JP2009524045A

JP2009524045A - バイオセンサ

Info

Publication number: JP2009524045A
Application number: JP2008551230A
Authority: JP
Inventors: シャントンチェン，; ミンビンユー，; ハンフアフェン，; グオキャングロ，
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2006-01-20
Filing date: 2006-01-20
Publication date: 2009-06-25
Also published as: WO2007084076A8; WO2007084076A1; US20100248284A1; EP1982167A1; EP1982167A4; AU2006335689A1

Abstract

埋設された電子感知素子を有する基板（１０１）を備え、埋設された電子感知素子の上に基板面（１２４）がある、バイオセンサを実現し、構造化された最上層（１２５）は基板面（１２４）を覆い、基板面（１２４）の上に上面を有し、少なくとも１つの刺激及び／又は感知電極（１１６）並びに上面（１２５）と基板面（１２４）との間に配列されたチャネル（１２１）を介した吸引を使って生体分子を保持するための前記チャネル（１２１）を備え、感知電極（１１６）は電子感知素子に電気的に結合され、試料液中に存在する生体分子を置けるように上面（１２５）が設けられ、生体分子内の電気的変動及び生体分子の存在を感知するための感知電極（１１６）が備えられる。
【選択図】図２Ｊ

Description

発明の分野

[001]本発明は、一般に、生体分子電子回路に関するものであり、より具体的には、生体細胞などの生体分子の検出に使用されるバイオセンサに関するものである。

発明の背景

[002]過去数十年にわたり、一連の法的遺伝毒性試験を実施できる効率的で信頼性の高い臨床前医薬品発見方法の必要性が高まってきているため、細胞内のイオンチャネル活性の並行及び自動監視を行うことができるバイオセンサの開発に向かって研究取り組みが拡大してきている。現在使用されているさまざまなタイプのバイオセンサの中でも、近年は、細胞及び組織ベースの試験を行う非侵襲的バイオセンサの開発が急速に進んでいる。

[003]非侵襲的バイオセンサは、細胞（又は細胞ネットワーク）の活動電位が細胞膜内のイオンチャネルを流れるイオン電流に対応するという原理に基づいて動作する。イオン電流は、細胞膜内に配置されている受容体及びチャネルタンパク質によりゲートされる、つまり制御されることが広く受け入れられている。これらのタンパク質は、次いで、受容タンパク質に結合することができ、その結果細胞膜内のイオンチャネルの開放をトリガし、ナトリウムイオン及び塩素イオンなどのイオンを流れるようにできる分子により制御される。これらのイオン電流は、大きさは小さいけれども、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）ベースの非侵襲的バイオセンサにより正確に測定できる。

[004]これらのイオンチャネルの挙動、特にそのゲーティング特性を調べるために、さまざまな方法を使用し、細胞バイオセンサを使って細胞で発生するイオン電流を連続的に監視しながら、受容体及びチャネルタンパク質の特性を刺激するか、又は受容体及びチャネルタンパク質の特性を変調することができる。これらの方法は、例えば、膜貫通電圧変調、チャネルの細胞内及び／又は細胞外側に作用するリガンド（リガンド依存性イオンチャネル）、機械的変形（機械刺激依存性イオンチャネル）、又はそれらの組み合わせを含む。

[005]非侵襲的ＦＥＴベースのバイオセンサは、例えば、米国特許第６，５７０，１９６Ｂ１号、及び第６，６０２，３９９Ｂ１号で説明されており、そこでは、ニューロンからのイオン信号と半導体センサ内の電子信号とを直接結合することができるデバイスについて説明している。このデバイス及び方法は、医薬品業界における基本的な神経生物学的研究からハイスループットスクリーニング用途に至るまで広範な使用分野を開く。他の実施例では、Ｆ．Ｐｅｔｅｒら（ＰｈｙｓｉｃａｌＲｅｖｉｅｗＬｅｔｔｅｒｓ、第７６巻、３２７ページ、１９９６年）は、パッチクランプデバイスにより神経細胞にＡＣ電圧が印加され、その結果得られた信号がＦＥＴベースのセンサにより記録された実験を説明している。

[006]しかし、これらのデバイスにおける電子機器による神経網の監視では、センサ上に神経細胞を正確に配置する必要がある。このような配列を実装する際に遭遇する問題は、試料と電極アセンブリとの間に良好な物理的相互作用（したがって、安定した電気的接続）を確立することである。良好な試料−電極間相互作用を実現しようとする際の問題に関わる要因の１つは、そのような細胞の運動性と構造的柔軟性である。生体内条件の下で、神経細胞は、例えば、成長中に、さまざまな形態の学習及び記憶過程に関して、その形態と接続性を変化させる。その結果、細胞と電極アセンブリとの間の電気的相互作用が常時変化することになる。そのような問題は、大規模な、高い試験スループットを得ようとデバイスをスケールアップするときにより深刻なものとなる。

[007]同様に、培養神経細胞は、試験デバイスの表面上に一定の位置を保持することは滅多にない。細胞の位置ずれについては、例えば、Ｍ．Ｊｅｎｋｎｅｒ、Ｂ．Ｍｕｌｌｅｒ、及びＰ．ＦｒｏｍｈｅｒｚらのＢｉｏｌ．Ｃｙｂｅｒｎ．、第８４巻、２３９ページ、２００１年で説明されており、そこでは、神経細胞が突出しながら成長して神経細胞体の位置をずらすことについて説明されている。神経細胞のこのような運動性のせいで、神経細胞体は電極面に関して連続的トランスロケーションを生じることになり、その結果、センサの感度及び記録された電位の正確さが影響を受ける。この問題に加えて、培養神経細胞の大部分は、感知デバイスと確実な物理的接触を形成しないことがしばしばあり、そのため、表面電極との機能的接触が確立されない。

[008]これらの問題を解決するために、いくつかの試みがなされている。国際公開第２００４／１０９２８２Ａ１号パンフレットでは、食作用と呼ばれる生物学的現象を利用して、電極として機能する生体細胞を突出金属マイクロネイルの構造に固定することを説明している。食作用は、生体細胞の原形質膜が粒子の周りに広がり、それにより、粒子を包み込む活動依存過程である。粒子が生体細胞内に「沈む」と、粒子は生体細胞内に取り込まれて吸収される。しかし、この固定が行われるためには、生体細胞は、少なくとも１つのマイクロネイルの頭を包み込んで緊密な物理的接触を形成する必要がある。このような現象の発生には、いくらかの統計的な可能性しかなく、したがって、このような現象は、細胞を監視する目的に関して十分に信頼性が高いといえないことがすでに報告されている。

[009]Ｇ．Ｚｅｃｋ及びＰ．Ｆｒｏｍｈｅｒｚ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９８巻、１０，４５７〜１０，４６２ページ、２００１年）は、初期位置から離れてゆくのを防ぐために神経細胞の周りに立てたポリマーの柱の形の機械的「フェンス」を設けることにより細胞の位置ずれという問題を解決しようと試みた。実験設定では、少数の大型神経細胞について、このような配列が細胞の位置ずれを低減できることが報告された。しかし、現実実務では、マルチトランジスタアレイにおいて、マイクロスケールの柱内に手作業で個々の神経細胞を入れるのは実用的ではない。操作の速度が重要な大規模アプリケーションでは、神経細胞を自動的に位置決めし、神経細胞のトランスロケーションを減らすように電子デバイスを設計することが重要である。

[010]Ｅｖｅｒｓｍａｎｎら（ＩＥＥＥＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｏｌｉｄ−ＳｔａｔｅＣｉｒｃｕｉｔｓ、第３８巻、第１２号、２００３年１２月）は、神経活動を撮像するためにＣＭＯＳチップを使用するセンサアレイを開示している。感知電極は、好適な生体適合誘電体層で覆われ、標準ＣＭＯＳプロセスで加工されたＭＯＳＦＥＴのポリシリコンゲートに接続される。誘電体層は、ＴｉＯ_２及びＺｒＯ_２の交互に並ぶ層からなる複合体を含む。試験される細胞試料は、誘電体層上で直接培養される。しかし、細胞試料を固定化するために、センサ上に専用の構造が設けられることはない。

[011]上記のデバイスの欠点は、他の隣接する細胞に影響を与えることなく個別の生体細胞上で薬物の薬学的スクリーニングを実行するのが困難である点である。そうするには、受容体系を含む生体細胞に試験製剤原料を接触させ、細胞受容体系上のエフェクターとしての薬物の機能を調べるために、ピペットパッチクランプが必要である。このような配列は、実験機器を手動で操作するためにかなりの設置労力と高い技能を有するオペレータを必要とし、また故障率も高い。例えば、Ｆ．Ｐｅｔｅｒ（上記）において開示されているデバイスでは、細胞を位置決めし、安定させることだけでなく、パッチクランプデバイスによりＡＣ電圧を細胞に印加することでも難題に直面する。

[012]したがって、本発明の目的は、従来技術のデバイスの上述の欠点のうちのいくつかを経済的に、また有利に回避するか、又は減らす代替えバイオセンサを実現することである。

発明の概要

[013]本発明の第１の態様によれば、生体分子の状態が変化することで生じる電気的変動を感知するための、埋設された電子感知素子を有する基板を備えるバイオセンサが実現される。この基板は、埋設された電子感知素子の上に配置された基板面を有する。構造化された最上層は、基板面を覆うように配列される。構造化された最上層は、試料液中に存在する生体分子が置かれる感知領域を設けた上面を有する。電子感知素子に電気的に結合された感知電極は、感知領域に露出している表面の少なくとも一部を有するように配列される。少なくとも１つのチャネルは、吸引力を使用し、生体分子と感知電極との間の物理的接触を確実にすることにより、生体分子を固定化するように適合された、構造化された最上層内に配列される。

[014]本発明の第２の態様によれば、バイオセンサを形成する方法は、生体分子の状態の変化により生じる電気的変動を感知するための電子感知素子を中に埋め込んだ基板、及び埋設された電子感知素子の上に配置されている基板面を形成するステップと、基板面の上に配置された上面を有する構造化された最上層で基板面を覆うステップと、構造化された最上層内に、又は構造化された最上層の上に感知電極を形成するステップと、感知電極を電子感知素子に電気的に結合するステップと、試料液中に存在する生体分子を置けるように上面を適合させるステップと、構造化された最上層内に、吸引力により生体分子を固定化するように適合された少なくとも１つのチャネルを形成するステップとを含む。

[015]本発明の第３の態様によれば、生体分子の状態を分析する方法が実現され、この方法は、本発明のバイオセンサの感知電極を生体分子と接触させるステップと、生体分子の第１の状態に関連する第１の電気信号を測定するステップと、生体分子を、その生体分子の状態を変化させることができると思われる条件に曝すステップと、前記条件に曝された後に生体分子の状態に関連する第２の電気信号を測定するステップとを含む。

[016]本発明のバイオセンサは、単一基板内に、ＦＥＴベースの感知デバイス、及びＣＭＯＳ互換プロセスを使用して従来の平面パッチクランプの機能を実行する必要な構造を組み込む。この組み込みにより、従来のパッチクランプ電極とＦＥＴトランジスタの両方による同時測定、及び順次測定を生体分子に対し実行し、これにより、医薬用原料のスクリーニングだけでなく細胞試料の機能的特性に関する測定などの感知アプリケーションを実行するのに要する時間を短縮することができる。それに加えて、加工にＣＭＯＳ互換プロセスを使用することにより、小型化が容易になり、他の有用な機能を備える複数の補助構造を簡単に取り入れることができる。本発明によるバイオセンサの利点の１つは、感知電極上に生体分子試験試料を固定化するのが容易であるという点である。本発明の吸い込みチャネルでは、感知電極及びパッチクランプ電極において生体分子を自動的に位置決めし、安定させることができ、そのため、生体分子と細胞外平面電位感応電極及び／又はパッチクランプ電極との間の予測可能な相互作用を実現できる。電位感応電極、及びしたがって、パッチクランプ電極は、測定のために同時に、又は順次使用することができ、したがって、生体分子を固定化し、刺激し、特徴付けるために従来技術で説明されている複雑な手順が不要になる。

[017]このような文脈において、「生体分子」という用語は、細胞塊、多細胞生物及び構造、単細胞及び細胞下構造を含む組織フラグメントを含む生物由来物質を指す。この用語は、さらに、「生体分子体」などの他の相当する用語と置き換えても使用される。本発明が適用されうる細胞は、一般に、電位感受性であるタイプの細胞又は真核細胞と原核細胞の両方を含む、電位の変化を受けうる細胞を含む。真核細胞の例は、植物細胞と動物細胞の両方を含む。いくつかの動物細胞の例は、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞などの神経系内の細胞、コリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、及びペプチド作動性神経細胞などの自律神経細胞、嗅細胞、聴細胞、光受容細胞などの感覚変換器細胞、ソマトトロピン産生細胞、プロラクチン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、下垂体前葉からの性腺刺激ホルモン産生細胞及び副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、甲状腺細胞、及び副腎細胞などのホルモン分泌細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺細胞、及び脂腺細胞などの内分泌上皮細胞、及び骨芽細胞、線維芽細胞、割球、肝細胞、神経細胞、卵母細胞、赤血球、リンパ球、又は単球などの血球、筋細胞、胚幹細胞などの筋肉細胞を含む他の細胞を含む。真核細胞の他の例は、酵母細胞及び原虫を含む。植物細胞の例は、分裂組織細胞、柔細胞、厚角細胞、及び厚壁細胞を含む。本発明において適用すべき原核細胞は、例えば、古細菌細胞及び細菌体を含む。それに加えて、生体分子という用語は、細胞核、核小体、小胞体、中心体、細胞骨格、ゴルジ体、ミトコンドリア、リソソーム、ペルオキシソーム、液胞、細胞膜、サイトゾル、細胞壁、葉緑体、並びにそのフラグメント、派生物、及び混合物などの細胞下（細胞内）構造などの他の種類の生物由来物質を包含する。

[018]バイオセンサの設計に対する以下のコメントは、バイオセンサを形成する方法について対応する形において有効である。

[019]本発明によれば、試験すべき生体分子を固定化するためチャネルが設けられる。このチャネルは、構造化された最上層内に形成され、これは従来の加工技術を使用して加工できる好適な物質を含むことができる。好ましくは、構造化された最上層は、従来のＣＭＯＳ処理の影響を受けやすい、したがってさまざまな構造を中に形成できる物質を含む。この構造化された最上層は、基板面の上に形成され、試料液が置かれる感知領域を設けた上面を有する。

[020]好ましい一実施形態では、上面に配置された少なくとも２つの開口部内で終端するチャネルが設けられ、このチャネルは構造化された最上層内に配列されるか、又は好ましくは構造化された最上層内に実質的に埋め込まれ、これら２つの開口部のうちの第１の開口部は感知電極の近く若しくは近接して配置され、これらの開口部のうちの第２の開口部は第１の開口部から隔てられている。感知電極は、その表面の少なくとも一部が感知領域に露出されるように配列される、つまり、いくつかの実施形態では、感知電極は、構造化された最上層の上面と基板面との間に配列されるか、又は構造化された最上層の上面上に配列されうるということである。電極が構造化された最上層の上面に配列された場合、電極と接触している溶液又は液体の電気化学特性の測定を行うことができ、これにより、本発明を、例えば、電気化学センサとして使用することができる。生体分子は、チャネル内の吸引を使って第１の開口部上に固定化することができ、前記吸引は第１の開口部を通して実行され、これにより、チャネル内に低い圧力を発生させ、その結果、試料液を第１の開口部内に、次いでチャネル内に移動させることができる。この吸引力は、試験される試料生体分子を第１の開口部へ向けて移動し、最終的に第１の開口部を塞ぎ、これにより、開口部上で固定化する。生体分子が置かれる試料液は、食塩液、蒸留水、又は場合によっては、生体細胞を生かし続けるために必要な栄養溶液を含むことができる。

[021]試料中の電気的変動を感知する電子感知素子が、基板内に埋め込まれる。基板は、電子感知素子に配線をつなぐため所望の回路に応じて、単一の層又は複数の層を備えることができる。また、これは、補助電気的コンポーネントが基板内に含まれるかどうかにも依存する。一実施形態では、基板は、半導体層、第１の電気的絶縁層、第２の電気的絶縁層、及び第３の電気的絶縁層を含む連続的に形成された層列を備える。感知電極接続部は、電気的絶縁スクリーニング電極により囲まれるようにでき、スクリーニング電極は、グラウンドに接続され、スクリーニング電極は、第３の電気的絶縁層内に形成される。電子感知素子は、さらに、半導体層及び第１の電気的絶縁層と重なり合うように形成されうる。

[022]電子感知素子は、感知電極の近く、又は感知電極上の領域の電気的特性の微細な変化を感知することができる電子デバイスを備えることができる。一実施形態によれば、電子感知素子は、ゲート領域を有する電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）である。生体分子と電界効果トランジスタとの間に電気的接続を確立するために、感知電極が、好適な接続手段を介して電界効果トランジスタのゲート領域に電気的に接続される。基板内の電界効果トランジスタの埋設位置に応じて、接続構造を使用して感知電極をゲート領域に物理的に接続し、それにより、感知電極と電界効果トランジスタとの間の電気的接続を確立することができる。例えば、感知電極は、感知電極接続部を介して電界効果トランジスタのゲート領域に電気的に接続されうる。

[023]測定が主に感知素子を使用して実行されうる場合、感知機能を実行するための他の補助コンポーネントをデバイスに組み込むとよい。一実施形態では、パッチクランプ電極が、第１の開口部の隣に配置されたチャネル内に設けられ、外部アクセス可能基準電極が、構造化された最上層の上面、又は感知室内の他の位置に設けられる。これら２つの電極は、チャネルに至る第１のアパーチャ上に位置決めされている細胞膜上の電流を測定するために、外部計測器に接続されるか、又は半導体層内に含まれる回路と一体化されうる。試料生体分子、例えば細胞を第１のアパーチャ上に位置決めし、チャネルを介して細胞の表面に好適な吸引力を加えることにより、チャネルを従来のパッチクランプマイクロピペットとして機能させることができる。加えられる吸引力は、細胞膜に孔があく程の十分な大きさとすることができる。これ以降、細胞に対する測定は、感知素子又はパッチクランプ電極／基準電極を使用して実行されるか、又は両方とも、測定結果を同時に得るために同時に使用されうる。

[024]従来のパッチクランプ機能を備えるのとは別に、パッチクランプ電極及び基準電極も、いくつかの他の機能に使用される。最初に、細胞がアパーチャ上に位置するか、又は適切に封止するかを検出する。アパーチャ上の細胞位置の前に、電解質溶液が導電性であるため、パッチクランプ電極と基準電極との間の抵抗は低い。細胞がアパーチャ上に独りでに位置するか、又は封止する場合、抵抗は増大する。適切に封止されている場合、抵抗は１ギガΩ以上の範囲内と高く、したがってパッチクランプ試験は、うまく確実に実行されうる。電極の第２の機能は、アパーチャの周りに非一様な電界を発生し、電気泳動効果により細胞がアパーチャに流れるのを助ける。第３に、これらの電極は、膜透過イオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の電気的特性を特徴付ける（例えば、電圧固定法により）。例えば、細胞の膜が、破裂した後、パッチクランプ電極及び基準電極によりそれぞれの１つ又は複数のイオンチャネルを含む膜に電位差が印加され、同時に、この電位差を維持するために必要な電流が分析される。このようにして、さまざま試験刺激に応答して生じる膜透過イオンチャネルの電気的特性の変化が測定されうる。

[025]感知電極は、規則正しい中実の楕円形又は中実の四角形、特に中実の円形又は中実の正方形などの好適な形状を取りうる。それとは別に、感知電極は、規則正しいリング（円環）形状を取ることができ、加えられる吸引力が通る第１の開口部は、リング形状の感知電極内に配置される。そのような形状を有する電極は、リング電極とも呼ばれる。また、試験すべき生体分子との十分な接触を実現できる限り、不規則な形状を使用することも可能である。統一された形状である、つまり単一の素子を備える感知電極とは別に、考えられている他の代替え手段は、チャネルの第１の開口部の周りに配列された複数の個別感知電極素子を備える１つの感知電極を含む。感知電極素子は、適している形状であればどのような形状でもよい。生体分子とこの代替え手段の感知電極との間の接触の可能性を高めるために、チャネルの第１の開口部の周りに４つ又はそれ以上電極素子を配列するとよい。

[026]他の実施形態では、感知電極に加えて、試料生体分子を電気的に刺激するためにチャネルの開口部の近くに刺激電極が備えられる。刺激電極が存在しない場合、試料生体分子に電気的刺激を加えるために、もし存在すればパッチ電極を使用することもできる。いずれの場合も、電気的刺激に対する個別生体分子の応答は、感知電極により検出され、同時に記録されうる。

[027]電子感知素子は、外部回路又は基板内に組み込まれている回路に電気的に接続できる。電気的な接続を確立するために、一実施形態による第２の電気的絶縁層内に形成されたトラック導体にその電子感知素子を接続するとよい。他の実施形態では、感知電極は、第３の電気的絶縁層内に配列されている感知電極接続部を介して電子感知素子に電気的に結合されうる。感知電極と基板との間に、電子感知素子により得られた信号を増大するための増幅回路などの補助電気コンポーネントを入れることができる。

[028]一実施形態では、補助電気コンポーネントは、グラウンドに接続されているスクリーニング電極を備える。グラウンドに接続されているスクリーン電極の目的は、位置決め時に、又はパッチクランプ試験の際に、又は細胞を刺激するときに、基板内の感知回路、刺激回路、及び増幅回路に由来する、特に半導体層内のノイズ信号をスクリーニングすることである。電子感知素子が電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）である場合、ＦＥＴのソース領域及びドレイン領域は、両方とも、半導体層内に配列され、トラック導体に接続される。さらに、ＦＥＴのゲート領域は、感知電極接続部を介して感知電極に電気的に接続される。望ましくないショートを防ぐために、基板の層の大部分は、ソース及びドレイン領域だけでなく増幅回路、記録回路などの必要な回路を形成するために使用される半導体層を除き、電気的絶縁材料で作られる。ゲート領域は、好ましくは、第１の電気的絶縁層の一部によりチャネル領域から電気的に絶縁される。

[029]他の実施形態では、構造化された層の上面の一部をなす感知電極の表面を含む、構造化された最上層の上面は、生体適合層で覆われる。感知電極及び／又は構造化された最上層の上面上への生体分子の付着を改善する必要がある場合、この生体適合層を設けるとよい。それに加えて、このような生体適合層は、生体分子が接触する層から有毒物質などの汚染物質を吸収するのを防ぐ。使用できる生体適合層の例として、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩＩ型、又はＶ型）、キトサン、ヘパリン、さらには、フィブロネクチン、デコリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、及び増殖因子（ＴＧＦβ、ｂＦＧＦなど）が挙げられる。

[030]生体適合性材料は、典型的には電気的に絶縁性を有するので、この生体適合層は、好ましくは、感知電極の感度が影響を受けないように、つまり、それでも生体分子により引き起こされる電位を検出できるように十分に薄いものとする。感知電極は、感知され分析される生体分子と直接的導電性接触をするか、又は生体適合層を介して感知され分析される生体分子に容量結合されうる。必要ならば、追加の電気的絶縁層を上面と生体分子との間に設けることもできる。

[031]一実施形態では、バイオセンサの上面に、室壁が設けられる。室壁は、少なくとも１つの感知室を定めるように、又は大規模アプリケーションの場合には、試験される試料が置かれる複数の感知室を定めるように配列されうる。一実施形態では、チャネルの第１の開口部が、少なくとも１つの感知室の内側に形成され、チャネルの２つの開口部のうちの第２の開口部が、少なくとも１つの感知室の外側に形成される。

[032]本発明の好ましい一実施形態では、室壁は、感知室に加えて、チャネルの第２の開口部が形成される少なくとも１つの流体制御室を定めるように配列される。この実施形態では、流体制御室は、感知室から排出又は放出された流体を保持するために使用される。例えば、生体分子が試料液中に含まれ、感知室内に置かれる場合、試料液は吸引でチャネルを通り感知室から流体制御室に引き込まれるようにできる。この結果、生体分子は開口部に向かって引かれ、最終的に、開口部の上に位置し、開口部を塞ぐ形になり、これにより、上で説明されているように開口部のところで固定化される。

[033]本発明の第２の態様によれば、本発明のバイオセンサを形成する方法が実現される。この方法は、埋設された電子感知素子を有する基板を備えるステップと、基板面を構造最上層により覆うステップと、構造化された最上層内、又はその上に、感知電極及び試料生体分子を固定化するためのチャネルを形成するステップと、感知電極を電子感知素子に電気的に結合するステップと、生体分子が置かれるように上面を適合させるステップとを含む。本発明のこの方法により得られる利点は、機械加工装置を使用することなく構造化された最上層内に横方向チャネルを形成できるという点である。

[034]一実施形態では、本発明の方法は、以下で詳しく説明されるウェットエッチング、化学機械研磨、及び材料蒸着を含む、従来のＣＭＯＳ加工技術の系統的組み合わせを使用する。チャネルは、上面で終端する少なくとも２つの開口部を有する、構造化された層内に形成され、チャネルは構造化された最上層内に実質的に埋め込まれ、２つの開口部のうちの第１の開口部（好ましくは、試験される生体分子よりも実質的に小さくなければならない範囲内にある、約０．３〜５μｍから約１０μｍまでの範囲を有する）は感知電極の隣に配列される。チャネルの機能は、吸引を通じて感知電極の上に置かれている生体分子の位置を油圧で制御することである。試料液をチャネルに通して排出すると、第１の開口部に吸引力が発生する。この吸引力を使用して、生体分子を感知電極の上の適所に保持する。

[035]チャネルは、膜蒸着、フォトリソグラフィ、乾式エッチング、ＣＭＰ、及びウェットエッチングなどの従来のＣＭＯＳバックエンドプロセスにより形成されうる。チャネル用の犠牲材料と周囲材料の最適な組み合わせを選択し、ウェットエッチングプロセスの実行中及び実行後に周囲材料が損なわれないようにしながらウェットエッチングプロセスにより犠牲材料を取り除けるようにすることが重要である。

[036]本発明の第３の態様は、本発明のバイオセンサの特定の用途に関係する。一般に、本発明のバイオセンサは、生体分子の電気生理学的評価を伴うアプリケーションにおいて使用されうる。このようなアプリケーションは、典型的には、評価される生体分子とトランジスタなどの電子センサとの接触を必要とする。バイオセンサの通常のアプリケーションは、薬物のスクリーニング（例えば、細胞膜内のイオンチャネルに対する化合物活性の電気生理学的な判定について調べる）及び細胞の特性の研究（微小電極電気せん孔法の仕組みに関する研究）を含む。

[037]細胞の研究、例えば、膜分極を特徴付ける、或いは孔形成又は生体分子の状態の変化の発生の検出のため膜貫通閾値電位を決定する研究は、第１及び／又は第２の電気信号を所定の電気信号閾値と比較することにより行うことができる。例えば、第２の電気信号は、変化した状態に対応することが知られている電気信号と比較することができ、それとは別に、第１の電気信号と第２の電気信号との差の形状及び大きさを所定の電気信号閾値と比較することができる。第１の電気信号と第２の電気信号との差の形状及び大きさが所定の電気信号閾値と比べて大きい場合、生体分子が曝される条件は、その状態を変化させることができるものと判定される。

[038]一実施形態では、試験される細胞を、チャネルを通して加えられる吸引力により所定の試験部位に配置し、次いで、生体分子の表面を、吸引力（生体分子を固定化するために使用される吸引力と同じ大きさでも、異なる大きさでもよい）を使って破裂させ、これにより、イオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の膜貫通電気的特性を利用することができる。試料に対する電気的測定を実行するために、生体分子上にパッチクランプ電極及び基準電極によりＡＣ電位差が印加され、その表面は、イオンチャネルを含み、それと同時に、その結果得られる、この差を維持するために必要な電流（吸引力が加えられる細胞の領域内に配置された、又は分離された輸送構造を介したイオン移動に由来する）は、ＦＥＴトランジスタにより測定される。この点に関して、細胞内の輸送構造は、細胞膜内に配置されている構造、つまり、アニオンチャネル、カチオンチャネル、アニオン輸送体、カチオン輸送体、受容タンパク質、及び結合タンパク質のどれかを含む。従来のパッチクランプ技術によれば、上記の測定は、全細胞又は細胞接着法を使用して無傷細胞に対し実行されうる。

[039]上述のアプリケーションを実行する過程において、電子感知デバイスと接触させるために、感知電極の表面に生体分子を固定化することが好ましい。一実施形態では、生体分子をバイオセンサ上に固定化するステップは、バイオセンサの上面で発生する吸引力を使って実行される。吸引力は、生体分子が置かれている感知室内の１つ又は複数の開口部を通して試料液のポンプ駆動吸引により発生させることができ、これらのアパーチャは感知室から試料液を取り出すチャネルに接続されている。

[040]消費されたときにヒト又は動物に対し治療効果を有すると思われている薬物及び薬用食物は、本発明のバイオセンサを使用してスクリーニングすることができる。この目的のために、生体分子の第１の状態に関連する第１の電気信号を測定するステップと、生体分子を、その生体分子の状態を変化させることができると思われるスクリーニング物質に曝すステップと、前記スクリーニング物質に曝された後に生体分子の状態に関連する第２の電気信号を測定するステップとを実行することができる。上記の方法を実行することにより、細胞、特に、細胞内のイオンチャネルの機能特性に対するスクリーニング物質の効果を測定することができる。

[041]バイオセンサを使用して生体分子に対し従来のパッチクランプ測定を実行する場合、パッチクランプ回路に接続されているパッチクランプ電極及び基準電極が両方とも使用され、これにより、電位を制御し、膜上を伝導する電流を測定する。電流又は電位及び刺激に対する応答の変化は、試料液と接触しているバイオセンサの上面に存在する基準電極及びチャネル内の電極により測定できる。生体分子に印加される刺激は、吸引力を使って生体分子の表面を破裂させ、チャネル内の電解質と細胞の内部との間の電気的導通を生じ、それにより、さまざまなイオンチャネル内を流れる全電流又は電圧を、チャネル内に配置されているパッチクランプ電極及びバイオセンサの上面に存在する基準電極により測定することができる。

[042]したがって、本発明は、１）生体分子の位置決めを簡素化し、特に、生体分子の位置を自動的に、また正確に位置決めし、２）生体分子、例えば、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）などの電子デバイスの表面上の神経細胞の位置ずれ問題を、所定の細胞外平面電位感応電極のところで生体分子を安定させることにより解決し、３）上述の生体分子に対する試験物質を容易にスクリーニングするための装置及び方法を実現する。いくつかの実施形態では、本発明を使用することで、複数の生体分子体を同時にスクリーニングすることができる。

[043]本発明は、生体分子の位置決め及び電気的分析に使用されうる。本明細書で使用されているように、生体分子を位置決めするステップは、一般に、典型的にはその後の分析のために、システム内の所定の位置に生体分子を配置するか、又は置くステップを含む。本明細書で使用されているように、生体分子を分析するステップは、一般に、生体分子の存在及び生体分子内の活動を検出するステップを含むが、その一方で、これは、典型的には少なくとも一部は生体分子の電気的特性に関して所定の位置に位置決めされる。

[044]本発明のさまざまな態様は、以下の説明、図面、及び限定されない実施例を考慮してさらに完全に理解される。

[045]本発明を理解するために、また本発明をどのように実用できるかを示すために、付属の図面を参照しつつ、限定されない実施例のみを使って好ましい実施形態を説明することにする。

詳細な説明

[053]本発明の第１の実施形態によるバイオセンサ１００を通る断面が、図１に示されている。生体分子２００、第１の実施形態では、神経細胞などの生体細胞が、分析のためバイオセンサ１００上に置かれる。本発明の第１の実施形態によれば、バイオセンサ１００は、基板１０１に埋め込まれている電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）１０６を使って生体分子２００の電気的特性を検出する。

[054]基板１０１は、一連の半導体層１０２、第１の電気的絶縁層１０３、第２の電気的絶縁層１０４、及び第３の電気的絶縁層１０５を含む層配列である。基板１０１の層配列は、第３の電気的絶縁層１０５を封じ込める基板面１１５で終端する。シリコン（Ｓｉ）を半導体層１０２の材料として使用し、また第１、第２、及び第３の電気的絶縁層１０３、１０４、１０５の材料として二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）を使用するのが好ましい。しかしながら、他の好適な半導体及び電気的絶縁材料も、それぞれ、基板１０１内の層１０１から１０５に使用されうる。

[055]ＦＥＴ１０６は、半導体層１０２内に配列され、半導体層１０２の好適なドーピングにより形成されるソース及びドレイン領域１０７、１０８、並びにソース領域１０７とドレイン領域１０８の上に、またその間に横方向に第１の電気的絶縁層１０３内に配置され、第１の電気的絶縁層１０３の残り部分がゲート領域１０９の電気的絶縁のためゲート領域１０９と半導体層１０２との間に保持されるように配置されているゲート領域１０９を備える。半導体層１０２では、ゲート領域１０９の下のソース領域１０７とドレイン領域１０８との間の領域は、ＦＥＴ１０６のチャネル領域として作用する。ソース及びドレイン領域１０７、１０８は、第２の電気的絶縁層１０４内に配列されているそれぞれのソース及びドレイントラック導体１１０、１１１に電気的に接続される。ゲート領域１０９は、第２の電気的絶縁層１０４内にさらに配列されているゲートリード１１２に電気的に接続される。さらに、ゲート領域１０９は、感知電極接続部１１４及びゲートリード１１２を介して感知電極１１６に電気的に接続される。感知電極１１６は、ゲートリード１１２の上にそれ自体配列される、また第２及び第３の電気的絶縁層１０４、１０５を通してゲートリード１１２から感知電極１１６に伸びる感知電極接続部１１４の上の基板面１１５上に配列されている。感知電極１１６及び感知電極接続部１１４の材料として銅（Ｃｕ）を使用するのが好ましい。しかしながら、感知電極１１６及び／又は感知電極接続部１１４に他の好適な導電体材料を使用することができる。さらに、感知電極接続部１１４に使用されている導電性材料と異なる導電体材料を感知電極１１６に使用することもできる。

[056]上面図において、感知電極１１６は、適している形状であればどのような形状でもよい。本発明の第１の実施形態によれば、上面図内の感知電極１１６の形状は、中実の四角形である。図３Ａの上面図に示されている本発明の第３の実施形態によれば、感知電極３０１Ａから３０１Ｄは、リングの形状である。上面図内の本発明の第１の実施形態の感知電極１１６の代替え形状は、前の方で説明されているように中実の矩形、中実の楕円形、及び中実の円形である。

[057]第２の電気的絶縁層１０４と第３の電気的絶縁層１０５との間の界面に隣接する第３の電気的絶縁層１０５内の感知電極接続部１１４の周りに電気的絶縁スクリーニング電極１１３が埋め込まれている。このスクリーニング電極１１３は、グラウンドに電気的に接続され、基板面１１５を通じて望ましくない容量性の影響からＦＥＴ１０６を保護する。本発明の他の実施形態では、このスクリーニング電極１１３は、本発明の本質から逸脱することなく省くことができる。基板面１１５は、上面１１８が基板面１１５の反対側にある構造化された最上層１１７で覆われ、感知電極１１６は、構造化された最上層１１７内に含まれ、上面１１８から基板面１１５へと伸びている。

[058]図１に示されているように、チャネル１２１は、構造化された最上層１１７を通り第１の開口部１２２から第２の開口部１２３へ伸びており、第１の開口部１２２と第２の開口部１２３は両方とも、上面１１８で終端し、第１の開口部１２２は、感知電極１１６に隣接して配列される。したがって、チャネル１２１は、実質的にＵ字型であり、幅広の土台と２本の短い脚を有する。チャネル１２１の土台の上壁は、生産プロセス（図２Ａから図２Ｊに関して説明されている）から残っている第１のエッチマスク層１２０Ｂの第２の部分で覆われる。このチャネル１２１は、同じ溶液の流れを油圧制御することにより生体分子２００の位置決めをし、安定させる役割を持つ（例えば、生体分子２００用の栄養物を含むことができる）。さらに、生体分子２００は、チャネル１２１内に低圧吸引が発生した場合に吸引により第１の開口部１２２に付着し、第１の開口部１２２を通じて低圧吸引が加えられ、第１の開口部を介して試料液を感知室から引き出すことができる。これにより、感知電極との良好な接触を保ちながら生体分子２００を開口部のところに安定するように位置固定することができる。第１の開口部１２２への生体分子２００の吸引は、ピペットを使用する従来のパッチクランプにおける固着に匹敵する。

[059]構造化された最上層１１７の上面１１８は、生体適合性を有しているべき薄いキャップ誘電体層１２４で覆われ、（１）容量性結合を改善する高い誘電定数、（２）細胞培養液への抵抗、及び（３）金属感知電極に対する良好なバリア性能を有する。第１及び第２の開口部１２２、１２３は、暴露されたままである。キャップ誘電体層１２４は、例えば、窒化ケイ素（ＳＩＮ）で作られている。このキャップ層１２４は、生体分子２００のバイオセンサ１００への結合力を改善するために結合層１２５で部分的に覆われる。さらに、結合層１２５は、とりわけ、生体分子２００の生体適合層として作用し、バイオセンサ１００内に存在している可能性のある有毒物質が生体分子２００に吸収されるのを防止する働きをする。結合層１２５は、例えば、０．１％のポリ−L−リジン（シグマ）で作られる。キャップ層１２４の残り部分は、例えば、室壁１２７の接着を改善するために、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）で作られた第４の電気的絶縁層１２６で覆われる。

[060]複数の生体適合室壁１２７が、第４の電気的絶縁層１２６の上に用意される。これらの生体適合室壁１２７は、少なくとも１つの感知室１２８を形成する。それぞれの感知室１２８は、結合層１２５で覆われた、感知電極１１６の隣にチャネル１２１の第１の開口部１２２を配列した、感知電極１１６の少なくともそれぞれ１つを備える。それぞれの感知電極１１６は、感知室１２８内に存在する単一の生体分子２００を感知するために備えられる。結合層１２５が備えられているため、また生体適合室壁１２７が生体適合材料で作られているという事実から、生体分子２００は、感知電極１１６の上に、容易に固定化される、つまり、位置決めでき、また感知電極１１６、感知電極接続部１１４、及びＦＥＴ１０６を使って非侵襲的感知を行うために安定した位置で低圧をもたらすチャネル１２１を使ってそこに保持できる。

[061]さらに、それぞれの感知室１２８は、第１の開口部１２２の隣のチャネル１２１内のパッチクランプ電極１２９及び第４の電気的絶縁層１２６上に配列された基準電極１３０を備え、オペレータがパッチクランプピペットを生体分子２００上に置かなくても、パッチクランプ試験を自動的に実行するようになっている。パッチクランプ電極１２９は、電極コネクタ１１４１を介して電圧源に接続されうる。電極コネクタは、感知電極と電子感知素子の両方と物理的に接触しており、これにより、感知電極は電子感知素子に電気的に結合される。したがって、パッチクランプ電極１２９及び基準電極１３０を使って実施されるパッチクランプ試験は、細胞全体又は細胞接着法を使用して無傷細胞に対し実行される。生体適合室壁１２７は、生体適合性のある有機ポリマー（つまり、エラストマー）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で作られる。パッチクランプ電極１２９及び基準電極１３０は、好ましくは、白金（Ｐｔ）で作られる。

[062]バイオセンサ１００に使用されている、上述の材料は、限定として理解してはならず、上述の材料に対応する他の材料も同様に使用できることに留意されたい。

[063]異なる生産工程における本発明の第２の実施形態によるバイオセンサ１００の断面は、図２Ａから図２Ｊに示されている。図１に関してすでに説明されている特徴は、ここで再び説明することはしない。しかしながら、同じ参照記号は、同一のコンポーネントを指し示している。

[064]バイオセンサ１００の生産については、インプラント、膜蒸着、フォトリソグラフィ、乾式エッチング、及びＣＭＰなどの一般に知られているＣＭＯＳ技術で加工される図２Ａに示されている第１の中間産物１４０から始めて説明される。この第１の中間産物１４０は、埋設されたＦＥＴ１０６、埋設されたソース及びドレイントラック導体１１０、１１１、埋設されたゲートリード１１２、並びに埋設されたスクリーニング電極１１３を含む基板１０１を備える。すでに上で述べたように、基板１０１は、基板面１１５とＦＥＴ１０６の上で接している。この第１の中間産物１４０は、一般に知られている生産工程を使用して生産されるので、ここでは、その説明を省く。

[065]一般に知られているリフトオフ法を使用することで、第１の中間産物１４０の基板面１１５上に、Ｐｔで作られたパッチクランプ電極１２９が形成される。次いで、残りの基板面１１５全体が、パッチクランプ電極１２９とともに、ＴｈｅＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙにより販売されている誘電定数が２．６の有機スピンオンポリマーであるＳＩＬＫ（商標）という名称の半導体誘電体樹脂から作られうる完全な垂直方向に厚い有機層１５１と第１のエッチマスク層１２０で覆われる。これは、従来の層蒸着プロセスにより行われる。図２Ｂに示されているような第２の中間産物１５０が結果として得られる。

[066]その後、第２の中間産物１５０は、従来の層パターニング及びエッチングプロセスによりパターニング及びエッチングされ、これにより第１のエッチマスク層１２０の一部及び完全な垂直方向に厚い有機層１５１の一部が除去される。それと同時に、残りの垂直方向に厚い有機層１５６上に配列された第１のエッチマスク層１２０Ｂが、維持される。この結果、図２Ｃに示されているような第３の中間産物１５５が得られる。

[067]次に、厚い電気的絶縁層１６１が、第３の中間産物１５５上に蒸着される。厚い電気的絶縁層１６１は、均一蒸着プロセスで、非ドープケイ酸塩ガラス（ＵＳＧ）を蒸着することにより形成され、したがって、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）を含む。均一蒸着プロセスが使用されるので、厚い電気的絶縁層１６１は、厚い電気的絶縁層１６１を超える層の数及び分布に応じて高いところと低いところを持つ露出面を有する。第３の中間産物１５５は、厚い電気的絶縁層１６１とともに、図２Ｄに示されている第４の中間産物１６０を形成する。

[068]第４の中間産物１６０に存在する高いところと低いところは、化学機械研磨（ＣＭＰ）により均され、その結果、平らな電気的絶縁層１６６が得られ、したがって、第５の中間産物１６５が得られる（図２Ｅと比較せよ）。

[069]以下では、第５の中間産物１６５をパターニングし、エッチングするステップを含むデュアルダマシンプロセスが、第５の中間産物１６５に適用される、つまり、均された電気的絶縁層１６６並びに第２及び第３の電気的絶縁層１０４、１０５は、エッチングされ、エッチングされた第５の中間産物１６５上で、又はエッチングされた第５の中間産物１６５内に銅（Ｃｕ）を蒸着し、感知電極接続部１１４と感知電極１１６を形成する。通常、銅は、エッチングされ充てんされた第５の中間産物１６５を覆う銅層１７１が残るようにデュアルダマシンプロセスにおいて過剰蒸着される。このエッチングされ、充てんされた中間産物１６５は、銅層１７１とともに、図２Ｆに示されている第６の中間産物１７０を形成する。エッチング時に、均された電気的絶縁層１６６は、エッチングされた電気的絶縁層１７２に変えられる。

[070]これ以降、銅層１７１は、エッチングされた電気的絶縁層１７２が露出されるまで化学機械研磨（ＣＭＰ）により除去され、これにより、上面１１８を形成する。これ以降、上面１１８は、まず最初に、構造化されていないキャップ層１７６で覆われ、次に、構造化されていない第４の電気的絶縁層１７７により覆われる。ここから、結果として第７の中間産物１７５が得られる（図２Ｇと比較せよ）。

[071]さらに、基準電極１３０は、一般に知られているリフトオフプロセスにより構造化されていない第４の電気的絶縁層１７７上に形成される。その後、構造化されていない第４の電気的絶縁層１７７は、エッチングを使って構造化され、これにより、第４の電気的絶縁層１２６を形成し、その後構造化するために構造化されていない第２のエッチマスク層１７６を露出させる。これにより、図２Ｈに示されている第８の中間産物１８０が得られる。

[072]そこで、第８の中間産物１８０が、パターニングされ、好適なエッチング工程が、その後、第８の中間産物１８０に施され、チャネル１２１の第１及び第２の開口部１２２、１２３を形成する。したがって、構造化されていない第２のエッチマスク層１７６が構造化され、つまり、部分的に除去され、第２のエッチマスク層１２４が結果として得られる。さらに、第１及び第２の開口部１２２、１２３は、エッチングされた電気的絶縁層１７２を構造化し、これにより構造化された最上層１１７が得られる。第８の中間産物１８０は、第１及び第２の開口部１２２、１２３及び第２のエッチマスク層１２４とともに、図２１に示されているような第９の中間産物１８５を形成する。

[073]バイオセンサ１００を完成するために（図２Ｊと比較せよ）、第９の中間産物１８５は、残りの垂直方向に厚い有機層１５６が取り除かれるように湿式エッチングされる。したがって、チャネル１２１が完成される、つまり、第１及び第２の開口部１２２、１２３が相互接続される。この湿式エッチングプロセスにおいて、パッチクランプ電極１２９は、影響を受けない。次いで、生体適合室壁１２７が、一般に知られている形成プロセスにより生体適合材料から第４の電気的絶縁層１２６の該当する部分上に形成される。本発明の第１の実施形態によれば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は、生体適合室壁１２７用の生体適合材料として使用される。最後に、第４の電気的絶縁層１２６により覆われていない第２のエッチマスク層１２４の露出部分は、結合層１２５で覆われる。第２のエッチマスク層１２４の露出部分を結合層１２５で覆う場合、選択的蒸着プロセスが施される。この目的のために、第２のエッチマスク層１２４及び第４の電気的絶縁層１２６の材料は、適宜選択されなければならない。

[074]結合層１２５の周りに配列されている複数の生体適合室壁１２７は、感知室１２８を形成し、感知室１２８は、結合層１２５で覆われ、感知電極１１６の隣にチャネル１２１の第１の開口部１２２を配列した少なくとも１つの感知電極１１６を備える。ＦＥＴ１０６を使って単一生体分子２００を感知するための感知電極１１６及び感知電極接続部１１４が備えられている。

[075]本発明の第３の実施形態によるバイオセンサ３００の上面図が、図３Ａに示されている。図３Ａに示されている点線にそったこの実施形態の一セクションの断面図が、図３Ｂに示されている。本発明の第１及び第２の実施形態において同一であるコンポーネントは、同じ参照記号で示されている。

[076]バイオセンサ３００は、本発明の第２の実施形態によるバイオセンサ１００と、主に以下の３つの点で異なる。

[077]第１の違いは、第３の実施形態のバイオセンサ３００は、感知室１２８内に４つの感知電極３０１Ａ、３０１Ｂ、３０１Ｃ、３０１Ｄを備えるが、第２の実施形態のバイオセンサ１００は、感知室１２８内に感知電極１１６を１つしか備えていない点である。第３の実施形態において例示されているように、本発明は、マトリックス状に並べた感知室及び対応する感知電極を加工することにより任意の適当なサイズに拡張できることが理解される。任意の個数の感知電極の規則正しい配列は、本発明の他の実施形態でも可能であろう。さらに、単一の感知室内に備えられた感知電極の個数及び、同様に、感知室の総数及び感知室の配列は互いに関して、必要に応じて変えられる。

[078]第２の違いは、４つの感知電極３０１Ａ、３０１Ｂ、３０１Ｃ、３０１Ｄのそれぞれが、第２の実施形態のバイオセンサ３００の上面図においてリング形状となっているが、第１の実施形態のバイオセンサ１００の感知電極１１６は、上面図において中実の正方形となっている点である。４つの感知電極３０１Ａ、３０１Ｂ、３０１Ｃ、３０１Ｄのリング形状は、それぞれの場合において、中心領域が４つの感知電極３０１Ａ、３０１Ｂ、３０１Ｃ、３０１Ｄのうちの対応する１つの電極の材料で充てんされないままにしている。

[079]第３の違いは、第２の実施形態では、第１の開口部１２２Ａ、１２２Ｂ、１２２Ｃ、１２２Ｄは、４つの感知電極３０１Ａ、３０１Ｂ、３０１Ｃ、３０１Ｄのうちのそれぞれ１つの中心領域内にそれぞれ配列されるが、第１の実施形態では、第１の開口部１２２は、感知電極１１６のそば、しかも近くに配列される点である。本発明では、対応する感知電極に関して第１の開口部の正確な配列の上で、それぞれの感知電極がそれぞれの生体分子を保持するため第１の開口部を近くに有することが重要である。

[080]第１の開口部１２２Ａ、１２２Ｂ、１２２Ｃ、１２２Ｄは、対応するチャネル１２１Ａ、１２１Ｂ、１２１Ｃ、１２１Ｄを介して、第２の開口部１２３Ａ、１２３Ｂ、１２３Ｃ、１２３Ｄにそれぞれ接続される。

[081]感知室１２８に隣接して、またただ１つの室壁１２７を使って感知室１２８から隔てられた状態で、感知室１２８から放出される流体が通る流体制御室３０２が配列される。第２の開口部１２３Ａ、１２３Ｂ、１２３Ｃ、１２３Ｄは、生体分子体２００の栄養物のために用意されている試料液の流体制御を行えるようにする流体制御室３０２内ですべて一緒に終端する。この流体制御は、さらに、４つの感知電極３０１Ａ、３０１Ｂ、３０１Ｃ、３０１Ｄの（うちの１つの）上に存在する生体分子２００／生体分子体２００を含む試料液が、引き出されるようにチャネル１２１Ａ、１２１Ｂ、１２１Ｃ、１２１Ｄ内に低い圧力を発生させ、それにより、生体分子２００が開口部に向かって引かれ、最終的に開口部の上に位置して開口部を「塞ぎ」、これにより、それぞれの第１の開口部１２２Ａ、１２２Ｂ、１２２Ｃ、１２２Ｄ（のうちの１つ）で安定した保持力を確定するために使用される。

[082]それぞれのチャネル１２１Ａ、１２１Ｂ、１２１Ｃ、１２１Ｄは、パッチクランプ電極１２９Ａ、１２９Ｂ、１２９Ｃ、１２９Ｄ（それぞれ、図３Ｄに示されているように第２の開口部１２３Ａ、１２３Ｂ、１２３Ｃ、１２３Ｄに伸びている部分を持つことができる）をそれぞれ備え、感知室１２８内に位置するただ１つの基準電極１３０に関して別々にそれぞれのパッチクランプ電極１２９Ａ、１２９Ｂ、１２９Ｃ、１２９Ｄに対してパッチクランプ試験を実行することができる。本発明の第２の実施形態によれば、基準電極１３０は、２つの室壁１２７の隅に配列されるが、基準電極１３０の他の好適な配列も可能である。

[083]バイオセンサ４００がリング電極の代わりにＣ字型電極を備えるバイオセンサの他の実施形態が、図３Ｄに示されている。この実施形態は、さらに、流体制御室３０２も備える。それぞれのチャネル１２１への入口１２２は、電極の空洞内のほぼ中心に配列される。

[084]図４Ａ及び４Ｂは、本発明のバイオセンサを使用し、トランジスタをセンサとして使用して電気的及び化学的刺激に対する細胞の応答を調べる単純なアプリケーションについて説明している。この実施形態では、バイオセンサは、細胞を刺激するための刺激電極を備え、これにより、細胞の応答挙動に関する観察を行うことができる。図４Ａから分かるように、スクリーニング物質を与える前に、電気的刺激に対する細胞の応答を調べた。スクリーニング物質を細胞栄養物に施した後、細胞の応答を調べた（図４ｂ）。イオンチャネルに対するスクリーニング物質の影響を評価するために、この第２の読み取り値を第１の読み取り値と比較した。

[085]図５Ａ及び５Ｂは、感知室及び吸引チャネル内に配置されているパッチクランプ電極を使用して化学的刺激に対する細胞の応答を評価するために細胞に対し実行されるパッチクランプ試験を例示している。第１のアパーチャのところにある膜は、吸引力を高めることにより破裂する。スクリーニング物質を細胞栄養物に加える前に、吸引チャネル及び感知室内の電極から初期読み取り値を取得した。スクリーニング物質を加えた後、２回目の読み取り値を取得し、初期読み取り値と比較して、化学的刺激に対する細胞の応答を評価した。

[086]図６Ａ及び６Ｂは、パッチクランプ電極により神経細胞に印加されるＡＣ電圧を示しており、その結果得られる信号は、スクリーニング物質を細胞栄養物を加える前（図６Ａ）及び加えた後（図６Ｂ）にそれぞれＦＥＴトランジスタにより記録された。前のと異なっていてもよい追加のスクリーニング物質を、さらに、試験される他の細胞に影響を及ぼすことなくチャネルを通じて細胞に供給することができる。両方の刺激電極からの、またパッチクランプ電極からの刺激に対する細胞応答の読み取り値の組み合わせも、図６Ａ及び６Ｂに示されているように得られる。

[087]図７Ａから７Ｃは、感知室内で互いに隣接して配列された３つの感知電極を有するバイオセンサアレイの断面図を示している。この図は、細胞間の通信機構、並びに刺激に対する応答としての電気的変動を測定することによりスクリーニング物質を標的細胞（中心細胞）に加える（ａ）前、（ｂ）後、及び（ｃ）スクリーニング物質が直接細胞内に注入される場合の、試料生体分子に対するスクリーニング物質の効果を示す概略図である。この実施形態では、中心細胞を除く試験される細胞は、スクリーニング物質の影響を受けない。

[088]図８Ａから８Ｃは、感知室内で互いに隣接して配列された３つの感知電極を有するバイオセンサの他の一連の断面図を示している。この図は、細胞間の通信機構、並びにスクリーニング物質を感知室全体に加えて、感知室内のすべての細胞に影響を及ぼす（ａ）前、（ｂ）後、及び（ｃ）スクリーニング物質が直接細胞上又は細胞内に注入される場合の、試料生体分子に対するスクリーニング物質の効果を示す概略図である。例えば、血液試料は、知られているウイルスを含む場合があり、スクリーニング物質は、ウイルスに対し効果をもたらすと思われる薬物を含む場合がある。

[089]図９及び１０は、本発明のバイオセンサの２つの異なる実施形態を示しており、感知室内に刺激電極と感知電極の両方が配列されている。感知電極は、一対の導電性プレートを備え、刺激電極は、それと類似の形状の一対の導電性プレートを備え、前記電極はチャネル１２１への入口１２２の周りに配列される。この実施形態では、両方の対の電極の形状は、それぞれ台形となっている。それとは別に、感知電極及び刺激電極は、相互に同心上に並ぶ形で配列されるリング電極であってよく、入口１２２は前記リングの中心周りに存在する。感知電極及び刺激電極の他のいくつかの代替え形状は、図１１に示されている。

[090]まとめると、本発明及び本発明の実施形態は、バイオセンサ、バイオセンサを形成する方法、及び以下の利点を有する生体分子の状態を分析する方法を実現するものである。
１．バイオセンサ上の生体分子（例えば、神経細胞又は小胞のような生体細胞）の位置を自動的に決める。
２．生体分子体を培養及び／又は測定する際に規則正しく配列された電子感知素子のアレイを有するバイオセンサ上であっても単一の生体分子又は複数の生体分子体を簡単に安定させることができる。
３．薬理学的有効成分スクリーニングのため生体分子体を簡単に選択できる。
４．それぞれの生体分子とそれぞれの電子感知素子との間の距離を短縮することにより、電子感知素子、例えば、トランジスタのゲート電極への神経細胞のような生体分子体の電気的結合を改善する。

[091]本発明は、好ましい実施形態に関して説明されているけれども、請求項で述べているように本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの変更及び修正を加えられることが理解されなければならない。

本発明の例示的な一実施形態によるバイオセンサの断面図である。異なる生産工程における本発明の第２の実施形態によるバイオセンサの断面を示す図である。異なる生産工程における本発明の第２の実施形態によるバイオセンサの断面を示す図である。異なる生産工程における本発明の第２の実施形態によるバイオセンサの断面を示す図である。異なる生産工程における本発明の第２の実施形態によるバイオセンサの断面を示す図である。異なる生産工程における本発明の第２の実施形態によるバイオセンサの断面を示す図である。異なる生産工程における本発明の第２の実施形態によるバイオセンサの断面を示す図である。異なる生産工程における本発明の第２の実施形態によるバイオセンサの断面を示す図である。異なる生産工程における本発明の第２の実施形態によるバイオセンサの断面を示す図である。異なる生産工程における本発明の第２の実施形態によるバイオセンサの断面を示す図である。異なる生産工程における本発明の第２の実施形態によるバイオセンサの断面を示す図である。リング形状感知電極がバイオセンサ内に存在する本発明の第３の実施形態によるバイオセンサの上面図である。図３Ａに示されている点線にそったこの実施形態の一セクションの断面図である。スクリーニング物質を試料生体分子に送出するため吸引チャネルを供給チャネルにどのように接続できるかを示す簡素化された図である。馬蹄形感知電極が使用される本発明の他の実施形態の上面図である。試料生体分子を感電死させるための刺激電極を備えるバイオセンサの一実施形態の断面図であり、刺激電極のみを使用するステップを示す図である。試料生体分子を感電死させるための刺激電極を備えるバイオセンサの一実施形態の断面図であり、刺激電極のみを使用するステップを示す図である。試料生体分子を感電死させるための刺激電極を備えるバイオセンサの一実施形態の断面図であり、チャネル内に配置されたパッチクランプ電極のみを使用するステップを示す図である。試料生体分子を感電死させるための刺激電極を備えるバイオセンサの一実施形態の断面図であり、チャネル内に配置されたパッチクランプ電極のみを使用するステップを示す図である。試料生体分子を感電死させるための刺激電極を備えるバイオセンサの一実施形態の断面図であり、生体分子の同時又は協調感電死を行わせるために両方の電極を使用するステップを示す図である。試料生体分子を感電死させるための刺激電極を備えるバイオセンサの一実施形態の断面図であり、生体分子の同時又は協調感電死を行わせるために両方の電極を使用するステップを示す図である。細胞の集合を評価するために感知電極及び刺激電極のアレイが使用され、スクリーニング物質が分離している標的細胞に適用される一実施形態を示す図である。細胞の集合を評価するために感知電極及び刺激電極のアレイが使用され、スクリーニング物質が分離している標的細胞に適用される一実施形態を示す図である。細胞の集合を評価するために感知電極及び刺激電極のアレイが使用され、スクリーニング物質が分離している標的細胞に適用される一実施形態を示す図である。細胞の集合を評価するために感知電極及び刺激電極のアレイが使用され、スクリーニング物質が感知室に加えられ、それにより感知室内のすべての細胞に影響を及ぼす他の実施形態を示す図である。細胞の集合を評価するために感知電極及び刺激電極のアレイが使用され、スクリーニング物質が感知室に加えられ、それにより感知室内のすべての細胞に影響を及ぼす他の実施形態を示す図である。細胞の集合を評価するために感知電極及び刺激電極のアレイが使用され、スクリーニング物質が感知室に加えられ、それにより感知室内のすべての細胞に影響を及ぼす他の実施形態を示す図である。感知電極のさまざまな実施形態及びバイオセンサ内におけるその対応するレイアウトを示す図である。感知電極のさまざまな実施形態及びバイオセンサ内におけるその対応するレイアウトを示す図である。感知電極のさまざまな実施形態及びバイオセンサ内におけるその対応するレイアウトを示す図である。

符号の説明

１００バイオセンサ
１０１基板
１０２半導体層
１０３第１の電気的絶縁層
１０４第２の電気的絶縁層
１０５第３の電気的絶縁層
１０６電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）
１０７ソース領域
１０８ドレイン領域
１０９ゲート領域
１１０ソーストラック導体
１１１ドレイントラック導体
１１２ゲートリード
１１３電気的絶縁スクリーニング電極
１１４感知電極接続部
１１５基板面
１１６感知電極
１１７最上層
１１８上面
１２０Ｂエッチマスク層
１２１チャネル
１２１Ａ、１２１Ｂ、１２１Ｃ、１２１Ｄ対応するチャネル
１２２第１の開口部
１２２Ａ、１２２Ｂ、１２２Ｃ、１２２Ｄ第１の開口部
１２３第２の開口部
１２３Ａ、１２３Ｂ、１２３Ｃ、１２３Ｄ第２の開口部
１２４キャップ誘電体層
１２５結合層
１２６第４の電気的絶縁層
１２７室壁
１２８感知室
１２９パッチクランプ電極
１２９Ａ、１２９Ｂ、１２９Ｃ、１２９Ｄパッチクランプ電極
１３０基準電極
１４０第１の中間産物
１５０第２の中間産物
１５１有機層
１５５第３の中間産物
１５６残りの垂直方向に厚い有機層
１６０第４の中間産物
１６１厚い電気的絶縁層
１６５第５の中間産物
１６６平らな電気的絶縁層
１７０第６の中間産物
１７１銅層
１７２エッチングされた電気的絶縁層
１７５第７の中間産物
１７６構造化されていないキャップ層
１７７構造化されていない第４の電気的絶縁層
１８０第８の中間産物
１８５第９の中間産物
２００生体分子
３００バイオセンサ
３０１Ａから３０１Ｄ感知電極
３０２流体制御室
４００バイオセンサ
１１４１電極コネクタ

Claims

生体分子の状態の変化により生じる電気的変動を感知するための電子感知素子が埋設さされ、前記埋設された電子感知素子上に基板面が配置されている基板と、
前記基板面を覆い、前記基板面上に上面が配置され、前記上面は前記生体分子を含む試料液が置かれる感知領域を備える、構造化された最上層と、
前記電子感知素子に電気的に結合された、前記感知領域に露出しているその表面の少なくとも一部を有する感知電極と、
前記構造化された最上層内に配置された少なくとも１つのチャネルと
を具備し、
前記少なくとも１つのチャネルによる吸引を用いて前記生体分子を固定化するようになっている、バイオセンサ。
前記チャネルは、前記構造化された最上層の前記上面で終端する２つの開口部を備え、前記２つの開口部のうちの１つは前記感知電極の近くに配列される請求項１に記載のバイオセンサ。
前記構造化された最上層の前記上面は、少なくとも一部は生体適合層で覆われる請求項１又は２に記載のバイオセンサ。
パッチクランプ電極は、前記チャネル内に含まれ、前記パッチクランプ電極は第１の端部及び第２の端部を備え、前記パッチクランプ電極の前記第１の端部は前記２つの開口部のうちの１つの近くに配列され、前記第２の端部は、増幅回路に接続される請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
基準電極は、前記構造化された最上層の前記上面上に配列される請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
前記感知電極は、前記構造化された最上層の前記上面と前記基板面との間に配列される請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
前記感知電極は、前記構造化された最上層の前記上面上に配列される請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
前記感知電極は、中実の楕円形又は中実の矩形の形状を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
前記感知電極は、リング形状ないし円環形状を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
前記チャネルの前記第１の開口部は、前記リング形状の感知電極内に配列される請求項９に記載のバイオセンサ。
前記構造化された最上層の前記上面は、室壁を備える請求項１〜１０のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
前記室壁は、少なくとも１つの感知室を定めるように配列される請求項１に記載のバイオセンサ。
室壁により前記少なくとも１つの感知室から隔てられた流体制御室をさらに備える請求項１２に記載のバイオセンサ。
前記チャネルの前記第１の開口部は、前記少なくとも１つの感知室の内側に配列され、前記チャネルの第２の開口部は、前記少なくとも１つの流体制御室の内側に配列される請求項１３に記載のバイオセンサ。
前記感知電極と前記電子感知素子の両方と物理的に接触し、これにより前記感知電極を前記電子感知素子に電気的に結合する感知電極コネクタをさらに備える請求項１〜１４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
前記基板は、少なくとも半導体層、第１の電気的絶縁層、第２の電気的絶縁層、及び第３の電気的絶縁層を備える連続的に配列された層列を具備する請求項１〜１５のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
前記電子感知素子は、前記半導体層及び前記第１の電気的絶縁層と重なり合うように配列される請求項１６に記載のバイオセンサ。
前記電子感知素子は、前記第２の電気的絶縁層内に配列されたトラック導電体に電気的に接続される請求項１７に記載のバイオセンサ。
前記感知電極は、前記第３の電気的絶縁層内に配列された感知電極コネクタを介して電子感知素子に電気的に結合される請求項１８に記載のバイオセンサ。
前記感知電極接続部は、グラウンドに接続され前記第３の電気的絶縁層内に配列された電気的絶縁スクリーニング電極により囲まれる請求項１９に記載のバイオセンサ。
前記電子感知素子は、ゲート領域を有する電界効果トランジスタであり、前記感知電極は、前記電界効果トランジスタの前記ゲート領域に電気的に接続される請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
前記感知電極は、前記感知電極コネクタを介して前記電界効果トランジスタの前記ゲート領域に電気的に接続される請求項２１に記載のバイオセンサ。
前記基板は、グラウンドに接続された電気的絶縁スクリーニング電極を備え、前記スクリーニング電極は前記感知電極コネクタの周りに配列される請求項２２に記載のバイオセンサ。
前記スクリーニング電極は、前記第３の電気的絶縁層内に配列される請求項２３に記載のバイオセンサ。
バイオセンサを形成する方法であって、
生体分子の状態の変化により生じる電気的変動を感知するための電子感知素子が埋設された基板、及び前記埋設された電子感知素子上に配置される基板面を備えるステップと、
前記基板面上に配置された上面を有する構造化された最上層で前記基板面を覆うステップと、
前記構造化された最上層内に、又は前記構造化された最上層上に、前記生体分子における電気的変動を感知するために用意されている感知電極を形成するステップと、
前記構造化された最上層内に、又は前記構造化された最上層上に、吸引を使って前記生体分子を固定化するための少なくとも１つのチャネルを形成するステップと、
前記感知電極を前記電子感知素子に電気的に結合するステップと、
試料液中に存在する生体分子を置けるように前記上面を適合させるステップと、
前記構造化された最上層内に、生体分子に吸引力を加えるように適合された少なくとも１つのチャネルを形成するステップと
を含む方法。
前記チャネルは、前記上面で終端する少なくとも２つの開口部を備え、前記チャネルは前記構造化された最上層内に実質的に埋設され、前記２つの開口部のうちの１つは前記感知電極の近くに配列される請求項２５に記載の方法。
前記構造化された最上層の前記上面を生体適合層で覆うさらにステップを含む請求項２５又は２６に記載の方法。
ゲート領域を有する電界効果トランジスタを電子感知素子として備え、前記感知電極を前記電界効果トランジスタの前記ゲート領域に電気的に接続するステップをさらに含む請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
前記感知電極を前記電界効果トランジスタの前記ゲート領域に電気的に接続するための感知電極コネクタを前記基板内に形成するステップをさらに含む請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
電気的絶縁スクリーニング電極を前記基板の前記第３の電気的絶縁層内に形成するステップをさらに含む請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
パッチクランプ電極を前記チャネル内に形成するステップをさらに含む請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
基準電極を前記上面上に形成するステップをさらに含む請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
感知電極を形成するステップは、中実の楕円形又は中実の矩形の形状を有する感知電極を形成するステップを含む請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
感知電極を形成するステップは、リング形状を有する感知電極を形成するステップを含む請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
前記構造化された最上層内にチャネルを形成するステップは、前記リング形状の感知電極内に前記第１の開口部を形成するステップを含む請求項３４に記載の方法。
前記構造化された最上層の前記上面を室壁で覆うステップをさらに含む請求項２５〜３５のいずれか一項に記載の方法。
前記上面を室壁で覆うステップは、
少なくとも１つの感知室を形成するステップと、
少なくとも１つの感知電極を前記少なくとも１つの感知室内に形成するステップとを含む請求項３６に記載の方法。
室壁を介して前記少なくとも１つの感知室から隔てられた少なくとも１つの流体制御室を形成するステップをさらに含む請求項３７に記載の方法。
少なくとも１つの感知室を形成するステップは、
前記少なくとも１つの感知室の内側に前記第１の開口部を形成するステップと、
前記流体制御室の内側に前記チャネルの第２の開口部を形成するステップとを含む請求項３７又は３８に記載の方法。
半導体層、第１の電気的絶縁層、第２の電気的絶縁層、及び第３の電気的絶縁層を備える層列を前記基板として連続的に形成するステップをさらに含む請求項２５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
前記半導体層及び前記第１の電気的絶縁層と重なり合うように前記電子感知素子を形成するステップをさらに含む請求項４０に記載の方法。
前記第２の電気的絶縁層内に配列されたトラック導電体に前記電子感知素子を電気的に接続するステップをさらに含む請求項４１に記載の方法。
前記第３の電気的絶縁層内に配列された感知電極接続部を介して前記感知電極を前記電子感知素子に電気的に結合するステップをさらに含む請求項４２に記載の方法。
グラウンドに接続され前記第３の電気的絶縁層内に配列された電気的絶縁スクリーニング電極により前記感知電極接続部を囲むステップをさらに含む請求項４３に記載の方法。
生体分子の状態を分析する方法であって、
前記生体分子を請求項１〜２４のいずれか一項に記載のバイオセンサの前記感知電極に接触させるステップと、
前記生体分子の第１の状態に関連する第１の電気信号を測定するステップと、
前記生体分子を、前記生体分子の状態を変化させることができると思われる条件に曝すステップと、
前記条件に曝された後に前記生体分子の状態に関連する第２の電気信号を測定するステップと
を含む方法。
前記第１の電気信号及び前記第２の電気信号を所定の電気信号閾値と比較し、前記生体分子の状態の変化の発生を検出するステップをさらに含む請求項４５に記載の方法。
前記第１の電気信号と前記第２の電気信号との差の形状及び／又は大きさは、前記所定の電気信号閾値と比較される請求項４６に記載の方法。
前記第１の電気信号と前記第２の電気信号との前記差の前記形状及び／又は前記大きさが、前記所定の電気信号閾値と比べて大きい場合、前記生体分子が曝される条件は、前記生体分子の状態を変化させることができるものと評価される請求項４７に記載の方法。
前記バイオセンサの前記チャネルを通じて発生させる吸引を使って前記バイオセンサ上に前記生体分子を固定化するステップをさらに含む請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
前記生体分子は、その電位の変化を受ける可能性のある細胞を含む請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞は、真核細胞を含む請求項５０に記載の方法。
前記真核細胞は、神経細胞、卵母細胞、リンパ球、単球、筋肉細胞、胚幹細胞、及び酵母細胞から選択される請求項５１に記載の方法。
前記生体分子は、原核細胞を含む請求項５０に記載の方法。
前記原核細胞は、古細菌細胞及び細菌体からなる群から選択される請求項５３に記載の方法。
前記第１の電気信号及び／又は前記第２の電気信号を測定するステップは、吸引力が加えられる前記細胞の前記領域内に配置された、又はそこから隔てられている、輸送構造を通過する電流を測定するステップを含む請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
前記輸送構造は、アニオンチャネル、カチオンチャネル、アニオン輸送体、カチオン輸送体、受容タンパク質、及び結合タンパク質を含む請求項５５に記載の方法。
前記第１の電気信号及び／又は第２の電気信号を測定するステップは、前記感知素子を通じて前記生体分子の電気的特性を検出するステップを含む請求項４５〜５６のいずれか一項に記載の方法。
前記第１の電気信号及び／又は第２の電気信号を測定するステップは、前記生体分子上の電位を測定するステップを含み、前記電位は
バイオセンサの前記上面に存在し、前記試料液と接触する基準電極と、
前記バイオセンサの前記構造化された最上層内に存在するチャネル内に配置されているパッチクランプ電極との間で測定される請求項４５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
前記吸引力を使って前記生体分子の前記表面を破裂させ、それにより膜透過イオンチャネル又はイオンチャネル型受容体の電気的特性を利用できるようにするステップをさらに含む請求項５８に記載の方法。