JP4516356B2 - シス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法と、その方法に使用するイオンチャネル解析装置 - Google Patents
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曽我部正博・老木成稔氏ら編集(共立出版社)『イオンチャネル』 第19頁の図6とその説明文、および第44頁の図3とその説明文
前記内管11と外管12の各々には電解液を潅流させて前記第1・第2液流路T・Cの内部に電解液を充満させた後、前記外管12の第2液流路Cに脂質溶液を送り込むことによって前記内管の微細孔11aに脂質平面膜Mを生成させ、ついで、内管11の第1液流路Tへ解析対象のイオンチャネル分子を含有する試料液を潅流させて前記脂質平面膜Mに当該イオンチャネル分子を組み込ませ、こうして組込み形成されたイオンチャネル脂質平面膜Mb近くの第1・第2液流路T・Cに設置された一方の電極2にパルス電流を印加して当該イオンチャネル脂質平面膜Mbを通過して両電極2・3間に流れる単一チャネル電流を検出測定する点に特徴がある。
前記内管11と外管12の各々には電解液を潅流させて両内外管の内部に電解液を充満させた後、前記第2液流路又は第1液流路に解析対象の細胞を含有する試料液を送り込むことにより前記内管の微細孔11aに当該細胞Mbを受止せしめる一方、ついで、前記試料液を送り込んだ流路とは反対側の第1液流路又は第2液流路側には瞬間的に陰圧を与えて微細孔11aに受止された細胞Mbの陰圧側の膜パッチを裂開させ、こうして膜パッチの裂開された微細孔11aの前記細胞Mbに対し、微細孔11aに近接して第1・第2液流路T・C内に設置された一方の電極にパルス電圧を印加することにより、当該細胞膜上のチャネル分子を通過して両電極間に流れる単一チャネル電流を検出測定して所要のデータを取得する点に特徴がある。
即ち、本発明の「イオンチャンネル解析装置」は、管壁wの所定位置に脂質膜の生成される微細孔11aが開設され、かつ、管壁内部には毛細管状の第1液流路Tを有する絶縁性内管11,およびこの内管11を包囲して当該内管の周囲に第2液流路Cを形成せる絶縁性外管12とを含んで構成される同軸管構造のシス−トランス異性液管1と;このシス−トランス異性液管1における第1液流路Tの中に、前記微細孔11aに近接して配設された内管電極2と;前記第2液流路Cの中に、前記微細孔11aに近接して配設された外管電極3と;前記内管11と外管12とが形成する第1・第2液流路T・Cの中に電解液が潅流充満し、かつ、前記微細孔11aに解析対象のイオンチャネル分子の組み込まれた脂質平面膜Mbが生成され、又は同微細孔11aに解析対象の細胞が膜パッチが裂開された状態で受止されている状態において、前記内外の両電極2・3の何れか一方に一定波高値のパルス電圧を印加するインパルス発生器4と;前記パルス電圧を印加して前記脂質平面膜Mbを通過する単一チャネル電流を検出測定するチャネル電流測定器5とを設けた点に特徴がある。
(1) 本発明において採用する同軸管構造のシス−トランス異性液管1は電気的に絶縁性が あることが必要であるから、ガラス、セラミック、合成樹脂を素材として用いるのが 普通であり、また外側から視認したり光線の照射をしたりすることもあるから、透明 であることが望ましく、しかも耐衝撃性もあることが望まれるから、フレキシブルで あるのが好ましい。
(2) しかして、本発明に用いるシス−トランス異性液管1は、内管11と外管12とから構成 されるが、内管11もこの内管11を包囲する外管12も電解液や試料液(イオンチャネル 分子含有液や細胞含有液)等の流動を阻害しない限度でなるべく細いことが望ましい ことから、内管11の外径は2〜0.5mm 、内径は1.7 〜 0.5mm(管壁wの厚さ= 0.2〜 0.5mm)、外管12の外径は8〜3mm、内径は4〜2.5 mm(管壁w'の厚さ=4〜0.5mm)程 度のものが採択される。ちなみに、内管11の内部は、毛細管状の第1液流路Tとなる 一方、内管11と外管12との間の空隙は環状の第2液流路Cとなる。
(3) また、内管11の管壁wにはシス−トランス異性液管1を構成した際に測定し易い箇所 に微細孔11aを開設するが、この微細孔11aの貫通孔径は小さいほど好ましく、一般 的には、中心を貫通する孔径は50〜10μm、更に細胞膜を対象とする場合には1個の 細胞を通過させずに当該微細孔壁に受止することが必要であるから1μm程度である ことが必要である。また、当該貫通する孔の周囲は当該管壁wの外面に至るほど孔径 が逓増的に拡大する円錐面としておくと脂質平面膜の形成に有利である。ちなみに、 内管11に形成される微細孔11aの貫通孔部分は、周知のYAGガスレーザを照射して 穿設することができ、その周囲に円錐面を形成する加工法としては円錐面を形成すべ き箇所以外の部分にはマスキング(例えば、ポリエチレン樹脂塗布)を施し、稀フッ 酸、フッ化水素酸、2フッ化キセノンなど周知のガラス腐蝕剤によってエッチングす る方法があり、かゝる加工法は従来周知である。
(4) 上記のように構成されるシス−トランス異性液管1においては、少なくとも脂質平面 膜の生成される内管11の微細孔11aに疎水処理を施しておくことが必要である。この 場合に適用される疎水処理法としては、シリコーン系撥水剤、フッ素系撥水剤などの ごとき周知の疎水処理液中に当該シス−トランス異性液管を浸漬したうえで、適宜、 加熱してヒートセットするといった方法が採られる。かくして、内管11における管壁 wの内外面と外管12の内面は疎水化されることになる(この浸漬法による場合には、 外管12の外周面も同時に疎水化されるが、本発明では特に必要でない)。
(5) 上記微細孔11aに近接して第1液流路T内に配設する内管電極2と、同微細孔11aに 近接して第2液流路C内に配設する外管電極3としては、導電性の良好な金属材料を 用いるのが良く、通常は銀塩化銀電極を採用する。
(6) 上記の内管電極2又は外管電極3にパルス電圧を印加する手段としては必要な波高値 のパルス電圧を任意に設定して出力可能な周知のインパルス発生器4を採用すること ができ、またイオンチャネル脂質平面膜Mbを通過して内管電極2又は外管電極3へ 流れる単一チャネル電流の検出測定手段としては、パッチクランプアンプを内蔵した チャネル電流測定器5を採用することができるのであり、これらインパルス発生器4 と電流測定器5の何れも従来周知のパッチクランプ法や脂質平面膜法に一般的に採用 されているものをそのまゝ採択可能である。
(7) そして、本発明の「イオンチャネル解析装置」においては、上記シス−トランス異性 液管1の第1液流路Tおよび第2液流路Cに対し、所定の電解液や解析対象のイオン チャネル試料液・細胞含有の試料液などを供給して送り込むための手段として、第1 液流路Tには第1シリンジ・ポンプ6、第2液流路Cには第2シリンジ・ポンプ7を 連結し、任意の圧力で当該液を間歇的又は連続的に射出して第1・第2の液流路T・ Cに対し各々潅流させることが可能である。
(8) さらに、本発明においては、シス−トランス異性液管1における第1液流路Tと第2 液流路Cを潅流する液体の圧力に相対的な圧力差を起こし得る給液手段を配設して、 内管11の管壁における微細孔11aに液圧の高い流路から低い流路へ吸引力を発生させ ることができるようにしておくと、イオンチャネル脂質平面膜Mbを生成し、または 再生修復する際に迅速かつ的確に行える。
本発明の上記実施例装置を使用してイオンチャネル解析を行う具体的手順について説明すると、以下のとおりである。たゞし、内管11における微細孔11aの中心を貫通する最小孔径は直径が1μm、管壁wの外面側の最大孔径は30μmのものを採用している。
本実施例装置の使用にあたっては十分な洗浄と殺菌処理が必要であり、シス−トランス異性液管1については当該液管部分を取り外し、内外管11・12の中の空気を抜いた状態で強酸(濃硝酸:濃硫酸=1:3)に数日間浸漬しておく。ついで、強酸洗浄を終えたシス−トランス異性液管1は内外を清水にて十分に洗浄して乾燥させ、クロロフォルム−メタノール液(1:1)を内外管11・12の中に導入して殺菌消毒する。
シス−トランス異性液管1を trioctylsylane(10% ベンジン希釈液)に浸漬して内外管11・12の液流路T・Cの壁面に trioctylsylane を付着させ、約 0.1mm程離れた位置から遠赤外線ヒーターで加熱乾燥させて流路T・C内全体を疎水化せしめる。このとき同時に微細孔11aの孔壁面も疎水化される。
シス−トランス異性液管1の内管11の下流端部から微細孔11aの近傍位置まで内管電極2を装入して当該内管をプラスチック・ホルダーに固定する。ついで、外管12の下流側からも微細孔11aの近くまで外管電極3を装入して当該外管部分も前記プラスチック・ホルダーに固定させる。そして、前記内管電極2は導線21を介してケースEに内蔵されたインパルス発生器4に接続し、また内観電極3は導線31を介してケースE内に内蔵されたチャネル電流測定器5に接続させる。なお、この際、内管11および外管の下流端部には第1集液器8および第2集液器9に連結して、第1液流路Tは第1集液器8、第2液流路Cは第2集液器9に各々連通させる。
まず、ワークステーション10を操作して第1シリンジ・ポンプ6と第2シリンジ・ポンプ7とを駆動させ、シス−トランス異性液管1における内管11と外管12とに電解質溶液(1M NaCl 溶液) を流し込んで(流量:0.5ml/min)、第1液流路Tおよび第2液流路Cの中に当該電解液を充満させる。
(1) まず、白血病が疑われる患者の血管から注射器を用いて血液を採取し、この採取血液 を遠心分離して白血球細胞だけを含有する試料液を調製する。
(2) つぎに、調製された上記試料液を第2シリンジ・ポンプ7を介し、外管12と内管11と の間の第2液流路Cに流し込む。このとき、第2液流路Cの試料液の液圧を第1液流
路Tより相対的にやゝ高目にしておくと、解析対象の白血球細胞Mbは微細孔11aの コーン状壁面に沿って吸引され受止され易くなる。
(3) こうして、白血球細胞Mbが微細孔11aに受止されたところで、第1シリンジポンプ 6に吸引駆動させて第1液流路T側に露出する当該白血球細胞に陰圧(1mH20)を
瞬間的に(0.1sec) 作用させて陰圧を受けた膜パッチ部分だけを裂開せしめ、ワーク ステーション10に対し全細胞記録状態にする。
(4) ついで、インパルス発生器4により内管電極2にパルス電圧(200mV )を印加する。 白血病に罹患した白血球細胞は、カリウムイオンK+ に反応して膜電位が脱分極する ので、外管電極3に検出される単一チャネル電流を測定する。この単一チャネル電流 はチャネル電流測定器5を介してワークステーション10で記録されることになる。(5) 本発明者が長年にわたる臨床検査を通じて独自に知見した研究成果によれば、チャネ ル電流のパターンがHERGカリウムチャネルを示す場合には白血病診断することが できる。ちなみに、本発明者は、白血球細胞に負荷した電圧を−80mVから+50mV に変化させ、500 msの時間レベルを維持して、再び、−80mVに戻してから10ms 後の電流値を測定して、その値が大きい場合に白血病と診断する。
11 絶縁性内管
11a 微細孔
12 絶縁性外管
2 内管電極
3 外管電極
4 インパルス発生器
5 チャネル電流測定器
6 第1シリンジ・ポンプ
7 第2シリンジ・ポンプ
8 第1集液器
9 第2集液器
10 ワークステーション
10a ディスプレー
C 第2液流路
M 脂質平面膜
Mb イオンチャネル脂質平面膜
T 第1液流路
w 内管の管壁
Claims (11)
- 管壁の所定位置に脂質平面膜の生成される微細孔が開設され、かつ、管壁内部には毛細管状の第1液流路を有する絶縁性内管と;この内管を包囲して当該内管の周囲に第2液流路を形成せる絶縁性外管とを含んで構成される同軸管構造のシス−トランス異性液管に対して、
前記内管と外管の各々には電解液を潅流させて両内外管の内部に電解液を充満させた後、前記外管の第2液流路に脂質溶液を送り込むことによって前記内管の微細孔に脂質平面膜を生成させ、ついで、内管の第1液流路へ解析対象のイオンチャネル分子を含有する試料液を潅流させて前記脂質平面膜に当該イオンチャネル分子を組み込ませ、こうして組込み形成されたイオンチャネル脂質平面膜近傍の第1・第2液流路に設置された一方の電極にパルス電圧を印加して当該イオンチャネル脂質平面膜を通過して両電極間に流れる単一チャネル電流を検出測定することを特徴とするシス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法。 - 内管の微細孔に生成した脂質平面膜が破損したときには、再び外管の第2液流路に脂質溶液を送り込んで前記内管の微細孔に脂質平面膜を生成させてから、内管の第1液流路に解析対象とするイオンチャネル分子を含有する試料液を潅流させて前記脂質平面膜に当該イオンチャネル分子を組み込むことを特徴とする請求項1記載の、シス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法。
- 管壁の所定位置に解析対象となる細胞を受止可能なサイズの微細孔が開設され、かつ、管壁内部には毛細管状の第1液流路を有する絶縁性内管と;この内管を包囲して当該内管の周囲に第2液流路を形成せる絶縁性外管とを含んで構成される同軸管構造のシス−トランス異性液管に対して、
前記内管と外管の各々には電解液を潅流させて両内外管の内部に電解液を充満させた後、前記第2液流路又は第1液流路に解析対象の細胞を含有する試料液を送り込むことにより前記内管の微細孔に当該細胞を受止せしめる一方、ついで、前記試料液を送り込んだ流路とは反対側の第1液流路又は第2液流路側には瞬間的に陰圧を与えて微細孔に受止された細胞の陰圧側の膜パッチを裂開させ、こうして膜パッチの裂開された微細孔の前記細胞に対し、微細孔に近接して第1・第2液流路内に設置された一方の電極にパルス電圧を印加することにより、当該細胞膜上のチャネル分子を通過して両電極間に流れる単一チャネル電流を検出測定することを特徴とするシス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法。 - 内管の管壁の微細孔が約1μmの孔径サイズに穿孔されており、シス−トランス異性液管の第2液流路又は第1液流路に白血球細胞を含有する試料液を送り込むことにより前記内管の微細孔に当該白血球細胞を受止せしめ、ついで、前記試料液を送り込んだ流路とは反対側の第1液流路又は第2液流路側には瞬間的に陰圧を与えて微細孔に受止された当該白血球細胞における陰圧側の膜パッチを裂開させ、こうして膜パッチの裂開された微細孔の白血球細胞に対し、第1・第2液流路内に設置した一方の電極にパルス電圧を印加することにより、当該細胞膜上のチャネル分子を通過して両電極間に流れる単一チャネル電流を検出測定して白血病罹患の表徴に関する電気的データを取得することを特徴とする請求項3記載の、シス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法。
- 第1液流路と第2液流路との間に相対的な液圧差を設け、内管の管壁における微細孔に液圧の高い流路から低い流路へ吸引力を生ぜしめることを特徴とする請求項1〜4の何れか一つに記載の、シス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法。
- 管壁の所定位置に脂質膜の生成される微細孔が開設され、かつ、管壁内部には毛細管状の第1液流路を有する絶縁性内管,およびこの内管を包囲して当該内管の周囲に第2液流路を形成せる絶縁性外管とを含んで構成される同軸管構造のシス−トランス異性液管と;このシス−トランス異性液管における第1液流路の中に、前記微細孔に近接して配設された内管電極と;前記第2液流路の中に、前記微細孔に近接して配設された外管電極と;前記内管と外管とが形成する第1・第2液流路の中に電解液が潅流充満し、かつ、前記微細孔に解析対象のイオンチャネル分子の組み込まれた脂質平面膜が生成され、又は同微細孔に解析対象の細胞が膜パッチが裂開された状態で受止されている状態において、前記内外の両電極の何れか一方に一定波高値のパルス電圧を印加するインパルス発生器と;前記パルス電圧を印加して前記脂質平面膜を通過する単一チャネル電流を検出測定するチャネル電流測定器とを備えたことを特徴とするシス−トランス液流方式のイオンチャネル解析装置。
- 絶縁性内管の管壁に開設された微細孔が、第1液流路側においては直径が小さく,第2液流路側に至るほど直径が逓増するコーン形状を成していることを特徴とする請求項6記載の、シス−トランス液流方式のイオンチャネル解析装置。
- 同軸管構造のシス−トランス異性液管の少なくとも内管における微細孔のコーン形状の孔壁面に疎水処理が施されていることを特徴とする請求項7記載の、シス−トランス液流方式のイオンチャネル解析装置。
- シス−トランス異性液管の流入側には、内管の第1液流路に所要液を射出して第1液流路に潅流させる第1シリンジ・ポンプと、外管の第2液流路に所要液を射出して潅流させる第2シリンジ・ポンプとを接続する一方、当該シス−トランス異性液管の流出側には、前記第1液流路を潅流してくる前記液を受け入れて収容する第1集液器と、前記第2液流路を潅流してくる前記液を収容する第2集液器とを接続し、さらに第1液流路に配設された内管電極はパルス電圧を発生するインパルス発生器に接続すると共に第2液流路に配設された外管電極はチャネル電流測定器に接続されていることを特徴とする請求項6〜8の何れか一つに記載の、シス−トランス液流方式のイオンチャネル解析装置。
- シス−トランス異性液管の内管および外管が、透明でフレキシブルな石英ガラスにより作製されている請求項6〜9の何れか一つに記載の、シス−トランス液流方式のイオンチャネル解析装置。
- 絶縁性内管および絶縁性外管から成るシス−トランス異性液管を、少なくとも2本以上具備している請求項6〜10の何れか一つに記載の、シス−トランス液流方式のイオンチャネル解析装置。
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