JP4516356B2 - シス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法と、その方法に使用するイオンチャネル解析装置 - Google Patents

Description

本発明は、イオンチャネル(ion channel) 解析技術の改良、さらに詳しくは、絶縁性の内管および外管から成る同軸管構造のシス−トランス(cis-trans) 異性液管のフロー性能を巧みに利用することによって、解析対象膜が解析処理の最中に破損した場合でも、当該対象膜を速やかに修復して所期のイオンチャネル解析を能率的に継続することを可能にした画期的な“シス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法と、その方法に使用するイオンチャネル解析装置”に関するものである。

膜蛋白質の機能を解明する方法としては、電気生理学的手法が用いられ、他の方法では得られないダイナミックな医学的・生物学的情報や単一分子の情報を得ることができる。ところで、これまでの電気生理学的手法は、大別すると、パッチクランプ法（対象試料＝培養細胞）と脂質平面膜法（対象試料＝生化学的に抽出した膜蛋白質）とに区分される。ここに“パッチクランプ法”とは、細胞に先端開口部分を滑らかにしたガラス電極を押し当てながら電極内を吸引することにより細胞膜を千切り取って当該電極内に微小細胞膜を形成し、こうして形成された微小細胞膜にパルス電流を印加して前記電極内に形成されたイオンチャネルを流れる単一チャネル電流を測定する方法である（非特許文献１＝19頁の図６、およびその説明文参照）。他方、“脂質平面膜法”というのは、容器内を仕切る隔壁に小孔を開け、ここに脂質平面膜を張り、cis 側へ膜ベシクルを加えて前記平面膜と融合させたうえ、cis 側の銀塩化銀電極からパルス電圧を印加し、このパルス電圧に起因してイオンチャネルから流れ出てくる単一チャネル電流を測定する方法である（非特許文献１＝44頁の図３、およびその説明文参照）。これらの“パッチクランプ法”や“脂質平面膜法”は、いずれも生体膜に存在する蛋白質が特定の分子に対し低濃度で特異的に敏感に応答し、その応答を極度に高い精度で電気的に計測することができ、しかも、その感度は１分子のみならず１光子をも捕捉することができるほどに高精度であるところから、超高感・超高精度にして高速応答性能を備えた夢のセンサーの実現が見込まれるようになり、当該技術分野に関わる研究者の間では様々な研究開発が試みられるようになってきたのである。
曽我部正博・老木成稔氏ら編集（共立出版社）『イオンチャネル』 第19頁の図６とその説明文、および第44頁の図３とその説明文

しかしながら、これら従来の方法には、共通の問題点があって適用範囲に限界と制約が存している。その原因として指摘される最大の隘路は、膜（パッチクランプ法にあってはガラス電極に形成した微小細胞膜、脂質平面膜法にあっては平面膜）の機械的脆弱性にあり、計測中に前記“膜”が周囲の物理的影響によって破損し易く、安定的に計測することができない点にある。

もっとも、このような“膜”の脆弱性を改善しようとする提案としては、膜分子の硬度や弾力性を改質する強化剤を使用して膜の機械的強度を高めようとする試みも為されてはいるけれども、“膜”そのものの生化学的性質が変化してしまって所期の目的たる医学的・生物学的情報や単一分子の情報を得ることが阻害されるという弊害が避けられないのであった。

本発明は、イオンチャネルを電気生理学的に解析する従来の手段に前述のごとき問題点があったことに鑑みて為されたものであり、機械的強度が脆弱でデリケートな微小細胞膜やイオンチャネル分子組込み脂質平面膜が解析処理中に破損することを当然の前提とした発想の転回の下に、その破損した前記“膜（微小細胞膜・脂質平面膜など）”を直ちに修復して所期のイオンチャネル解析を能率的に継続することを可能にする画期的な方法と装置を提供することを目的とするものである。

また、本発明の他の目的は、イオンチャネル分子組込み脂質平面膜を境界として両側に存する電解液の各々を急速かつ効率的に任意に個別的に置換して電気的測定を行うことが可能な頗る実用的な方法と装置を提供することにある。

また、本発明の他の目的は、細胞膜表面に存在する膜蛋白質のみならず、細胞小器官や核などの膜蛋白質、さらには細菌やウィルスの膜蛋白質など従来のパッチクランプ法では処理できなかった膜蛋白分子の測定分析をも可能とする非常に利用範囲の広い電気生理学上有用な方法と装置を提供するにある。

さらに、本発明の他の目的は、脂質平面膜の表面積を極端に小さくすることができて、かつ、静電容量も大幅に少なくできると共に、回路内の浮遊容量が小さく、しかも、誘電損失も極端に少ない低ノイズで信頼性の高い医学的・生物学的情報を的確に得ることができる試験研究に有効なイオンチャネル解析方法とその装置を提供するにある。

本発明者が上記目的を達成するために採用した方法的手段を、添附図面を参照して説明すれば、次のとおりである。即ち、本発明が提供する「脂質平面膜の潅流生成によるイオンチャネル解析方法」は、管壁ｗの所定位置に脂質平面膜の生成される微細孔11ａが開設され、かつ、管壁ｗ内部には毛細管状の第１液流路Ｔを有する絶縁性内管11と；この内管11を包囲して当該内管の周囲に第２液流路Ｃを形成せる絶縁性外管12とを含んで構成される同軸管構造のシス−トランス(cis-trans）異性液管１に対して、
前記内管11と外管12の各々には電解液を潅流させて前記第１・第２液流路Ｔ・Ｃの内部に電解液を充満させた後、前記外管12の第２液流路Ｃに脂質溶液を送り込むことによって前記内管の微細孔11ａに脂質平面膜Ｍを生成させ、ついで、内管11の第１液流路Ｔへ解析対象のイオンチャネル分子を含有する試料液を潅流させて前記脂質平面膜Ｍに当該イオンチャネル分子を組み込ませ、こうして組込み形成されたイオンチャネル脂質平面膜Ｍｂ近くの第１・第２液流路Ｔ・Ｃに設置された一方の電極２にパルス電流を印加して当該イオンチャネル脂質平面膜Ｍｂを通過して両電極２・３間に流れる単一チャネル電流を検出測定する点に特徴がある。

また、本発明者が上記目的を達成するために採用した他の方法的手段は、管壁ｗの所定位置に解析対象となる細胞を受止可能なサイズの微細孔11ａが開設され、かつ、管壁ｗに囲われる内部には毛細管状の第１液流路Ｔを有する絶縁性内管11と；この内管11を包囲して当該内管の周囲に第２液流路Ｃを形成せる絶縁性外管12とを含んで構成される同軸管構造のシス−トランス異性液管１に対して、
前記内管11と外管12の各々には電解液を潅流させて両内外管の内部に電解液を充満させた後、前記第２液流路又は第１液流路に解析対象の細胞を含有する試料液を送り込むことにより前記内管の微細孔11ａに当該細胞Ｍｂを受止せしめる一方、ついで、前記試料液を送り込んだ流路とは反対側の第１液流路又は第２液流路側には瞬間的に陰圧を与えて微細孔11ａに受止された細胞Ｍｂの陰圧側の膜パッチを裂開させ、こうして膜パッチの裂開された微細孔11ａの前記細胞Ｍｂに対し、微細孔11ａに近接して第１・第２液流路Ｔ・Ｃ内に設置された一方の電極にパルス電圧を印加することにより、当該細胞膜上のチャネル分子を通過して両電極間に流れる単一チャネル電流を検出測定して所要のデータを取得する点に特徴がある。

他方、本発明者が上記目的を達成するために採用した装置的手段は、これを添附図面を参照して説明すると、次のとおりである。
即ち、本発明の「イオンチャンネル解析装置」は、管壁ｗの所定位置に脂質膜の生成される微細孔11ａが開設され、かつ、管壁内部には毛細管状の第１液流路Ｔを有する絶縁性内管11，およびこの内管11を包囲して当該内管の周囲に第２液流路Ｃを形成せる絶縁性外管12とを含んで構成される同軸管構造のシス−トランス異性液管１と；このシス−トランス異性液管１における第１液流路Ｔの中に、前記微細孔11ａに近接して配設された内管電極２と；前記第２液流路Ｃの中に、前記微細孔11ａに近接して配設された外管電極３と；前記内管11と外管12とが形成する第１・第２液流路Ｔ・Ｃの中に電解液が潅流充満し、かつ、前記微細孔11ａに解析対象のイオンチャネル分子の組み込まれた脂質平面膜Ｍｂが生成され、又は同微細孔11ａに解析対象の細胞が膜パッチが裂開された状態で受止されている状態において、前記内外の両電極２・３の何れか一方に一定波高値のパルス電圧を印加するインパルス発生器４と；前記パルス電圧を印加して前記脂質平面膜Ｍｂを通過する単一チャネル電流を検出測定するチャネル電流測定器５とを設けた点に特徴がある。

そこで、本発明の方法と装置とについて若干の注釈を加えれば、次のとおりである。
(1) 本発明において採用する同軸管構造のシス−トランス異性液管１は電気的に絶縁性が あることが必要であるから、ガラス、セラミック、合成樹脂を素材として用いるのが 普通であり、また外側から視認したり光線の照射をしたりすることもあるから、透明 であることが望ましく、しかも耐衝撃性もあることが望まれるから、フレキシブルで あるのが好ましい。
(2) しかして、本発明に用いるシス−トランス異性液管１は、内管11と外管12とから構成 されるが、内管11もこの内管11を包囲する外管12も電解液や試料液（イオンチャネル 分子含有液や細胞含有液）等の流動を阻害しない限度でなるべく細いことが望ましい ことから、内管11の外径は２〜0.5mm 、内径は1.7 〜 0.5mm（管壁ｗの厚さ＝ 0.2〜 0.5mm)、外管12の外径は８〜３mm、内径は４〜2.5 mm（管壁w'の厚さ＝４〜0.5mm)程 度のものが採択される。ちなみに、内管11の内部は、毛細管状の第１液流路Ｔとなる 一方、内管11と外管12との間の空隙は環状の第２液流路Ｃとなる。
(3) また、内管11の管壁ｗにはシス−トランス異性液管１を構成した際に測定し易い箇所 に微細孔11ａを開設するが、この微細孔11ａの貫通孔径は小さいほど好ましく、一般 的には、中心を貫通する孔径は50〜10μｍ、更に細胞膜を対象とする場合には１個の 細胞を通過させずに当該微細孔壁に受止することが必要であるから１μｍ程度である ことが必要である。また、当該貫通する孔の周囲は当該管壁ｗの外面に至るほど孔径 が逓増的に拡大する円錐面としておくと脂質平面膜の形成に有利である。ちなみに、 内管11に形成される微細孔11ａの貫通孔部分は、周知のＹＡＧガスレーザを照射して 穿設することができ、その周囲に円錐面を形成する加工法としては円錐面を形成すべ き箇所以外の部分にはマスキング（例えば、ポリエチレン樹脂塗布）を施し、稀フッ 酸、フッ化水素酸、２フッ化キセノンなど周知のガラス腐蝕剤によってエッチングす る方法があり、かゝる加工法は従来周知である。
(4) 上記のように構成されるシス−トランス異性液管１においては、少なくとも脂質平面 膜の生成される内管11の微細孔11ａに疎水処理を施しておくことが必要である。この 場合に適用される疎水処理法としては、シリコーン系撥水剤、フッ素系撥水剤などの ごとき周知の疎水処理液中に当該シス−トランス異性液管を浸漬したうえで、適宜、 加熱してヒートセットするといった方法が採られる。かくして、内管11における管壁 ｗの内外面と外管12の内面は疎水化されることになる（この浸漬法による場合には、 外管12の外周面も同時に疎水化されるが、本発明では特に必要でない）。
(5) 上記微細孔11ａに近接して第１液流路Ｔ内に配設する内管電極２と、同微細孔11ａに 近接して第２液流路Ｃ内に配設する外管電極３としては、導電性の良好な金属材料を 用いるのが良く、通常は銀塩化銀電極を採用する。
(6) 上記の内管電極２又は外管電極３にパルス電圧を印加する手段としては必要な波高値 のパルス電圧を任意に設定して出力可能な周知のインパルス発生器４を採用すること ができ、またイオンチャネル脂質平面膜Ｍｂを通過して内管電極２又は外管電極３へ 流れる単一チャネル電流の検出測定手段としては、パッチクランプアンプを内蔵した チャネル電流測定器５を採用することができるのであり、これらインパルス発生器４ と電流測定器５の何れも従来周知のパッチクランプ法や脂質平面膜法に一般的に採用 されているものをそのまゝ採択可能である。
(7) そして、本発明の「イオンチャネル解析装置」においては、上記シス−トランス異性 液管１の第１液流路Ｔおよび第２液流路Ｃに対し、所定の電解液や解析対象のイオン チャネル試料液・細胞含有の試料液などを供給して送り込むための手段として、第１ 液流路Ｔには第１シリンジ・ポンプ６、第２液流路Ｃには第２シリンジ・ポンプ７を 連結し、任意の圧力で当該液を間歇的又は連続的に射出して第１・第２の液流路Ｔ・ Ｃに対し各々潅流させることが可能である。
(8) さらに、本発明においては、シス−トランス異性液管１における第１液流路Ｔと第２ 液流路Ｃを潅流する液体の圧力に相対的な圧力差を起こし得る給液手段を配設して、 内管11の管壁における微細孔11ａに液圧の高い流路から低い流路へ吸引力を発生させ ることができるようにしておくと、イオンチャネル脂質平面膜Ｍｂを生成し、または 再生修復する際に迅速かつ的確に行える。

本発明の方法と装置にあっては、管壁の所定位置に脂質平面膜を生成さすべき微細孔が開設され、かつ、管壁内部には毛細管状の第１液流路を有する絶縁性内管と；この内管を包囲して当該内管の周囲に第２液流路を形成せる絶縁性外管とを含んで構成される同軸管構造のシス−トランス異性電解液管を採用しているので、かゝるシス−トランス異性電解液管の内管と外管との中に必要とする電解液、イオンチャネル試料液、細胞含有の試料液を適時選択的に送給して第１液流路および第２液流路の中へ潅流させることにより、前記微細孔に解析対象のイオンチャネル脂質平面膜を迅速に形成したり、膜パッチ裂開の細胞を迅速に受止させたりすることができから、イオンチャネル解析の途中に微細孔の前記脂質平面膜や受止細胞が何らかの原因で破損した場合においても直ちに修復して所期のイオンチャネル解析を能率的に継続することが可能である。

また、本発明の方法と装置にあっては、上記同軸管構造のシス−トランス異性電解液管を採用しているので、イオンチャネル脂質平面膜やパッチ裂開細胞を境界として両側に存する電解液の各々を急速かつ効率的に任意に個別的に交換して電気的測定が可能であり、特定のイオンチャネル脂質平面膜や解析対象の細胞について医学的・生物学的情報や単一分子の情報を非常にダイナミックに収集ことができるうえに、内管の管壁に開設した微細孔には細胞膜表面に有する膜蛋白質だけでなく、細胞小器官や核などの膜蛋白質、さらには細菌やウィルスの膜蛋白質などに由来するイオンチャネル脂質平面膜を自由自在に作れるため、従来のパッチクランプ法では処理できなかった膜蛋白分子の測定分析が可能となり、例えば白血病や癌の早期発見など電気生理学上の利用範囲が頗る広いものである。

さらに、本発明の方法と装置にあっては、毛細管状の同軸シス−トランス異性電解液管を採用し内管に開設した微細孔の孔径サイズを極端に小さくできることから、当該微細孔に生成させるイオンチャネル脂質平面膜の表面積も従来パッチクランプ法や脂質平面膜法よりも格段にできて静電容量を大幅に減少させることができると共に、絶縁性の高い材料で内管・外管を使用しているので、当該電気回路内の浮遊容量と誘電損失も大幅に減少でき、低ノイズで信頼性の高い医学的・生物学的情報を的確に得ることができる。

以下、本発明に係るイオンチャネル解析の方法と装置を、添附図面に示される実施例に基いて、さらに詳しく説明する。

図１および図２は、本発明のイオンチャネル解析装置（実施例）の概略を表わした断面説明図である。図中の符号１で指示するものは、同軸管構造のシス−トランス異性液管であって、中心部には透明な石英ガラスから成るフレキシブルな絶縁性内管11が内装されており、この内管11の周囲は当該内管と同材質の透明でフレキシブルな石英ガラスの絶縁性外管12によって囲われ、前記内管11の管壁外周と外管12の内壁面との間には第２液流路Ｃが形成されている。ちなみに、前記内管11の管壁ｗの内部は、毛細管状の第１液流路Ｔを構成し、かつ、その管壁ｗの所定位置（図１では、内管11における中央右寄りの箇所）に脂質平面膜の形成されるべき微細孔11ａが開設されている。

本実施例における内管11は、外径が１mm、内径が 0.7mm、管壁ｗの厚さが 0.3mmに作製されており、微細孔11ａにおいて中心を貫通する最小孔径は直径が30μｍ、管壁ｗの外面側の最大孔径は86μｍであり、この最大孔径から前記最小孔径に至る孔径は逓次的に変化してコーン形状を成している。この場合、本実施例においては、少なくともコーン形状をなす微細孔11ａの孔壁面には生成される脂質平面膜の付着安定性を確保する必要上、疎水処理を必要とするから、使用にあたっては、シス−トランス異性液管１全体を疎水処理液(trioctylsylane=10% ベンジン希釈液）に浸漬して脱泡し引き上げた後、赤外線ヒーターにて１５秒ほど加熱してヒットセットに処するものとする。

つぎに、図中の符号２は、上記シス−トランス異性液管１における内管11の微細孔11ａに近接するごとく第１液流路Ｔの中に装入配設された内管電極を示し、また符号３は前記微細孔11ａに近接するごとく外管12と内管11との間の第２液流路Ｃの中に装入配設された外管電極を示す。これら内外の電極２・３は何れも高導電性が要求されるので、本実施例では銀−塩化銀が用いられている。これら内管電極２および内管電極３は、各々、高導電性金属からなる導線21および23に接続されて後述のインパルス発生器、およびチャネル電流測定器に連繋されている。

他方、図１において符号４で指示するものは、上記内管電極２へ導線21を介して必要な波高値のパルス電圧を任意に設定して出力可能なインパルス発生器であり、符号５はパッチクランプアンプを内蔵したチャネル電流測定器である。このチャネル電流測定器５は、微細孔11ａのイオンチャネル脂質平面膜Ｍｂによって電気的に絶縁された第１液流路Ｔと第２液流路Ｃ内の両電解液間において、前記インパルス発生器４の出力するパルス電圧が当該イオンチャネル脂質平面膜固有のイオン透過・開閉機構の作用により変形されて特有の単一チャネル電流として出力されてくるところを、外管電極３が集電し導線31を介して受信入力する回路機構である。本実施例においては、前記インパルス発生器４とチャネル電流測定器５は、ケースＥに収納されて一体化され、シス−トランス異性液管１の下流側に連結されている。

つぎに、図１のシス−トランス異性液管１の上流側において、符号６で指示するものは内管11内の第１液流路Ｔに接続された第１シリンジ・ポンプであり、符号７にて指示するものは外管12と内管11との間の第２液流路Ｃに接続された第２シリンジ・ポンプである。しかして、前記第１シリンジ・ポンプ６は、第１液流路Ｔに所要の電解液又は解析対象のイオンチャネル試料液若しくは解析対象の細胞を含有した試料液を射出して第１液流路Ｔ内に潅流せしめるための機構である一方、第２シリンジ・ポンプ７は所要の電解液又は資質溶液を射出して第２液流路Ｃ内に潅流せしめるための機構である。

また、シス−トランス異性液管１の下流側において、符号８で指示するものは上記第１液流路Ｔを潅流して流下してくる電解液およびイオンチャネル試料液を受け入れて収容する第１集液器であり、符号９で指示するものは上記第２液流路Ｃを潅流して流下してくる電解液および脂質溶液を受け入れて収容する第２集液器である。これら第１・第２の集液器８・９によってシス−トランス異性液管１を潅流する電解液・イオンチャネル試料液・・細胞含有試料液・脂質溶液は漏らすことなく全て回収することができる。

さらに、図１において符号１０で指示するものはワークステーション（富士通:CelsiusV 810)であって、上記インパルス発生器４とチャネル電流測定器５、および上記第１シリンジ・ポンプ６と第２シリンジ・ポンプ７に接続されている。

そして、ワークステーション１０は、インパルス発生器４の出力すべき電位、波高値、パルス波形、ヘルツ数などを任意に又は所定のプログラムに基づいてコントロール信号をインパルス発生器４に送信して当該インパルス発生器が出力するパルス電圧を制御する。また、微細孔11ａの各イオンチャネル脂質平面膜Ｍｂに応じて出力されてくる各膜Ｍｂに特有の単一チャネル電流はパッチクランプアンプを内蔵したチャネル電流測定器５に入力されるが、こうして入力された各々の単一チャネル電流はワークステーション１０に送られることになる。そして、ワークステーション１０では、入力された前記各単一チャネル電流を記録媒体（図示せず）に記録する一方、ディスプレー10ａに映出してモニターすることも可能である。

〔実施例装置の使用例〕
本発明の上記実施例装置を使用してイオンチャネル解析を行う具体的手順について説明すると、以下のとおりである。たゞし、内管11における微細孔11ａの中心を貫通する最小孔径は直径が１μｍ、管壁ｗの外面側の最大孔径は30μｍのものを採用している。

(1) 洗浄・殺菌消毒処理
本実施例装置の使用にあたっては十分な洗浄と殺菌処理が必要であり、シス−トランス異性液管１については当該液管部分を取り外し、内外管11・12の中の空気を抜いた状態で強酸（濃硝酸：濃硫酸＝１：３）に数日間浸漬しておく。ついで、強酸洗浄を終えたシス−トランス異性液管１は内外を清水にて十分に洗浄して乾燥させ、クロロフォルム−メタノール液（１：１）を内外管11・12の中に導入して殺菌消毒する。

(2) 微細孔11ａ周辺の疎水化処理
シス−トランス異性液管１を trioctylsylane(10% ベンジン希釈液）に浸漬して内外管11・12の液流路Ｔ・Ｃの壁面に trioctylsylane を付着させ、約 0.1mm程離れた位置から遠赤外線ヒーターで加熱乾燥させて流路Ｔ・Ｃ内全体を疎水化せしめる。このとき同時に微細孔11ａの孔壁面も疎水化される。

(3) 実施例装置の組立
シス−トランス異性液管１の内管11の下流端部から微細孔11ａの近傍位置まで内管電極２を装入して当該内管をプラスチック・ホルダーに固定する。ついで、外管12の下流側からも微細孔11ａの近くまで外管電極３を装入して当該外管部分も前記プラスチック・ホルダーに固定させる。そして、前記内管電極２は導線21を介してケースＥに内蔵されたインパルス発生器４に接続し、また内観電極３は導線31を介してケースＥ内に内蔵されたチャネル電流測定器５に接続させる。なお、この際、内管11および外管の下流端部には第１集液器８および第２集液器９に連結して、第１液流路Ｔは第１集液器８、第２液流路Ｃは第２集液器９に各々連通させる。

また、シス−トランス異性液管１の内管11の上流端部には上流側用のプラスチック・ホルダーを介して第１シリンジ・ポンプ６、外管12の上流端部にも前記上流側用プラスチック・ホルダーを介して第２シリンジ・ポンプ７を連結する。

そして、上記インパルス発生器４とチャネル電流測定器５、および第１シリンジ・ポンプ６と第２シリンジ・ポンプ７をワークステーション１０のインターフェース・アダプタに接続する。

しかして、ワークステーション１０にインストールしてある制御プログラムに基いて、内管電極２と外管電極３との間に既定のパルス電圧・コマンドを印加してチャネル電流測定器５に入力される単一チャネル電流を検出測定し、ワークステーション１０の記録媒体上に記録してゆく。この場合において、第１液流路Ｔと第２液流路Ｃに対してイオンチャネル脂質平面膜Ｍｂを境界として両側に存する電解液の各々を種々個別的に交換して測定することにより、有用な医学的・生物学的情報や単一分子の情報を非常にダイナミックに収集ことが可能である。

(4) イオンチャネル解析プロセス
まず、ワークステーション１０を操作して第１シリンジ・ポンプ６と第２シリンジ・ポンプ７とを駆動させ、シス−トランス異性液管１における内管11と外管12とに電解質溶液(1Ｍ NaCl 溶液) を流し込んで（流量：0.5ml/min)、第１液流路Ｔおよび第２液流路Ｃの中に当該電解液を充満させる。

つぎに、ワークステーション１０によりインパルス発生器４を電圧固定モードに設定して内管電極２と外管電極３との間に一定波高値のパルス電圧を反復して印加し、電気抵抗と電気容量とをディスプレー10ａにより連続的にモニターする。この場合における電気抵抗の目安は 500Ω、電気容量の目安は１ｐＦ（浮遊容量）である。

ついで、第２シリンジ・ポンプ７にリン脂質溶液（フォスファチジルコリン 20mg/ml ヘキサデカン）を供給して、ワークステーション１０を操作して前記シリンジ・ポンプ７を駆動して、外管12と内管11との間の第２液流路Ｃ中に同液を50μl 流し込む。この場合において第２液流路Ｃの前記リン脂質溶液の液圧は、第１液流路Ｔの液圧よりも相対的に少し高目にしておくと、微細孔11ａに吸引力が生じて脂質平面膜Ｍが生成され易くなる。この状態において、ディスプレー10ａによって電気抵抗と電気容量の増大量を目安に監視し微細孔11ａに脂質平面膜Ｍが生成しているか否かを確認する。この場合における脂質平面膜Ｍの生成の目安は、電気抵抗が300GΩ、電気容量が10ｐＦである。脂質平面膜が生成されていても十分な特性を示さないときには、ワークステーション１０を操作して第１・第２シリンジ・ポンプ６・７を駆動させ、第１液流路Ｔと第２液流路Ｃとの間に大きな圧力差を発生させることによって不十分な前記脂質平面膜を破って、再度、前述の操作を行って十分かつ適正な脂質平面膜Ｍが生成するまで同操作を繰り返す。

微細孔11ａに必要な脂質平面膜Ｍが生成されたところで、この脂質平面膜Ｍにチャネル分子を組み込むことになる。本発明において組込み対象にできるチャネル分子としては、細胞膜表面に有する膜蛋白質だけでなく、細胞小器官や核などの膜蛋白質、さらには細菌やウィルスの膜蛋白質などに由来するイオンチャネル分子のすべてが含まれるのである。

本解析においては、次のような手順によって解析処理が行われる。
(1) まず、白血病が疑われる患者の血管から注射器を用いて血液を採取し、この採取血液 を遠心分離して白血球細胞だけを含有する試料液を調製する。
(2) つぎに、調製された上記試料液を第２シリンジ・ポンプ７を介し、外管12と内管11と の間の第２液流路Ｃに流し込む。このとき、第２液流路Ｃの試料液の液圧を第１液流
路Ｔより相対的にやゝ高目にしておくと、解析対象の白血球細胞Ｍｂは微細孔11ａの コーン状壁面に沿って吸引され受止され易くなる。
(3) こうして、白血球細胞Ｍｂが微細孔11ａに受止されたところで、第１シリンジポンプ ６に吸引駆動させて第１液流路Ｔ側に露出する当該白血球細胞に陰圧(1ｍＨ₂０）を
瞬間的に（0.1sec) 作用させて陰圧を受けた膜パッチ部分だけを裂開せしめ、ワーク ステーション１０に対し全細胞記録状態にする。
(4) ついで、インパルス発生器４により内管電極２にパルス電圧(200ｍＶ )を印加する。 白血病に罹患した白血球細胞は、カリウムイオンＫ⁺ に反応して膜電位が脱分極する ので、外管電極３に検出される単一チャネル電流を測定する。この単一チャネル電流 はチャネル電流測定器５を介してワークステーション１０で記録されることになる。(5) 本発明者が長年にわたる臨床検査を通じて独自に知見した研究成果によれば、チャネ ル電流のパターンがＨＥＲＧカリウムチャネルを示す場合には白血病診断することが できる。ちなみに、本発明者は、白血球細胞に負荷した電圧を−80ｍＶから＋50ｍＶ に変化させ、500 ｍｓの時間レベルを維持して、再び、−80ｍＶに戻してから10ｍｓ 後の電流値を測定して、その値が大きい場合に白血病と診断する。

しかして、上記した本発明方法による白血病の診断方法は、血液と白血球の遠心分離に１０分、シス−トランス液流処理によるイオンチャネル解析に要する時間が５分の合計１５分にて診断を行うことができるのであって、解析対象の白血球細胞も普通採血法にて得ることができるので、被験者の苦痛も極めて軽いものである。これに対し、現在一般に行われている白血病診断は、白血球細胞を抹消血ではなく、骨髄から採取せねばならないために、被験者には大変な苦痛を与えるうえに、その診断の全経過に少なくとも１時間は必要とされている。このように本発明は白血病の診断に適用される場合だけ例にとっても、従来類例をみないほど画期的な効用をもたらす。

本明細書に具体的に開示する本発明の実施例は上記のとおりであるが、本発明は前述の実施例に限定されるものでは決してなく、「特許請求の範囲」の記載内で種々の設計変更が可能であって、例えば図３に図示するごとく、シス−トランス液管１を複数列設して、一挙に多種類のイオンチャネル脂質平面膜を並行的に解析可能に構成することは本発明の技術的範囲に属することは明らかである。

以上の説明からも明らかなとおり、本発明の提供するイオンチャネル解析方法と装置は構造的に頗る簡素であるにも拘わらず、細胞そのもの、また細胞膜表面の膜蛋白質、細胞小器官や核などの膜蛋白質、さらには細菌やウィルスの膜蛋白質等に由来するイオンチャネル分子を用いて高精度の解析データを獲得できるのであって、医学および生物学上の研究開発に大いに寄与し得ることはもとより、さらにバイオセンサー技術としても活用することができることから、その産業上の利用価値は極めて大きい。

図１は、本発明のイオンチャネル解析装置（実施例）の概略を表わした断面説明図である。 図２は、本実施例装置におけるシス−トランス異性液管の構造および微細孔の形態が理解できるように図１のＡ−Ａ部分を拡大して示した一部拡大断面図である。 図３は、本発明の装置をマルチプル・タイプ構成した変形実施例を示す概念図である。

符号の説明

１ シス−トランス液管
11 絶縁性内管
11ａ 微細孔
12 絶縁性外管
２ 内管電極
３ 外管電極
４ インパルス発生器
５ チャネル電流測定器
６ 第１シリンジ・ポンプ
７ 第２シリンジ・ポンプ
８ 第１集液器
９ 第２集液器
１０ ワークステーション
10ａ ディスプレー
Ｃ 第２液流路
Ｍ 脂質平面膜
Ｍｂ イオンチャネル脂質平面膜
Ｔ 第１液流路
ｗ 内管の管壁

Claims (11)

1. 管壁の所定位置に脂質平面膜の生成される微細孔が開設され、かつ、管壁内部には毛細管状の第１液流路を有する絶縁性内管と；この内管を包囲して当該内管の周囲に第２液流路を形成せる絶縁性外管とを含んで構成される同軸管構造のシス−トランス異性液管に対して、
   前記内管と外管の各々には電解液を潅流させて両内外管の内部に電解液を充満させた後、前記外管の第２液流路に脂質溶液を送り込むことによって前記内管の微細孔に脂質平面膜を生成させ、ついで、内管の第１液流路へ解析対象のイオンチャネル分子を含有する試料液を潅流させて前記脂質平面膜に当該イオンチャネル分子を組み込ませ、こうして組込み形成されたイオンチャネル脂質平面膜近傍の第１・第２液流路に設置された一方の電極にパルス電圧を印加して当該イオンチャネル脂質平面膜を通過して両電極間に流れる単一チャネル電流を検出測定することを特徴とするシス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法。
2. 内管の微細孔に生成した脂質平面膜が破損したときには、再び外管の第２液流路に脂質溶液を送り込んで前記内管の微細孔に脂質平面膜を生成させてから、内管の第１液流路に解析対象とするイオンチャネル分子を含有する試料液を潅流させて前記脂質平面膜に当該イオンチャネル分子を組み込むことを特徴とする請求項１記載の、シス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法。
3. 管壁の所定位置に解析対象となる細胞を受止可能なサイズの微細孔が開設され、かつ、管壁内部には毛細管状の第１液流路を有する絶縁性内管と；この内管を包囲して当該内管の周囲に第２液流路を形成せる絶縁性外管とを含んで構成される同軸管構造のシス−トランス異性液管に対して、
   前記内管と外管の各々には電解液を潅流させて両内外管の内部に電解液を充満させた後、前記第２液流路又は第１液流路に解析対象の細胞を含有する試料液を送り込むことにより前記内管の微細孔に当該細胞を受止せしめる一方、ついで、前記試料液を送り込んだ流路とは反対側の第１液流路又は第２液流路側には瞬間的に陰圧を与えて微細孔に受止された細胞の陰圧側の膜パッチを裂開させ、こうして膜パッチの裂開された微細孔の前記細胞に対し、微細孔に近接して第１・第２液流路内に設置された一方の電極にパルス電圧を印加することにより、当該細胞膜上のチャネル分子を通過して両電極間に流れる単一チャネル電流を検出測定することを特徴とするシス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法。
4. 内管の管壁の微細孔が約１μｍの孔径サイズに穿孔されており、シス−トランス異性液管の第２液流路又は第１液流路に白血球細胞を含有する試料液を送り込むことにより前記内管の微細孔に当該白血球細胞を受止せしめ、ついで、前記試料液を送り込んだ流路とは反対側の第１液流路又は第２液流路側には瞬間的に陰圧を与えて微細孔に受止された当該白血球細胞における陰圧側の膜パッチを裂開させ、こうして膜パッチの裂開された微細孔の白血球細胞に対し、第１・第２液流路内に設置した一方の電極にパルス電圧を印加することにより、当該細胞膜上のチャネル分子を通過して両電極間に流れる単一チャネル電流を検出測定して白血病罹患の表徴に関する電気的データを取得することを特徴とする請求項３記載の、シス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法。
5. 第１液流路と第２液流路との間に相対的な液圧差を設け、内管の管壁における微細孔に液圧の高い流路から低い流路へ吸引力を生ぜしめることを特徴とする請求項１〜４の何れか一つに記載の、シス−トランス液流方式によるイオンチャネル解析方法。
6. 管壁の所定位置に脂質膜の生成される微細孔が開設され、かつ、管壁内部には毛細管状の第１液流路を有する絶縁性内管，およびこの内管を包囲して当該内管の周囲に第２液流路を形成せる絶縁性外管とを含んで構成される同軸管構造のシス−トランス異性液管と；このシス−トランス異性液管における第１液流路の中に、前記微細孔に近接して配設された内管電極と；前記第２液流路の中に、前記微細孔に近接して配設された外管電極と；前記内管と外管とが形成する第１・第２液流路の中に電解液が潅流充満し、かつ、前記微細孔に解析対象のイオンチャネル分子の組み込まれた脂質平面膜が生成され、又は同微細孔に解析対象の細胞が膜パッチが裂開された状態で受止されている状態において、前記内外の両電極の何れか一方に一定波高値のパルス電圧を印加するインパルス発生器と；前記パルス電圧を印加して前記脂質平面膜を通過する単一チャネル電流を検出測定するチャネル電流測定器とを備えたことを特徴とするシス−トランス液流方式のイオンチャネル解析装置。
7. 絶縁性内管の管壁に開設された微細孔が、第１液流路側においては直径が小さく，第２液流路側に至るほど直径が逓増するコーン形状を成していることを特徴とする請求項６記載の、シス−トランス液流方式のイオンチャネル解析装置。
8. 同軸管構造のシス−トランス異性液管の少なくとも内管における微細孔のコーン形状の孔壁面に疎水処理が施されていることを特徴とする請求項７記載の、シス−トランス液流方式のイオンチャネル解析装置。
9. シス−トランス異性液管の流入側には、内管の第１液流路に所要液を射出して第１液流路に潅流させる第１シリンジ・ポンプと、外管の第２液流路に所要液を射出して潅流させる第２シリンジ・ポンプとを接続する一方、当該シス−トランス異性液管の流出側には、前記第１液流路を潅流してくる前記液を受け入れて収容する第１集液器と、前記第２液流路を潅流してくる前記液を収容する第２集液器とを接続し、さらに第１液流路に配設された内管電極はパルス電圧を発生するインパルス発生器に接続すると共に第２液流路に配設された外管電極はチャネル電流測定器に接続されていることを特徴とする請求項６〜８の何れか一つに記載の、シス−トランス液流方式のイオンチャネル解析装置。
10. シス−トランス異性液管の内管および外管が、透明でフレキシブルな石英ガラスにより作製されている請求項６〜９の何れか一つに記載の、シス−トランス液流方式のイオンチャネル解析装置。
11. 絶縁性内管および絶縁性外管から成るシス−トランス異性液管を、少なくとも２本以上具備している請求項６〜１０の何れか一つに記載の、シス−トランス液流方式のイオンチャネル解析装置。

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