JPWO2020241453A1

JPWO2020241453A1 - 脂質二分子膜チャネル評価チップ及びその製造方法並びに評価装置

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Publication number: JPWO2020241453A1
Application number: JP2021522290A
Authority: JP
Inventors: 文彦廣瀬; 健作鹿又; 愛弓平野; 大介但木
Original assignee: Tohoku University NUC; Yamagata University NUC
Current assignee: Tohoku University NUC; Yamagata University NUC
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2021-12-02
Anticipated expiration: 2040-05-21
Also published as: WO2020241453A1; JP7162283B2

Abstract

脂質二分子膜チャネル評価チップ１０が、孔１１ａが形成された樹脂フィルム１１と、金属薄膜からなり、樹脂フィルムの表面に孔１１ａに臨むように且つ孔１１ａを挟んで相対向して設けられた一対の電極１２と、一対の電極１２を覆う金属酸化物膜１３と、を具備するようにする。

Description

本発明は、脂質二分子膜に埋め込まれたイオンチャネル（プロテインチャネル）の機能性を評価するための脂質二分子膜チャネル評価チップ及びその製造方法並びに脂質二分子膜チャネル評価チップを備える評価装置に関するものである。

脂質二分子膜は、リン脂質分子が二層で反対向きに配列した構造をもっており、生物の細胞膜の基本構造でもある。これは、細胞の機能としては細胞内部と外界との隔壁の役割を担っている。実際の細胞においては、細胞の内外においてイオンや分子輸送をつかさどるタンパク質、すなわちプロテインチャンネルが埋め込まれており、細胞の活動の一部を担っている。膜タンパク質の中でもイオンチャネルと呼ばれるタンパク質は、刺激に反応してイオンを細胞の内外に透過させる機能をもつ。受容体機能を有するイオンチャネルはリガンド依存性チャネルと呼ばれ、細胞外からのシグナルを受け取り、細胞内へのイオン流入を引き起こす。一方、膜電位の変化に鋭敏に反応してイオン流出入を制御するイオンチャネルは電位依存性チャネルと呼ばれる。どちらのチャネルも細胞の活動において重要な働きを担っており、特に神経や筋肉での信号伝搬において、信号伝令媒体として機能している。

このような重要な機能を有するイオンチャネルタンパク質であるが、薬物に敏感で、多くの薬物の開発ターゲットであると同時に、予期せぬ副作用の作用点にもなり易いことが知られている。したがって、創薬の領域においては、新規候補化合物のイオンチャネルに対する薬物の効果および副作用のリスクを評価することが必要である。チャネル機能の評価法としては、図９に示されるパッチクランプ法が用いられている。これは電極を内封したガラス管を細胞膜に密着させ、細胞膜中のイオンチャネルを透過するイオン流を電流波形として計測するものである。この方法は、精密操作を駆使した熟練を要する方法であり、測定に時間がかかるのみならず、細胞の状態に依存しやすい等の課題も多い。

一方、東北大学の平野らは、特許文献１に示されるような、シリコン基板に貫通孔を開け、端部をテーパー構造とし、脂質二分子膜でＳｉ基板を挟むように据え付け、貫通孔に脂質膜を固定して張る方法を考案している。この方法では、シリコン基板に貫通孔を形成し、貫通孔を覆うようにＳｉＯ_２膜とＳｉ_３Ｎ_４膜を形成し、ＳｉＯ_２膜とＳｉ_３Ｎ_４膜に微細孔を設けて、テーパー構造を形成したことを特徴とするチップが用いられている。この構造においては、脂質二分子膜を容易に上記微細孔の部分に形成し保持することができ、そこにイオンチャンネルを埋め込んで、チップを生理食塩水中におくことで、脂質二分子膜越しに電界をかけ、導電性を評価して、膜の形成の有無やイオンチャンネルの有無、そしてその動作を評価することが可能になる。この方法は、パッチクランプ法に比べて評価が簡便であり、イオンチャネルを任意に包埋して評価できるため、対象イオンチャネルのみの評価が可能であり、計測の信頼性を高めることができた。

かかる脂質二分子膜のイオンチャンネル評価チップは、微細孔が汚染されると脂質二分子膜の再形成が困難であり、使い捨てで利用するのが実態であり、できる限り低コストなものとする必要があった。

しかし上記の方法においては、Ｓｉ基板に高度な微細加工を施して貫通孔や微細孔を形成する必要があり、その際に高額な半導体製造装置を活用するため、高コストになる問題があった。さらにこの方法では、シリコンウェハを加工して形成した微細構造を使用するため、加工の工程数が多く、高コストになってしまう問題があった。

また、脂質二分子膜に平行な方向に電圧をかけることができれば、新規なイオンチャネル機能評価法を構築できる可能性があるが、パッチクランプ法では対応が困難であり、シリコンチップタイプでは加工が容易でないという問題があった。

特開２０１８−１４０４７８号公報

本発明は、上述した事情に鑑み、脂質二分子膜を孔に張り付け形成できる脂質二分子膜チャネル評価チップにおいて、低コストで製造できる構造とその製造方法を提供し、さらに脂質二分子膜に埋め込まれたイオンチャンネルの動作を簡易に安価で評価することが可能な評価装置を提供することを目的とする。

前記目的を達成する本発明の第１の態様は、孔が形成された樹脂フィルムと、金属薄膜からなり、前記樹脂フィルムの表面に前記孔を臨むように且つ当該孔を挟んで相対向して設けられた一対の電極と、前記一対の電極を覆う金属酸化物膜と、を具備することを特徴とする脂質二分子膜チャネル評価チップにある。

本発明の第２の態様は、前記金属酸化物膜上には、その表面をシラン化処理したシラン化処理膜が設けられている、ことを特徴とする第１の態様の脂質二分子膜チャネル評価チップにある。

本発明の第３の態様は、前記樹脂フィルムの厚さが１０〜２０μｍであり、前記孔の直径が１００〜３００μｍである、ことを特徴とする第１又は２の態様の脂質二分子膜チャネル評価チップにある。

本発明の第４の態様は、前記樹脂フィルムがポリテトラフルオロエチレンからなる、ことを特徴とする第１〜３の何れか一つの態様の脂質二分子膜チャネル評価チップにある。

本発明の第５の態様は、樹脂フィルムに孔を形成する工程と、前記樹脂フィルムの表面に、金属薄膜からなる一対の電極を、前記孔を臨むように且つ当該孔を挟んで相対向するように形成する工程と、前記一対の電極を覆う金属酸化物膜を形成する工程と、を具備することを特徴とする脂質二分子膜チャネル評価チップの製造方法にある。

本発明の第６の態様は、前記金属酸化物膜上に、その表面をシラン化処理したシラン化処理膜を形成する工程をさらに具備する、ことを特徴とする第５の態様の脂質二分子膜チャネル評価チップの製造方法にある。

本発明の第７の態様は、前記樹脂フィルムの厚さを１０〜２０μｍとし、１００〜２００μｍの直径で前記孔を形成する、ことを特徴とする第５又は６の態様の脂質二分子膜チャネル評価チップの製造方法にある。

本発明の第８の態様は、前記孔を電界放電により形成する、ことを特徴とする第７の態様の脂質二分子膜チャネル評価チップの製造方法にある。

本発明の第９の態様は、前記金属酸化物膜を電子ビーム蒸着により、厚さ５０〜３００ｎｍの厚さに形成する、ことを特徴とする第５〜８の何れか一つの態様の脂質二分子膜チャネル評価チップの製造方法にある。

本発明の第１０の態様は、第１〜４の何れか一つの態様の脂質二分子膜チャネル評価チップと、該脂質二分子膜チャネル評価チップに設けられた前記一対の電極に接続され、当該電極に電圧を印加する電源と、を含んで構成されている、ことを特徴とする評価装置にある。

本発明によれば、脂質二分子膜を孔に張り付け形成できる脂質二分子膜チャネル評価チップにおいて、低コストで製造できる構造とその製造方法を提供することができる。さらに、この脂質二分子膜チャネル評価チップを備え、脂質二分子膜に埋め込まれたイオンチャンネルの動作を簡易に安価で評価することが可能な評価装置を提供することができる。

本発明に係る脂質二分子膜チャネル評価チップの概略構成を示す斜視図である。本発明に係る脂質二分子膜チャネル評価チップの断面図である。本発明に係る脂質二分子膜チャネル評価チップの変形例を示す平面図である。本発明に係る脂質二分子膜チャネル評価チップの変形例を示す平面図である。本発明に係る脂質二分子膜チャネル評価チップの変形例を示す断面図である。本発明に係る脂質二分子膜チャネル評価チップを利用した評価装置の概略構成を示す模式図である。本発明に係る脂質二分子膜チャネル評価チップの作製方法を示す模式図である。本発明に係る脂質二分子膜チャネル評価チップによって記録したイオンチャンネルの動作波形の一例を示す図である。従来法である、細胞膜中に埋め込まれたイオンチャンネルを評価するパッチクランプ法の説明図である。

図１は、本発明の一実施形態に係る脂質二分子膜チャネル評価チップの概念的な斜視図である。図２は、本発明の一実施形態に係る脂質二分子膜チャネル評価チップの断面構造を示す図であり、図１のＡ−Ａ´線に対応する断面図である。図３は、脂質二分子膜チャネル評価チップの変形例を示す平面図である。また図４は、脂質二分子膜チャネル評価チップの変形例を示す平面図であり、図５は、図４のＢ−Ｂ´線に対応する断面図である。

図１及び図２に示すように、本発明に係る脂質二分子膜チャネル評価チップ（以下、イオンチャネル評価チップともいう）１０は、孔１１ａが形成された樹脂フィルム１１と、金属薄膜からなり樹脂フィルム１１の表面に孔１１ａに臨むように且つ孔１１ａを挟んで相対向して設けられた一対の電極１２と、一対の電極１２を覆う金属酸化物膜１３と、を具備する。

樹脂フィルム１１の材質、厚みは特に限定されないが、好適には、厚み１０〜２０μｍのフッ素樹脂フィルム（フッ化炭素樹脂フィルム）が用いられ、より好適には、厚みが１２〜１５μｍのポリテトラフルオロエチレンフィルム、特に好適には、テフロン（登録商標）フィルムが用いられる。

このような樹脂フィルム１１に形成される貫通孔である孔１１ａは、脂質二分子膜を設けることができるものであれば、その大きさや形状は特に限定されないが、例えば、１００〜２００μｍ程度の直径を有する。

一対の電極１２は、この孔１１ａを挟んで相対向して設けられている。これら一対の電極１２は、それぞれＬ字型に形成されており、各電極１２の一方の端部同士が孔１１ａを挟んで向い合い、且つ一対の電極１２の全体が孔１１ａを挟んで線対称となるように配置されている。また各電極１２の一方の端部は、孔１１ａを臨むように設けられている。「電極１２が孔１１ａを臨むように設けられている」とは、電極１２が孔１１ａの周縁端部ぎりぎりまで又は孔１１ａの内周面の少なくとも一部まで設けられていることをいう。また、各電極１２の他方の端部は、後述する評価装置の電源に接続される接続端子１２ａとなっている。このような電極１２は、樹脂フィルム１１の全面に形成された金属薄膜をパターニングしたものでも、パターン形成された金属薄膜であってもよい。

一対の電極１２は、脂質二分子膜が設けられた孔１１ａの直径方向に平行な方向に電圧を印加することができるものであればよく、そのパターン形状等は特に限定されない。

電極１２を形成する金属薄膜の材料としては、アルミニウム（Ａｌ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、チタン（Ｔｉ）などを挙げることができ、特にチタン（Ｔｉ）が好ましい。また、金属薄膜の厚さは、例えば、５０〜３００ｎｍである。

金属酸化物膜１３は、電極１２を覆うように設けられている。具体的には、金属酸化物膜１３は、各電極１２の一端部に設けられる接続端子１２ａを除いた部分を覆って設けられている。この金属酸化物膜１３の材料は、周囲との電気的絶縁を確保することができるものであれば、特に限定されない。金属酸化物膜１３の材料としては、例えば、シリコン（Ｓｉ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ハフニウム（Ｈｆ）、アルミニウム（Ａｌ）などの酸化物を挙げることができ、シリコン酸化物（ＳｉＯ_２）が特に好ましい。

金属酸化物膜１３の厚さは、例えば、５０〜２００ｎｍ程度であり、好ましくは、７０〜１２０ｎｍである。本実施形態では、孔１１ａの両側に設けられた一対の電極１２の上にシリコン酸化物（ＳｉＯ_２）の薄膜である金属酸化物膜１３を１００ｎｍの厚さで形成している。

ここで、金属酸化物膜１３の表面には、その表面をシラン化処理したシラン化処理膜１４が設けられている。シラン化処理膜１４を設けることで、金属酸化物膜１３の表面が疎水化され、金属酸化物膜１３の表面への脂質膜形成が促される。なおシラン化処理膜１４は、必須の構成ではなく、必要に応じて設けられればよい。

ところで、電極１２の接続端子１２ａは、本実施形態では、電極１２の他の部分と同様に一層の金属薄膜で形成されているが、複数層の金属薄膜で形成されていてもよい。例えば、図３に示すように、接続端子１２ａは、樹脂フィルム１１上に設けられるチタン（Ｔｉ）からなる第１層１２１と、第１層１２１上に設けられる白金（Ｐｔ）又は金（Ａｕ）からなる第２層１２２とで形成されていてもよい。

さらに、接続端子１２ａを複数層で形成する場合、電極１２の接続端子１２ａ以外の部分も複数層で形成するようにしてもよい。例えば、図４及び図５に示すように、接続端子１２ａがチタン（Ｔｉ）からなる第１層１２１と金（Ａｕ）からなる第２層１２２とで形成されている場合、電極１２の接続端子１２ａ以外の部分は、第１層１２１及び第２層１２２と、チタン（Ｔｉ）からなる第３層１２３とで形成するようにしてもよい。

このように接続端子１２ａを複数層の金属薄膜で形成することで、電極１２への電圧印加を繰り返した際に、接続端子１２ａにおける接触抵抗の上昇を抑制することができる。

このような本発明のイオンチャネル評価チップ１０の活用法について、図６を用いて説明する。図６は、脂質二分子膜チャネル評価チップ（イオンチャネル評価チップ）を用いる評価装置の概略構成を示す模式図である。

イオンチャネル評価チップ１０は、例えば、図６に示すような評価装置１００の一部として活用される。図示するように、イオンチャネル評価チップ１０の表裏面両側から、孔１１ａを覆うように脂質二分子膜２０を形成し、その中にイオンチャネルタンパク質を埋め込む。この脂質二分子膜２０を含めて、イオンチャネル評価チップ１０を生理食塩水からなるバッファー３０に浸す。その際、バッファー３０は、イオンチャネル評価チップ１０により、図中左右で別室に分離される。また、図中左右の別室のバッファー３０にそれぞれ電極４０を差し込み、これらの電極４０に電位をかける。これにより、イオンチャネル評価チップ１０の表裏の両面に形成されている脂質二分子膜２０に垂直方向の電界がかかり、イオンチャネル５０を通過するイオンを電流のパルスとして計測することができる。

また評価装置１００は、イオンチャネル評価チップ１０に設けられた一対の電極１２間に電圧を印加するための電源１１０を備えている。すなわち評価装置１００は、イオンチャネル評価チップ１０と共に、イオンチャネル評価チップ１０に設けられた一対の電極１２に接続されてこれら一対の電極１２間に電圧を印加する電源１１０と、を含んで構成されている。

この評価装置１００の構成では、電源１１０によって一対の電極１２間に、脂質二分子膜２０に平行する方向、すなわち孔１１ａの直径方向に平行する方向、に電圧が印加される。これにより、イオンチャネル５０に対する外部電圧による刺激の効果を比較的容易に確認することができる。

なお、評価装置１００に用いられるイオンチャネル評価チップ１０は、複数のチップがアレイ化されたものであってもよい。これにより、評価装置１００のスループットの向上を図ることができる。

また、本発明に係るイオンチャネル評価チップ１０は、チップ単体、あるいは評価装置１００として販売できることはもちろん、イオンチャネル評価チップ１０と専用の電源ボックスとをセットにして販売することも可能である。

イオンチャネル評価チップの作製方法を図７に示す。イオンチャネル評価チップの作製方法としては、まずは、図７（ａ）に示すように、樹脂フィルム１１としてテフロン（登録商標）フィルムを準備し、図７（ｂ）に示すように、電界放電により直径が約１００μｍの孔１１ａを形成する。この後、例えば、ニッケル（Ｎｉ）製メタルマスクを用いて、図７（ｃ）に示すように、空間選択的にチタン（Ｔｉ）等の金属薄膜からなる一対の電極１２を形成する。樹脂フィルム１１と金属薄膜の密着性を高めるために、金属薄膜の蒸着方法としては電子ビーム蒸着法を用いるのが好ましい。

次に、各電極１２の接続端子１２ａを除いて、図７（ｄ）に示すように、シリコン酸化物（ＳｉＯ_２）からなる金属酸化物膜１３を電極１２上に均一に蒸着する。これにより、電極１２と外界の電気的接触が抑制される。さらに、必要に応じて、図７（ｅ）に示すように、シリコン酸化物（ＳｉＯ_２）からなる金属酸化物膜１３の表面にシラン化処理を行い、シラン化処理膜１４を形成する。以上の工程により脂質二分子膜２０に埋め込まれたイオンチャンネル評価チップ１０は完成する（図７（ｆ）参照）。

（実施例１）
イオンチャネル評価チップ１０を次のように作製した。樹脂フィルム１１として、厚さ１２〜１５μｍで広さが３２×４０ｍｍ^２のテフロン（登録商標）フィルム（ＹＳＩＩｎｃ．ＨｉｇｈＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＭｅｍｂｒａｎｅＫｉｔ）を準備し、電界放電により約１００μｍの孔１１ａを形成した。そのときに、樹脂フィルム１１を平坦な銅板の上に置き、タングステンニードルを樹脂フィルム１１上に接触させ、１．７ｋＨｚで振幅３ｋＶの交流を３４０サイクル分のバースト波として銅板とタングステンニードルとの間にかけることで放電させた。

この後、ニッケル（Ｎｉ）製メタルマスクを用いて、空間選択的にチタン（Ｔｉ）の金属薄膜からなる一対の電極１２を形成する。電極１２の厚みは２００ｎｍである。樹脂フィルム１１と電極１２との密着性を高めるために、電極１２となるチタン薄膜の蒸着方法として電子ビーム蒸着法を用い、この時の樹脂フィルム１１の温度は２５℃とした。

一対の電極１２の形状は、それぞれＬ字型とし、それらが孔１１ａを挟んで向い合せた形で配置する。電極１２のＬ字の上部分の一部、すなわち接続端子１２ａを除いて、シリコン酸化物（ＳｉＯ_２）の薄膜である金属酸化物膜１３を均一に蒸着する。これにより、電極１２と外界の電気的接触を抑制している。金属酸化物膜１３の厚みは、１００ｎｍである。金属酸化物膜１３の蒸着方法も電子ビーム蒸着とし、その時の樹脂フィルム１１の温度は室温とする。

さらに金属酸化物膜１３の表面をシラン化処理してシラン化処理膜１４を形成する。具体的には、窒素雰囲気化において、tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl demethylchloro silane(PFDS)を２％（体積濃度）でトルエンに溶かし、完成したチップを６時間、室温にて浸漬する。これによりチップ表面に対して、脂質二分子膜２０の接触を促し、膜張を容易にする。以上の工程で脂質二分子膜２０に埋め込まれた実施例１のイオンチャンネル評価チップ１０を作製した。

（試験例）
実施例１のイオンチャンネル評価チップ１０を活用し、脂質二分子膜２０にＮａｖ１．５チャネルを埋めこみ、評価装置１００によって膜越しの電流を評価する試験を行った。その結果を図８に示す。Ｎａｖ１．５チャネルとは、心筋活動電位の脱分極を担うナトリウムチャネルで、このチャネルは、通常では閉じている。この状態で電流波形を観測すると、図８（ｂ）のような平坦な電流波形となる。

電源１１０によって一対の電極１２に電圧を印加し、脂質二分子膜２０に平行な電圧（膜平行電圧）がかかると、図８（ａ）に示すようなパルス波形が観測された。このことから、膜平行電圧がかかると、イオンチャネルが開いてチャネルとして機能することが分かった。つまり、膜平行電圧をトリガとして、イオンチャネルの機能性を評価できることが分かった。

１樹脂フィルム
２電極
１０イオンチャネル評価チップ（脂質二分子膜チャネル評価チップ）
１１樹脂フィルム
１１ａ孔
１２電極
１２ａ接続端子
１３金属酸化物膜
１４シラン化処理膜
２０脂質二分子膜
３０バッファー
４０電極
５０イオンチャネル
１００評価装置
１１０電源

Claims

孔が形成された樹脂フィルムと、
金属薄膜からなり、前記樹脂フィルムの表面に前記孔を臨むように且つ当該孔を挟んで相対向するように設けられた一対の電極と、
前記一対の電極を覆う金属酸化物膜と、を具備する、
ことを特徴とする脂質二分子膜チャネル評価チップ。
前記金属酸化物膜上には、その表面をシラン化処理したシラン化処理膜が設けられている、
ことを特徴とする請求項１に記載の脂質二分子膜チャネル評価チップ。
前記樹脂フィルムの厚さが１０〜２０μｍであり、前記孔の直径が１００〜３００μｍである、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の脂質二分子膜チャネル評価チップ。
前記樹脂フィルムがポリテトラフルオロエチレンからなる、
ことを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の脂質二分子膜チャネル評価チップ。
樹脂フィルムに孔を形成する工程と、
前記樹脂フィルムの表面に、金属薄膜からなる一対の電極を、前記孔を臨むように且つ当該孔を挟んで相対向するように形成する工程と、
前記一対の電極を覆う金属酸化物膜を形成する工程と、を具備する、
ことを特徴とする脂質二分子膜チャネル評価チップの製造方法。
前記金属酸化物膜上に、その表面をシラン化処理したシラン化処理膜を形成する工程をさらに具備する、
ことを特徴とする請求項５に記載の脂質二分子膜チャネル評価チップの製造方法。
前記樹脂フィルムの厚さを１０〜２０μｍとし、１００〜２００μｍの直径で前記孔を形成する、
ことを特徴とする請求項５又は６に記載の脂質二分子膜チャネル評価チップの製造方法。
前記孔を電界放電により形成する、
ことを特徴とする請求項７に記載の脂質二分子膜チャネル評価チップの製造方法。
前記金属酸化物膜を電子ビーム蒸着により、厚さ５０〜３００ｎｍの厚さに形成する、ことを特徴とする請求項５〜８の何れか一項に記載の脂質二分子膜チャネル評価チップの製造方法。
請求項１〜４の何れか一項に記載の脂質二分子膜チャネル評価チップと、
該脂質二分子膜チャネル評価チップに設けられた前記一対の電極に接続され、当該電極に電圧を印加する電源と、を含んで構成されている、
ことを特徴とする評価装置。