステムの有用性が実証された。
レチノール産生菌株ML17767を、URA3栄養マーカーに連結されたコドン最適化アシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する精製HinDIII/Xbal遺伝子断片で形質転換し、ウラシルを含まない最小培地において選択した。複数の単離株を振とうプレートアッセイにおいてレチノールのアシル化の増大及び残留レチノールの低減についてスクリーニングした。成功した単離株を流加バッチ攪拌漕反応器において実行させ、レチノールエステルの産生の増大のための方法の有用性が示された。実験の結果は以下に示され、真菌産生系においてレチノールアシル化活性が増大された遺伝子が単離されたことを示した。
通常、ベータカロテン菌株は、当該技術分野において知られている(例えば、米国特許出願公開第20160130628号明細書又は国際公開第2009126890号パンフレットに記載される)ような標準的方法に従って、ベータカロテンを産生している構築されたゲラニルゲラニルシンターゼ、フィトエンシンターゼ、リコペンシンターゼ、リコペンシクラーゼなどの酵素をコードする異種遺伝子で形質転換される。本明細書で定義されるアシルトランスフェラーゼ酵素を導入すること、及び/又は過剰発現させることにより、長鎖レチニルエステルの産生に関して同様の結果が得られる。さらに、ベータカロテンオキシダーゼ遺伝子で形質転換される場合、レチナールを産生することができる。さらに、レチノールデヒドロゲナーゼで形質転換されると、レチノールを産生することができる。このアプローチを用いて、長鎖レチニルエステルに対する生産性に関して同様の結果が得られる。
Claims (6)
- アシルトランスフェラーゼ[EC2.3.1.20]の酵素活性によって、総レチノイドを基準として少なくとも14%長鎖レチニルエステルを増加させることを含む、レチノイドを生産するためのプロセスであって、レチノールを、適切なレチノイド産生宿主細胞において発現された配列番号3、5、又はそれらに対して少なくとも90%の同一性を有する配列に従うアシルトランスフェラーゼと接触させることを含み、前記長鎖レチニルエステル混合物中のトランス-アイソフォームのシス-アイソフォームに対する比率が少なくとも4であり、前記増加が前記アシルトランスフェラーゼを含まない又は発現しない宿主細胞と比較したものである、プロセス。
- (a)配列番号3、5、又はそれらに対して少なくとも90%の同一性を有する配列に従うアシルトランスフェラーゼ[EC2.3.1.20]をコードする核酸分子を適切なレチノイド産生宿主細胞に導入するステップと、
(b)レチノールを、少なくとも4の比率のトランス-及びシス-レチニルエステルを含む長鎖レチニルエステル混合物に酵素変換するステップと、
(c)適切な培養条件下で長鎖レチニルエステルをビタミンAに変換するステップと
を含む、ビタミンAの生産プロセス。 - 前記レチノイド産生宿主細胞が、植物、真菌、藻類又は微生物から選択される、請求項1又は2に記載のプロセス。
- 前記レチノイド産生宿主細胞が、エシェリキア属(Escherichia)、ストレプトミケス属(Streptomyces)、パンテア属(Pantoea)、バチルス属(Bacillus)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、シネココックス属(Synechococcus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、ミクロコックス属(Micrococcus)、ミクソコックス属(Mixococcus)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)、ゴルドニア属(Gordonia)、ディエトジア属(Dietzia)、ムリカウダ属(Muricauda)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)、シノコキスティス属(Synochocystis)、パラコックス属(Paracoccus)、サッカロミケス属(Saccharomyces)、アスペルギルス属(Aspergillus)、ピキア属(Pichia)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、フィコミケス属(Phycomyces)、ムコール属(Mucor)、ロドトルラ属(Rhodotorula)、スポロボロミケス属(Sporobolomyces)、キサントフィロミセス属(Xanthophyllomyces)、ファフィア属(Phaffia)、ブラケスレア属(Blakeslea)、及びヤロウイア属(Yarrowia)からなる群から選択される、請求項1又は2に記載のプロセス。
- 前記レチノイド産生宿主細胞が、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)又はサッカロミケス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)から選択される、請求項4に記載のプロセス。
- 前記宿主細胞がヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)である、請求項5に記載のプロセス。
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