CN114870917A - 用于识别不同细胞的微流控芯片及其制备方法和检测平台 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于识别不同细胞的微流控芯片及其制备方法和检测平台，所述微流控芯片由微流体通道层和玻璃基底层键合而成，微流体通道层具有一微流控管道，微流控管道具有收缩结构和主管路通道，玻璃基底层上蒸镀了插指微电极；其中玻璃基底层的插指微电极设置在微流体通道层的主管路通道的正下方，且插指微电极的电极方向与主管路通道中流体流动方向垂直。本发明采用了具有阶段式收缩结构的直通道代替传统的鞘流结构通道，可以保证细胞稳定、依次地通过检测区域，降低了微流控管道的复杂度以及通道流阻，采用的插指微电极由四对微电极组成，使用配套的阻抗微流控芯片夹具灵活地选择了检测用的电极，提高了微流控芯片的重复使用率。

Description

用于识别不同细胞的微流控芯片及其制备方法和检测平台
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及一种用于识别不同细胞的微流控芯片及其制备方法和检测平台。
背景技术
传统的商业化流式细胞仪通常要使用荧光抗体对细胞样本进行标记，之后利用鞘流技术将细胞悬浮液样本通过聚焦的激光束，通过识别细胞的吸收信号、反射信号、散射信号或荧光强度信号对不同的细胞进行分类。然而，对于细胞的荧光标记可能会损伤细胞表面的结构，降低细胞群体的活力，标记后的细胞由于受到了损伤，难以进行后续的生物化学分析，更不能注射回到病人的体内。此外这种方法需要复杂的粒子聚焦系统，保证粒子能够依次通过激光聚焦区域，以及昂贵且笨重的光学检测设备。传统的基于库尔特计数器原理的阻抗分析仪器是探测细胞通过检测区域引起的直流电阻的微小变化，并逐步发展成为了血细胞分析的金标准。阻抗式流式细胞术是一种新兴的单细胞分析方法，阻抗检测微流控芯片具有占地面积小、试剂消耗少、易于使用以及无创检测等优势，在即时检测领域具有巨大的应用潜力。阻抗式流式细胞仪器件的灵敏度主要取决于微流控管道中电场的分布情况，因此对于微电极的设计需要着重地考虑。阻抗式流式细胞术适用于检测流动的细胞样本，通过检测细胞流经阻抗传感区域后引起的阻抗变化分析细胞的电学特性，进而对细胞生理、病理状态进行检测。
现有的阻抗式流式细胞术中微流控芯片结构复杂，制备过程复杂，通道流阻大，微流控芯片的重复使用率不高，且微流控芯片与阻抗检测仪器之间连接不稳定，无法同时满足较高的检测通量和检测灵敏度。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种检测通量高、检测灵敏度强、结构简单的用于识别不同细胞的微流控芯片；本发明的另一目的是提供一种微流控芯片的制备方法；本发明的另一目的是提供一种包含上述微流控芯片的检测平台。
技术方案：本发明的用于识别不同细胞的微流控芯片，所述微流控芯片由微流体通道层和玻璃基底层键合而成，微流体通道层具有一微流控管道，微流控管道由沿水平轴线依次连通的进样通道、第一收缩结构、主管路通道、第二收缩结构和出样通道构成，其中主管路通道的直径小于进样通道和出样通道，第一收缩结构用于将检测样品从大直径的进样通道向小直径的主管路通道引入；第二收缩结构用于将检测样品从小直径的主管路通道向大直径的出样通道引入；玻璃基底层上蒸镀有若干微电极组成的插指微电极；其中玻璃基底层的插指微电极设置在微流体通道层的主管路通道的正下方，且插指微电极的电极方向与主管路通道中流体流动方向垂直。
其中微流体通道层中由主管路通道构成检测区域，插指微电极上与主管路通道对应的位置为阻抗传感区域，微流体通道层的检测区域与玻璃基底层的阻抗传感区域对齐，并通过键合处理实现对于微流道的封闭。
进一步地，微流体通道层的长度与玻璃基底层的长度相等，其宽度小于玻璃基底层的宽度，微流体通道层位于玻璃基底层的中央位置，玻璃基底层上的插指微电极的中间部分与微流体通道层接触，其他部分暴露在空气中。
进一步地，主管路通道的尺寸为检测目标物尺寸的0.2-10倍。
进一步地，第一收缩结构和/或第二收缩结构的长度是主管路通道长度的1-5倍；第一收缩结构和/或第二收缩结构的宽度是主管路通道的宽度的5-10倍。
进一步地，插指微电极中微电极为四对，且插指微电极的体积是检测目标物的体积1-20倍。
另一方面，本发明提供一种上述用于识别不同细胞的微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
S1制备微流体通道层：在单晶硅片基材上制备一层光刻胶层；准备一具有微流控管道结构图案的微流控芯片掩模板，并通过光刻机将微流控芯片掩模板的图案转移到光刻胶层上，然后对光刻胶层进行显影，去除掉未发生交联反应的光刻胶，获得具有微流控管道结构的阳模具；向阳模具中注入PDMS预聚物，然后经真空、固化、剥离后，得到具有微流控管道结构的微流体通道层；
S2制备玻璃基底层：在基底上制备一层光刻胶层；准备一具有电极图案的电极掩模板，利用电极掩模板和紫外曝光机对光刻胶层进行紫外曝光处理，然后对光刻胶层进行显影，去除掉未发生交联反应的光刻胶，获得具有插指微电极图案结构及其引线图案结构的阳模具；依次在光刻后的基底上溅射一层铬和一层金，去除基底表面的光刻胶以及光刻胶上的金属层，得到具有插指微电极结构的玻璃基底层；
S3微流体通道层与玻璃基底层键合：在微流体通道层两侧分别打孔，孔分别与微流体管路的进样通道和出样通道连通；调整微流体通道层与玻璃基底层的相对位置，然后将上层的微流体通道层和下层的玻璃基底层紧密的贴合，并通过烘干使键合牢固。
进一步地，步骤(3)中，调整微流体通道层与玻璃基底层的相对位置为主管路通道与插指微电极的图案基本保持垂直，误差不超过3-5μm，插指微电极在微流控管道的两侧对称分布，且其中间部分与微流控管道接触。
另一方面，本发明提供一种检测平台，所述检测平台包括上述用于识别不同细胞的微流控芯片、锁相放大器和电流放大器，三者构成电路回路。
进一步地，所述检测平台包括倒置显微镜成像系统，设在倒置显微镜成像系统正下方的阻抗微流控芯片夹具；阻抗微流控芯片夹具上设有用于与微流控芯片中微电极电连的若干外置金属棒，微流控芯片固定在阻抗微流控芯片夹具上且与阻抗微流控芯片的外置金属棒电连；装载有微流控芯片的阻抗微流控芯片夹具依次连接有精密压力控制仪、用于存放待检测目标物的储液槽、流量监测单元和用于供气的压缩泵，其中流量监测单元还与压力控制仪通过数据线连接。
进一步地，所述检测平台还包括废液收集装置，废液收集装置与微流控芯片中的微流控管道的出样通道连接。
本发明检测平台集成了锁相放大器、电流放大器、精密压力控制仪、压缩泵、成像系统、微流控芯片、芯片夹具。检测平台可以对不同类型的细胞进行无标记的鉴别。本发明采用了具有阶段式收缩结构的直通道代替传统的鞘流结构通道，可以保证细胞能够稳定、依次地通过检测区域，降低了微流控管道设计的复杂程度以及通道的流阻，采用的金插指微电极由四对微电极组成，通过使用配套的阻抗微流控芯片夹具可以灵活地选择检测用的电极从而改变微电极间距提高了微流控芯片的重复使用率，降低了阻抗检测实验的成本，同时芯片夹具的连接方式更加稳定，降低了外部因素对于检测过程的影响，提高了灵敏度与信噪比。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)检测通量高和检测灵敏度强，微流控芯片采用了无需鞘流聚焦的阶段式收缩结构，结构简单容易制备；有效优化微流控芯片通道的设计，在保证检测样本能够依次通过阻抗传感区域的同时尽可能地简化通道结构，采用了一种无需鞘流聚焦的分段式收缩通道的设置，缩短了检测通道的长度，减小了通道的流阻，提高了检测的灵敏度；
(2)微电极的使用效率高，适用性广，插指微电极的设计方案包含了四对微电极的交错布置方案，通过与搭建好的阻抗检测平台的集成使用能够大大提升微电极的使用效率，改变不同的连接位点就可以有效地控制电极间距，从而使得设计好的微流控芯片能够匹配尺寸不同的检测样本；
(3)电阻抗检测平台的结构性能稳定，能够有效地改进微流控芯片中的插指微电极与锁相放大器之间的连接方式，稳定了微流控芯片与阻抗检测仪器的连接，提高了微电极的使用效率，降低了实验成本；
(4)对检测样本损害度低，搭建的电阻抗检测平台实现了在微流控芯片中检测微粒的电阻抗特性，并采用了多频检测、交流检测以及差分检测的模式，简化了对于微流控芯片通道内流体的控制，基于电学特性的检测属于无创检测，不需要在检测样本的表面进行特定的标记，不会对检测样本产生损害。
附图说明
图1为本发明的微流控芯片中流体通道层与玻璃基底层结构示意图；
图2为本发明的微流控芯片中流体通道层与玻璃基底层键合后的结构示意图；
图3为图2中检测区域和阻抗传感区域的局部放大图；
图4为本发明的检测平台的原理示意图，(A)为检测平台的阻抗检测示意图；(B)为插指微电极的布置方案；
图5为本发明的检测平台的结构示意图；
图6为实施例4-8的结果图；(A)为实施例4的不同尺寸聚苯乙烯微球产生的阻抗响应信号的幅值与微球尺寸之间的线性关系；(B)为实施例5的不同尺寸油包水液滴产生的阻抗响应信号的幅值与液滴尺寸之间的线性关系；(C)为实施例6的不同尺寸气泡产生的阻抗响应信号的幅值与气泡尺寸之间的线性关系；(D)为实施例7的不同种类细胞产生的阻抗响应信号幅值分布的箱线图；(E)为实施例8的不同活性H460细胞不透明度光谱分布的箱线图；(F)为实施例8的不同活性H460细胞相位角分布的箱线图；(G)为实施例8的不同活性HEK293细胞不透明度光谱分布的箱线图；(H)为实施例8的不同活性HEK293细胞相位角分布的箱线图；
附图标记，1、微流体通道层；101、进样口；102、出样口；2、微流控管道；201、进样通道；202、第一收缩结构；203、主管路通道；204、第二收缩结构；205、出样通道；3、玻璃基底层；301、插指微电极；4、电流放大器；5、阻抗微流控芯片夹具；6、压力控制仪；7、储液槽；8、流量监测单元；9、压缩泵；10、倒置显微镜成像系统；11、废液收集装置；12、锁相放大器。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
如图1-3所示，本实施例提供一种微流控芯片，其用于测试微米级尺寸样本的阻抗响应信号，微流控芯片由两层部分组成，芯片上层的微流体通道层1由PDMS材料制作成，包含有检测试剂的进口与出口部分，进出口处的直径均为1mm；芯片下层为蒸镀了插指微电极图案的玻璃基底层3，将这两部分通过等离子体清洗机键合得到阻抗检测芯片。
微流体通道层1与玻璃基底层3具有相似的大小，二者的长度近似，宽度不同，其中玻璃基底层3的宽度大于微流体通道层1的宽度。微流体通道层1位于玻璃基底层3的中央，使玻璃基底层3两侧的插指微电极301暴露在外。微流体通道层1中包含了有微小翻模出来的、具有阶段式收缩结构的微流控管道2，玻璃基底层3包含了由四对微电极组成的插指微电极301；微流体通道层1中由主管路通道203构成检测区域，插指微电极301上与主管路通道203对应的位置为阻抗传感区域，微流体通道层1的检测区域与玻璃基底层3的阻抗传感区域对齐，并通过键合处理实现对于微流道的封闭。
在微流控管道2的两端的微流体通道层1上分别设有进样口101和出样口102，其中微流控管道2由沿水平轴线依次连通的进样通道201、第一收缩结构202、主管路通道203、第二收缩结构204和出样通道205构成，其中进样通道201与进样口101连通，出样通道205与出样口102连通，主管路通道203的直径小于进样通道201和出样通道205，第一收缩结构202用于将检测样品从大直径的进样通道201向小直径的主管路通道203引入；第二收缩结构204用于将检测样品从小直径的主管路通道203向大直径的出样通道205引入。
在一实施例中，微流控芯片中的阻抗传感区域的体积是检测目标物的体积1-20倍之间，微流控芯片的第一收缩结构202/第二收缩结构204的宽度是主管路通道203宽度的1-5倍。主管路通道203两边设置了两段收缩结构，即第一收缩结构202和第二收缩结构204，从进样通道201到阻抗传感区域处逐步收窄，再从阻抗传感区域到出样通道205逐步放宽。主管路通道203具有对称式的结构，对称轴为进样口101中心与出样口102中心之间的连线。从进样口101到阻抗传感区域分布有两段对称式的收缩通道结构，用于将检测样本引入到管路中央流动。
在一实施例中，微流控管道2部分的长宽高设计尺寸必须与检测目标物的尺寸与特性相关，主管路通道203的长宽高设计尺寸需要满足是检测目标物尺寸大小的0.2-10倍。对于弹性较大的检测样本例如细胞，主管路通道203的长宽高设计尺寸可以小于检测目标物尺寸的1倍，对于弹性较差的检测样本例如聚苯乙烯微球，主管路通道203的长宽高设计尺寸必须大于检测目标物尺寸的1倍。
在一实施例中，插指微电极301的宽度分布在10μm到20μm，电极高度分布在50nm到100nm，电极间距分布在10μm到20μm，微电极用于接收激励电压信号在微流控管道中形成交变电场，传导检测样本产生的电阻抗响应信号。微流控芯片底部的插指微电极会暴露在导电的流体中，电极的方向与流体流动的方向垂直。插指微电极与微流控管道对齐的区域构成了阻抗传感区域，通过使用微电子加工的导线将插指微电极与锁相放大器相连接，构成检测的回路。
在一实施例中，插指微电极的布置方案如下，电极整体由四对微电极对组成，一共有8根单个微电极，单个微电极宽度的分布范围为10μm到20μm，单个微电极高度分布范围在50nm到100nm，相邻两微电极的间距分布范围在10μm到20μm。
在一实施例中，微流控管道2总长28-30mm，以左侧入口作为样品进口处。进样通道201长度为6.0-6.5mm，宽度为250-300μm；第一收缩结构202长度为1.8-2.0mm，宽度为100-150μm；主管路通道203为检测区域，长度为0.5-0.6mm，宽度为30-50μm；第二收缩结构204的长度为0.5-1.0mm，宽度为100-150μm；出样通道205的长度为17-18mm，宽度为250-300μm。
实施例2
本实施例提供一种用于识别不同细胞的微流控芯片的制备方法，该制备方法的内容包括：(1)上层微流控芯片通道的加工工艺流程；(2)下层蒸镀有插指微电极的玻璃基底的加工工艺流程；(3)微流控芯片通道与玻璃基底键合的工艺流程。
(1)上层微流控芯片通道的加工工艺流程，包括了以下几个步骤：
a.根据检测目标物的特性在AutoCAD软件上设计出微管道的结构图案；
b.根据设计好的微管道的结构图案加工出微流控芯片掩模板；
c.提供抛光的单晶硅片基材，充分去除硅片表面水分，清洗干净；
d.使用匀胶仪在单晶硅片表面旋涂一层厚度为50-150μm的SU-8-2050光刻胶，光胶旋涂的厚度与微流道的高度保持一致；
e.设置分段的甩胶程序，第一阶段设置为转速500rpm旋涂10s，第二阶段设置为转速1500rpm旋涂30s，旋涂加速度设置为100rpm/s；
f.去除厚胶边，采用浸有丙酮的棉签擦拭硅片边缘一圈的光刻胶；
g.前烘干，将旋涂好光胶的硅片转移到加热板上，设置加热板的分段式升温程序，第一阶段设置为65℃下烘烤5min，第二阶段设置为95℃烘烤15min，将的升温速率均设置为2℃/min；
h.在光刻机上使用微流控芯片模板，对SU-8-2050光刻胶层进行紫外曝光，将微流控芯片模版上的通道结构图案转移到光刻胶层上；
i.后烘烤，将硅片转移到加热板上，设置分段升温程序，第一阶段设置为65℃烘烤3min，第二阶段设置为95℃烘烤10min，升温速率设置为2℃/min；
j.对曝光后的光刻胶层进行显影，去除掉未发生交联反应的光刻胶，保留具有微流控芯片管路结构的阳模具；
k.对SU-8-2050进行烘干处理，设置分段升温程序，第一阶段设置为90℃烘烤10min，第二阶段设置为200℃烘烤30min，升温速率设置为2℃/min；
l.对于具有SU-8-2050光刻胶层阳模具的单晶硅片，在其四周用铝箔纸包围起来形成浇注用的围栏；
m.制备PDMS预聚物，聚合体与交联剂的混合质量比例为10:1，放入到真空罐中用真空泵进行抽真空处理，去除预聚物中的气泡，抽真空约30min；
n.固化PDMS，在85℃的烘箱中烘烤120min；
o.将固化好的PDMS从阳模具上剥离，得到具有管路结构的微流体通道层；
p.利用打孔器对进口处与出口处进行打孔，打孔直径为1mm，使进口处和出口处与微流体管路相连接，形成上层微流控芯片通道，作为备用。
(2)下层蒸镀有插指微电极的玻璃基底的加工工艺流程，包括以下几个步骤：
a.根据检测目标物的特性设计好插指微电极的图案，包括对于微电极的电极间距、电极宽度、电极对数的设计，并根据设计好的电极图案加工出掩模板；
b.充分去除抛光平整的玻璃片表面的水分，清洗干净；
c.将基底转移到匀胶仪上，通过甩胶的工艺旋涂一层均匀的光刻胶；
d.光胶固化后，利用掩模板和紫外曝光机对基底进行紫外曝光处理；
e.对基底进行显影处理，去除掉未发生交联反应的光刻胶，保留具有插指微电极图案结构及其引线图案结构的阳模具；
f.利用磁控溅射仪器在光刻后的基片上溅射厚度为20-120nm的铬；
g.利用磁控溅射仪器在光刻后的基片上溅射厚度为20-420nm的金；
h.使用丙酮溶液去除基底表面的光刻胶以及光刻胶上的金属层，形成金插指微电极的图案，加工出蒸镀有插指微电极的玻璃基底，包括了插指微电极的图案以及电极引线。
(3)微流控芯片通道与玻璃基底键合的工艺流程，包括了以下几个步骤：
a.将上层微流控芯片通道和下层玻璃基底均清洗干净，吹干备用；
b.在显微镜下观察上层微流控通道与下层玻璃基地的初步位置，保证微流控芯片管路与电极检测区域的位置精确对准，其中微流控芯片管路中最狭窄的部位与插指微电极图案基本保持垂直，误差不得超过3-5μm，微电极在微流控管道两侧对称分布，电极最终暴露在微流控管道管路中，与微管路的两个竖直的侧壁均有接触。
c.调整好位置后进行键合处理，将上层微流控芯片通道和下层玻璃基底紧密的贴合，形成电阻抗检测微流控芯片的主体；
d.将微流控芯片主体放入到60-80℃的烘箱中烘干90-120min，进行牢固键合。
实施例3
如图4-5所示，本实施例提供一种包含有实施例1中所述的微流控芯片的检测平台，平台集成了锁相放大器12、电流放大器4、压力控制仪6、压缩泵9、倒置显微镜成像系统10、用于微流控阻抗检测的微流控芯片以及阻抗微流控芯片夹具5。阻抗微流控芯片夹具5上设有用于与微流控芯片中微电极电连的若干外置金属棒，微流控芯片固定在阻抗微流控芯片夹具5上且与阻抗微流控芯片的外置金属棒电连；微流控芯片中的微流控管道2的进样通道201依次连接有压力控制仪6、用于存放待检测目标物的储液槽7、流量监测单元8和用于供气的压缩泵9，其中流量监测单元8还与压力控制仪6电连。倒置显微镜成像系统10设在的阻抗微流控芯片夹具5的正上方，用于观测微流控芯片中的样本。锁相放大器12、电流放大器4与阻抗微流控芯片夹具5上的微流控芯片构成电回路。
微流控芯片中的四对插指微电极，四对插指微电极共计8个电极的连接点，不同的连接点均可以与阻抗微流控芯片夹具5的外置金属棒进行连接，通过使用不同的连接点可以选用不同的电极对进行阻抗测量，可以灵活地改变电极宽度，更好地与检测样本的大小匹配，同时芯片夹具的连接方式更加稳定，降低了外部因素对于检测过程的影响，提高阻抗检测过程的灵敏度与信噪比。
检测平台还包括废液收集装置11，废液收集装置11与微流控芯片中的微流控管道2的出样通道205连接，用于接收微流控管道2中出样通道205流出的废液。
压缩泵9负责气源的供给，泵输出的气体经过减压阀后输入到精密的压力控制仪6中，之后再输入到储液槽7中。通过外部施加压力的方式将储液槽7中的液体压出到微流控管道2中，流体流量通过流量监测单元8进行精准控制后，再输入到微流控管道2中。锁相放大器12负责激励信号的调制与响应信号的解调，通过定制的导线与阻抗微流控芯片夹具5连接，阻抗微流控芯片夹具5与微流控芯片裸露的插指微电极301连接。
插指微电极301与微流体通道层1对齐的区域构成了阻抗传感区域，使用微电子加工的导线将插指微电极301与锁相放大器12相连接，构成检测的回路。插指微电极301位于微流控芯片底部的部分会暴露在导电的流体中，电极的方向与流体流动的方向垂直。插指微电极301接收锁相放大器12传导的激励电压信号在微流控管道中形成交变电场，传导响应信号，检测样本产生的电阻抗信号。锁相放大器12通过对于响应电流信号的解调可以实现对于检测样本尺寸大小的分析、介电特性的分析以及微粒数目的识别。
在一实施例中，检测平台的搭建及其使用方法如下：
(1)搭建检测平台，按照检测平台中双通道宽频的锁相放大器12、电流放大器4、精密的压力控制仪6、流量监测单元8、微流控芯片、阻抗微流控芯片夹具5、倒置显微镜成像系统10、储液槽7、压缩泵9、废液收集装置11的位置关系进行搭建；
(2)微流控芯片通道的预处理，向微流控芯片中的微流控管道中通入含有5wt％Pluronic F127的1×PBS缓冲液，处理时间为15-30min，尽可能减少检测样本粒子在微流控通道壁面上的粘附效应；
(3)检测样本的预处理，检测样本需要过滤处理去除大尺寸的杂质，对于尺寸较大的样本需要将样本浓度控制在50-200个/μL，对于尺寸较小的样本需要将样本浓度控制在300-600个/μL；
(4)检测参数的设置，需要根据检测样本的种类以及检测需求针对性地设置好检测参数，包括样本通入微流控芯片的流量、微流控芯片入口处的压力、跨阻电流放大器的放大倍数、激励信号的频率、激励信号的幅值、设备的采样频率、设备的检测模式等；
(5)通过锁相放大器配套的Labone软件实时采集阻抗响应数据，通过精密压力控制仪配套的All-in-One软件在计算机上对流体流量进行实时精准的控制；
(6)阻抗原始数据的分析与处理，锁相放大器收集的阻抗原始信号包括了阻抗信号的实部与虚部、相位角以及时间等，通过实部与虚部信号计算出阻抗响应信号的模值后进行筛选，通过仪器的采样频率可以获得时间向量，之后使用阻抗信号模值对时间绘图，可以得到时域中的阻抗响应信号图像，再通过MATLAB中的峰值查找函数findpeaks对数据进行筛选，获得样本的阻抗峰值信号。
实施例4
利用搭建的检测平台区分不同尺寸的聚苯乙烯微球，包括如下步骤：
(1)阻抗检测微流控芯片的预处理，向微流控芯片中的微流控管道中通入含有5wt％Pluronic F127的1×PBS缓冲液，冲洗微流控芯片通道15-30min；
(2)检测频率的优化，对插指微电极之间的目标检测物进行频谱扫描，在锁相放大器的参数设置中，选取了Output1作为输出信号，选定频率扫描的范围为1kHz-10 MHz，最终确定的激励信号的频率为10kHz；
(3)聚苯乙烯微球检测样本的制备，采用10×PBS作为悬浮介质，实验中使用5μm、10μm、15μm、20μm的聚苯乙烯微球作为阻抗的样本，将5μm聚苯乙烯微球样本的浓度稀释到200-300个/μL；将10μm聚苯乙烯微球样本浓度稀释到120-150个/μL；将15μm聚苯乙烯微球样本浓度稀释到80-110个/μL；将20μm聚苯乙烯微球样本浓度稀释到40-70个/μL；
(4)阻抗检测平台检测参数的设置，将激励电压信号的幅值设定为1V，频率设定为500kHz，跨阻电流放大器的放大倍数设定为1000倍，采样频率设定为224.9Sa/s，将锁相放大器的阻抗检测模式设置为AC与DIFF混合。
检测结果如图6(A)所示，图中显示了微球产生的阻抗信号的幅值与微球尺寸之间具有很好的线性关系，可以根据拟合的直线方程计算不同大小的聚苯乙烯微球对应的阻抗幅值，从而利用搭建的阻抗检测平台对不同尺寸的聚苯乙烯微球进行无标记的区分。
实施例5
利用搭建的检测平台区分不同尺寸的油包水液滴，包括如下步骤：
(1)检测微流控芯片处理，向通道中通入含有5wt％Pluronic F127的1×PBS缓冲液，冲洗微流控芯片通道15-30min；
(2)检测频率的优化，对插指微电极之间的目标检测物进行频谱扫描，在锁相放大器的参数设置中，选取了Output1作为输出信号，选定频率扫描的范围为1kHz-10 MHz，最终确定的激励信号的频率为10kHz；
(3)油包水液滴的生成，用专用的十字型通道生成油包水液滴。油相为含有2wt％dSurf的3MTM NovecTM HFE7500，水相为纯水(18.2MΩ·cm)，由优普系列超纯水机UPH-11-5T制备。通过调整油相和水相的压力改变两相的流速生成不同尺寸的油包水液滴；
(4)阻抗检测平台检测参数的设置，将激励电压信号的幅值设定为1V，频率设定为500kHz，跨阻电流放大器的放大倍数设定为1000倍，采样频率设定为224.9Sa/s，将锁相放大器的阻抗检测模式设置为AC与DIFF混合。
检测结果如图6(B)所示，图中显示了油包水液滴产生阻抗信号的幅值与液滴体积之间具有很好的线性关系，可以通过液滴产生的低频电阻抗信号幅值对液滴尺寸进行分析，从而实现非侵入式、无标记的液滴尺寸分析。
实施例6
利用搭建的检测平台区分不同尺寸的气泡，包括如下步骤：
(1)阻抗检测微流控芯片的预处理，向微流控芯片中的微流控管道中通入含有5wt％Pluronic F127的1×PBS缓冲液，冲洗微流控芯片通道15-30min；
(2)检测频率的优化，对插指微电极之间的目标检测物进行频谱扫描，在锁相放大器的参数设置中，选取了Output1作为输出信号，选定频率扫描的范围为1kHz-10 MHz，最终确定的激励信号的频率为10kHz；
(3)气泡的生成，用专用的十字型通道生成气泡，将油相微流道的压力调至270mbar，将水相微流道的压力调至267mbar，产生均匀的气泡，通过微调两相流体流道的压力控制两相液体的流速，改变产生的气泡的大小，通过图像处理软件Image-Pro分析生成的气泡的实际尺寸；
(4)阻抗检测平台检测参数的设置，将激励电压信号的幅值设定为1V，频率设定为10kHz，跨阻电流放大器的放大倍数设定为1000倍，将采样频率设定为224.9Sa/s，将锁相放大器的阻抗检测模式设置为AC与DIFF混合。
检测结果如图6(C)所示，图中显示了气泡产生阻抗信号的幅值与气泡尺寸之间具有非常好的线性关系，可以通过气泡产生的低频电阻抗信号幅值对液滴尺寸进行分析，从而实现非侵入式、无标记的气泡尺寸分析。
实施例7
利用搭建的检测平台区分不同种类的细胞，包括如下步骤：
(1)阻抗检测微流控芯片的预处理，向微流控芯片中的微流控管道中通入含有5wt％Pluronic F127的1×PBS缓冲液，冲洗微流控芯片通道15-30min；
(2)检测频率的优化，对插指微电极之间的目标检测物进行频谱扫描，在锁相放大器的参数设置中，选取了Output1作为输出信号，选定频率扫描的范围为1kHz-10 MHz，最终确定的激励信号的频率由500kHz和5MHz叠加而成；
(3)不同种类细胞样本的制备，实验所用的细胞为Hela细胞、HEK293细胞以及酵母细胞，采用的二氧化碳恒温培养箱的参数设置如下，培养箱温度恒定为37℃，设定二氧化碳浓度恒定为5％。采用了DMEM(高糖)培养基，实验采用了10×PBS对传代后的细胞进行了重悬浮，实验中将Hela细胞悬浮液的浓度控制在250-300个/μL，将HEK293细胞悬浮液的浓度控制在500-550个/μL，将酵母细胞悬浮液的浓度控制在350-400个/μL；
(4)阻抗检测平台检测参数的设置，细胞样本的进样压力为200mbar，进样流量控制在1-2μL/min，激励信号的幅值设置为1-3V，频率设置为500kHz与5MHz的叠加，跨阻电流放大器的放大倍数设定为1000倍，将采样频率设定为224.9Sa/s，将锁相放大器的阻抗检测模式设置为AC与DIFF混合。
检测结果如图6(D)所示，图中显示了不同种类细胞产生的阻抗幅值分布的差异，Hela细胞作为肿瘤细胞产生的阻抗信号的幅值更大，酵母细胞产生的阻抗信号的幅值次之，HEK293细胞作为常规的非肿瘤细胞产生的阻抗信号的幅值更小，不同种类细胞产生的阻抗信号幅值的大小与分布存在明显的差异，证实了利用搭建的电阻抗检测平台测试得到的细胞阻抗信号可以用作非侵入性的、无标记的区分细胞的参数。
实施例8
利用搭建的检测平台区分不同活性的细胞，包括如下步骤：
(1)阻抗检测微流控芯片的预处理，向微流控芯片中的微流控管道中通入含有5wt％Pluronic F127的1×PBS缓冲液，冲洗微流控芯片通道15-30min；
(2)检测频率的优化，对插指微电极之间的目标检测物进行频谱扫描，在锁相放大器的参数设置中，选取了Output1作为输出信号，选定频率扫描的范围为1kHz-10 MHz，最终确定的激励信号的频率由500kHz和5MHz叠加而成；
(3)不同活性细胞样本的制备，实验所用的细胞为H460细胞和HEK293细胞，实验中采用了10×PBS对传代后的细胞进行了重悬浮，接着将细胞样本放置于0℃冰箱中冷冻放置24h后取出作为低活性的细胞样本，将低活性H460细胞样本的浓度控制在200-300个/μL，将低活性HEK293细胞样本的浓度控制在400-500个/μL，将正常活性H460细胞样本的浓度控制在300-350个/μL，将正常活性HEK293细胞样本的浓度控制在450-550个/μL；
(4)阻抗检测平台检测参数的设置，细胞样本的进样压力为200mbar，进样流量控制在1-2μL/min，激励信号的幅值设置为1-3V，频率设置为500kHz与5MHz的叠加，跨阻电流放大器的放大倍数设定为1000倍，将采样频率设定为224.9Sa/s，将锁相放大器的阻抗检测模式设置为AC与DIFF混合。
检测结果如图6(E)-(H)所示，(E)中显示了正常形态H460细胞与低活性的H460细胞产生的不透明度光谱的差异，正常形态H460细胞的不透明度的值明显高于低活性的H460细胞的不透明度的值，这所示，图中显示了搭建的检测平台对于不同活性细胞进行区分的能力。(F)中显示了正常形态H460细胞与低活性的H460细胞产生的阻抗相位角的差异，正常形态H460细胞的相位角的值明显低于低活性的H460细胞的相位角的值，这所示，图中显示了搭建的检测平台对于不同活性细胞进行区分的能力。(G)中显示了正常形态HEK293细胞与低活性HEK293细胞产生的不透明度值的差异，正常形态HEK293细胞的不透明度值明显高于低活性的HEK293细胞的不透明度值，这所示，图中显示了搭建的平台对于不同活性细胞进行区分的能力。(H)中显示了正常形态HEK293细胞与低活性的HEK293细胞产生的阻抗相位角的差异，正常形态HEK293细胞的相位角的值明显低于低活性的HEK293细胞的相位角的值，这所示，图中显示了检测平台对于不同活性细胞进行区分的能力。

Claims (10)

1.一种用于识别不同细胞的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由微流体通道层(1)和玻璃基底层(3)键合而成，微流体通道层(1)具有一微流控管道(2)，微流控管道(2)由沿水平轴线依次连通的进样通道(201)、第一收缩结构(202)、主管路通道(203)、第二收缩结构(204)和出样通道(205)构成，其中主管路通道(203)的直径小于进样通道(201)和出样通道(205)，第一收缩结构(202)用于将检测样品从大直径的进样通道(201)向小直径的主管路通道(203)引入；第二收缩结构(204)用于将检测样品从小直径的主管路通道(203)向大直径的出样通道(205)引入；玻璃基底层(3)上蒸镀有若干微电极组成的插指微电极(301)；其中玻璃基底层(3)的插值微电极(301)设置在主管路通道(203)的正下方，且插指微电极(301)的电极方向与主管路通道(203)中流体流动方向垂直。
2.根据权利要求1所述的用于识别不同细胞的微流控芯片，其特征在于，微流体通道层(1)的长度与玻璃基底层(3)的长度相等，其宽度小于玻璃基底层(3)的宽度，微流体通道层(1)位于玻璃基底层(3)的中央位置，玻璃基底层(3)上的插指微电极(301)的中间部分与微流体通道层(1)接触，其他部分暴露在空气中。
3.根据权利要求1所述的用于识别不同细胞的微流控芯片，其特征在于，主管路通道(203)的尺寸为检测目标物尺寸的0.2-10倍。
4.根据权利要求2所述的用于识别不同细胞的微流控芯片，其特征在于，第一收缩结构(202)和/或第二收缩结构(204)的长度是主管路通道(203)长度的1-5倍；第一收缩结构(202)和/或第二收缩结构(204)的宽度是主管路通道(203)的宽度的5-10倍。
5.根据权利要求1所述的用于识别不同细胞的微流控芯片，其特征在于，插指微电极(301)中微电极为四对，且插指微电极(301)的体积是检测目标物的体积1-20倍。
6.一种根据权利要求1-4任一所述的用于识别不同细胞的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1制备微流体通道层：在单晶硅片基材上制备一层光刻胶层；准备一具有微流控管道结构图案的微流控芯片掩模板，并通过光刻机将微流控芯片掩模板的图案转移到光刻胶层上，然后对光刻胶层进行显影，去除掉未发生交联反应的光刻胶，获得具有微流控管道结构的阳模具；向阳模具中注入PDMS预聚物，然后经真空、固化、剥离后，得到具有微流控管道结构的微流体通道层；
S2制备玻璃基底层：在基底上制备一层光刻胶层；准备一具有电极图案的电极掩模板，利用电极掩模板和紫外曝光机对光刻胶层进行紫外曝光处理，然后对光刻胶层进行显影，去除掉未发生交联反应的光刻胶，获得具有插指微电极图案结构及其引线图案结构的阳模具；依次在光刻后的基底上溅射一层铬和一层金，去除基底表面的光刻胶以及光刻胶上的金属层，得到具有插指微电极结构的玻璃基底层；
S3微流体通道层与玻璃基底层键合：在微流体通道层两侧分别打孔，孔分别与微流体管路的进样通道和出样通道连通；调整微流体通道层与玻璃基底层的相对位置，然后将上层的微流体通道层和下层的玻璃基底层紧密的贴合，并通过烘干使牢固键合。
7.根据权利要求6所述的用于识别不同细胞的微流控芯片的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，调整微流体通道层与玻璃基底层的相对位置为主管路通道与插指微电极的图案基本保持垂直，误差不超过3-5μm，插指微电极在微流控管道的两侧对称分布，且其中间部分与微流控管道接触。
8.一种检测平台，其特征在于，所述检测平台包括根据权利要求1-4任一所述的用于识别不同细胞的微流控芯片、锁相放大器(12)和电流放大器(4)，三者构成电路回路。
9.根据权利要求8所述的检测平台，其特征在于，所述检测平台包括倒置显微镜成像系统(10)，设在倒置显微镜成像系统(10)正下方的阻抗微流控芯片夹具(5)；阻抗微流控芯片夹具(5)上设有用于与微流控芯片中微电极电连的若干外置金属棒，微流控芯片固定在阻抗微流控芯片夹具(5)上且与阻抗微流控芯片的外置金属棒电连；微流控芯片中的微流控管道(2)的进样通道(201)依次连接有压力控制仪(6)、用于存放待检测目标物的储液槽(7)、流量监测单元(8)和用于供气的压缩泵(9)，其中流量监测单元(8)还与压力控制仪(6)通过数据线连接。
10.根据权利要求8所述的检测平台，其特征在于，所述检测平台还包括废液收集装置(11)，废液收集装置(11)与微流控芯片中的微流控管道(2)的出样通道(205)连接。
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