JPWO2020262342A1 - セルロース産生菌の培養方法および培養装置、ならびにバクテリアセルロースの製造方法および製造装置 - Google Patents
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Abstract
従来と比較して培養速度が向上すると共に安定的に培養可能なセルロース産生菌の培養方法および培養装置、ならびにこれらを用いたバクテリアセルロースの製造方法および製造装置を提供することを課題とする。解決手段として、本発明に係るセルロース産生菌の培養装置（１０）は、開閉可能な本体部（１２）と、各々第１回転軸（１６ａ）を中心に回転可能に設けられて、複数の前記容器（１４）を各々保持する複数の容器ホルダ（１６）と、該各容器ホルダ（１６）を回転駆動する第１駆動手段（１８）と、該各容器ホルダ（１６）の第１回転軸（１６ａ）を回転可能に支持すると共に、第２回転軸（２２ａ）を中心に回転可能に設けられて、該各容器ホルダ（１６）を該第２回転軸（２２ａ）の周りに公転させる公転部材（２２）と、該公転部材（２２）を回転駆動する第２駆動手段（２４）と、を備える。
Description
本発明は、セルロース産生菌の培養方法および培養装置、ならびにこれらを用いたバクテリアセルロースの製造方法および製造装置に関する。
セルロースは分子式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎで表される多糖類であり、食品分野、医療分野、工業分野等の様々な分野で広く利用されている。
セルロースは植物細胞の細胞壁の主成分であることから、一般的には木材等の植物原料を化学処理することで製造されている。一方、一部の動物や細菌（バクテリア）の中にはセルロース産生能を持つものがあり、特にバクテリアによって産生されたセルロースはバクテリアセルロースと呼ばれている。バクテリアセルロースは、例えば植物由来のセルロースに対して繊維径が微細といった特性を有し（特開２０１４−１８７９０１号公報参照）、利用性が注目されている。
バクテリアセルロースの製造は、セルロース産生能を持つバクテリア（以下、「セルロース産生菌」と表記する）を培養することによって行われる。セルロース産生菌を添加した培地を静置して培養すると膜状セルロース（ペリクル）が生成される。一方、セルロース産生菌を添加した液体培地（培養液）を撹拌等して動的に培養すると液状セルロース（スラリー）が生成される。ここで、動的な培養方法として、従来、培養液を撹拌子や撹拌翼等で撹拌する方法、または培養液を収容した容器を水平方向に揺動させる等して振盪する方法によって行われていた。しかしながら、培養速度は十分でなく、高コストであった。したがって、セルロース産生菌の安定した培養技術、ひいてはそれに基づくバクテリアセルロースの安定した製造技術の早期確立が求められていた。
本発明は、上記事情に鑑みてなされ、従来と比較して培養速度が向上すると共に安定的に培養可能なセルロース産生菌の培養方法および培養装置、ならびにこれらを用いたバクテリアセルロースの製造方法および製造装置を提供することを目的とする。
本発明は、一実施形態として以下に記載するような解決手段により、前記課題を解決する。
本発明に係るセルロース産生菌の培養方法は、セルロース産生菌を添加した培地を収容した容器を公転させつつ自転させる工程を含む方法である。
また、本発明に係るバクテリアセルロースの製造方法は、本発明に係るセルロース産生菌の培養方法を用いる方法である。
また、本発明に係るセルロース産生菌の培養装置は、開閉可能な本体部と、各々第１回転軸を中心に回転可能に設けられて、複数の前記容器を各々保持する複数の容器ホルダと、該各容器ホルダを回転駆動する第１駆動手段と、該各容器ホルダの第１回転軸を回転可能に支持すると共に、第２回転軸を中心に回転可能に設けられて、該各容器ホルダを該第２回転軸の周りに公転させる公転部材と、該公転部材を回転駆動する第２駆動手段と、を備える装置である。
また、本発明に係るバクテリアセルロースの製造装置は、開閉可能な本体部と、各々第１回転軸を中心に回転可能に設けられて、複数の前記容器を各々保持する複数の容器ホルダと、該各容器ホルダを回転駆動する第１駆動手段と、該各容器ホルダの第１回転軸を回転可能に支持すると共に、第２回転軸を中心に回転可能に設けられて、該各容器ホルダを該第２回転軸の周りに公転させる公転部材と、該公転部材を回転駆動する第２駆動手段と、を備える装置である。
また、本発明に係る培養方法は、生物検体を収容した容器を公転させつつ自転させる工程を含む方法である。
また、本発明に係る培養装置は、開閉可能な本体部と、各々第１回転軸を中心に回転可能に設けられて、複数の前記容器を各々保持する複数の容器ホルダと、該各容器ホルダを回転駆動する第１駆動手段と、該各容器ホルダの第１回転軸を回転可能に支持すると共に、第２回転軸を中心に回転可能に設けられて、該各容器ホルダを該第２回転軸の周りに公転させる公転部材と、該公転部材を回転駆動する第２駆動手段と、を備える装置である。
また、本実施形態に係る化学反応器は、開閉可能な本体部と、各々第１回転軸を中心に回転可能に設けられて、複数の容器を各々保持する複数の容器ホルダと、該各容器ホルダを回転駆動する第１駆動手段と、該各容器ホルダの第１回転軸を回転可能に支持すると共に、第２回転軸を中心に回転可能に設けられて、該各容器ホルダを該第２回転軸の周りに公転させる公転部材と、該公転部材を回転駆動する第２駆動手段と、を備える装置である。
本発明によれば、従来と比較して培養速度が向上すると共に安定的にセルロース産生菌を培養することができる。したがって、低コストで大量のバクテリアセルロースを安定的に製造することができる。
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について詳しく説明する。
先ず、本実施形態に係るセルロース産生菌の培養装置１０の基本構成について説明する。図１は、本実施形態に係る培養装置１０の例を示す正面概略図であって、一部を断面で示す。この自公転機構は、開閉部１２ａにより開閉可能な本体部１２の内部に収容されている。ただし、後述する第２駆動手段２４は本体部１２の外部に配設されてもよい。
本実施形態に係る培養装置１０は、図１に示すように、培養液を収容する複数の容器１４と、各々第１回転軸１６ａを中心に回転可能に設けられて、複数の容器１４を各々保持する複数の容器ホルダ１６と、容器ホルダ１６を回転駆動する第１駆動手段１８（本実施形態では、モータ）とを備えている。これによって、容器ホルダ１６および容器１４を、第１回転軸１６ａを中心に自転させることができる。本実施形態では、第１駆動手段１８の主軸と第１回転軸１６ａとはギアを用いた減速器２０等の機構を介して連結されている。
また、本実施形態に係る培養装置１０は、各容器ホルダ１６の第１回転軸１６ａを回転可能に支持すると共に、第２回転軸２２ａを中心に回転可能に設けられて、各容器ホルダ１６を第２回転軸２２ａの周りに公転させる公転部材２２と、公転部材２２を回転駆動する第２駆動手段２４（本実施形態では、モータ）とを備えている。これによって、容器ホルダ１６および容器１４を、第２回転軸２２ａを中心に公転させることができる。本実施形態では、第２回転軸２２ａが公転部材２２の中心部を貫通すると共にベアリング２６を介して回転可能に支持され、第１回転軸１６ａが公転部材２２の周縁部を貫通すると共にベアリング１９を介して回転可能に支持されている。また、第２駆動手段２４と第２回転軸２２ａとはプーリーおよびベルトを用いた減速器２７等の機構を介して連結されている。
このように、自転に係る駆動機構と公転に係る駆動機構とを独立して設ける構成によって、自転と公転とを別々に駆動制御することができる。したがって、培養液を収容する容器１４を公転させつつ自転させる（自公転させる）ことができる。さらに、自転および公転の各回転数（例えば、回転毎分［ｒｐｍ］）を別々に調整することができ、自公転比率（自転の回転数：公転の回転数）を自在に調整することができる。なお、これらを制御する制御部（不図示）が設けられている。
また、各容器ホルダ１６は、公転部材２２の傾斜部２３によって、第１回転軸１６ａが公転部材２２の配設面に対して所定の角度Ａをなすように配設されている。一例として角度Ａを４０［°］≦Ａ≦６０［°］に設定する。このように、容器１４を所定角度傾斜させた状態で保持して自転および公転させることによって容器１４に収容される培養液に対するせん断力を向上させ、分散性を高めることができる。なお、本実施形態では角度Ａを固定する構成としているが、一例として傾斜部２３に公知の角度調整部材を用いることにより角度Ａを自在に制御可能な構成としてもよい。
また、任意の構成として、本体部１２内（すなわち、容器１４内）の温度を調節する温度調節器（不図示）を設けてもよい。この温度調節器は、具体的には本体部１２内を加熱する加熱器もしくは冷却する冷却器、または加熱および冷却の両方の機構を備えた加熱冷却器を意味する。また、温度調節器に加えて本体部１２内（すなわち、容器１４内）の温度を感知する温度センサ２８（例えば、赤外線温度センサ）を設けてもよい。この場合、制御部により温度センサ２８からの信号（測定情報）に応じて温度調節器を動作させて、本体部１２内の温度を制御可能に構成することができる。したがって、運転時（培養時）における培養温度（培養液の温度）を一定に保持したり、自在に変化させることができる。温度センサ２８の数、位置は限定されないが、一例として図１に示す本体部１２内における容器ホルダ１６の公転軌道の近傍、公転部材２２における各容器ホルダ１６の近傍部位等に設けると、容器１４内の温度をより正確に測定できるため、好ましい。
また、任意の構成として、本体部１２内（すなわち、容器１４内）の湿度を調節する湿度調節器（不図示）を設けてもよい。この湿度調節器は、具体的には本体部１２内を加湿する加湿器もしくは除湿（乾燥）する除湿器（乾燥器）、または加湿および除湿（乾燥）の両方の機構を備えた加湿除湿器（加湿乾燥機）を意味する。また、湿度調節器に加えて本体部１２内（すなわち、容器１４内）の湿度を感知する湿度センサ（不図示）を設けてもよい。これによって、運転時（培養時）における湿度（容器１４内の湿度）を一定に保持したり、自在に変化させることができる。
また、任意の構成として、容器１４内（培養液内）にプローブ３２を挿入し、プローブ３２により培養液の各種状態を測定可能に構成してもよい。本実施形態では、図１に示すように、公転部材２２の傾斜部２３の端部２３ａに支持部材３０が連結されている。支持部材３０は、容器ホルダ１６と同一角度（ここでは、角度Ａと一致）で傾斜して容器ホルダ１６に並行する第１支持部３０ａと、容器ホルダ１６の上部で第１支持部３０ａが屈曲して容器ホルダ１６の上面（容器１４を出し入れする面）に対向する第２支持部３０ｂとからなり、側面視Ｌ字状に形成されている。第２支持部３０ｂには、一または複数の（図１では、３つ）プローブ３２が容器ホルダ１６（すなわち、容器ホルダ１６に収容された容器１４）に向かって配設され、その先端が容器１４内に挿入されている。これによって、公転部材２２の回転に伴って第２支持部３０ｂに固定されたプローブ３２を、公転部材２２と共に回転させることができる。したがって、プローブ３２の先端を容器１４内に挿入した状態で容器１４を自公転させることができる。
また、第１支持部３０ａには、プローブ３２と連結してプローブ３２から受信した測定信号を制御部に送信する通信部３４が設けられている。これによって、例えばプローブ３２を水素イオン指数（ｐＨ）や溶存酸素量（ＤＯ）等を測定する電極とした場合、容器１４を自公転させながら培養液のｐＨやＤＯを測定できる。また、プローブ３２を温度もしくは湿度を測定する電極とした場合、前述の温度センサ２８もしくは湿度センサに対して培養液の温度もしくは容器内の湿度を直接測定できる。
なお、プローブ３２と通信部３４との通信を無線で行う構成としてもよい。また、通信部３４を必ずしも支持部材３０（第１支持部３０ａ）に取付ける必要はなく、公転部材２２等に取付けてもよい。特に、プローブ３２との通信を無線で行う場合、本体部１２の内壁等に取付けてもよい。その他、支持部材３０（第１支持部３０ａ）と公転部材２２（傾斜部２３の端部２３ａ）とが簡易に着脱可能に構成される等によって、適宜容器１４が支持部材３０（第２支持部３０ｂ）等に干渉されないで容器ホルダ１６に出し入れ可能に構成される。
また、他の実施例として、プローブ３２をヒータに置換してもよい（不図示）。この場合、通信部３４を制御部から受信した制御信号をヒータに送信する送受信機に構成することにより、制御部の制御によりヒータの電源をＯＮ（またはＯＦＦ）にして培養液を加温することができる。温度を測定するプローブ３２とヒータとを備える構成とした場合、制御部によりプローブ３２からの信号（測定情報）に応じて培養液を加温することが可能になるため、運転時（培養時）における培養温度（培養液の温度）を一定に保持したり、自在に変化させることができる。
また、任意の構成として、容器１４内（培養液内）に通流管路３６の一端３６ａを挿入し、通流管路３６を通じて容器１４内外に所定の物質を給排可能に構成してもよい。本実施形態では、図１に示すように、第２回転軸２２ａと同じ中心軸で回転可能に設けられて、複数のポート３８ａを有するロータリージョイント３８を備えている。各ポート３８ａに連結された通流管路３６は第２支持部３０ｂを介して、その一端３６ａが容器１４内へ一または複数（図１では、４つ）挿入され、他端３６ｂが前記各ポート３８ａを介して本体部１２外へ連通している。これによって、公転部材２２の回転に伴って第２支持部３０ｂに固定された通流管路３６を、ロータリージョイント３８により公転部材２２と共に回転させることができる。したがって、通流管路３６の一端３６ａを容器１４内に挿入した状態で容器１４を自公転させることができる。
このようにして、容器１４を自公転させながら通流管路３６を通じて各容器１４内外に所定の物質を給排させることができる。具体的には、培養中の培養液内にｐＨ調整剤（酸またはアルカリ）、消泡剤、培地成分、酸素、暖気、冷気等を供給して培養条件（ｐＨ条件、培地条件（成分条件）、ＤＯ条件、温度条件等）を調整することができる。また、培養装置１０を運転しながら（すなわち、容器１４を自公転させながら）所望の容器１４内から培養液（生成物）を回収し、新たな培養液（微生物または培地成分）を導入することが可能になる。
また、制御部により前述のプローブ３２（例えば、ｐＨプローブやＤＯプローブ等）からの信号（測定情報）に応じて通流管路３６を通じて培養液内にｐＨ調整剤や酸素等を供給することが可能になる。したがって、運転時（培養時）における培養条件（ｐＨ条件、ＤＯ条件等）を一定に保持したり、自在に変化させることができる。
続いて、本実施形態に係るセルロース産生菌の培養方法について説明する。本実施形態に係る培養方法は、一例として培養装置１０を用いて、セルロース産生菌を添加した培地を収容した容器１４を公転させつつ自転させる工程を含む方法である。この方法は、従来の撹拌や振盪に対して、自公転よってセルロース産生菌と培地とを混合することに特徴がある。以下、具体的に説明する。
先ず、培地を用意する。培地は、セルロース産生菌の培養に一般に用いられるＨＳ培地やＺｈｏｕ培地等を適宜選択すればよい。ただし、当該培地を自公転させることから、流動体および半流動体を含む液体培地を選択する。
一例として表１にＨＳ培地およびＺｈｏｕ培地の配合を示す。ＨＳ培地には、セルロース産生菌の培養に必要な炭素源（グルコース）、窒素源（ペプトン）、ミネラル源（リン酸水素二ナトリウム）の他、有機栄養素（酵母エキス）が配合されている。また、Ｚｈｏｕ培地にも、セルロース産生菌の培養に必要な炭素源（グルコース）、窒素源（コーンスティープ）、ミネラル源（硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム・７水和物）が配合されている。これらの培地をそのまま使用してもよいが、適宜酸（例えば、酢酸）またはアルカリ（例えば、水酸化ナトリウム溶液）を加えてｐＨを調整してもよい。
次いで、用意した培地を滅菌する。一例として高圧蒸気滅菌装置で１２１［℃］、１５［分］の滅菌条件により滅菌し、その後自然冷却する。これによって、無菌培地を作製することができる。なお、前述の培地のｐＨ調整は、滅菌前および滅菌後のいずれに行ってもよい。
次いで、培地にセルロース産生菌を添加して培養液を作製する。セルロース産生菌としては、ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒまたはＫｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ等に属する細菌が知られている。細菌の添加は、無菌培地（液体）に対して細菌含有液を無菌条件下で混合することによって行う。細菌含有液とは、所定数の細菌を含む液体で、細菌として市販されているもの、およびこれを予備的に培養したもの等である。混合比は適宜調整されるが、一例として培地の体積に対して１０［％］程度の細菌含有液を混合する。
次いで、上記の通り作製した培養液（セルロース産生菌を添加した培地）を、所定の容器に収容して恒温、無菌条件下で公転させつつ自転させる。これによって、容器内でセルロース産生菌を培養することができ、当該容器内にバクテリアセルロースを生成させることができる。好ましくは、本実施形態に係る培養装置１０を用いて、容器１４内に培養液を収容し、必要に応じて栓（好気性のセルロース産生菌の場合、通気栓）（不図示）で閉じる。容器ホルダ１６に容器１４をセットし、所定温度、所定時間、容器１４を公転させつつ自転させる。このようにすれば、密閉可能な本体部１２により培養液中に雑菌等が侵入することを防止でき、温度調節器、通流管路３６等により恒温状態を維持できる。その結果、セルロース産生菌が培養され、容器１４内にはセルロースが生成される。
培養温度は限定されないが、一例としてＫｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓをＨＳ培地で培養する場合、例えば３０［℃］程度が好適である。培養温度は、厳密には培養液の温度を意味するが、培養装置１０の設定温度としてよい。なお、培養状態に応じて培養温度を変化させることが有効な場合もある。培養時間は限定されないが、一例として５日〜７日（１２０時間〜１６８時間）程度で十分なセルロースを製造することができる。
このように、本実施形態に係る培養方法では、容器１４（培養液）を自公転させることにより、従来の撹拌や振盪と比較して培養液に対するせん断力を向上させ、分散性を高めることができる。したがって、細菌と培地成分とをより均一に混合することができ、細菌の培地成分に対する接触機会および接触面積を増加させることができる。また、培養液の流れが三次元的になって容器１４内の空気を巻き込みながら攪拌されるため、細菌への酸素供給を促進することができる。その結果、従来と比較して培養速度が著しく向上すると共に安定的な培養が可能になる。また、これに伴って低コストで大量のバクテリアセルロースを安定的に製造することができる。
容器１４の自公転比率（自転の回転数：公転の回転数）は、１：２〜３：１（公転の回転数［ｒｐｍ］に対して自転の回転数［ｒｐｍ］が０．５倍〜３倍）の範囲で設定するとよい。換言すると、自公転比率＝ａ：ｂは、１≦ａ≦３、１≦ｂ≦２の範囲で設定するとよい。
このうち、自公転比率を、概ね２：１（すなわち、自公転比率＝ａ：ｂが、ａ＝２±０．１、ｂ＝１±０．１）に設定し、自転の回転数ｘ［ｒｐｍ］を、ｘ＝１４０〜１６０、公転の回転数ｙ［ｒｐｍ］をｙ＝７０〜８０に設定すると、特にせん断力および分散性が向上して、培養速度が向上し、安定的な培養が可能になる。なお、この条件で、ｘ＝１５０、ｙ＝７５に設定するとさらに好適である。
一方、自公転比率を、概ね１：１（すなわち、自公転比率＝ａ：ｂが、ａ＝１±０．１、ｂ＝１±０．１）に設定し、自転の回転数ｘ［ｒｐｍ］を、ｘ＝２８〜３２、公転の回転数ｙ［ｒｐｍ］をｙ＝２８〜３２に設定すると、生成物であるセルロース中に散在する小球の粒子径が相対的に小さく少なくなって、微小繊維を相対的に多く含むセルロースを得られる。なお、この条件で、ｘ＝３０、ｙ＝３０に設定するとさらに好適である。
本実施形態に係る培養装置１０によれば、自転および公転の各回転数（例えば、回転毎分［ｒｐｍ］）を別々に調整することができ、自公転比率（自転の回転数：公転の回転数）を自在に調整することができる。また、前述の温度調節器（および温度センサ２８）、湿度調節器（および湿度センサ）、通流管路３６（およびプローブ３２）等により培養温度、湿度、培養液のｐＨおよびＤＯ等の培養条件を自在に調整することができる。したがって、本実施形態に係る培養装置１０を用いて自転の回転数、公転の回転数、自公転比率、その他各種の培養条件を調整することにより、本実施形態に係る培養方法を最適化することができる。また、これらの条件はいずれも容器１４を自公転させながら調整可能であることから、培養中において培養状態に応じて各条件を適宜調整することにより、常時最適な状態での培養が可能になる。その結果、培養速度をさらに向上させることができ、より安定的な培養が可能になる。また、これに伴ってバクテリアセルロースをさらに安定的に製造可能になる。
これまで述べた通り、本実施形態に係る培養方法により、バクテリアセルロースを製造できる。したがって、本実施形態に係る培養方法をバクテリアセルロースの製造方法として使用でき、培養装置１０をバクテリアセルロースの製造装置として使用できる。すなわち、本実施形態に係るバクテリアセルロースの製造方法は、本実施形態に係る培養方法と同一方法であり、本実施形態に係るバクテリアセルロースの製造装置は培養装置１０と同一構成である。
本実施形態に係るバクテリアセルロースの製造方法および製造装置では、本実施形態に係る培養方法（培養装置１０）による培養後の培養液から、従来の撹拌培養あるいは振盪培養と同様の方法により、生成物（バクテリアセルロース）を回収すればよい。一例として培養後の培養液を遠心分離して底部に溜まった物質を回収する（篩に通して篩に残った物質を回収してもよい）。次いで、回収物をアルカリ（例えば、水酸化ナトリウム溶液）で処理した後蒸留水等で洗浄することによってバクテリアセルロースを回収できる。
本実施形態に係る培養装置１０を用いてセルロース産生菌を培養した。培養対象のセルロース産生菌は、Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ（Ｂｒｏｗｎ １８８６）Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．２０１３（ＮＢＲＣ番号１６６４４）とした（以下、全試験で同じ）。
（試験１）
［方法］
表１に示すＨＳ培地に水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを６．８に調整後、高圧蒸気滅菌装置で１２１［℃］、１５［分］の滅菌条件により滅菌し、その後自然冷却して無菌ＨＳ培地を得た。無菌ＨＳ培地に対して体積比１０［％］のＫｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ液を添加して培養液を得た。
［方法］
表１に示すＨＳ培地に水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを６．８に調整後、高圧蒸気滅菌装置で１２１［℃］、１５［分］の滅菌条件により滅菌し、その後自然冷却して無菌ＨＳ培地を得た。無菌ＨＳ培地に対して体積比１０［％］のＫｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ液を添加して培養液を得た。
実施例１として、本実施形態に係る培養装置１０を用いて、自転の回転数１５０［ｒｐｍ］、公転の回転数７５［ｒｐｍ］、培養温度３０［℃］設定で、培養液を７日間培養した。一方、比較例１として、水平旋回式の振盪装置を用いて、回転数１５０［ｒｐｍ］、培養温度３０［℃］設定で、培養液を７日間培養した。なお、水平旋回式の振盪装置は、培養液を収容した容器を温度制御可能な本体部内で水平方向且つ単一方向に旋回する装置である。
培養後、培養液から回収した生成物について生成率およびフーリエ変換赤外分光光度（ＦＴ−ＩＲ）による解析を行った。なお、解析に際して生成物を適宜凍結乾燥した（以下、全試験で同じ）。また、生成率は、培養後の培養液中から回収された生成物（バクテリアセルロース）の乾物重量の割合［ｇ／Ｌ］を表す（以下、全試験で同じ）。特に、本試験（試験１）では、培養日数で除した１日当たりの生成率［ｇ／Ｌ／ｄａｙ］を算出して解析を行った。生成率に関し、セルロース産生菌の培養速度が向上する程バクテリアセルロース（ＢＣ）の生成率も高くなる。したがって、生成率を培養速度の指標とすることができる。
［結果］
結果を図２および図３に示す。図２は、生成物のＦＴ−ＩＲスペクトルであって、実施例１（実線）および比較例１（破線）を比較し易くするために各例のスペクトルを上下に並列して示す。図３は、生成率［ｇ／Ｌ／ｄａｙ］を示すグラフである。
結果を図２および図３に示す。図２は、生成物のＦＴ−ＩＲスペクトルであって、実施例１（実線）および比較例１（破線）を比較し易くするために各例のスペクトルを上下に並列して示す。図３は、生成率［ｇ／Ｌ／ｄａｙ］を示すグラフである。
図２に示すＦＴ−ＩＲスペクトルは、実施例１と比較例１とで同様のピーク推移を示した。したがって、振盪培養（比較例１）で得られる生成物がバクテリアナノセルロース（ＢＮＣ）であることが既に公知であるため、自公転培養（実施例１）で得られた生成物がＢＮＣであることが確認された。
また、図３に示すＢＣ（ＢＮＣ）の生成率［ｇ／Ｌ／ｄａｙ］は、実施例１（０．３７）は比較例１（０．０３）に対して１２倍以上の高い値を示した。したがって、自公転培養によれば振盪培養に対して培養速度が著しく向上可能で、多量のセルロースが製造可能であることが示された。
（試験２）
［方法］
表１に示すＨＳ培地およびＺｈｏｕ培地それぞれ５０［ｍｌ］を、高圧蒸気滅菌装置で１２１［℃］、１５［分］の滅菌条件により滅菌し、その後自然冷却して無菌培地を得た。次いで無菌環境下において、ＨＳ培地に対しては酢酸を、Ｚｈｏｕ培地に対しては２［ｍｏｌ／Ｌ］水酸化ナトリウム溶液をそれぞれ加えて、両培地のｐＨを５．０に調整した。さらに冷凍保存していたＫｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ液を解凍し、各培地に１．８［ｍｌ］ずつ加え、３０［℃］に設定した恒温槽内で３日間培養した。こうして、ＨＳ培地およびＺｈｏｕ培地の種菌を用意した。
［方法］
表１に示すＨＳ培地およびＺｈｏｕ培地それぞれ５０［ｍｌ］を、高圧蒸気滅菌装置で１２１［℃］、１５［分］の滅菌条件により滅菌し、その後自然冷却して無菌培地を得た。次いで無菌環境下において、ＨＳ培地に対しては酢酸を、Ｚｈｏｕ培地に対しては２［ｍｏｌ／Ｌ］水酸化ナトリウム溶液をそれぞれ加えて、両培地のｐＨを５．０に調整した。さらに冷凍保存していたＫｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ液を解凍し、各培地に１．８［ｍｌ］ずつ加え、３０［℃］に設定した恒温槽内で３日間培養した。こうして、ＨＳ培地およびＺｈｏｕ培地の種菌を用意した。
一方、新たなＨＳ培地およびＺｈｏｕ培地それぞれ２７０［ｍｌ］を、上記種菌と同様に滅菌処理およびｐＨ調整を行って、各培地を実施例２用の「培養装置１０の容器１４」、および、比較例２用および参考例用の「２００［ｍｌ］容量のガラスフラスコ」に９０［ｍｌ］ずつ移した。次いで前述の種菌（種菌の入った容器）をよく振ったうえで上記の容器１４およびフラスコに１０［ｍｌ］ずつ加えた。このとき、ＨＳ培地の種菌をＨＳ培地に、Ｚｈｏｕ培地の種菌をＺｈｏｕ培地に添加した。こうして、培養装置１０用および振盪装置用のＨＳ培地培養液およびＺｈｏｕ培地培養液を得た。なお、細菌含有液として上記のように種菌を用意したのは、比較試験に際して予め所定の個体数を確保するためおよび各例の細菌条件を同一にするためである。
実施例２として、本実施形態に係る培養装置１０を用いて、自転の回転数１５０［ｒｐｍ］、公転の回転数７５［ｒｐｍ］、培養温度３０［℃］設定で、培養液を培養した。一方、比較例２として、水平旋回式の振盪装置（ＭＯ−ＡＯＲ−０２、Ｍａｊｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、回転数１５０［ｒｐｍ］、培養温度３０［℃］設定で、培養液を培養した。さらに、参考例として、恒温槽を用いて培養温度３０［℃］設定で培養液を培養した。以上の方法による培養を、培養日数１日、３日、５日、７日としてそれぞれ実施した。
培養後、培養液から回収した生成物を観察すると共に走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、フーリエ変換赤外分光光度（ＦＴ−ＩＲ）、生成率、Ｘ線回折（ＸＲＤ）、および結晶化度［％］による解析を行った。
［結果］
結果を表２および図４〜図８に示す。なお、培養日数に関わらない解析結果（図４〜図６および図８）は、適宜視認しやすい培養日数の検体を選択して示している。
結果を表２および図４〜図８に示す。なお、培養日数に関わらない解析結果（図４〜図６および図８）は、適宜視認しやすい培養日数の検体を選択して示している。
図４は生成物の写真であって、図４Ａに実施例２、図４Ｂに比較例２、図４Ｃに参考例を示す。このうち、「Ｉ」は外観写真、「ＩＩ」は拡大写真（３０倍）を示す（ただし、図４Ｃは拡大写真「ＩＩ」を示さない）。また、図５は生成物のＳＥＭ像（１００００倍）であって、図５Ａに実施例２、図５Ｂに比較例２、図５Ｃに参考例を示す。
実施例２および比較例２では、微小繊維および直径が約１［ｍｍ］の小球からなるセルロースが生成された（直径は「断面の直径」）。一方、参考例では、膜状セルロース（ペリクル）が生成され、実施例２および比較例２とは相違した。これに対して、図５に示すＳＥＭ像では、実施例２、比較例２および参考例いずれもナノサイズの微小繊維から構成されて構造が共通し、微小繊維のサイズにも差異が認められなかった。このことから、セルロース中の小球は微小繊維同士が絡み合ったものと推測され、実施例２および比較例２では、自公転または振盪によりせん断力が作用するため、参考例（静置培養）のような膜状セルロース（ペリクル）にはならなかったと推測された。以上の結果から、自公転培養によれば静置培養および振盪培養と同程度の微小なナノセルロース繊維が得られることが示された。
また、図６は、生成物のＦＴ−ＩＲスペクトルであって、実施例２（実線）および比較例２（破線）ならびに参考例（長鎖線）を上下方向に並列して示す。これによれば、実施例２および比較例２ならびに参考例で同様のピーク推移を示し、セルロースの赤外吸収ピークが確認された。したがって、自公転培養（実施例２）で得られた生成物がＢＣ（ＢＮＣ）であることが確認された。
また、図７は、培養日数［日］によるＢＣ（ＢＮＣ）の生成率［ｇ／Ｌ］の変化を示すグラフであって、図７ＡにＺｈｏｕ培地、図７ＢにＨＳ培地を示し、それぞれ実施例２を実線、比較例２を破線で示す。これによれば、いずれの培地でも全ての培養日数で振盪培養（比較例２）よりも自公転培養（実施例２）の方が、ＢＣ生成率が高くなった。また、振盪培養（比較例２）では、いずれの培地でもＢＣ生成率が培養５日に対して培養７日で低くなる等、不安定な培養が認められた。これに対して、自公転培養（実施例２）では、いずれの培地でもＢＣ生成率が培養日数と共に直線的に高くなる安定的な培養が認められた。以上の結果から、自公転培養によれば振盪培養に対して培養速度が向上すると共に安定的な培養が可能であることが示された。また、これに伴って低コストで大量のバクテリアセルロースを安定的に製造可能であることが示された。
また、図８は、生成物のＸＲＤパターンであって、実施例２および比較例２ならびに参考例を上下方向に並列して示す（上側が実施例２、中央が比較例２、下側が参考例）。これによれば、実施例２および比較例２ならびに参考例でいずれもＢＣの回折ピーク（２θ＝１４．３°、２θ＝１６．８°および２θ＝２２．５°の位置）が確認された。したがって、自公転培養（実施例２）で得られた生成物がＢＣであることが確認され、自公転培養によれば振盪培養と同様に結晶化したＢＣを得られることが示された。
また、表２に、回折ピークから算出した生成物の結晶化度［％］を示す。これによれば、自公転培養（実施例２）では、全ての培養条件で結晶化度は振盪培養（比較例２）に対して同等または高い値を示した。特に、培養３日（ＨＳ培地：＋１４．６［％］、Ｚｈｏｕ培地：＋１２．８［％］）および培養５日（ＨＳ培地：＋１６．９［％］、Ｚｈｏｕ培地：＋６．１［％］）では顕著に高かった。
従来、動的培養では、培養液に対してせん断力が作用するため、得られるＢＣの結晶化度は比較的低くなると言われていた。これに対して、自公転培養により得られるＢＣは結晶化度が相対的に高く、条件によっては静置培養と同等の約９０［％］に近いものも得られることが示された（Ｚｈｏｕ培地の培養５日：８８．１［％］）。
以上のことから、自公転培養によれば、静置培養に匹敵する高い結晶化度を持つ微小なナノセルロース繊維を製造することができる。得られた微小繊維は他の材料と混ぜて使用することができる。例えば、セルロースは人体に有害でないため、分散安定剤として水に不溶の食品と混ぜて使用するができる。他にも、抄紙の工程で紙力増強剤として使用したり、表面改質をすることで樹脂と混ぜて樹脂の強度を向上させることができる。さらに、当該微小繊維は高い結晶化度を有して強度や融点が相対的に高く、従来の振盪培養等により得られた繊維よりも高い補強効果を発揮することができる。
（試験３）
［方法］
表１に示すＺｈｏｕ培地２００［ｍｌ］に対して試験２と同様に滅菌処理およびｐＨ調整を行った培地に、試験２と同様に解凍したＫｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ液１．８［ｍｌ］を加え、３０［℃］に設定した恒温槽内で３日間培養して種菌を用意した。
［方法］
表１に示すＺｈｏｕ培地２００［ｍｌ］に対して試験２と同様に滅菌処理およびｐＨ調整を行った培地に、試験２と同様に解凍したＫｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ液１．８［ｍｌ］を加え、３０［℃］に設定した恒温槽内で３日間培養して種菌を用意した。
一方、新たなＺｈｏｕ培地２７０［ｍｌ］に対して上記種菌と同様に滅菌処理およびｐＨ調整を行った培地を４検体分用意し、次いで前述の種菌（種菌の入った容器）をよく振ったうえで各培地に３０［ｍｌ］ずつ加え、培養液を得た。
実施例３〜実施例６として、本実施形態に係る培養装置１０を用いて、それぞれ表３に示す自転回転数［ｒｐｍ］および公転回転数［ｒｐｍ］ならびに自公転比率で、培養液を培養した。各例共に、培養温度は３０［℃］、培養日数は３日とした。
培養後、培養液から回収した生成物を観察すると共に粒子径分布による解析を行った。なお、粒子径分布は、ＳＡＬＤ−７０００（島津製作所製）を使用したレーザ回折錯乱法により測定した。
［結果］
結果を図９および図１０に示す。図９は生成物の写真であって、図９Ａに実施例３、図９Ｂに実施例４、図９Ｃに実施例５、図９Ｄに実施例６を示す。このうち、「Ｉ」は外観写真、「ＩＩ」は拡大写真（３０倍）を示す。また、図１０は生成物の粒子径分布を示すグラフである。
結果を図９および図１０に示す。図９は生成物の写真であって、図９Ａに実施例３、図９Ｂに実施例４、図９Ｃに実施例５、図９Ｄに実施例６を示す。このうち、「Ｉ」は外観写真、「ＩＩ」は拡大写真（３０倍）を示す。また、図１０は生成物の粒子径分布を示すグラフである。
図９に示すように、全ての実施例で微小繊維および小球からなるセルロースが生成され、自公転比率１：２〜３：１の範囲で問題なくＢＮＣが得られることが確認された。一方、実施例４（自公転比率＝１：１）では、実施例３、５、６と比較して小球が相対的に少なく、微小繊維が相対的に多い状態が認められた。
また、図１０に示す粒子径分布は、実施例３、５、６では粒子径のピークが３００［μｍ］〜４００［μｍ］であるのに対して、実施例４では粒子径のピークが１７０［μｍ］付近であった。以上のことから、自公転比率を１：１に設定することにより生成物中の小球が相対的に小さく少なくなって、微小繊維を相対的に多く含むセルロースを得られることが示された。
なお、追加試験として培養装置１０を用いて前述のＫｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓを培養したところ、自転の回転数７５［ｒｐｍ］且つ公転の回転数７５［ｒｐｍ］に設定した場合のＢＣ生成率［ｇ／Ｌ］は０．６３であったのに対して、自転の回転数３０［ｒｐｍ］且つ公転の回転数３０［ｒｐｍ］に設定した場合のＢＣ生成率［ｇ／Ｌ］は０．８０であった。したがって、自公転比率を１：１に設定する場合、概ね自転の回転数を３０［ｒｐｍ］、公転の回転数を３０［ｒｐｍ］に設定すると、比較的培養速度が速くなって好適である。
本発明は、以上説明した実施例に限定されることなく、本発明を逸脱しない範囲において種々変更可能である。特に、本発明に係る自公転による培養方法を、セルロース産生菌に限らず、各種の生物検体すなわちセルロース産生菌以外のバクテリアおよび微生物、ならびに各種の細胞、組織およびこれらの成分に対して適用してもよい。また、本発明に係る培養装置を、上記の生物検体に使用する生化学反応装置として、さらには各種の反応物に使用する化学反応器として適用してもよい。
Claims (23)
- セルロース産生菌を添加した培地を収容した容器を公転させつつ自転させる工程を含むこと
を特徴とするセルロース産生菌の培養方法。 - 前記工程において、培養状態に応じて自公転比率（自転の回転数：公転の回転数）を変更すること
を特徴とする請求項１記載のセルロース産生菌の培養方法。 - 前記工程において、培養状態に応じて自転および公転の少なくとも一方の回転数［ｒｐｍ］を変更すること
を特徴とする請求項１記載のセルロース産生菌の培養方法。 - 前記工程において、
自公転比率（自転の回転数：公転の回転数）＝ａ：ｂが、
１≦ａ≦３、１≦ｂ≦２であること
を特徴とする請求項１または請求項２記載のセルロース産生菌の培養方法。 - 前記工程において、
自公転比率（自転の回転数：公転の回転数）＝ａ：ｂが、
ａ＝１±０．１、ｂ＝１±０．１であること
を特徴とする請求項４記載のセルロース産生菌の培養方法。 - 前記工程において、
自転の回転数ｘ［ｒｐｍ］が、ｘ＝２８〜３２であり、
公転の回転数ｙ［ｒｐｍ］が、ｙ＝２８〜３２であること
を特徴とする請求項５記載のセルロース産生菌の培養方法。 - 前記工程において、
自公転比率（自転の回転数：公転の回転数）＝ａ：ｂが、
ａ＝２±０．１、ｂ＝１±０．１であること
を特徴とする請求項４記載のセルロース産生菌の培養方法。 - 前記工程において、
自転の回転数ｘ［ｒｐｍ］が、ｘ＝１４０〜１６０であり、
公転の回転数ｙ［ｒｐｍ］が、ｙ＝７０〜８０であること
を特徴とする請求項７記載のセルロース産生菌の培養方法。 - 請求項１〜８のいずれか一項に記載のセルロース産生菌の培養方法を用いたバクテリアセルロースの製造方法。
- 請求項１〜８のいずれか一項に記載の培養方法に用いるセルロース産生菌の培養装置であって、
開閉可能な本体部と、
各々第１回転軸を中心に回転可能に設けられて、複数の前記容器を各々保持する複数の容器ホルダと、
該各容器ホルダを回転駆動する第１駆動手段と、
該各容器ホルダの第１回転軸を回転可能に支持すると共に、第２回転軸を中心に回転可能に設けられて、該各容器ホルダを該第２回転軸の周りに公転させる公転部材と、
該公転部材を回転駆動する第２駆動手段と、を備えていること
を特徴とする培養装置。 - 前記第２回転軸と同じ中心軸で回転可能に設けられて、複数のポートを有するロータリージョイントを備え、
前記各ポートに連結された通流管の一端が前記各容器内へ一または複数挿入され、他端が前記各ポートを介して前記本体部外へ連通していることによって、該通流管を介して、前記各容器内へｐＨ調整剤、消泡剤、培地成分、培養液および酸素の少なくともいずれかが供給可能に、または培養による生成物が回収可能に構成されていること
を特徴とする請求項１０記載の培養装置。 - 前記本体部内の温度を調節する温度調節器、および前記本体部内の湿度を調節する湿度調節器の少なくともいずれかの機器を備えていること
を特徴とする請求項１０または請求項１１記載の培養装置。 - 請求項９記載の製造方法に用いるバクテリアセルロースの製造装置であって、
開閉可能な本体部と、
各々第１回転軸を中心に回転可能に設けられて、複数の前記容器を各々保持する複数の容器ホルダと、
該各容器ホルダを回転駆動する第１駆動手段と、
該各容器ホルダの第１回転軸を回転可能に支持すると共に、第２回転軸を中心に回転可能に設けられて、該各容器ホルダを該第２回転軸の周りに公転させる公転部材と、
該公転部材を回転駆動する第２駆動手段と、を備えていること
を特徴とする製造装置。 - 前記第２回転軸と同じ中心軸で回転可能に設けられて、複数のポートを有するロータリージョイントを備え、
前記各ポートに連結された通流管の一端が前記各容器内へ一または複数挿入され、他端が前記各ポートを介して前記本体部外へ連通していることによって、該通流管を介して、前記各容器内へｐＨ調整剤、消泡剤、培地成分、培養液および酸素の少なくともいずれかが供給可能に、または製造されたバクテリアセルロースが回収可能に構成されていること
を特徴とする請求項１３記載の製造装置。 - 前記本体部内の温度を調節する温度調節器、および前記本体部内の湿度を調節する湿度調節器の少なくともいずれかの機器を備えていること
を特徴とする請求項１３または請求項１４記載の製造装置。 - 生物検体を収容した容器を公転させつつ自転させる工程を含むこと
を特徴とする培養方法。 - 前記生物検体は微生物であって、該微生物を添加した培地を収容した容器を公転させつつ自転させる工程を含むこと
を特徴とする請求項１６記載の培養方法。 - 前記工程において、培養状態に応じて自公転比率（自転の回転数：公転の回転数）を変更すること
を特徴とする請求項１６または請求項１７記載の培養方法。 - 前記工程において、培養状態に応じて自転および公転の少なくとも一方の回転数［ｒｐｍ］を変更すること
を特徴とする請求項１６または請求項１７記載の培養方法。 - 前記工程において、
自公転比率（自転の回転数：公転の回転数）＝ａ：ｂが、
１≦ａ≦３、１≦ｂ≦２であること
を特徴とする請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の培養方法。 - 前記工程において、
自転の回転数ｘ［ｒｐｍ］が、ｘ＝１４０〜１６０であり、
公転の回転数ｙ［ｒｐｍ］が、ｙ＝７０〜８０であること
を特徴とする請求項１９記載の培養方法。 - 請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の培養方法に用いる培養装置であって、
開閉可能な本体部と、
各々第１回転軸を中心に回転可能に設けられて、複数の前記容器を各々保持する複数の容器ホルダと、
該各容器ホルダを回転駆動する第１駆動手段と、
該各容器ホルダの第１回転軸を回転可能に支持すると共に、第２回転軸を中心に回転可能に設けられて、該各容器ホルダを該第２回転軸の周りに公転させる公転部材と、
該公転部材を回転駆動する第２駆動手段と、を備えていること
を特徴とする培養装置。 - 開閉可能な本体部と、
各々第１回転軸を中心に回転可能に設けられて、複数の容器を各々保持する複数の容器ホルダと、
該各容器ホルダを回転駆動する第１駆動手段と、
該各容器ホルダの第１回転軸を回転可能に支持すると共に、第２回転軸を中心に回転可能に設けられて、該各容器ホルダを該第２回転軸の周りに公転させる公転部材と、
該公転部材を回転駆動する第２駆動手段と、を備えていること
を特徴とする化学反応器。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019117575 | 2019-06-25 | ||
| JP2019117575 | 2019-06-25 | ||
| PCT/JP2020/024502 WO2020262342A1 (ja) | 2019-06-25 | 2020-06-23 | セルロース産生菌の培養方法および培養装置、ならびにバクテリアセルロースの製造方法および製造装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2020262342A1 true JPWO2020262342A1 (ja) | 2021-12-23 |
Family
ID=74061364
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021526993A Pending JPWO2020262342A1 (ja) | 2019-06-25 | 2020-06-23 | セルロース産生菌の培養方法および培養装置、ならびにバクテリアセルロースの製造方法および製造装置 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPWO2020262342A1 (ja) |
| WO (1) | WO2020262342A1 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6339516A (ja) * | 1986-08-05 | 1988-02-20 | 株式会社 日本医化器械製作所 | ２重回転テ−ブル |
-
2020
- 2020-06-23 WO PCT/JP2020/024502 patent/WO2020262342A1/ja active Application Filing
- 2020-06-23 JP JP2021526993A patent/JPWO2020262342A1/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6339516A (ja) * | 1986-08-05 | 1988-02-20 | 株式会社 日本医化器械製作所 | ２重回転テ−ブル |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF CHEMICAL TECHNOLOGY & BIOTECHNOLOGY, vol. 85, JPN6020033325, 2010, pages 151 - 164, ISSN: 0005022560 * |
| JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY & BIOTECHNOLOGY, vol. 29, JPN6020033327, 2002, pages 189 - 195, ISSN: 0005022561 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2020262342A1 (ja) | 2020-12-30 |
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